Nghiên cứu định danh và đặc tính đối kháng của chủng vi khuẩn vk5 với một số chủng nấm gây bệnh trên chuối (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ ĐẶC TÍNH ĐỐI
KHÁNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN VK5 VỚI MỘT SỐ
CHỦNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CHUỐI

HÀ NỘI - 2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------------***--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ ĐẶC TÍNH ĐỐI
KHÁNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN VK5 VỚI MỘT SỐ
CHỦNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CHUỐI
Sinh viên thực hiện

: PHAN QUẾ ANH

Lớp

: K63CNSHD

MSV

: 637301

Chuyên ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN XUÂN CẢNH

HÀ NỘI - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện
trong thời gian từ tháng 03/2022 - 09/2022 dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.
Nguyễn Xuân Cảnh, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và
chưa từng được bất kì ai cơng bố trong các nghiên cứu nào khác. Các tài liệu được
trích dẫn trong khố luận đã được nêu trong mục tài liệu tham khảo.
Hà Nội, ngày 08 tháng 9 năm 2022
Sinh viên

Phan Quế Anh

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi cảm ơn đến ban Giám đốc Học viện, đội ngũ giảng viên,

cán bộ đang giảng dạy và công tác tại Học viện. Tôi vô cùng biết ơn đến thầy cô
khoa Công nghệ sinh học đã giảng dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện để tơi hồn
thành chương trình học, thực tập nghề nghiệp và khố luận tốt nghiệp.
Đặc biệt hơn, tơi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS
Nguyễn Xuân Cảnh đã định hướng nghiên cứu và hướng dẫn tận tình tơi trong
thời gian thực hiện khố luận.
Tơi xin cảm ơn đến thầy cô bộ môn Công nghệ vi sinh thầy PGS.TS Nguyễn
Văn Giang, cô Th.S Trần Thị Hồng Hạnh, cô Th.S Nguyễn Thanh Huyền, cô Th.S
Trần Thị Đào và chị nghiên cứu viên Nguyễn Thị Thu đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi
trong thời gian thực hiện khố luận.
Cuối cùng tơi xin cảm ơn đến bạn bè thực hiện khố luận tại bộ mơn Cơng
nghệ vi sinh và gia đình đã khuyến khích, động viên và giúp đỡ để tơi có thể hồn
thành khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 08 tháng 9 năm 2022
Sinh viên

Phan Quế Anh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH .....................................................................................................vii
TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... viii

PHẦN I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................ 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Tổng quan về một số bệnh hại do nấm bệnh gây ra trên chuối và một số cây
trồng ................................................................................................................................. 3
2.1.1. Tổng quan về bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides ............. 3
2.1.2. Tổng quan về bệnh héo Panama do Fusarium oxysporum f. sp cubense .......... 7
2.2.3. Tổng quan về bệnh bạc lá, bệnh đốm lá do nấm Alternaria alternata ........... 11
2.2.4. Tổng quan về bệnh trên lá do nấm Corynespora cassiicola ........................... 12
2.2. Tổng quan về chủng vi khuẩn VK5 ....................................................................... 14
2.2.1. Nguồn gốc phân lập, đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh lý, sinh hóa của
chủng vi khuẩn VK5 ...................................................................................................... 14
2.2.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ................................................................... 15
2.2.3. Khả năng đối kháng nấm C. musae của chủng VK5 ...................................... 15
PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 17
3.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 17
3.1.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 17
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................... 17
3.1.3. Thiết bị và hố chất ......................................................................................... 17
3.1.4. Mơi trường sử dụng trong nghiên cứu ........................................................... 18

iii


3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 18
3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm phổ rộng của chủng vi khuẩn VK5 ................ 18
3.2.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng dịch nuôi cấy vi khuẩn đến sự phát triển hệ
sợi của nấm bệnh ........................................................................................................... 19

3.2.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng dịch nuôi cấy vi khuẩn đến tỷ lệ nảy mầm
bào tử của nấm bệnh ...................................................................................................... 20
3.2.4. Phương pháp tách chiết DNA ......................................................................... 21
3.2.5. Phương pháp chạy điện di trên gel Agarose ................................................... 22
3.2.6. Kỹ thuật PCR .................................................................................................. 23
3.2.7. Xây dựng cây phân loài................................................................................... 23
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 24
4.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm phổ rộng của vi khuẩn .............................. 24
4.2. Kết quả ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn VK5 đến sự phát triển hệ sợi của
nấm C. musae ................................................................................................................ 26
4.3. Kết quả ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn VK5 đến tỷ lệ nảy mầm của nấm
C. musae ........................................................................................................................ 29
4.4. Định danh chủng vi khuẩn VK5 ............................................................................. 32
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 35
5.1. Kết luận................................................................................................................... 35
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 36
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 43

iv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Diễn giải chữ viết tắt

CLF

Bệnh rụng lá Corynespora

cs.

Cộng sự

CT

Công thức

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Axit

LB

Lysogeny Broth

MT

Mơi trường

PDA

Potato Dextrose Agar

PSA

Potato Sugar Agar

TAE

Tris-Acetate-EDTA

TN

Thí nghiệm

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn VK5 với một số chủng nấm
phổ biến gây bệnh trên chuối .............................................................................. 25
Bảng 2. Ảnh hưởng của dịch lọc vi khuẩn VK5 đến sự sinh trưởng, phát triển
tản nấm C. musae ................................................................................................ 27
Bảng 3. Khả năng nảy mầm của nấm C. musae.................................................. 29

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1. Các bộ phận chuối bị nhiễm bệnh thán thư .......................................... 3

Hình 2. 2. Hình thái khuẩn lạc và bào tử chủng VK5 ......................................... 14

Hình 4. 1. Khả năng kháng một số chủng nấm của chủng vi khuẩn VK5 trên
môi trường PDA sau 07 ngày nuôi cấy ............................................................... 24
Hình 4. 2. Ảnh hưởng của dịch lọc vi khuẩn VK5 đến sự sinh trưởng, phát triển
tản nấm C. musae sau 168h ni cấy .................................................................. 26
Hình 4. 3. Hình ảnh độ phóng đại 40x hệ sợi nấm Colletotrichum musae ngày
thứ 7 ở mẫu đối chứng và mẫu xử lý với dịch lọc VK5 ..................................... 28
Hình 4. 4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy VK5 đến sự nảy mầm bào tử nấm
Colletotrichum musae ......................................................................................... 30
Hình 4. 5. Hình ảnh độ phóng đại 400 lần của bào tử C. musae ban đầu và nảy
mầm ở mẫu đối chứng và mẫu xử lý với dịch lọc VK5 ...................................... 31
Hình 4. 6. Kết quả điện di DNA tổng số và sản phẩm PCR của VK5 ................ 33
Hình 4. 7. Cây phân loại của chủng VK5 ........................................................... 34

vii


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đề tài đã khảo sát khả năng đối kháng nấm phổ rộng của vi khuẩn VK5 trên
04 chủng nấm bệnh phân lập từ các bộ phận nhiễm bệnh trên chuối. Kết quả chủng
VK5 có khả năng đối kháng đồng thời 04 chủng nấm bệnh, tỷ lệ đối kháng trên
04 chủng nấm đều đạt trên 50%.
Các thử nghiệm đối với dịch nuôi cấy chủng VK5 cho thấy, dịch ni cấy
chủng VK5 có hiệu quả ức chế sự phát triển hệ sợi và tỷ lệ nảy mầm bào tử của
C. musae. Dịch nuôi cấy chủng VK5 ở tỷ lệ 1:10 tác động tới đường kính tản nấm,
tỷ lệ đối kháng là 59,57 ± 2,1%; ngày thứ 7 quan sát dưới kính hiển vi độ phóng
đại 400 lần, các sợi nấm quăn rụt teo lại, ít phân nhánh, thành tế bào sợi mỏng,
không phát triển cuống sinh bào tử, ngày thứ 7 nhiều sợi nấm bị đứt gãy. Dịch
nuôi cấy chủng VK5 ở nồng độ dịch 100% ức chế sự nảy mầm bào tử, tỷ lệ ức

chế là 89,80% so với mẫu đối chứng; hình thái bào tử nấm bị biến dạng so với
bào tử trong mẫu đối chứng.
Kết quả định danh chủng vi khuẩn VK5 có quan hệ gần gũi với chủng
Paenibacillus polymyxa (còn được gọi là Bacillus polymyxa) dựa trên phân tích
trình tự 16S rDNA.

viii


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chuối tên khoa học là Musa spp., chủ yếu thuộc họ Musaceae. Chuối có
nguồn gốc từ khu vực Đông Nam Á và vùng ven Thái Bình Dương, được trồng
tại khoảng 150 quốc gia ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với diện tích trên 12
triệu ha, sản lượng xấp xỉ 163 triệu tấn/ năm (Theo FAO, 2020). Tại Việt Nam,
chuối là một trong số ít cây ăn quả có khả năng phát triển thành những vùng sản
xuất tập trung quy mô tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung bộ và Đồng
bằng sơng Cửu Long. Năm 2021, Việt Nam có diện tích canh tác chuối đạt 155,3
nghìn ha (Theo số liệu báo cáo của Tổng cục thống kê Việt Nam, 2021).
Trong những năm gần đây, sản lượng chuối của Việt Nam không ngừng tăng
lên. Tuy nhiên, năng suất chuối nước ta còn rất thấp so với nhiều nước trồng chuối
xuất khẩu trên thế giới. Nguyên nhân là do điều kiện đất đai, kỹ thuật canh tác và
sự phá hại của sâu bệnh. Trong số đó, bệnh hại do nấm bệnh gây ra trên chuối như
bệnh héo vàng, thán thư, bạc lá, rụng lá đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng.
Đặc biệt, bệnh thán thư do nấm Colletotrichum musae gây ra được coi là bệnh
gây hại nghiêm trọng nhất đối với chuối ở các nước nhiệt đới trên thế giới
(Maqbool & cs., 2011a, 2011b).
Để hạn chế bệnh hại, một số biện pháp canh tác, hoá học và sinh học được
nghiên cứu và áp dụng. Tuy nhiên, ngày nay, các biện pháp sinh học được xem là
giải pháp tối ưu, an toàn và bền vững. Trong đó, vi khuẩn là đối tượng được ưu

tiên nghiên cứu và phát triển chế phẩm sinh học phịng trừ bệnh hại cây trồng vì
khả năng kháng nấm gây bệnh tối ưu. Vì vậy, việc phân lập, chọn lọc ra chủng vi
khuẩn có khả năng đối kháng nấm phổ rộng từ đó tạo ra chế phẩm sinh học có
hiệu quả rộng rãi là vấn đề cần thiết nghiên cứu. Chủng vi khuẩn VK5 được phân
lập từ mẫu đất thu thập tại vườn chuối ở Hưng Yên, đã được chứng minh có hiệu
lực đối kháng 77,41% với nấm C. musae sau 07 ngày đồng nuôi cấy. Chủng vi
khuẩn VK5 cịn có khả năng sinh các enzyme ngoại bào như cellulase, chitinase,
amylase, và protease đồng thời có khả năng khử nitrate (NO3-) trong môi trường
1


thành nitrit (NO2-), khả năng sinh acetoin, khả năng tạo và duy trì acid trong q
trình lên men glucose. Có thể thấy chủng vi khuẩn VK5 là đối tượng nghiên cứu
tiềm năng trong phòng trừ các nấm bệnh khác gây ra trên cây chuối. Tuy nhiên,
những nghiên cứu thực hiện trên chủng vi khuẩn VK5 nhằm cung cấp cơ sở cho
sản xuất chế phẩm sinh học cịn rất ít..
Nhằm tiếp tục đóng góp vào hướng nghiên cứu tiềm năng này, tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định danh và đặc tính đối kháng của chủng vi
khuẩn VK5 với một số chủng nấm gây bệnh trên chuối”. Kết quả nghiên cứu sẽ
cung cấp kết quả định danh, khả năng kháng nấm phổ rộng trên các chủng nấm
bệnh chuối khác nhau và ảnh hưởng đến sự phát triển, sinh trưởng của hệ sợi và
bào tử nấm C. musae của dịch ni cấy chủng vi khuẩn VK5. Từ đó tạo cơ sở cho
việc tạo ra chế phẩm sinh học hiệu quả, nâng cao năng suất chuối, mang lại nguồn
lợi kinh tế cho người dân trồng chuối.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu đặc tính đối kháng của chủng vi khuẩn VK5 với một số chủng
nấm gây bệnh trên chuối và ảnh hưởng của dịch nuôi cấy VK5 đến sự phát triển
của nấm C. musae ở điều kiện in vitro
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định khả năng kháng nấm phổ rộng của chủng VK5 đối với 4 chủng

nấm bệnh chuối bằng phương pháp đồng nuôi cấy
- Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy VK5 đến sự phát triển hệ sợi nấm
C. musae trên môi trường PDA
- Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy VK5 đến sự nảy mầm bào tử nấm
C. musae.
- Định danh chủng VK5.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về một số bệnh hại do nấm bệnh gây ra trên chuối và một số
cây trồng
2.1.1. Tổng quan về bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides

(Nguồn: />
Hình 2. 1. Các bộ phận chuối bị nhiễm bệnh thán thư
 Lịch sử phát hiện bệnh và nghiên cứu
Chuối dễ bị mắc một số bệnh dẫn đến những tổn thất lớn sau thu hoạch, nhất
là trong quá trình vận chuyển và lưu trữ. Bệnh thán thư đã trở thành một vấn đề
nghiêm trọng khi chuối được vận chuyển dưới dạng kín trong một thời gian dài
và chín dưới nhiệt độ cao. Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh hại trên lá,
thân và quả, bộ phận nhiễm bệnh có các vết bệnh màu nâu nhạt đến đậm, hình hơi
trịn hoặc khơng định hình, bệnh làm rụng hoa, lá, quả. Bệnh nặng có thể gây chết
ngọn cây.
Lần đầu tiên tên C. gloeosporioides được đề xuất ở Penzig (1882) với tên
gọi Vermicularia gloeosporioides được thu thập từ Citrus (cây họ Cam Quýt) ở
Ý (Theo Penz. & Sacc., 1884). Tiếp nối phát hiện này đã có rất nhiều cơng trình
nghiên cứu phát hiện nấm C.gloeosporioides gây bệnh thán thư trên các cây trồng
khác nhau, tại các vùng khác nhau trên thế giới được công bố. Theo Riera & cs.

(2019) đã báo cáo lần đầu về bệnh thán thư trên chuối do nấm C. gloeosporioides

3


gây ra ở Ecuador. Intan Sakinah & cs. (2013) đã công bố ở Malaysia, nấm C.
gloeosporioides gây bệnh thán thư trên một số giống chuối như Mas, Berangan,
Awak, Nangka, và Rastali ở các bang Perak và Penang của Malaysia trong khoảng
thời gian từ tháng 8 đến tháng 10 năm 2011. Khoảng 80% quả bị nhiễm bệnh với
các triệu chứng ban đầu đặc trưng là màu nâu đến đen, các đốm sau đó trở thành
các vết lõm với các khối bào tử màu da cam hoặc màu cá hồi. Ở Parkistan, năm
2018, khoảng 25% quả chuối thu được từ các đồn điền khác nhau đã bị nhiễm
bệnh. Các triệu chứng được nêu ra tương tự như chuối ở Ecuador và Malaysia
(Alam, Muhammad Waqar & cs., 2021). Các kiểu hình thái của C.
gloeosporioides được nghiên cứu tại Parkistan cho biết đầu tiên khuẩn lạc xuất
hiện với sợi nấm màu trắng và sau đó chuyển sang màu xám đen sau ni cấy ở
270C trong 5 ngày với chu kỳ 12 giờ sáng và 12 giờ tối. Bào tử sinh ra trong
acervuli (cuống sinh bào tử) có hình trịn, hyalin (dạng trong như thủy tinh), thẳng
và vách nhẵn, với cả hai đầu tròn rộng. Bào tử được đo 14,0 ± 0,5 × 33,4 ± 0,6
µm, conidiomata có màu nâu sẫm và hình cầu. Appresoria (tế bào chuyên biệt)
của C. gloeosporioides chỉ được hình thành từ sợi nấm, khác với C. musae,
appresoria có thể nảy mầm từ sợi nấm và cũng trực tiếp từ ống mầm (Theo
Zakaria, Latiffah & cs., 2009). Brown & cs. (1998) đã công bố C. gloeosporioides
nằm trong số các endophytes (vi sinh vật nội sinh) trội được phân lập từ chuối ở
Hồng Kông mặc dù C. gloeosporioides là nguyên nhân gây bệnh thán thư và đốm
lá trên chuối. Tuy nhiên, C. gloeosporioides nội sinh từ chuối dại không gây ra
bệnh đốm lá trên lá chuối in vitro (Photita & cs., 2004).
 Mức độ lây lan và ảnh hưởng của bệnh tới kinh tế - xã hội.
Sự xâm nhiễm bệnh thán thư trên chuối thường bắt đầu trong quá trình phát
triển nhưng chưa biểu hiện triệu chứng rõ rệt cho đến khi trái chín vì khi ở giai

đoạn chín, appressoria (được hình thành ở giai đoạn chuối non) nảy mầm và hình
thành sợi nấm gây nhiễm bệnh, dẫn đến sự phát triển của bệnh thán thư. Điều kiện
ẩm ướt và ấm là điều kiện bệnh thán thư dễ bùng phát. Các triệu chứng thường
biểu hiện trong quá trình bảo quản sau thu hoạch và tiếp thị. Bệnh thán thư trở
4


nên trầm trọng khi quả chuối bị thương do trầy xước trong quá trình xử lý và vận
chuyển tiêu thụ, khiến chất lượng và giá trị dinh dưỡng của chuối suy giảm dẫn
đến các sản phẩm khơng thích hợp cho tiếp thị và tiêu thụ.
Những thiệt hại nặng nề do bệnh thán thư gây ra không những làm thiếu hụt
nguồn cung ứng chuối trên thị trường mà còn làm giảm nguồn thu nhập và ảnh
hưởng tới cuộc sống của người nông dân trồng cây ăn quả và thương nhân kinh
doanh trái cây trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
 Tổng quan về nấm Colletotrichum gloeosporioides
Colletotrichum
Phyllachoraceae,

gloeosporioides

Bộ:

Phyllachorales,

thuộc
Lớp:

Chi:

Colletotrichum,

Sordariomycetes,

Họ:

Ngành:

Ascomycota, Giới: Nấm.
Chu kỳ sống của mầm bệnh này bắt đầu từ sự nảy mầm của bào tử trên bề
mặt thực vật để tạo thành các cấu trúc xâm nhiễm melanin hoá, được gọi là
appressoria, sau đó là sự xâm nhập vào mơ chủ. Tại các điểm xâm nhiễm, các sợi
nấm dày được sinh ra từ các tế bào bị nhiễm trùng sơ cấp, giai đoạn này được gọi
là giai đoạn sinh biotrophic. Sau đó, nấm đột ngột chuyển sang giai đoạn hoại tử,
được đặc trưng bởi sự hình thành của các sợi nấm thứ cấp mỏng, có nguồn gốc từ
các sợi nấm sơ cấp. Sợi nấm thứ cấp bắt đầu xâm nhập vào các tế bào gần đó, dẫn
đến sự phát triển của các tổn thương nhìn thấy được ở vị trí nhiễm trùng. Cuối
cùng các bào tử được hình thành trên bề mặt của mô bị nhiễm bệnh và chúng được
phát tán bởi cơn trùng, khơng khí và dịng nước để bắt đầu một chu kỳ lây nhiễm.
Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng sợi nấm là 25 - 28oC. Tuy nhiên, sự tăng trưởng
của sợi nấm không bị ức chế nhiều ngay cả ở 35oC. Độ pH tối ưu cho sự tăng
trưởng sợi nấm là pH 5,8 - 6,5. Các dòng phân lập của C. gloeosporioides đều
phát triển tốt khi chúng tiếp xúc với chu kỳ bóng tối 12 giờ xen kẽ ánh sáng 12
giờ (M. Sharma & S. Kulshrestha, 2015).
C. gloeosporioides được ghi nhận là nấm hoại sinh trong nhiều nghiên cứu:
Nghiên cứu về sự lây nhiễm hoại sinh của nấm trên chanh, musambi và quả cam
được nghiên cứu bởi Agrawal & cs., 1979. C.gloeosporioide được báo cáo là bệnh
5


hại sau thu hoạch ở xoài bởi K. Prabakar & cs. (2005). Tương tự, các nghiên cứu

về C. gloeosporioides là mầm bệnh sau thu hoạch của đu đủ đã được thực hiện
bởi Rathod & Gulab (2010).
C. gloeosporioides đồng thời cũng là nấm nội sinh: Các nghiên cứu đã cho
thấy C. gloeosporioides như một nấm nội sinh với thực vật. Những phát hiện này
đã tạo ra một sự quan tâm đáng kể và sự tò mò của các nhà nghiên cứu trong cộng
đồng khoa học toàn cầu để nghiên cứu sự liên kết của C. gloeosporioides với thực
vật và khám phá ra các giả thuyết về các hợp chất có hoạt tính sinh học có tầm
quan trọng về mặt kinh tế như: Piperine được sản xuất bởi nấm C. gloeosporioides
được phân lập từ hồ tiêu (S. Chithra & cs., 2014), Phillyrin được sản xuất bởi C.
gloeosporioides được phân lập từ cây liên kiều (Zhang & cs., 2012).
 Các phương pháp giảm thiểu tác hại của bệnh thán thư trên chuối
Có rất nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng nhằm giảm thiểu
tác hại của bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides gây ra trên chuối và các loại
thực vật khác.
Các biện pháp sinh học đã và đang được nghiên cứu để áp dụng thực tế trong
chống lại mầm bệnh nấm C. gloeosporioides như sử dụng chiết xuất thực vật:
chiết xuất của tỏi, gừng (Nguyễn Thỵ Đan Huyền & Lê Thanh Long, 2019); chiết
xuất Ethanol của quả Sapindus saponaria L. (Gasca, Cristian Aldemar & cs.,
2020). Hay sử dụng những chủng vi khuẩn thuộc Bacillus siamensis (Nguyễn
Kim Nữ Thảo & cs., 2022), Pseudomonas (Trương Chí Hiền & Lê Thanh Tồn,
2020) được phân lập, tuyển chọn nghiên cứu khả năng đối kháng tốt với nấm C.
gloeosporioides. Ngồi ra, có thể sử dụng Chitosan hay chế phẩm oligochitosan nano silica (SiO2) để kiểm soát sinh học mầm bệnh C. gloeosporioides trên các
loại thực vật (Lê Nguyễn Đoan Duy & cs., 2014).
Các biện pháp canh tác và hóa học cũng đang được áp dụng như:
- Sử dụng giống chống chịu với bệnh. Nấm C.gloeosporioides là tác nhân
gây bệnh có tính cơ hội. Do đó, việc tránh tổn thương cho cây có tầm quan trọng
đặc biệt
6

- Theo dõi vườn, khi thời tiết ấm và ẩm cần tiến hành phun thuốc: Bavistin
50 FL nồng độ 0,1%; Benlate 50 WP 0,1%. Lượng nước thuốc cần phun khoảng
600 - 800 l/ha.
2.1.2. Tổng quan về bệnh héo Panama do Fusarium oxysporum f. sp cubense
 Lịch sử phát hiện bệnh và nghiên cứu
Năm 1874, bệnh héo Fusarium (bệnh héo Panama) của chuối được Tiến sĩ
Joseph Bancroft phát hiện lần đầu tiên tại Eagle Farm gần Brisbane (Úc). Năm
1992, bệnh héo Fusarium được phát hiện ở 10 trên 153 đồn điền Cavendish (chuối
tiêu) tại Carnarvon ở Tây Úc. Phát hiện sự có mặt của chủng 1 và các điều kiện
mơi trường bất lợi (lũ lụt và hạn hán) có liên quan đến sự bùng phát dịch
bệnh. Năm 1997, một đợt bùng phát bệnh héo Fusarium đã xảy ra trên chuối tiêu
ở phía Bắc nước Úc. Đây là phát hiện đầu tiên về chủng nhiệt đới 4 (TR4) ở
Úc. Vào tháng 3 năm 2015, TR4 đã được phát hiện tại khu vực sản xuất chuối lớn
của Úc gần Tully ở Bắc Queensland (Kenneth G. Pegg & cs., 2019).
 Mức độ lây lan của bệnh và ảnh hưởng của bệnh tới kinh tế - xã hội
Dịch bệnh thường bắt đầu bằng một hoặc một vài cây bị ảnh hưởng. Sự lây
lan từ cây này sang cây khác diễn ra chủ yếu bằng các rễ chồng lên nhau của thảm
liên kết (lan truyền tích cực), trong khi các trung tâm lây nhiễm mới là kết quả
của sự phát tán thụ động của chủng. Trồng trọt thâm canh, vận chuyển, việc áp
dụng chưa đúng các quy trình vệ sinh trang trại cơ bản và (có lẽ quan trọng nhất)
việc tưới cây thường xuyên từ nguồn nước bị ô nhiễm, sẽ tạo điều kiện thuận lợi
cho sự phát triển của ổ bệnh mới và đẩy nhanh dịch bệnh. Khi bệnh đã có mặt
trong một thời gian dài và mức độ lây nhiễm đã tăng lên thì các cây trong trang
trại chuối sẽ trở nên lùn hoặc cịi cọc. Nấm có thể gây bệnh ở mức độ cấy ban đầu
rất thấp vì cây chuối vẫn tồn tại trong đất nhiều năm và rễ được tìm thấy thơng
qua một khối lượng lớn đất, xác suất những rễ này sẽ tiếp xúc với rễ của các cây
trồng khác có trong đất là rất cao. Vì vậy, nên hạn chế trồng chuối ở những khu
vực đã xuất hiện triệu chứng bệnh trên chuối. (Kenneth G. Pegg & cs., 2019).

7

Bệnh Panama ở chuối vẫn đang diễn ra và gây nhiều hậu quả nghiêm trọng
đối với kinh tế và xã hội trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Ở Philippines, Foc đã có mặt từ năm 1970, nhưng TR4 đã được phát hiện
vào năm 2006. Sau đó, một hecta rừng trồng chuối ở đây đã bị nông dân bỏ hoang
vì Foc TR4, dẫn đến mất 3 tỷ đơ la hàng năm và khoảng 66.000 gia đình mất đi
nguồn thu nhập. Ấn Độ là nước sản xuất chuối lớn nhất thế giới, Foc TR4 đã được
tìm thấy lần đầu tiên tại Ấn Độ vào năm 2015 ở tỉnh Bihar, sau đó được phát hiện
ở các tỉnh Uttar Pradesh, Madhya Pradesh và Gujarat, trên bờ biển phía tây. Người
ta ước tính rằng Foc TR4 có thể gây thiệt hại khoảng 7 tỷ đô la Mỹ cho ngành
công nghiệp chuối của đất nước này (Giovanni Bubici & cs., 2019).
Ở Việt Nam, chuối được trồng hầu hết tất cả các địa phương, từ quy mô nhỏ
tới lớn. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, do ảnh hưởng của dịch bệnh Panama
trên chuối nên sản lượng chuối ngày càng giảm dẫn đên không đủ lượng chuối để
cung cấp cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Do vậy nên thu nhập từ việc trồng
chuối ngày càng giảm dẫn tới thua lỗ, đời sống của bà con nơng dân trồng chuối
ngày càng khó khăn.
 Tổng quan về nấm Fusarium oxysporum f.sp. cubense
Fusarium oxysporum f.sp. cubense thuộc loài Fusarium oxysporum, chi
Fusarium, họ Nectriaceae, bộ Hypocreales, lớp Sordariomycetes, ngành
Ascomycota, giới Nấm.
Fusarium oxysporum f.sp.cubense (Foc) được báo cáo là tác nhân gây bệnh,
bắt đầu lây nhiễm từ rễ và bó mạch rồi lan đến các mơ trên, gây tắc nghẽn mạch
xylem và cuối cùng dẫn đến khô héo toàn bộ cây trồng (WU Kai-li & cs., 2019).
Cụ thể, theo Andrew Chen & cs., 2019, Foc xâm nhập vào vật chủ thực vật qua
rễ. Khi vào bên trong, nó xâm nhập vào thân rễ và đi lên mơ phân sinh, nơi nó
chặn các mạch xylem dẫn nước và do đó ngăn cản sự vận chuyển nước và chất
dinh dưỡng đến các bộ phận trên không của cây.
Các triệu chứng bên ngoài của bệnh héo Fusarium bắt đầu bằng việc các lá

già bị vàng và héo rồi tiến triển đến các lá non cho đến khi cây chết. Bên trong,
8


cây có biểu hiện đổi màu nâu và hoại tử các mạch xylem ở thân rễ và thân. Tỷ lệ
bệnh thay đổi tùy thuộc vào giống cây trồng, môi trường nhưng có thể kéo dài đến
mất mùa tồn bộ ở những ruộng bị nhiễm nặng. Foc là một mầm bệnh truyền qua
đất, tạo ra bào tử hậu (chlamydospores) cho phép nó tồn tại trong đất khi khơng
có vật chủ. Foc cũng được biết tới khi tồn tại trên ký chủ cỏ dại một cách không
gây bệnh. Một khi đất bị nhiễm nấm Foc, nó thường trở nên khơng thích hợp để
trồng lại trong nhiều năm sau đó. Hơn nữa, bệnh héo Fusarium khơng thể được
kiểm sốt bằng thuốc diệt nấm.
Fusarium oxysporum f.sp. cubense được phân thành bốn chủng (race), dựa
trên phạm vi các giống cây trồng mà chúng gây bệnh, nhưng có ít nhất 24 nhóm
tương thích thực vật (VCG) trong các chủng khác nhau. Ba chủng chính ảnh
hưởng đến chuối ăn bao gồm: Foc Race 1 gây bệnh trên giống cây trồng Michel
Michel cũng như Lady Finger; Foc Race 2, ảnh hưởng đến các giống cây trồng
giống như Race 1 và cả giống Bluggoe; và Race 4, gây bệnh trên hầu hết các giống
cây trồng bao gồm Cavendish. Race 3 ban đầu được mô tả là một chủng lây
nhiễm Musa nhưng từ đó được ghi nhận là chỉ lây nhiễm trên giống chuối
Heliconia. Ban đầu, chủng 4 chỉ được biết là ảnh hưởng đến các giống Cavendish
ở các khu vực cận nhiệt đới, ở những nơi nhiệt độ tương đối mát hơn được cho là
làm tăng tính nhạy cảm của Cavendish. Tuy nhiên, đến đầu những năm 1990, các
giống cây Cavendish ở các khu vực nhiệt đới ở Đông Nam Á đã bắt đầu chống lại
bệnh héo Fusarium, và do đó đã phát hiện ra một chủng nhiệt đới 4 của Foc. Kể
từ đó, các VCG khác nhau đã được sử dụng để phân biệt giữa chủng cận nhiệt đới
4 (STR4) (VCGs 0120,0129,01211 và 01215) và chủng nhiệt đới 4 (TR4) (VCG
01213-01216), (Noeleen M. Warman và Elizabeth AB Aitken, 2018). Fusarium
oxysporum có 3 loại bào tử riêng biệt bao gồm: tiểu bào tử (microconidia), bào tử
đại (macroconidia) và bào tử hậu (chlamydospores), mỗi loại bào tử đều được

chuyên môn hóa cao tương ứng với vai trị của chúng trong chu trình lây nhiễm
(Whan & cs., 2008).

9


 Các phương pháp giảm thiểu tác hại của bệnh Panama trên chuối.
Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp được đưa ra để giảm thiểu tác hại của
bệnh Panama do Fusarium oxysporum f. sp cubense gây ra.
Đầu tiên một số biện pháp canh tác cần được lưu ý và áp dụng như:
- Mật độ trồng hợp lý.
- Chăm bón đầy đủ.
- Loại bỏ các bộ phận mục nát và cỏ dại của các lồi khơng trồng trọt để
giảm các điều kiện ẩm ướt thuận lợi cho nhiễm nấm.
- Sử dụng loại chuối sạch bệnh: chuối ni cấy mơ.
Kiểm sốt dịch bệnh theo hướng sinh học đã được đề xuất bởi Chao Xue &
cs. năm 2015 để ngăn chặn bệnh Panama. Bacillus được xác định là nhóm vi
khuẩn chiếm ưu thế trong đất ức chế. Một loại phân hữu cơ sinh học (BIO), được
bào chế bằng cách kết hợp chủng B. amyloliquefaciens NJN-6 phân lập từ đất với
phân hữu cơ, đã cho kết quả giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh tới 68,5%.
Khử trùng đất sinh học (BSD): Các thí nghiệm thực địa đã chỉ ra rằng bệnh
héo do Fusarium gây ra trên chuối có thể giảm tới 82% trong đất ngập nước kết
hợp với rơm rạ 0,5%. Ngoài ra, một số vi khuẩn (ví dụ, Clostridium spp.) sản xuất
axit hữu cơ độc cho Foc (axit axetic, butyric, isovaleric và propionic) đã được tìm
thấy nhiều hơn sau BSD (Giovanni Bubici & cs., 2019).
Kết hợp Fe (sắt) và B (boron) khử héo ở chuối: Để nghiên cứu hiệu ứng dinh
dưỡng khoáng, các thí nghiệm thủy canh đã được tiến hành trong nhà kính với sự
kết hợp của nồng độ sắt thấp, trung bình và cao Fe và B, sau đó là cấy mầm bệnh.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng Fe và B đóng vai trị đa chức năng trong việc giảm
mức độ nghiêm trọng của bệnh bằng cách ảnh hưởng đến sự phát triển của F.

oxysporum và các phản ứng giữa thực vật và mầm bệnh (Xian Dong & cs., 2016).
Ngồi các phương pháp trên thì phương pháp sử dụng giống kháng cũng
được quan tâm. Sử dụng giống chuối Cavendish chuyển gen chống lại chủng Foc
TR4 (James Dale & cs., 2017).

10


2.2.3. Tổng quan về bệnh đốm lá do nấm Alternaria alternata
Nấm Alternaria alternata là một mầm bệnh phổ biến trên nhiều loại cây quan
trọng về kinh tế, bao gồm táo, bông cải xanh, súp lơ, khoai tây, cà chua, chuối,…
được phát hiện lần đầu vào năm 1912 (Encinas-Basurto, David & cs., 2017). Bệnh
hại do nấm A. alternata gây ra trên lá và quả tạo thành những đốm trịn có màu
nâu đỏ, bệnh nặng làm rách lá và thối, rụng quả.
Từ những năm 80, các nhà khoa học đã có các báo cáo về A. alternata gây
bệnh trên cây lục bình (K. R. Aneja & Singh Kulvinder, 1989). Trong những năm
gần đây, các nghiên cứu về bệnh hại do nấm A. alternata trên các loại cây trồng
tại các vùng khác nhau vẫn ln được quan tâm: ví dụ như bệnh mốc sương trên
cây hồ trăn ở Úc (G. J. Ash, & V. M. Lanoiselet, 2001), bệnh cháy bìa lá của
Gloriosa superba L. (hoa ly lửa) ở Ấn Độ (Maiti, Chandan Kumar & cs., 2007),
bệnh cháy lá khoai tây ở Nam Phi (Van der Waals, E. Jacquie & cs., 2011), bệnh
bạc lá Alternaria trên chuối ở Hoa Kỳ (V. Parkunan & cs., 2013) và chuối lùn
Trung Quốc ở Trung Quốc (B. Z. Fu & cs., 2014).
Trong báo cáo về bệnh đốm lá Alternaria trên chuối ở Hoa Kỳ (V. Parkunan
& cs., 2013) và chuối lùn Trung Quốc ở Trung Quốc (B. Z. Fu & cs., 2014). Tỷ
lệ nhiễm bệnh được báo cáo dựa trên 07 giống cây chuối (African Red, Blue
Torres Island, Cacambou, Chinese Cavendish, Novaria, Raja Puri, and Veinte
Cohol) trồng trên đảo Đảo Blue Torres là 10% và 63% tại Novaria; đối với giống
chuối lùn Trung Quốc trồng tại Côn Minh, tỉnh Vân Nam, tỷ lệ nhiễm bệnh là
22%. Với những tỷ lệ nhiễm bệnh ở mức cao đồng thời có khả năng gây nhiều

bệnh hại trên nhiều loài thực vật, nấm A. alternata gây ảnh hưởng lớn đến năng
suất và chất lượng của nhiều loại cây.
Trong hai nghiên cứu trên, triệu chứng của bệnh đã được nêu ra: Trên bề mặt
của lá xuất hiện các đốm màu nâu nhạt đến đậm, hình bầu dục nhỏ (dài 0,5 đến
1,0 mm và rộng 0,3 đến 0,9 mm). Các đốm tập trung dọc theo gân chính hơn phần
cịn lại của lá và xuất hiện trên tất cả trừ các lá mới mọc. Phân lập từ các mẫu lá
bệnh, cho thấy các khuẩn lạc của sợi nấm từ trắng đến xám đen hình thành trên
11


PSA có màu đen ở mặt dưới, màu xám đen trên PDA. Bào tử của mẫu bệnh ở Hoa
Kỳ có chiều dài từ 23 đến 73 μm và rộng từ 15 đến 35 μm, với chiều dài mỏ từ 5
đến 10 μm, và có 3 đến 6 vách ngăn ngang và 0 đến 5 vách ngăn dọc. Bào tử của
nấm bệnh chuối lùn Trung Quốc dài 5,26 đến 30,26 μm và rộng 3,95 đến 15,79
μm, trung bình 10,21 (± 3,17) × 20,02 (± 5,75) μm (n= 50), với chiều dài mỏ từ 0
đến 7,89 μm, và có 3 đến 8 vách ngăn ngang và 0 đến 3 vách ngăn dọc.
Một số biện pháp giảm thiểu các bệnh trên thực vật do nấm A. alternata:
- Biện pháp canh tác:
+ Thu dọn, khử trùng, thường xuyên vệ sinh sạch sẽ khu vực đất trồng;
+ Bố trí mật độ trồng thích hợp;
+ Áp dụng kỹ thuật cắt tỉa, tưới, tiêu nước, bón phân, làm cỏ.
- Biện pháp sinh học: Sử dụng chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật đối
kháng như nấm Trichoderma, xạ khuẩn Steptomyces, vi khuẩn Bacillus, thảo mộc
trừ tuyến trùng chứa các hoạt chất Saponin, Ankaloid, nấm ký sinh cơn trùng
Metarhizium… và các vi sinh vật có ích khác để phòng trừ nấm và tuyến trùng
gây hại trong đất. Ngoài ra các các chiết xuất từ thực vật như dịch chiết tỏi, ớt có
khả năng hạn chế sự nảy mầm của nấm A. alternata đã được nghiên cứu, tuy nhiên
hiệu quả đem lại chưa cao (Lima, Cristina Batista de & cs., 2016).
- Biện pháp hoá học:
+ Khi bệnh mới chớm xuất hiện, sử dụng luân phiên thuốc có các hoạt chất

như Tebuconazole, Mancozeb, Propineb, Metalaxyl,…để phòng trừ.
+ Phun khi cây ra chồi mới hoặc vào đầu mùa mưa, bệnh nặng, cần phun lại
lần 2 cách lần 1 khoảng 7 - 10 ngày. Tưới, sục gốc, hoặc quét các loai thuốc có
hoạt chất như Phosphonate, Fosetyl Aluminium, Mancozeb, Metalaxyl,…(Theo
Cục Bảo vệ Thực vật).
2.2.4. Tổng quan về bệnh trên lá do nấm Corynespora cassiicola
Corynespora cassiicola (Berk & Curt)Wei là một loại nấm Ascomycetes gây
bệnh trên nhiều loại thực vật, chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới
hoặc nhà kính.
12


Trên cây cao su, C. cassiicola gây bệnh rụng lá Corynespora (CLF) gây ra
các vết bệnh hoại tử trên lá và rụng lá hàng loạt ở các giống mẫn cảm. CLF lần
đầu tiên được quan sát thấy ở Sierra Leone (Deighton, 1936). Ban đầu chỉ giới
hạn trong vườn ươm, CLF được coi là mối đe dọa đối với canh tác cao su sau một
đợt bùng phát nghiêm trọng ở Sri Lanka vào cuối những năm 1980, dẫn đến việc
nhổ bỏ hơn 4.000 ha của giống cao su RRIC103 rất dễ bị nhiễm bệnh (Liyanage
& cs., 1986). Kể từ đó, CLF đã dần dần lan rộng ra hầu hết các khu vực sản xuất
cao su ở châu Á và châu Phi, làm giảm năng suất sản xuất cao su tự nhiên (Lopez,
David & cs., 2018).
Corynespora là một chi đa ngành trong bộ Pleosporale, chủ yếu bao gồm
các mầm bệnh thực vật. C. cassiicola hình thành với Corynespora smithi - một họ
cụ thể trong Pleosporales (Schoch & cs., 2009).
Bệnh Corynespora gây ra nặng hơn trong thời kỳ tái sinh lá, từ tháng 12 đến
tháng 4 (Reshma & cs., 2016). Mặc dù nó ảnh hưởng đến lá của tất cả các giai
đoạn, nhưng lá non ở giai đoạn xanh nhạt dường như dễ bị nhiễm bệnh nhất. Một
trong những tính năng độc đáo của mầm bệnh này là tạo ra các loại triệu chứng
khác nhau tùy thuộc vào loại vơ tính và trạng thái trưởng thành của cây. Sự đa
dạng của các triệu chứng là một yếu tố hạn chế nghiêm trọng đối với việc chẩn

đốn và xử trí sớm.
Tuy nhiên, các tổn thương hình trịn có kích thước khác nhau với tâm mỏng,
rìa nâu và quầng vàng là triệu chứng phổ biến nhất (Manju, 2011). Vùng trung
tâm vết thương có thể bị phân rã, để lại các lỗ thủng. Nhiệt độ và độ ẩm cao trong
thời kỳ tái sinh lá tạo điều kiện cho tỷ lệ mắc bệnh (Manju & cs., 2016).
Corynespora cassiicola cũng đã được tìm thấy trên lá chuối ở các vùng trồng
chuối Vân Nam, Trung Quốc, C. cassiicola gây bệnh đốm lá Corynespora trên
chuối đã được nghiên cứu để làm cơ sở cho việc kiểm sốt tồn diện bệnh (Fan
HuaCai & cs., 2018).

13


2.2. Tổng quan về chủng vi khuẩn VK5
2.2.1. Nguồn gốc phân lập, đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh lý, sinh
hóa của chủng vi khuẩn VK5
Chủng vi khuẩn VK5 được phân lập từ mẫu đất ở vườn chuối tại địa bàn Yên
Linh, Dân Tiến, Khoái Châu, Hưng Yên.
Với mục đích tìm ra chủng vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh thán thư trên
cây chuối, nghiên cứu trước đó đã phân lập và sàng lọc được chủng vi khuẩn VK5
có khả năng đối kháng nấm C. musae gây bệnh thán thư trên chuối trên môi trường
LB, ở nhiệt độ nuôi cấy 30oC, pH 7,2.
Khuẩn lạc chủng vi khuẩn VK5 có màu trắng sữa, trịn, nhẵn, trơn, có tâm
lồi, mép răng cưa. Tế bào VK5 hình que, có kích thước khoảng 0,2 - 0,5 µm, là vi
khuẩn gram dương. Nội bào tử của VK5 bắt màu xanh lục của dung dịch lục
malachite, cịn các tế bào thì lại bắt màu hồng của dung dịch fucshin. Những đặc
điểm sinh học của VK5 này giống với mô tả về đặc điểm của họ Bacillaceae của
De Vos năm 2003.

Hình 2. 2. Hình thái khuẩn lạc và bào tử chủng VK5

Sau khi phân lập và làm thuần, chủng vi khuẩn VK5 được giữ giống trong
môi trường thạch nghiêng LB và giữ giống trong Glycerol 30% theo phương pháp
của Lương Đức Phẩm, 2004:

14


- Giữ giống trong môi trường thạch nghiêng LB: Vi khuẩn đã thuần sẽ được
cấy trên môi trường thạch nghiêng. Nuôi ở tủ ấm 30oC. Sau khi khuẩn lạc thuần
sẽ được bảo quản ở 4oC, cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa khi nhân giống.
- Giữ giống trong Glycerol 30%: Lấy 1 ml mẫu đã tăng sinh cho vào ống
eppendoff 2 ml chứa 1 ml glycerol 30% đã tiệt trùng, lắc đều mẫu trên máy vortex.
Mẫu được giữ lạnh ở tủ âm.
Trong nghiên cứu về đặc điểm sinh học vi khuẩn đối kháng nấm gây bệnh
thán thư trên cây chuối trước đó đã chứng minh VK5 thể hiện dương tính với các
phản ứng Nitrate, MR và VP trong các phản ứng sinh hóa. VK5 cịn có khả năng
sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của VK5
đồng thời có khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ q trình lên men glucose.
Điều này có ý nghĩa trong việc ứng dụng VK5 vào sản xuất chế phẩm sinh học.
Ngồi ra, VK5 khơng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá
trình biến dưỡng.
2.2.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Trong nghiên cứu trước, chủng vi khuẩn VK5 đã được đánh giá có khả năng
sinh ra enzyme Chitinase mạnh. Điều này là rất có ý nghĩa liên quan việc đánh giá
khả năng kháng nấm Colletotrichum musae của chủng vi khuẩn này. Chitin chiếm
từ 22 đến 44% thành tế bào của nấm (Muzzarelli & cs.,1977; Muzzarelli &
cs.,1994), Chitinase phân giải chitin, là một trong các enzyme ngoại bào hoạt động
chống lại đối với thành tế bào mầm bệnh. Nó có vai trị bảo vệ cây chủ chống lại
mầm nấm gây bệnh (Aerts JMFG & cs.,1996; Escott GM & cs.,1996).
Ngồi ra, VK5 cũng có khả năng sinh enyzme protease, enzyme amylase,

cellulase ngoại bào. Những enzyme này đều có vai trò quan trọng hỗ trợ đối kháng
nấm bệnh và có tiềm năng trong việc ứng dụng vào nơng nghiệp.
2.2.3. Khả năng đối kháng nấm C. musae của chủng VK5
Nghiên cứu trước tiến hành phương pháp đồng nuôi cấy C. musae và chủng
VK5 đồng nuôi cấy trên môi trường PDA đã đánh giá được ảnh hưởng của thời
gian đến khả năng đối kháng nấm của chủng VK5. Từ ngày thứ 03 sau nuôi cấy,
15