Quy trình chiết tách, tinh sạch và khảo sát tác dụng kháng khuẩn từ cây neem

24
TP CHÍ KHOA HC VÀ CÔNG NGH Tp 44, s 2, 2006 Tr. 24-
31
CHIT TÁCH, TINH SCH VÀ KHO SÁT TÁC DNG I
KHÁNG VI SINH VT CA SALANIN T NHÂN HT CÂY XOAN
N  (Azadirachta indica A. juss) TR'NG TI VI(T NAM
V V!N "#, NGUY&N TI(N TH)NG, NGUY&N TH* MINH, NGUY&N NGC HNH
I. M U
Cây xoan n  còn gi là cây neem (Azadirachta indica A. juss) h Meliaceae !"c s#
d%ng làm thu'c tr) sâu r*t có hi,u qu. / nhi0u n1i trên th3 gi4i [6, 8, 10]. Hi,n nay các nhà khoa
hc ã phân lAp h1n 60 ch*t limonoid có kh. nBng gây ngán Bn và xua uDi côn trùng t) hGt và
lá neem [1, 2, 3, 8, 9, 11]. J n!4c ta, cây neem ang !"c trKng nhi0u / các tLnh Nam Trung B
nh! Ninh ThuAn, Bình ThuAn Q phR xanh vùng *t cát cSn cTi và c.i tGo *t bV hoang hóa nhW
kh. nBng chVu hGn cao cRa cây.
GYn ây chúng tôi ã báo cáo k3t qu. phân lAp azadirachtin, mt limonoid chính cRa nhân
hGt neem trKng tGi Ninh ThuAn [12]. Trong bài này, chúng tôi trình bày ph!1ng pháp phân lAp và
xác Vnh c*u trúc salanin, kh.o sát hoGt tính gây c t3 bào và kh. nBng kháng vi sinh vAt kiQm
Vnh cRa salanin.
II. NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP
1. Nguyên liu
HGt neem (Azadirachta indica A. juss) !"c thu tGi khu r)ng neem trKng tGi huy,n Ninh
Ph!4c, tLnh Ninh ThuAn vào tháng 7 nBm 2003, t) nh_ng cây 4 - 5 nBm tuDi.
2. Ph!"ng pháp và thi(t b*
-PhD hKng ngoGi (IR) !"c o trên máy VECTOR 22, dùng viên nén KBr.
-PhD kh'i l!"ng !"c o trên thi3t bV 1100 series LC/ MSD Trap, Agilent.
-PhD cng h!/ng t) hGt nhân !"c o trên máy Bruker Avance 500 MHz.  dVch chuyQn
hóa hc !"c tính theo mppm so v4i TMS, hSng s' t!1ng tác (J) tính bSng Hz.
-Phân tích soc kí l4p mpng trên b.n nhôm Silicagel Merck 60 F
254
tráng srn có  dày 0,2
mm.

- Soc kí ct s# d%ng silicagel Merck cs hGt 0,04 mm - 0,063 mm.
- Soc kí lpng cao áp (HPLC) s# d%ng Yu dò DAD, ct Bondapack, C
18
, 3,9 × 300 mm.
- iQm nóng ch.y !"c o trên máy Electrothermal IA 9000 series, dùng mao qu.n không
hi,u chLnh.
- Tác ng 'i kháng vi sinh vAt và gây c t3 bào !"c th# tGi phòng thí nghi,m th# hoGt
tính sinh hc - Vi,n Hóa hc các h"p ch*t thiên nhiên, Hà Ni.
III. K,T QU/ VÀ TH/O LU1N
1. Chi(t tách và phân l5p salanin
25
HGt neem thu !"c, sau khi loGi bp h3t vp và phYn thVt qu., !"c s*y 3n khô / 50
o
C. 5
kg nhân hGt em li trích v4i ete dYu hpa (40 - 60
o
C) bSng b chi3t Soxhlet. Sau khi loGi dung
môi ete dYu hpa, thu !"c 970 g ctn dYu s,t, màu vàng nâu. HTn h"p dYu !"c ti3p t%c hòa tan
trong methanol (MeOH). LoGi dung môi methanol, thu !"c 230 g ctn s,t màu vàng sAm. Ctn
tan trong methanol cho chGy soc kí ct nhanh v4i h, dung môi là ete dYu hpa và chloroform v4i
 phân cvc tBng dYn. KiQm tra các phân oGn thu !"c sau soc kí ct bSng soc kí b.n mpng Q
gom các phân oGn có R
f
gi'ng nhau.
Ti3p t%c soc kí ct lYn 2 v4i các phân oGn giàu salanin thu !"c / trên, chúng tôi thu !"c
120 mg tinh thQ hình lBng tr% không màu, kí hi,u MS.
Bng 1. PhD
1
H - NMR và
13

C - NMR cRa ch*t MS trong dung môi CDCl
3
, mppm
V* trí

H
[500 MHz, J(Hz)] 
C
(125 MHz)
1 4,96 t, j = 3 71,37
2 2,31 m 27,62
3 4,78 t, j = 3 71,37
4 42,75
5 2,81 d, j = 12,5 39,46
6 3,99 dd, j = 3; 12 72,65
7 4,18 d, j = 3 85,72
8 49,12
9 2,75 dd, j = 4; 8 39,98
10 40,65
11 2,22 m 30,72
12 172,80
13 134,89
14 146,60
15 5,44 m 87,93
16a
16b
2,13 d, j = 12
2,25 d, j = 12
41,43
17 3,64 d, j = 3,5 49,46

18 1,67 s 13,14
19 0,98 s 15,14
20 127,13
21 7,32 t, j = 1,5 142,94
22 6,29 m 110,63
26
23 7,26 138,83
2
8a
28b

3,69 d, j = 3
3,59
7
7,70
29 1,22 s 19,63
30 1,30 s 16,93
OCH
3
3,26 s 51,49
1’ 170,40
2’ 129,09
3’ 137,24
4’ 1,82 d, j = 1 14,35
41,43
5’
6’
1,94 s
1,94 s
11,92

20,87
2. Xác ;*nh c<u trúc
MS có các tc tính sau:
- iQm nóng ch.y: Mp = 156
o
C (Hexan - Ete etilic)
- PhD hKng ngoGi: Vmax (cm
-1
): 2953, 1727, 1701, 1650, 1483, 1264, 1141, 1054.
- PhD kh'i l!"ng: 619 [M + Na]
+
.
- PhD cng h!/ng t) hGt nhân
1
H - NMR và
13
C - NMR !"c o trong dung môi CDCL
3
và
 dVch chuyQn hóa hc mppm !"c trình bày / b.ng 1.
- PhD cng h!/ng t) hGt nhân 2 chi0u
1
H -
1
H - COSY và HMBC !"c trình bày / b.ng 2,
hình 1 và hình 2.
Bng 2. Sv t!1ng tác
1
H -
1

H - COSY và HMBC cRa ch*t MS
Vò trí COSY HMBC
1 H
1
– H
2
C
10
, C
9
2 H
2
– H
1
; H
2
– H
3
C
5
3 H
3
– H
2
4
5 H
5
– H
6
C

19
, C
29
, C
10
, C
4
, C
1
, C
3
, C
7
6 H
6
– H
5
; H
6
– H
7
7 H
7
– H
6
8
9 H
9
– H
11

27
10
1
1 H
11

– H
9
C
12

12
13
14
15 H
15
– H
16a
; H
15
– H
16b

16a
16b
H
1
6
– H

1
5
H
16
– H
17

C
2
0
17 H
17
– H
16
C
20
, C
13
, C
23
, C
14
, C
15
, C
2
, C
8
18 C
8

K3t qu. nhAn !"c cho th*y:
- PhD cng h!/ng t) hGt nhân
1
H – NMR cho th*y các proton cRa vòng furan có mppm là
7,32; 6,29 và 7,26 t!1ng }ng v4i vV trí H-21, H-22 và H-23, mt nhóm CH
3
- có m~i ôi / vV trí
4’ (b.ng 1).
- PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u COSY cho th*y rõ sv t!1ng tác cRa H
1
– H
2
, H
2
–
H
3
, H
5
– H
6
… (hình 1 và b.ng 2).
- PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u HMBC cho th*y có sv t!1ng tác xa cRa H
1
v4i C
9
–
C
10
, tc bi,t / vV trí H

5
t!1ng tác v4i carbon / vV trí 19, 29, 10, 4, 1, 3 và 7 (hình 2 và b.ng 2).
Hình 1. PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u
1
H -
1
H - COSY cRa MS
28
Hình 2. PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u HMBC cRa MS
Dva vào phân tích phD cng h!/ng t) hGt nhân 2 chi0u và so sánh v4i các tài li,u ã công
b' [4, 6], ch*t MS !"c xác Vnh chính là salanin có c*u trúc nh! sau:
O
O
O
O
D
C
1
5
6
7
15
17
13
H
O
O
H
3
C

H
3
C
C
H
3
C
O
O
OCH
3
1'
2'
3'
2
3
4
8
9
10
19
6'
28
29
5
'
4'
30
18
11

12
16
20
21
22
2
3
ây là lYn Yu tiên, salanin !"c kh.o sát c*u trúc bSng phD
1
H -
1
H - COSY và phD
HMBC.
3. Xác ;*nh kh@ nAng gây ;Bc t( bào ng!Di
Kh. nBng gây c t3 bào !"c th# nghi,m theo ph!1ng pháp hi,n ang !"c ti3n hành tGi
vi,n nghiên c}u ung th! Qu'c gia cRa M„. Các dòng t3 bào ung th! ng!Wi: Hep - G2 (ung th!
gan), Fl (ung th! màng t# cung), RD (ung th! màng tim).
T3 bào ung th! !"c duy trì liên t%c / các i0u ki,n tiêu chu…n và !"c s# d%ng th# v4i
các ch*t th# ã !"c chu…n bV srn / các nKng  khác nhau trên phi3n vi l!"ng 96 gi3ng, phi3n
th# nghi,m bao gKm: t3 bào, môi tr!Wng nuôi c*y và ch*t th#, !"c R / 37
o
C Q t3 bào ti3p t%c
phát triQn. Sau ó t3 bào !"c l*y ra c' Vnh, r#a, nhum và hòa lGi bSng dung dVch chu…n, c
trên máy Elisa / b!4c sóng 515 - 540 nm. K3t qu. th# nghi,m c tính t3 bào cRa ch*t MS biQu
hi,n bSng s' t3 bào s'ng sót (%), !"c ghi nhAn / b.ng 3.
29
Bng 3. Kh. nBng gây c t3 bào cRa MS
SF t( bào sFng sót (%)
STT Kí hiu mLu
Hep-G2 F1 RD

1 DMSO* 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0
2 Ch}ng (+)** 1,5 ± 0,09 1,05 ± 0,6 2,5 ± 0,02
3 MS 101,8 ± 1,1 102,8 ± 2,5 68,7 ± 1,5
* DMSO [Dimethyl sulfoxide, (CH
3
)
2
SO)]: Dung dVch không, dùng làm 'i ch}ng trong trong thí
nghi,m; ** Ch}ng(+): S# d%ng thu'c trV ung th! tc hi,u.
Các k3t qu. nhAn !"c / trên cho th*y MS không gây c 'i v4i 3 dòng t3 bào Fl, RD và
Hep-G2.
4. Xác ;*nh tính ;Fi kháng vi sinh v5t
HoGt tính 'i kháng vi sinh vAt !"c thvc hi,n theo 2 b!4c:
Bc 1: Th# Vnh tính theo ph!1ng pháp khu3ch tán trên thGch, s# d%ng khoanh gi*y lc
t…m ch*t th# theo nKng  tiêu chu…n.
Các chRng vi sinh vAt kiQm Vnh gKm Gi di,n các nhóm sau:
- Vi khu…n Gr (-): E. coli, P. aeruginosa.
- Vi khu…n Gr (+): B. subtillis, S. aureus.
- N*m m'c: Asp. niger, F. oxysporum.
- N*m men: C. albicans, S. cerevisiae.
Bc 2: Các mˆu cho hoGt tính d!1ng / b!4c 1 s‰ !"c ti3n hành th# ti3p b!4c 2 Q tính ra
nKng  }c ch3 t'i thiQu (MIC) theo ph!1ng pháp cRa Vanden Bergher và Vlietlink (1994) ti3n
hành trên phi3n vi l!"ng 96 gi3ng.
Kháng sinh kiQm Vnh bao gKm: Ampicilin, Tetracycline, Nystatin.
+ Mˆu thô có giá trV: MIC <= 200 ‹g/ ml, !"c coi là d!1ng tính kháng vi sinh vAt.
+ Mˆu tinh có giá trV: MIC <= 50 ‹g/ ml, !"c coi là d!1ng tính kháng vi sinh vAt.
K3t qu. xác Vnh hoGt tính 'i kháng vi sinh vAt kiQm Vnh cRa MS !"c trình bày / b.ng 4.
Bng 4. K3t qu. xác Vnh hoGt tính 'i kháng vi sinh vAt kiQm Vnh cRa MS
Kí
hiu mLu

NNng ;B Oc ch( tFi thiPu MIC ( µg/ ml)
Vi khu…n Gr(-) Vi khu…n Gr(+)
N*m m'c N*m men
E.
coli
P.
aeruginosa
B.
substillis
S.
aureus
Asp.
niger
Asp.
oxysporum
C.
albicans
S.
cerevisiaeMS
(_) (_)
25
(_)
12,5 25 12,5 25
30
K3t qu. nhAn !"c cho th*y MS có hoGt tính 'i kháng 5 vi sinh vAt kiQm Vnh, tc bi,t
kháng mGnh A. niger và C. albicans.
IV. K,T LU1N
T) nhân hGt neem trKng tGi Ninh ThuAn chúng tôi ã phân lAp salanin / dGng tinh khi3t và
kh.o sát c*u trúc bSng các ph!1ng pháp phD hi,n Gi, tc bi,t là phD cng h!/ng t) hGt nhân 2
chi0u COSY và HMBC cRa salanin !"c công b' lYn Yu tiên / Vi,t Nam. Salanin !"c kh.o

sát hoGt tính gây c t3 bào ng!Wi và hoGt tính 'i kháng vi sinh vAt kiQm Vnh. K3t qu. cho th*y
salanin không có tác d%ng gây c t3 bào ng!Wi nh!ng lGi có hoGt tính kháng 5 vi sinh vAt kiQm
Vnh, tc bi,t kháng mGnh 'i v4i A. niger và C. albicans.
TÀI LIU THAM KH/O
1. Bina S. Siddiqui and Munawwer Rasheed - Three new triterpenoids from Azadirachta
indica, Helvetica Chimica Acta 84 (2001) 1962-1968.
2. Bina S. Siddiqui, Syed Tariq Ali, Munawwer Rasheed and Muhammad Nadeem Kardar -
Chemical constituents of the flowers of Azadirachta indica, Helvetica Chimica Acta 86
(2003) 2787-2796.
3. S. P. Basak and D. P. Chakraborty - Chemical investigation of Azadirachta indica leaves,
Journal of the Indian Chemical Society 45 (1968) 466-467.
4. R. Bryan Yamasaki, Thomas G. Ritland, Marka, Barnby, and James. A. Kloc - Isolation
and purification of salanin from neem seeds and its quantification in neem and chinaberry
seeds and leaves, (1988) 277-283.
5. De Silva, L. B., W. Stocklin and T. A. Geissman - The isolation of salanin from Melia
dubia. Phytochemistry 8 (1969) 1817-1819.
6. H. S. Garg and D. S. Bhakuni - Salanoide, a meliacin from Azadirachta indica seed (neem
oil), Journal of Ethnopharmacology 23 (1981) 39-51.
7. R. Henderson, R. Mc Crindle, A. Melera, and K. H. Overton - Tetranortriterpenoids - I.
The constitution and stereochemistry of salanin, Tetrahedron 24 (1967) 1525-1528.
8. M. Jacobson - Review of neem research in the United States, In : Locke, J. C. and Lawson,
R. H (Eds.), Proceeding of a workshop on neem potential in pest management, 1990.
9. W. Krans, M. Bokel, A. Klenk, and H. Pohnl - The structure of azadirachtin and 22, 23 -
dihydro - 23 -ß – methocyazadirachtin, Tetrahedron letters (1985) 6435-6438.
10. H. Schmuttere, H. Properties and potential of natural pestisides from the neem tree,
Azadirachta indica. Ann. Rev. Entomol. 35 271-290.
11. S. Siddiqui, T. Mahmood, B. S. Siddiqui, and S. Faizi - Isolation of triterpenoid from
Azadirachta indica. Phytochemistry 25 (1986) 2183-2185.
12. V~ VBn , Nguy•n Ti3n Thong - Chi3t xu*t, tinh sGch và xác Vnh hàm l!"ng cRa
azadirachtin trong hGt neem, TGp chí Sinh hc 27 (2) (2005) 57-60.

31
SUMMARY
ISOLATION, PURIFICATION AND INVESTIGATION ON ANTIMICROBIAL
ACTIVITY OF SALANIN FROM NEEM SEED KERNEl (Azadirachta indica A. juss) OF
THE NEEM TREE PLANTED IN NINH THUAN PROVINCE, VIET NAM
From the seed of the neem tree (Azadirachta indica A. juss), collected from Ninh Thuan
province. For the first time, Salanin have been isolated, characterized and determinded
molecular structure by spectroscopic analysis such as IR, MA, 1H - NMR,
13
C - NMR, COSY,
HMBC. Salanin showed antimicrobial activity against B. subtillis, Asp. niger, F. oxysporum, C.
albicans and S. cerevisiae. But, it was harmless for human cells.
*+a ch,: Nh.n bài ngày 9 tháng 4 n2m 2005
V~ VBn , Nguy•n Ti3n Thong,
Vi,n Sinh hc nhi,t 4i, Vi,n Khoa hc và Công ngh, Vi,t Nam.
Nguy•n ThV Minh, Nguy•n Ngc HGnh,
Vi,n Công ngh, hóa hc, Vi,n Khoa hc và Công ngh, Vi,t Nam.