Nghiên cứu bào chế tạo cao chiết đông trùng hạ thảo có hàm lượng hợp chất thứ cấp cao (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

O

N

N

ỆS N

Ọ

-------� � � -------

Ĩ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀ :
N
ÊN ỨU BÀO
Ế TẠO CAO CHIẾT
Đ N TRÙN
Ạ THẢO Ó ÀM LƢỢNG HỢP CHẤT
THỨ CẤP CAO

à Nội -2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA

N

N

ỆS N

Ọ

-------� � � -------

Ĩ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀ :
N
ÊN ỨU BÀO
Ế TẠO CAO CHIẾT
Đ N TRÙN
Ạ THẢO Ó ÀM LƢỢNG HỢP CHẤT
THỨ CẤP CAO

Ngƣời thực hiện

:

TRẦN THỊ DIỄM

Mã sinh viên

:

637115

Lớp

:

K63CNSHB

Khoa

:

NG NGHỆ SINH HỌC

:

TS. P Í T Ị CẨM MIỆN

iáo viên hƣớng dẫn

à Nội -2022


LỜ

M ĐO N

Tơi xin cam đoan khóa luận này được thực hiện và hồn thành bằng sự tìm
hiểu nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS. Phí Thị Cẩm
Miện, khoa Cơng nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tất cả các
số liệu, hình ảnh, kết quả được trình bày trong khóa luận này là hồn tồn trung
thực, khơng sao chép bất cứ tài liệu, cơng trình nghiên cứu của người khác. Các

thơng tin trích đẫn, tham khảo trong khóa luận đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước Hội đồng chấm
khóa luận tốt nghiệp và Học viện.
Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2022
Sinh viên

Trần Thị Diễm

i


LỜ

ẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn đến tồn bộ thầy cơ đang cơng tác tại Học
viện Nơng nghiệp Việt Nam, đặc biệt là thầy cô của khoa Cơng nghệ sinh học đã
ln tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý giá cho tôi trong những
năm học tập và rèn luyện tại trường.
Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Phí Thị Cẩm Miện đã tận tình
giúp đỡ, hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tơi cũng xin trân trọng cảm ơn tất cả các anh, chị, bạn bè làm việc tại Viện
nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận
tình giúp đỡ, đóng góp những ý kiến bổ ích và tạo điều kiện cho tơi hồn thành
tốt khóa luận tốt nghiệp.
Mặc dù đã cố gắng hoàn thiện luận văn bằng sự nhiệt tình, năng lực của
mình, tuy nhiên khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được
những đóng góp của q thầy cơ và các bạn để tơi có thể hồn thành khóa luận
được tốt nhất.

Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2022
Sinh viên

Trần Thị Diễm

ii


MỤ LỤ
LỜ

M ĐO N ................................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vi
DANH MỤ

ÌN

ẢNH ................................................................................. vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... viii
TÓM TẮT ........................................................................................................... ix
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và yêu cầu....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ...................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................ 2

PHẦN 2: TỔN

QU N TÀ L ỆU................................................................... 3

2.1. Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo ........................................................ 3
2.1.1. Giới thiệu chung .......................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái đơng trùng hạ thảo ....................................................... 3
2.2. Kĩ thuật nuôi trồng và các phương pháp nhân giống Đông trùng hạ thảo ..... 4
2.3. Thành phần hóa học trong đơng trùng hạ thảo............................................... 5
2.4. Tác dụng của Đông trùng hạ thảo .................................................................. 7
2.5. Tổng quan về Adenosine và Cordycepin ....................................................... 9
2.5.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học ............................................... 9
2.5.2. Dược động học cordycepin và adenosine ................................................. 10
2.5.3. Tác dụng của cordycepin và adenosine..................................................... 11
2.6. Tình hình nghiên cứu tách chiết Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam và trên thế giới13
2.6.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết Đơng trùng hạ thảo tại Việt Nam .......... 13
2.6.2. Tình hình nghiên cứu tách chiết Đông trùng hạ thảo trên thế giới ........... 14
2.7. Giới thiệu về một số phương pháp chiết ...................................................... 15
2.7.1. Phương pháp chiết Soxhlet ....................................................................... 15
iii


2.7.2. Phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE) ............................................ 17
2.7.3. Phương pháp ngấm kiệt............................................................................. 18
2.8. Các phương pháp tạo cao khô Đông trùng hạ thảo ...................................... 18
2.8.1. Phương pháp sấy thăng hoa ...................................................................... 18
2.8.2. Phương pháp sấy nhiệt .............................................................................. 19
2.9. Phương pháp đánh giá hàm lượng hoạt chất thứ cấp ................................... 19
2.9.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..................................... 19
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘ DUN

VÀ P ƢƠN

P ÁP N

ÊN ỨU . 22

3.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu..................................................................... 22
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................ 22
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất..................................................................... 22
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 22
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 22
3.2.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 22
3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 22
3.4. Các phương pháp nghiên cứu....................................................................... 23
3.4.1. Phương pháp xử lí mẫu ............................................................................. 23
3.4.2. Phương pháp tách chiết thu cao chiết từ sợi nấm Đông trùng hạ thảo bằng
phương pháp Soxhlet ................................................................................ 23
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố vật lý, hóa học tới hiệu suất tách
chiết Đông trùng hạ thảo ........................................................................... 25
3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp sấy tới chất lượng cao khô Đông
trùng hạ thảo ............................................................................................. 26
3.4.5. Định lượng adenosine và cordycepin bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) ...................................................................................................... 27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ T ẢO LUẬN .......................................................... 29
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố vật lý hóa học tới hiệu suất tách chiết
Đông trùng hạ thảo.................................................................................... 29

iv

4.1.1. Ảnh hưởng của yếu tố dung môi tới hiệu suất tách chiết Đông trùng hạ
thảo ............................................................................................................ 29
4.1.2. Ảnh hưởng của yếu thời gian tới hiệu suất chiết Đông trùng hạ thảo ...... 32
4.2. Ảnh hưởng của phương pháp sấy tới chất lượng cao khô Đông trùng hạ thảo
................................................................................................................... 34
4.3. Đánh giá hàm lượng hợp chất thứ cấp cao khô Đông trùng hạ thảo bằng
HPLC ........................................................................................................ 36
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ

ẾN NGHỊ.......................................................... 39

TÀ L ỆU THAM KHẢO ................................................................................ 40
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 44

v


D N

MỤ BẢN

Bảng 2.1. Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008) .................. 6
Bảng 2.2. Độ tan của adenosin trong một số dung môi (Harry G. Britain, 1998) .... 10
Bảng 4.1. Hiệu suất tách chiết sợi tươi Đông trùng hạ thảo trong các loại dung
môi khác nhau ............................................................................................ 29
Bảng 4.2. Hiệu suất tách chiết sợi khô Đông trùng hạ thảo trong các loại dung
môi khác nhau ............................................................................................ 30
Bảng 4.3. Bảng kết quả khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hiệu suất
chiết sợi tươi Đông trùng hạ thảo .............................................................. 32

Bảng 4.4. Bảng kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thời gian đến hiệu
suất chiết sợi khô Đông trùng hạ thảo ....................................................... 33
Bảng 4.5. Bảng kết quả ảnh hưởng của phương pháp sấy tới cao khô sợi tươi
Đông trùng hạ thảo .................................................................................... 35
Bảng 4.6. Bảng kết quả ảnh hưởng của phương pháp sấy tới cao khô sợi khô
Đông trùng hạ thảo .................................................................................... 35
Bảng 4.7. Xác định hàm lượng hợp chất cordycepin và adenosine của mẫu Đông
trùng hạ thảo .............................................................................................. 37

vi


D N

MỤ

ÌN

ẢN

Hình 2.1. Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử
(Christian & cs., 1837) .......................................................................................... 4
Hình 2.2. Cấu tạo một số nucleotid trong Đơng trùng hạ thảo (Yung- Jen Tsai &
cs., 2010) ............................................................................................................... 7
Hình 2.3. Công thức cấu tạo cordycepin (P. Karthe & cs., 1997) ........................ 9
Hình 2.4. Cơng thức cấu tạo adenosine (Harry G. Britain, 1998) ........................ 9
Hình 2.5. Con đường chuyển hóa của adenosine ở động vật có vú (Yung – Jen
Tsai & cs., 2010) ................................................................................................. 11
Hình 2.6. Bộ chiết Soxhlet (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). ............................. 16
Hình 2.7. Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (Nguyễn Văn Ri, 2011) ... 20

Hình 3.1. Mẫu đơng trùng hạ thảo ...................................................................... 23
Hình 3.2. Phương pháp tách chiết thu dịch chiết bằng phương pháp Soxhlet .... 25
Hình 3.3. Máy sấy thăng hoa và máy sấy hoa quả .............................................. 26
Hình 4.1. Ảnh hưởng của yếu tố dung môi sử dụng đến hiệu suất tách chiết
Đơng trùng hạ thảo .............................................................................................. 30
Hình 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thời gian đến hiệu suất tách chiết
Đơng trùng hạ thảo .............................................................................................. 33
Hình 4.3. Dịch chiết của hai loại mẫu Đông trùng hạ thảo................................. 34
sau khi chiết Soxhlet ........................................................................................... 34
Hình 4.4. Cao khơ của hai loại mẫu Đơng trùng hạ thảo .................................... 36
Hình 4.5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp ................................................... 37
Hình 4.6. Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử .............................................................. 37
Hình 4.7. Kết quả phân tích hàm lượng các vi chất trong Đơng trùng hạ thảo do
Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mỹ phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
sản xuất của Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia ngày
5/4/2022. .............................................................................................................. 38

vii


D N

MỤ

Ữ V ẾT TẮT

Từ đầy đủ

Từ viết tắt
C. militaris

Cordyceps militaris

C. sinensis

Cordyceps sinensis

cs

Cộng sự

g

gam

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

MAE

Microwave Assisted

Extraction
mg

miligam

mg/g

miligam/gam

MeOH

Methanol

µg

microgam

SD

Standard Deviation

TB

Trung bình

viii


TĨM TẮT
Nấm Đơng trùng hạ thảo (C. militaris) có tên khoa học là Cordyceps
militaris là một loài nấm ký sinh trên cơn trùng có nhiều giá trị dược liệu và
được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm chức năng và dược phẩm. Việc
nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo cũng như các nghiên cứu phương pháp tách
chiết các hợp chất có hoạt tính hóa học của chúng ngày càng được quan tâm.
Nghiên cứu này đã nghiên cứu về quy trình tách chiết, xác định hàm lượng
adenosine và cordycepin trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Kết quả nghiên cứu tách chiết mẫu sợi tươi và sợi khô Đông trùng hạ thảo
bằng phương pháp Soxhlet với điều kiện tối ưu: dung môi tách chiết ethanol
70%, thời gian tách chiết 10 giờ với hiệu suất tách chiết thu được là 13,98% và
14,96%, hàm lượng adenosine đạt 2,91 mg/g và 0,051 mg/g, hàm lượng
cordycepin là 6,14 mg/g và 4,46 mg/g, tương ứng với mẫu sợi tươi và sợi khô
Đông trùng hạ thảo. Phương pháp sấy thăng hoa cho khối lượng cao khô 0,104 ±
0,011 g và 0,165 ± 0,009 g với hàm lượng adenosine là 2,89 mg/g và 0,047
mg/g, cordycepin đạt 6,11 mg/g và 4,45 mg/g tương ứng ở cả hai loại vật liệu
sợi tươi và sợi khơ. Thí nghiệm đánh giá hàm lượng hợp chất thứ cấp bằng
HPLC cho thấy hàm lượng adenosine và cordycepin đạt cao nhất ở mẫu cao khô
sợi tươi Đông trùng hạ thảo lần lượt là 290 mg/100g và 608 mg/100g.

ix


P ẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps là loài nấm ký sinh trên sâu
non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số lồi cơn trùng. Hơn 400 phân lồi
nấm thuộc chi Cordyceps đã tìm thấy và mơ tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 lồi
được ni trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể. Giống Cordyceps
có hai lồi hiên nay đang đươc nghiên cứu rất nhiều về chiết xuất và sản xuất
do có giá tri dược liệu và giá trị kinh tế cao. Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps
sinensis (C. sinensis) là một loại nấm dược liệu có phân bố rất hạn chế trong tự
nhiên và được nuôi trồng trong điều kiện hoang dại, loài nấm này hiện tại vẫn
chưa đươc nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo, do đó sản lượng
nấm thu được khơng đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường. Trong số những loài
này, chỉ có lồi Cordyceps militaris (C. militaris) đã được trồng thành cơng ở
quy mơ lớn và có chứa nhiều các chất có hoạt chất sinh học (Li & cs., 2006).

Hiện nay, nhu cầu sử dụng các loại thảo dược có nguồn gốc thiên nhiên để
phòng và trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến, trong đó phải kể đến Đơng trùng
hạ thảo, một loại thảo dược mang những giá trị dược liệu thần kỳ. Trong y học
cổ truyền Trung Quốc, nấm Đơng trùng hạ thảo có tác dụng bổ thận, bổ khí điều
trị các trường hợp mệt mỏi, đổ mồ hôi về đêm, tăng đường huyết, tăng mỡ máu,
bệnh phổi, bệnh thận, suy thận, loạn nhịp tim và bệnh gan, … Hoạt chất chính
có trong Đơng trùng hạ thảo được kể đến là adenosine và cordycepin, có nhiều
tác dụng trong dược phẩm. Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về
nấm Đông trùng hạ thảo cho thấy những ứng dụng thần kỳ của nó trong y học,
đồng thời cũng đã nghiên cứu xác định hàm lượng adenosine và cordycepin
bằng phương pháp HPLC đối với hai lồi Đơng trùng hạ thảo phổ biến là C.
militaris và C. sinensis. Ngoài ra, cịn có những nghiên cứu tách chiết và phân
lập một số hợp chất từ Đông trùng hạ thảo nuôi cấy.
Cũng nghiên cứu về phương pháp tách chiết Đông trùng hạ thảo. Năm
2017, nhóm tác giả Lê Thị Huyền Trang đã nghiên cứu quy trình tách chiết
adenosine và cordycepin từ Đơng trùng hạ thảo được nuôi trồng bằng phương
1


pháp siêu âm, sử dụng dung môi tách chiết là nước. Bên cạnh đó, cịn tách chiết
Đơng trùng hạ thảo bằng phương pháp vi sóng của nhóm tác giả Li Deng &
cộng sự năm 2013 thực hiện nghiên cứu tối ưu hóa ly trích axit cordyielic và
codycepin bằng phương pháp phản ứng bề mặt từ Đông trùng hạ thảo được ni
cấy bằng phương pháp có hỗ trợ vi sóng. Trong năm 2019, Zheng-Ming Qian và
nhóm tác giả thực hiện nghiên cứu: xác định nhanh trong Đông trùng hạ thảo
bằng cách ly trích trực tiếp bằng máy HPLC: Bột mẫu cordyceps cho vào cột
bảo vệ và được ly trích bằng nước nóng ở 75°C và áp suất 150 bar trong 3 phút.
Kết quả adenosine lần lượt là 0,24% và 0,94%. Nhìn chung, nghiên cứu các
phương pháp tách chiết hoạt chất từ Đông trùng hạ thảo cho hàm lượng
adenosine và cordycepin thu được bằng các phương pháp tách chiết và tối ưu

các thơng số kỹ thuật trong q trình tách chiết là khác nhau.
Hàm lượng adenosine và cordycepin thu được được ứng dụng trong công tác
nghiên cứu tạo sản phẩm chống ung thư đang là mối quan tâm hàng đầu trong giai
đoạn dịch bệnh hiện nay. Do đó, việc nghiên cứu tạo bột cao Đông trùng hạ thảo
giàu hợp chất thứ cấp (adenosine và cordycepin) là nghiên cứu cần thiết.
Vậy nên, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu bào chế tạo cao chiết Đơng trùng
hạ thảo có hợp chất thứ cấp cao”.
1.2. Mục đích và u cầu
1.2.1. Mục đích
Tạo cao khơ Đơng trùng hạ thảo có hàm lượng hợp chất adenosine và
cordycepin cao.
1.2.2. Yêu cầu
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý và hóa học tới hiệu suất
tách chiết Đơng trùng hạ thảo.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp sấy tới chất lượng cao khô
Đông trùng hạ thảo.
Đánh giá hàm lượng hợp chất thứ cấp cao khô thu được.

2


P ẦN 2: TỔN

QU N TÀ L ỆU

2.1. Giới thiệu chung về Đông trùng hạ thảo
2.1.1.

iới thiệu chung

Nấm C. militaris thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes,
bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps và loài Cordyceps militaris.
Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris
sau đó đươc đổi tên thành Cordyceps militaris (Kobayasi & cs., 1982).
Nấm Đơng trùng hạ thảo là các lồi nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc
sâu trưởng thành của một số lồi cơn trùng. Đến nay, đã phát hiện được hơn 400
lồi nấm Đơng trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps nhưng chỉ có 2 lồi được chú
trọng nghiên cứu nhiều nhất là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris do có
giá trị dược liệu cao. Ngồi tự nhiên, nấm Đơng trùng hạ thảo thường được tìm
thấy vào mùa hè, lồi nấm C. sinensis phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao thuộc
dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000 m so với mực nước biển như vùng Tây
Tạng (Trung Quốc), một số vùng Nepan và Butan; lồi nấm C. militaris tìm thấy
ở vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000 – 3000 m, phân bố rộng (Trung Quốc, Nhật
Bản, Hàn Quốc và các nước trong khu vực Đông Nam Á) (Wang, 1995).
2.1.2. Đặc điểm hình thái đơng trùng hạ thảo
Lồi nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, quả thể có màu cam, chiều dài 8
– 10 cm. Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng. Quả thể nấm nhô lên từ
xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa. Các
nang bào tử dài từ 300 – 510 µm, bề rộng 4 µm. Các bào tử nang hình sợi,
khơng màu và phân đoạn, kích thước 3,5 – 6 x 1 – 1,5 µm. Các bào tử nang này
trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp.
Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc Mỹ, châu u và châu Á (Paul & cs., 2008).

3


ình 2.1. Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử
(Christian & cs., 1837)
2.2. ĩ thuật nuôi trồng và các phƣơng pháp nhân giống Đông trùng hạ thảo
Cordyceps militaris được trồng trong môi trường lỏng để thu hoạch sợi

nấm đồng thời trên môi trường rắn để thu quả thể. Các tác giả Kim và cộng sự
đã tối ưu hóa điều kiện ni cấy chìm nấm C. militaris (Kim & cs., 2003). Để
sản xuất quy mô lớn về số lượng quả thể nấm C. militaris hiện nay người ta chỉ
sử dụng môi trường rắn chứa các cơ chất nhân tạo hoặc mơi trường rắn chứa cơn
trùng (ví dụ, ấu trùng tằm B. mori). Tuy nhiên, viêc nuôi nấm lấy quả thể trên
côn trùng rất tốn kém, do đó hiên nay nấm chủ yếu được ni trên mơi trường
có thành phần chính là gạo. Các mơi trường dùng cho nuôi cấy bao gồm môi
trường nhân giống, môi trường tiền nuôi cấy hê sợi và môi trường sản xuất.
Thành phần các môi trường này khác nhau phù hơp với sự phát triển của nấm ở
các giai đoạn. Có 4 giai đoan chính trong sự phát triển của nấm, bao gồm: giai
đoan tạo hệ sợi, giai đoạn tạo sắc tố, giai đoan nảy chồi, và giai đoan tạo quả thể
(Lu & cs., 2005). Các q trình này địi hỏi việc kiểm soát chặt chẽ về nhiêt độ,
độ ẩm và ánh sáng. Việc ni cấy các lồi nấm trên mơi trường rắn đã được
nghiên cứu trong nhiều năm qua. So sánh với các loại môi trường khác, môi
trường rắn hiệu quả hơn về các mặt như diện tích ni trồng nhỏ, giảm lương
nước tiêu thụ so với nuôi cấy lỏng, đồng thời giảm chi phí xử lý nước thải và
tiêu thụ năng lượng trong quy trình ni nấm. Trong tự nhiên nấm C. militaris
sinh trưởng rất hạn chế ký sinh trên côn trùng. Khi nuôi trồng trong điều kiện
4


nhân tạo nấm có thể phát triển trong điều kiên tối ưu như độ thống khí giúp cho
việc phát triển tơ nấm và quả thể, nhất là chủ yếu quả thể chứa nhiều hợp chất có
hoạt tính sinh học hơn. Quả thể đã được trồng thành công trên môi trường gạo
lứt hoăc ấu trùng côn trùng. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy việc sử dụng
hạt kê có thể tạo ra nấm có hàm lượng adenosine cao. Các nghiên cứu cũng cho
thấy khi hat đậu nành được dùng làm môi trường rắn hàm lượng cordycepin tăng
so với giá thể gạo (Lim & cs., 2012).
2.3. Thành phần hóa học trong đơng trùng hạ thảo
Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C.militaris

cho thấy lồi nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại
vitamin: vitamin A (34,7 mg/g), vitamin B1 (13,0 mg/g), vitamin B6 (62,2
mg/g), vitamin B12 (70,3 mg/g), vitamin B3 (42,9 mg/g); các nguyên tố khoáng:
Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp
chất quan trọng: Cordycepin (1,52%), Cordycepic acid (11,8%), polychaccaride
(30%) (Shih & cs., 2007).
Acid amin
Kết quả nghiên cứu của Hur năm 2008 cho thấy trong quả thể nấm
Cordyceps militaris có chứa lương acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối
nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng
acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao
động từ 1,15 – 15,06 mg/g và 0,36 – 2,99 mg/g. Thành phần acid amin của mỗi
loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g),
prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18
mg/g) trong quả thể. Số liệu phân tích của Chang năm 2001 cho thấy phần lớn
trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và
tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001).
Polysaccharide
Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đươc tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường
5


monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai
polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác
dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan và cộng sự năm 2008 cho
rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ
nấm (Yan & cs., 2008).
cid b o
Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo khơng no, chiếm

70% tổng số acid béo, trong đó lương acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả
thể và 21,5% trong sinh khối. Lương acid béo no chủ yếu là acid palmitic,
chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Bảng 2.1) (Hur, 2008).
Bảng 2.1. Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008)
Phần trăm acid béo tổng (%)
Quả thể

Sinh khối

Palmitic acid (C16:0)

24.5

21,5

Palmitoeic acid (C16:1)

2.3

2,1

Stearic acid (C18:0)

5.8

5,0

Oleic acid (C18:1)

6.0

17,7

Linoleic acid (C18:2)

61.3

33,0

Linolenic acid (C18:3)

-

20,6

Các nhóm hoạt chất khác
Đơng trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid
aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu polyamin như cadaverin, spermidin,
spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A. Các hợp chất này có hoạt
tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus (Xuanwei Zhou & cs., 2009)

6


ình 2.2. ấu tạo một số nucleotid trong Đông trùng hạ thảo (Yung- Jen
Tsai & cs., 2010)
2.4. Tác dụng của Đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y từ
giữa thế kỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765). Theo tài liệu cổ,
đơng trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ơn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng ích

phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng chữa hư lao sinh ho, ho ra máu,
liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh (Xuanwei Zhou & cs., 2009).
Tác dụng tăng cường sức khỏe
Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết cao Đơng trùng hạ thảo có tác dụng
tăng cường hoạt động các enzym superoxid dismutase, glutathion peroxidase và
catalase (các enzym tham gia loại bỏ gốc tự do trong cơ thể), giảm q trình
peroxide lipid do đó có tác dụng chống lại các nhân tố có hại như căng thẳng,
tuổi tác (Buenz E.J. & cs., 2005).

7


Tác dụng miễn dịch
Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh Đơng trùng hạ thảo có khả
năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể. Cụ
thể là tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự nhiên
(natural killer cell), điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường một
cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể
IgG, IgM trong huyết thanh (Buenz E.J. & cs., 2005)
Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết cao Đơng trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự
như quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase (Buenz E.J. & cs., 2005).
Tác dụng chống ung thư
Thành phần polysaccharides trong nấm đơng trùng hạ thảo cũng như vài
lồi nấm khác được cho là có tác dụng ức chế khối u do hai cơ chế: (1) trực tiếp
gây độc cho tế bào ung thư; (2) gián tiếp ức chế thông qua hệ miễn dịch tự
miễn của cơ thể (Peter C.K. Cheung, 2008).
Tác dụng chống viêm
Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây viêm
như gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và phát

triển của bạch cầu. Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả
thể nấm C. militaris (CMWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát
lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm k ch th ch việc sản xuất nitric oxide),
việc phóng th ch yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế
bào RAW 264,7. Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE
làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch
chiết. Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc
sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol & cs., 2010).
Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan
Đơng trùng hạ thảo có cơng dụng nhanh trong việc phục hồi và làm giảm
các triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau lưng,
các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao
8


phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các men
AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH (Patel K.J. & cs., 2013).
2.5. Tổng quan về Adenosine và Cordycepin
2.5.1. ơng thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học
Cordycepin và adenosine đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường
ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucosid (Karthe P. & cs., 1997).

ình 2.3. ơng thức cấu tạo cordycepin (P. Karthe & cs., 1997)
2.5.1.1. Cordycepin
Tên khoa học: 9 – (3 – deoxy – β – D – ribofuranosyl) adenin; Công thức
phân tử: C10H13N5O3; Trọng lượng phân tử: 251,24; Phân tử cordycepin tính
kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết; Điểm chảy: 228 – 231°C; Độ tan: tan
trong DMSO, methanol, ethanol; Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm (Karthe
P. & cs., 1997).

ình 2.4. ơng thức cấu tạo adenosine (Harry G. Britain, 1998)
9


2.5.1.2. Adenosine
Tên khoa học: 9 – β – D – ribofuranosyl adenin; Công thức phân tử:
C10H13N5O4; Trọng lượng phân tử: 267,24; Adenosin dạng bột tinh thể màu
trắng; Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235°C; Độ tan:
Bảng 2.2. Độ tan của adenosin trong một số dung môi (Harry G. Britain, 1998)
Dung môi

Độ tan (mg/ml)

Nước

5

Methanol

6

Ethanol

13

1 – propanol

20

2 – propanol

13

1 – butanol

9

Ethylene glycol

8

Phổ hấp thụ UV: Trong dung dịch nước, HCl 0,1N, NaOH 0,1N adenosin
có phổ hấp thụ UV tương tự nhau, bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm với ε =
15185 (Harry G. Britain,1998).
2.5.2. Dƣợc động học cordycepin và adenosine
Cordycepin là chất cấu tạo tương tự adenosin nên có con đường chuyển
hóa tương tự. Khi nghiên cứu dùng adenosine cho động vật có vú, ở bên ngồi
tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosine deaminase
trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào
trong tế bào, adenosine được phosphoryl hóa bởi adenosine kinase tạo thành
ATP. Nếu tế bào khơng cần dùng adenosine, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm
amin bởi adenosine deaminase trong tế bào. Dạng hypoxanthinosin khơng hoạt
tính được tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận. Tương tự như vậy,
10


cordycepin cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosine deaminase
tạo hypoxanthinosin (Yung – Jen Tsai & cs.,2010).

ình 2.5. on đƣờng chuyển hóa của adenosine ở động vật có vú (Yung –

Jen Tsai & cs., 2010)
2.5.3. Tác dụng của cordycepin và adenosine
Các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong nấm C. militaris đã được
nghiên cứu ly trích, đánh giá khả năng trong trị liệu và đã được ứng dụng rộng
rãi trong điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe cho con người với kết rất tốt.
Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm C. militaris.
Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối với
chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối
(0,97% so với 0,36%) (Hur, 2008).
2.5.3.1. Tác dụng của cordycepin
Ức chế sinh tổng hợp purin, DN/ RN và tín hiệu mTOR
Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri
phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và 5 –
phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin. Do
cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN,
enzyme kết hợp cordycepin, gây rối loạn tổng hợp ARN. Các nghiên cứu cũng

11


chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di
truyền, sinh trưởng phát triển tế bào (Hong Jue Lee & cs.,2012).
Tác dụng chống sự di căn
Sự di căn thông thường là sự tách tế bào ung thư khỏi vị trí ban đầu, xâm
lấn vào các khối ngoại bào khác. Cordycepin có tác dụng ức chế các enzyme
metalloproteinase (bản chất là endopeptidase phụ thuộc kẽm và calci, vai trị
chính trong phân hủy tổ chức ngoại bào) (Baoyan Fan & cs., 2012).
Tác dụng chống viêm
Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan đến q trình ung thư. Các tế bào
ung thư sinh nhiều cytokine, chemokine và các receptor của chúng, các chất

này gây ra phản ứng viêm. Cordycepin được cho rằng làm giảm các tác nhân
gây viêm như NO, PGE2, TNF α và IL 1β (Hardeep S. Tuli & cs., 2013).
Tác dụng giảm đường huyết
Li Ma & cộng sự nghiên cứu tác dụng cordycepin trên chuột gây tiểu
đường bởi alloxan. Kết quả cho thấy cordycepin không làm tăng nồng độ
insulin trong máu nhưng làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng
làm tăng nồng độ glycogen tại gan. Đồng thời cordycepin có tác dụng bảo vệ
thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường (Li Ma & cs., 2015).
2.5.3.2. Tác dụng của adenosine
Tác dụng chống viêm
Adenosin được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ
thể của adenosin A2A. Nồng độ adenosin ngoại bào ở tế bào bình thường
khoảng 300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng
nâng lên 600 – 1200 nM (Lucia Spicuzza & cs., 2006)
Tác dụng trên tim
Adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch
vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn
truyền nút nhĩ thất. Adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim
(Masatsugu Hori & cs.,1991).
12


Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương
Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến
bệnh viêm đường hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho… Ngồi ra adenosin có
tác dụng tốt đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thối
hóa thần kinh… (Masatsugu Hori & cs., 1991; Lucia Spicuzza & cs.,2006).
2.6. Tình hình nghiên cứu tách chiết Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam và
trên thế giới
2.6.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết Đơng trùng hạ thảo tại Việt Nam

Năm 2018, Đoàn Thị Phương Thùy và cộng sự đã nghiêm cứu thực hiện
các thí nghiệm để tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố như loại dung mơi, tỉ lệ
dung mơi, thời gian ủ có đánh sóng siêu âm, độ pH của dung môi, nhiệt độ ủ đến
hiệu suất tách chiết hoạt chất cordycepin trong các lượt tách chiết cordycepin từ
quả thể nấm NTT. Kết quả thí nghiệm cho thấy, sự tách chiết hoạt chất
cordycepin từ quả thể nấm NTT đạt hiệu quả cao nhất trong dung môi ethanol:
nước, 2:1 (v/v); pH 7; ủ ở nhiệt độ 55C có kết hợp đánh sóng siêu âm 2 lần,
mỗi lần 3 phút; vortex trong 1 phút và nghỉ 3 phút giữa hai lần đánh (Đoàn Thị
Phương Thùy & cs., 2018).
Trong nghiên cứu của Đỗ Thị Gấm và cộng sự năm 2020 về bào chế hệ
chất mang nano Chitosan-Peg chứa các hoạt chất từ nấm đông trùng hạ thảo
(Cordyceps militaris Link) với mục đích tạo ra nano Đơng trùng hạ thảo ứng
dụng trong y học, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của
quy trình tách chiết đến hiệu quả thu hồi hoạt chất và khả năng ứng dụng hệ chất
mang chitosan-PEG trong đóng gói hoạt chất từ dịch chiết C. militaris Link
NBRC 100741. Cơng trình đã thành công trong tách chiết hoạt chất từ quả thể
nấm đông trùng hạ thảo (C. militaris Link NBRC 100741) theo quy trình chiết
phân đoạn (ethanol 96°, ethanol 50°, nước) ở 55°C, thu được cao chiết có hàm
lượng cordycepin khoảng 9,92 mg/g cao chiết, hàm lượng adenosine đạt 1,32
mg/g cao chiết, độ ẩm (Đỗ Thị Gấm & cs., 2020).

13


Năm 2020, Nguyễn Thu Quỳnh và cộng sự nghiên cứu bào chế xây dựng
công thức bào chế và tiêu chuẩn cơ sở của cốm tan đông trùng hạ thảo. Đông
trùng hạ thảo được chiết bằng phương pháp ngâm nóng, dung môi nước, nhiệt
độ chiết 65°C, thời gian chiết 4 giờ, cho hiệu xuất chiết cao và khả thi khi áp
dụng quy mô pilot. Bào chế thành công cốm tan đông trùng hạ thảo có tỷ lệ cao
lỏng đơng trùng và tá dược 1: 9; tá dược là lactose: glucose với tỷ lệ 6: 4. Cốm tan

có màu vàng, khơ tơi, vị ngọt thanh, độ đồng đều khối lượng đều nằm trong khoảng
± 7,5% so khối lượng trung bình gói, độ rã nhỏ hơn 5 phút, hàm ẩm nhỏ hơn 5%,
hàm lượng cordycepin 102,4 ± 0,09% (Nguyễn Thu Quỳnh & cs., 2020).
2.6.2. Tình hình nghiên cứu tách chiết Đơng trùng hạ thảo trên thế giới
Năm 2009, Lei Huang và cộng sự đã nghiên cứu hàm lượng của các thành
phần hoạt tính sinh học chính, cordycepin và adenosine trong quả thể và sợi nấm
từ tự nhiên C. sinensis và C. militaris được nuôi cấy nhân tạo, bằng phương
pháp HPLC cải tiến. Kết quả cho thấy hàm lượng trung bình của cordycepin và
adenosine trong quả thể của C. militaris là 2,654 ± 0,02 và 2,45 ± 0,03 mg / g, ở C.
sinensis là 0,9801 ± 0,01 và 1,643 ± 0,03 mg / g, trong khi ở sợi của C. militaris là
0,9040 ± 0,02 và 1,592 ± 0,03 mg / g. Nồng độ cordycepin và adenosine trong quả
thể của C. militaris cao hơn ở C. sinensis tự nhiên, trong khi sợi nấm của C.
militaris tương tự với C. sinensis tự nhiên (Lei Huang & cs., 2009).
Trong nghiên cứu của Hsiu-Ju Wang và cộng sự năm 2014 về việc tối ưu
hóa các điều kiện chiết xuất của cordycepin từ Cordyceps militaris bằng cách sử
dụng siêu âm. Với mục đích này, thiết kế thí nghiệm trực giao đã được sử dụng
để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến q trình chiết xuất có hỗ trợ siêu âm
(UAE). Bốn yếu tố: thời gian chiết (phút), nồng độ ethanol (%), nhiệt độ chiết
(°C) và tần số chiết (kHz), đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy năng suất
cordycepin cao nhất là 7,04 mg /g (86,98% ± 0,23%) với thời gian chiết là 60
phút, nồng độ etanol là 50%, nhiệt độ chiết là 65°C và tần số chiết là 56
kHz. Người ta nhận thấy rằng năng suất chiết xuất cordycepin tăng lên khi có tác
dụng của siêu âm trong q trình chiết xuất. Do đó, UAE có thể được sử dụng
14