Nghiên cứu tạo phôi bò thịt in vitro (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- -------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TẠO PHƠI BỊ THỊT IN VITRO

HÀ NỘI - 2022


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- -------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TẠO PHƠI BỊ THỊT IN VITRO

Ngƣời thực hiện

: NGUYỄN THỊ LAN ANH

Lớp

: K63CNSHA

Mã sinh viên

: 637003

Giảng viên hƣớng dẫn

: TS. NGUYỄN KHÁNH VÂN
PGS. TS. NGUYỄN XUÂN CẢNH

HÀ NỘI - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực, chƣa từng đƣợc sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và
các cơng trình khoa học nào trƣớc đây.
Các thơng tin, trích dẫn đƣợc sử dụng trong khóa luận đều đã đƣợc ghi rõ
nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định.
Nếu không đúng nhƣ đã nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề
tài của mình!
Hà Nội, ngày 06 tháng 07 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thị Lan Anh

i


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc Phịng Thí nghiệm
trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi, nơi em thực tập khóa
luận tốt nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em đƣợc học tập và hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp của mình.
Để hồn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này em đã nhận đƣợc sự hƣớng
dẫn khoa học của TS Nguyễn Khánh Vân và PGS. TS Nguyễn Xuân Cảnh. Em
xin gửi tới các thầy cô hƣớng dẫn lịng biết ơn sâu sắc về sự tận tình giúp đỡ,
động viên dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Khóa luận tốt nghiệp này khó có thể hồn thành nếu khơng nhận đƣợc sự
hỗ trợ của Th.S Vũ Thị Thu Hƣơng; chị Phạm Thị Kim Yến; chị Nguyễn Thị Lệ
Hƣơng; chị Hoàng Thị Âu và các cán bộ Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ
tế bào động vật – Viện Chăn nuôi. Em luôn trân trọng sự giúp đỡ quý báu đó.
Xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên bộ môn Công nghệ vi
sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã chỉ bảo,
hƣớng dẫn em trong q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động
viên, ủng hộ, và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 06 tháng 07 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thị Lan Anh

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................viii
I. MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu................................................................................. 2
1.2.1 Mục đích ............................................................................................. 2
1.2.2 Yêu cầu ............................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa của nghiên cứu ............................................................................ 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học................................................................................ 2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................ 3
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4
2.1. Buồng trứng và quá trình hình thành tế bào trứng..................................... 4
2.1.1. Quá trình hình thành, cấu tạo và hoạt động của buồng trứng bò ..... 4
2.1.2. Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng ............................................. 6
2.2. Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng................................ 8
2.2.1. Cấu tạo tinh trùng .............................................................................. 8
2.2.2. Quá trình hình thành tinh trùng ....................................................... 9
2.3. Sự thành thục in vitro tế bào trứng bò (IVM) ......................................... 10
2.3.1.Sự thành thục nhân tế bào trứng........................................................ 10
2.3.2. Sự thành thục tế bào chất ................................................................. 11
2.3.3. Vai trò của tế bào cumulusđến sự thành thục tế bào trứng ............... 12
iii


2.3.4. Vai trị của mơi trường ni thành thục in vitro tế bào trứng bò .... 13
2.4. Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro) ...................................................... 14
2.4.1. Khái niệm thụ tinh ............................................................................ 14
2.4.2. Q trình thụ tinh in vitro................................................................. 15
2.5. Ni phơi trong ống nghiệm (in vitro) .................................................... 17
2.5.1. Q trình phát triển của phôi ........................................................... 17
2.5.2. Môi trường nuôi phôi bị in vitro .................................................... 17

2.6. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................ 19
III. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 20
3.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................ 20
3.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 20
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 20
3.3.1. Phương pháp thu buồng trứng bò từ lò mổ ....................................... 20
3.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng bò từ buồng trứng lò mổ ................... 20
3.3.3. Phân loại tế bào trứng bị sau khi thu ............................................... 21
3.3.4.Phương pháp ni thành thục in vitro tế bào trứng bò ...................... 22
3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng
sau nuôi thành thục in vitro ........................................................................ 22
3.3.6. Phương pháp thụ tinh in vitro tế bào trứng bò thành thục in vitro .... 23
3.3.7. Phương pháp nuôi phôi in vitro ........................................................ 24
3.3.8.Phương pháp nhuộm phơi bị với Hoechst 33342 .............................. 24
3.3.9. Phương pháp xử lí số liệu .............................................................. 24
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 25
4.1. Đánh giá chất lƣợng tế bào trứng bò thu từ buồng trứng bò ở lò mổ ....... 25
4.2. Đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng bò thu từ buồng
trứng lị mổ.................................................................................................... 27
4.3. Đánh giá khả năng tạo phơi bò in vitro từ tế bào trứng bò thu từ lò mổ . 30

iv


4.3.1 Đánh giá khả năng xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng bò sau
thụ tinh in vitro .......................................................................................... 30
4.3.2. Đánh giá khả năng tạo phơi bị in vitro của tế bào trứng bò thu từ
buồng trứng lò mổ ...................................................................................... 32
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 37
5.1. Kết luận .................................................................................................. 37

5.2. Đề nghị................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 38

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

IVM

In vitro Maturation

IVF

In vitro Fertilization

NST

Nhiễm sắc thể

FSH

Follicle Stimulating Hormone

LH

Luteinizing Hormone

IGF-I

Insulin-like Growth

CR1aa

Môi trƣờng dịch ống dẫn trứng tổng hợp

BSA

Albumin huyết thanh bò

FCS

Huyết thanh thai bê (Fetal calf serum)

SOF

Môi trƣờng dịch ống dẫn trứng tổng hợp

vi


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Chất lƣợng tế bào trứng bò thu từ buồng trứng bò thịt ở lò mổ ............ 25
Bảng 2. Khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng bò thu từ buồng trứng
lò mổ.................................................................................................... 27
Bảng 3. Khả năng xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng bò sau thụ tinh
in vitro ................................................................................................. 30
Bảng 4. Khả năng tạo phơi bị in vitro của tế bào trứng bò thu từ buồng
trứng lò mổ .......................................................................................... 33

vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Cấu tạo của buồng trứng .......................................................................... 6
Hình 2. Hình dạng và cấu tạo tinh trùng bị .......................................................... 8
Hình 3. Thu tế bào trứng bị bằng phƣơng pháp chọc hút .................................. 21
Hình 4. Phân loại tế bào trứng trƣớc khi ni..................................................... 22
Hình 5. Tế bào trứng sau khi loại bỏ tế bào cumulus và có sự xuất hiện của
thể cực thứ nhất ................................................................................... 23
Hình 6. Buồng trứng bị thịt thu tại lị mổ ........................................................... 26
Hình 7. Tế bào trứng bò loại A, B sau khi thu .................................................... 26
Hình 8. Tế bào trứng bị với sự xuất hiện của thể cực thứ nhất .......................... 28
Hình 9. Tế bào trứng bị sau ni thành thục in vitro ......................................... 29
Hình 10. Tế bào trứng khơng có tinh trùng xâm nhập sau thụ tinh in vitro
(có 1 tiền nhân tại thời điểm 10 giờ sau thụ tinh in vitro) .................. 31
Hình 11. Tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập sau thụ tinh in vitro (có 2
tiền nhân tại thời điểm 10 giờ sau thụ tinh in vitro) ........................... 32
Hình 12. Phơi bị phân chia ở ngày thứ 2 sau thụ tinh in vitro ........................... 33
Hình 13. Phơi nang bị ở ngày thứ 7 sau thụ tinh in vitro ................................... 34
Hình 14. Phơi nang bị in vitro đƣợc nhuộm Hoechst 33342 để kiểm tra tổng
số tế bào/phôi nang ............................................................................. 35

viii


I. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, một kỹ thuật mới

đã đƣợc sử dụng thay thế cho bƣớc gây rụng trứng nhiều trong cơng nghệ cấy
truyền phơi đó chính là kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (thụ tinh in vitro). Kỹ
thuật này giúp ngƣời chăn nuôi rút ngắn đƣợc khoảng cách thế hệ, gia tăng số
lƣợng cá thể trong một thế hệ lên rất nhiều. Ở bò số lƣợng nang trứng có thể
phát triển thành trứng thành thục có khả năng tạo phơi khoảng 68.000-70.000 tế
bào trứng/bị. Trong sinh sản tự nhiên, số tế bào trứng thành thục thƣờng là một
trứng cho một chu kỳ 21 ngày, nếu tế bào trứng đƣợc thụ tinh và tạo phôi dẫn
đến mang thai thì số tế bào trứng đƣợc sử dụng là rất hạn chế so với tiềm năng
của buồng trứng. Để nâng cao khai thác tiềm năng di truyền của những cá thể bị
có giá trị, cơng nghệ tạo phơi bị in vitro là sự lựa chọn tối ƣu cho mục đích này.
Cơng nghệ sản xuất phơi bị in vitro khơng chỉ giúp tạo ra những đàn bị
có giá trị di truyền cao mà cịn cung cấp một lƣợng lớn phơi bị sử dụng cho các
nghiên cứu nhƣ: xác định giới tính phôi, nhân bản, cấy chuyển nhân, chuyển gen
(Galli và Lazzari, 2008). Mặc dù các nhà nghiên cứu cũng đã nỗ lực nâng cao
hiệu quả tạo phơi bị in vitro, tuy nhiên hiệu quả của q trình tạo phơi bị in
vitro vẫn cịn thấp. Theo Siard và cs (2006) chỉ có khoảng 30%-40% tế bào
trứng sau khi thành thục in vitro đƣợc thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi
nang. Hiệu quả tạo phơi bị in vitro phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ: chất lƣợng
tế bào trứng, môi trƣờng nuôi thành thục in vitro, kỹ thuật thụ tinh in vitro, mơi
trƣờng ni phơi in vitro....
Chăn ni bị thịt là thành phần không thể thiếu để phát triển kinh tế nông
nghiệp nƣớc ta. Trong bối cảnh dịch tả lợn châu Phi đang là một trở ngại lớn cho
việc tái đàn, phát triển đàn lợn ở nƣớc ta thì chăn ni bị thịt là hƣớng đi tổng
hợp nhất có thể giải quyết đồng thời nhiều vấn đề trong đời sống ngƣời chăn
ni. Hiện nay sản lƣợng thịt bị trong nƣớc mới chỉ đáp ứng đƣợc 30% nhu cầu
1

tiêu dùng của ngƣời dân, 70% còn lại là lƣợng thịt bị nhập khẩu. Do đó, cần có
một chiến lƣợc để tăng nhanh và phát triển bền vững ngành chăn ni bị thịt.
Cơng nghệ tạo phơi bị in vitro kết hợp với cấy truyền phôi là một công cụ hữu
hiệu, đáp ứng đƣợc nhu cầu cấp bách này.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu tạo phơi bị in vitro đã đƣợc thực hiện từ
những năm 1990 và hiện nay vẫn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu tại Viện Công
nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phịng Thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ tế bào động vật - Viện Chăn nuôi và Học viện Nông nghiệp
Việt Nam. Cho đến nay các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu ứng
dụng cơng nghệ sinh sản trên bị nhƣ: cấy chuyển phôi, đông lạnh tế bào trứng
và phôi, chuyển gen…. Nguồn nguyên liệu chính sử dụng cho các nghiên cứu
này là nguồn phơi bị in vitro thu từ tế bào trứng lị mổ. Chất lƣợng của nguồn
phơi bị sẽ ảnh hƣởng đến kết quả và độ chính xác của các nghiên cứu. Xuất phát
từ nhu cầu thực tế đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo phơi bị thịt
in vitro”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Tạo ra nguồn phơi bị in vitro chất lƣợng bằng việc áp dụng các kỹ thuật
trong cơng nghệ phơi bị
1.2.2 u cầu
Tạo đƣợc phơi bị in vitro làm nguồn ngun liệu cho các nghiên cứu về
phơi bị.
Đánh giá đƣợc chất lƣợng phơi nang bò in vitro.
1.3. Ý nghĩa của nghiên cứu
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ tạo tiền đề cho việc mở rộng hƣớng
nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ phơi bị tại Việt Nam.

2

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần vào việc phát triển ngành chăn
ni bị tại Việt Nam.

3


II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Buồng trứng và quá trình hình thành tế bào trứng
2.1.1. Quá trình hình thành, cấu tạo và hoạt động của buồng trứng bò
Buồng trứng là cơ quan sinh sản của gia súc cái, sản sinh ra tế bào trứng
và các hormone sinh sản của gia súc cái (oestrogen và progestins). Số lƣợng tế
bào trứng rụng, thụ thai và số con sinh ra khác nhau giữa các lồi nhƣ: trâu, bị,
ngựa mỗi chu kỳ động dục chỉ rụng một tế bào trứng, cá biệt có hai tế bào.
Trong khi đó ở lợn mỗi chu kỳ động dục lại rụng nhiều tế bào trứng, số lƣợng tế
bào trứng rụng ở lợn có thể lên tới 25 tế bào trứng/chu kỳ động dục.
Buồng trứng bị đƣợc hình thành khi các gị tuyến sinh dục phát triển do
có sự dày lên của khoang biểu mô ở mặt giữa của trung thận (Dyce và cs., 1966)
và tạo sự liên kết với các mô trung thận bởi rất nhiều tế bào đƣợc gọi là màng
sợi giới tính nguyên thủy (Byskov và Hoyer, 1994). Ở gị tuyến sinh dục, túi
nỗn hồng đƣợc bao quanh bởi các sợi tế bào mầm (ovigerous) và đƣợc hình
thành do có sự bao bọc xung quanh bởi các sợi tế bào mầm, tạo nên một tổ hợp
bao gồm tế bào biểu mơ, túi nỗn. Các tế bào biểu mô hay các tế bào soma là
các tế bào có nguồn gốc từ khoang biểu mơ, có hình lập phƣơng hay nhân tế bào
hình cầu và là tiền thân của các tế bào nang trứng (Hirshfield và Desanti, 1995).
Trung mơ hay tế bào cơ chất là tế bào có nguồn gốc từ sự phân tầng phần mặt
ngoài trung thận, nhân kéo dài ra và có sự xuất hiện của các nguyên bào sợi và
làm cho các tế bào mô vỏ (theca cells) tăng lên. Ở phần cơ sở, các sợi tế bào
mầm đƣợc liên kết với nhau bởi mô trung thận và ở bề mặt chúng đƣợc liên kết

với biểu mơ sinh dục. Ở bị gị tuyến sinh dục đƣợc biến đổi thành buồng trứng ở
ngày thứ 40 của bào thai. Với sự phân rã của các sợi tế bào nguyên thủy, buồng
trứng phân ra thành phần vỏ và phần tủy (Erickson).
Buồng trứng bò đƣợc cấu tạo bao gồm miền tủy bên trong và miền vỏ bên
ngoài, hai miền đó đƣợc cấu tạo bằng lớp mơ liên kết sợi xốp. Miền tủy có nhiều
mạch máu, thần kinh và mơ liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mơ có
4


nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng, xảy ra quá trình trứng chín, rụng trứng và tạo ra
các hormone (Hình 1). Trong cơ thể, buồng trứng đƣợc treo ở cạnh trƣớc dây
chằng rộng, nằm trong xoang chậu. Ở bò chúng ta có thể xác định đƣợc bằng tay
khi khám qua trực tràng. Buồng trứng thƣờng có hình ovan dẹt, song hình dáng
và kích thƣớc của buồng trứng sẽ bị thay đổi và biến dạng do sự phát triển của
nang trứng và sự tồn tại của thể vàng. Kích thƣớc của buồng trứng to hay nhỏ
phụ thuộc rất nhiều vào giống, tuổi của bị. Kích thƣớc bình qn của buồng
trứng ở bò Lai Sind là 23,45 x 16,50 x 11,55 mm và ở bò sữa 35 x 25 x 15 mm
(Bearden và Fuquay, 2000) và 4 x 2 x 1,5 cm (Dyce và cs., 1987). Buồng trứng
đƣợc xem nhƣ một tuyến nội tiết của con cái, làm nhiệm vụ nuôi dƣỡng cho
trứng chín, tiết ra các hormone sinh dục, tác động đến chức năng của tử cung và
làm thay đổi tính biệt giữa con đực và con cái.
Khi buồng trứng có các nang trứng thành thục, các tế bào hạt trong biểu
mơ nang trứng tiết ra nhiều oestrogen, oestrogen có chức năng tới đặc tính sinh
dục thứ cấp của gia súc cái làm âm đạo tiết ra nhiều dịch nhầy, âm hộ xung
huyết đỏ, sừng tử cung và ống dẫn trứng dinh dƣỡng đƣợc tăng cƣờng, tuyến vú
phát triển, vỏ não hƣng phấn con vật xuất hiện động dục. Đồng thời tiết ra
hormone progesterone từ thể vàng đi vào máu sau khi rụng trứng, có tác dụng
kích thích niêm mạc tử cung, tăng cƣờng dinh dƣỡng, màng nhầy phát triển để
trứng đƣợc thụ tinh về nơi làm tổ, đồng thời còn tác dụng tới tế bào biểu mô
màng nhầy tử cung tiết ra nhiều glycogen và các chất dinh dƣỡng nuôi phôi,

giúp phôi bám chặt vào thành tử cung và phát triển. Progesterone cịn ức chế
nang trứng chín trên buồng trứng, thông qua sự ức chế của FSH ức chế cơ trơn
tử cung làm giảm co bóp, giảm hormone thùy sau tuyến yên làm cho tử cung
yên tĩnh trong thời gian mang thai. Ngồi ra progesterone cịn kích thích tuyến
vú phát triển. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt. Ngay
bên dƣới biểu mổ bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết, phía dƣới
lớp mơ dày đặc là nhu mơ có chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone

5


buồng trứng. Sự hình thành của chức năng buồng trứng phụ thuộc vào: Giai
đoạn đầu của phân bào giảm nhiễm, quá trình hình thành nang trứng và sự khác
nhau của các tế bào sản sinh steroid.

Hình 1. Cấu tạo của buồng trứng (Nguồn: Bearden và Fuquay, 2000)

2.1.2. Cấu tạo và sự hình thành tế bào trứng
Nguồn gốc của tế bào trứng là tế bào mầm nguyên thủy. Tế bào mầm
nguyên thủy đƣợc hình thành từ nội bì của túi nỗn hồng ở thời kỳ phơi thai
(Senger, 1997). Tế bào mầm nguyên thủy di chuyển theo kiểu amip từ biểu mô
của túi nỗn hồng theo đƣờng mặt lƣng màng treo ruột của đoạn cuối ruột phơi
và di chuyển đến các gị tuyến sinh dục khi bào thai đƣợc 35 - 36 ngày tuổi ở bò
(Senger, 1997). Các gò tuyến sinh dục là túi sinh dục chƣa đƣợc phân hóa và
đƣợc hình thành ở ngày thứ 32 của bào thai bò. Các yếu tố giúp cho tế bào mầm
nguyên thủy di chuyển đƣợc đến gò tuyến sinh dục vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ ràng.
Tuy nhiên khi nghiên cứu in vivo và nghiên cứu in vitro, French-Constant và cs
(1991), Alvarez và Merchan(1986) đều nhận thấy sự tham gia của fibronectin.
Fibronectin có mặt trên đƣờng đi từ biểu mơ của túi nỗn hồng đến gò tuyến
sinh để tạo nên sự di chuyển của tế bào mầm nguyên thủy (French-Constant và

cs., 1991). Nghiên cứu in vitro trên chuột cho thấy rằng yếu tố sinh trƣởng biến
đổi β1 (Transforming growth factor β1) đƣợc tạo ra bởi tuyến sinh dục liên quan
đến dãy hóa chất (Godin và Wylie, 1991), ảnh hƣởng đến tế bào mầm nguyên
thủy làm cho chúng di chuyển theo một phƣơng hƣớng nhất định. Cũng nghiên
cứu trên chuột (De Felici và Pesce, 1994) thấy rằng bộ giao tử (Kit Gland) cần
thiết cho sự sống sót và sự phát triển của tế bào mầm nguyên thủy khi di chuyển
6


(Kit Ligand cũng đƣợc gọi là yếu tố tế bào mầm hay yếu tố tế bào lớn). Kit
Ligand kích thích lên mô xôma của phôi chuột dọc theo đƣờng di chuyển của tế
bào mầm và ở các gò tuyến sinh dục. Ảnh hƣởng qua lại giữa tế bào mầm
nguyên thủy và Kit Ligand thúc đẩy sự di chuyển của tế bào mầm nguyên thủy
và tăng nhanh sự phát triển của tế bào mầm ngun thủy thơng qua q trình
ngăn chặn tế bào chết theo chƣơng trình (De Felici và Pesce, 1994).
Tế bào mầm nguyên thủy trải qua một sự giới hạn về số lƣợng của các quá
trình phân chia nguyên nhiễm khi đang di chuyển cũng nhƣ khi đến gò tuyến
sinh dục (Smitz và Cortvrindt, 2002). Quá trình phân chia nguyên nhiễm xảy ra
ở gò tuyến sinh dục thƣờng xuyên hơn so với khi chúng đang trên đƣờng di
chuyển đến gị tuyến sinh dục. Ở bị có sự tăng lên đột ngột về số lƣợng phân
chia nguyên nhiễm ở mỗi buồng trứng bắt đầu ở ngày thứ 60 của bào thai (304
lần giảm phân/ngày so với 13 lần/ngày ở ngày thứ 50) với cƣờng độ phân chia
nguyên nhiễm rất mạnh. Khi tế bào mầm nguyên thủy ngừng di chuyển và cố
định vào gị tuyến sinh dục để phân chia thì chúng đƣợc gọi là túi nỗn (Smitz
và Cortvrindt, 2002). Có thể đƣợc phân biệt túi noãn với tế bào mầm nguyên
thủy dựa vào mức độ tế bào, do túi noãn có nhiều cơ quan tế bào, đặc biệt là
màng lƣới nội chất và các ống có chứa các ty lạp thể. Các ty lạp thể có chứa
ATP và các enzyme liên quan đến các hoạt động của tế bào (Russe, 1983).
Các tế bào mầm di chuyển đến gò tuyến sinh dục trong một khoảng thời
gian nhất định đƣợc tìm thấy ở các chu kỳ nguyên nhiễm khác nhau trong các

nhóm tế bào mầm phân chia. Khi buồng trứng phát triển các tế bào mầm nguyên
thủy di chuyển trƣớc sẽ trƣởng thành sớm hơn, các tế bào mầm nguyên thủy di
chuyển đến muộn và nằm ở phần sâu của tuyến sinh dục phát triển. Phần ngoại
vi của tế bào mầm nguyên thủy hoạt động nhƣ các tế bào gốc để tạo ra các túi
nỗn mới (Russe, 1983). Q trình phân chia nguyên phân của túi noãn dừng ở
ngày thứ 150 của bào thai, ấn định số lƣợng tế bào mầm của bò cái. Số lƣợng tế
bào mầm giữa 2 buồng trứng phải và trái chỉ có sự khác nhau khoảng 10%.

7


Ở bị, sự phân bào giảm nhiễm của túi nỗn bắt đầu sau khi bào thai đƣợc
75 - 80 ngày tuổi, các tế bào mầm của túi noãn tăng lên sau khi bắt đầu quá trình
phân bào giảm nhiễm và đƣợc xem nhƣ tế bào trứng sơ cấp (Byskov và Hoyer,
1994). Sự phân bào giảm nhiễm của tế bào trứng sơ cấp vƣợt quá giai đoạn sợi
dày của tiền kỳ phân bào I. Ở giai đoạn sợi dày của tiền kỳ phân bào I, các NST
tập hợp lại, đƣợc gói vào trong nhân tế bào trứng và đƣợc gọi là túi mầm. Các tế
bào trứng tƣơng đối sáng và dễ nhận biết vì có sự tăng lên về kích thƣớc tế bào
do tăng lên của tế bào chất và sự phồng lên của nhân (Russe, 1983).
2.2. Cấu tạo tinh trùng và quá trình hình thành tinh trùng
2.2.1. Cấu tạo tinh trùng
Tinh trùng của các lồi gia súc rất nhỏ, khơng khác nhau nhiều về hình
dạng bên ngồi và kích thƣớc mặc dù khối lƣợng cơ thể chúng khác nhau rất
nhiều. Tinh trùng của động vật có vú có hình dạng giống nhƣ con nịng nọc,
gồm có đầu, đọan giữa và đi. Chiều dài từ 55-77µm, đầu rộng 3,0-4,8µm,
đoạn giữa dài 8,0-14,8µm rộng 0,5-1,0µm, đi dài 30-50µm rộng 0,3-0,7µm.

Hình 2. Hình dạng và cấu tạo tinh trùng bò

Đầu tinh trùng bò hình oval dẹp, trong có chứa nhân tế bào. Nhân chứa

NST, số NST của tinh trùng bằng một nửa NST của tế bào thân, đó là kết quả
của q trình phân bào giảm nhiễm. Đầu tinh trùng đƣợc bao bọc bởi acrosome
nhƣ một cái mũ bảo vệ, trong “mũ” này có chứa men hyaluronidase, acrosin và
một số enzyme thủy phân khác, rất cần thiết giúp cho tinh trùng tiến vào màng
trong của trứng trong q trình thụ tinh. Phần đi của tinh trùng nhỏ và dài, bao

8


gồm đoạn cổ, đọan giữa và chóp đi. Cổ nối liền đầu với đoạn giữa giúp cho
việc tiếp nối giữa đầu và phần đuôi sau trở nên linh hoạt hơn. Đoạn giữa có một
tập hợp các sợi trục chạy xuyên suốt. Trong có chứa các chất dinh dƣỡng cung
cấp năng lƣợng cho tinh trùng sống và vận động. Chóp đi chứa những sợi trục
đƣợc bao bọc bởi màng tế bào giúp cho tinh trùng có thể vận động đƣợc.
2.2.2. Quá trình hình thành tinh trùng
Bị đực 10-12 tháng tuổi đã thành thục về tính và có khả năng giao phối và
bài xuất tinh trùng. Khi con đực thành thục về tính, tại dịch hồn, những tế bào
sinh dục ngun thủy trải qua qúa trình phân chia và biến đổi phức tạp để tạo
thành tinh bào sơ cấp, tinh bào thứ cấp rồi thành tinh trùng. Biểu mô tinh trong
ống sinh tinh bao gồm 2 lọai tế bào cơ bản, tế bào Sertoli và những tế bào mầm
(germ cell) đang phát triển. Những tế bào mầm trải qua một loạt quá trình phân
chia tế bào và biệt hố sự phát triển trong ống sinh tinh để thành tế bào tinh
nguyên (spermatogonia), hay còn gọi là tế bào thân (stem cell). Tế bào tinh
nguyên tiếp tục phân chia một vài lần để tăng số lƣợng và phát triển thành tinh
bào sơ cấp (spermatocyte). Từ tinh bào sơ cấp (2n) trải qua quá trình phân bào
giảm nhiễm để giảm DNA trong tế bào xuống còn một nửa so với tế bào thân
thành các tinh bào thứ cấp (n). Tinh bào thứ cấp tiếp tục phân chia nguyên
nhiễm và phát triển thành tinh tử (spermatids). Các tinh tử trải qua quá trình phát
triển và hoàn thiện chức năng để trở thành tinh trùng (spermatozoa).
Quá trình phân chia tế bào bao gồm phân chia nguyên nhiễm và phân chia

giảm nhiễm của tế bào tinh nguyên (spermatogonia) gọi là q trình sinh tinh. Ở
bị đực, q trình phân chia tế bào từ tế bào tinh nguyên đến tinh tử kéo dài
khoảng 45 ngày. Từ 1 tế bào tinh nguyên tạo ra 16 tinh bào sơ cấp. Từ 1 tinh
bào sơ cấp hình thành ra 2 tinh bào thứ cấp, tạo ra 4 tinh tử phát triển lên thành 4
tinh trùng. Trong đó 2 tinh trùng mang NST giới tính X và 2 tinh trùng mang
NST giới tính Y.

9


Bị đực cũng nhƣ động vật có vú khác, thuộc lọai dị giao tử
(heterogametic), một nửa số tinh trùng chứa NST giới tính X và nửa cịn lại
chứa NST Y. Tinh trùng mang NST giới tính X khi thụ tinh với trứng sẽ hình
thành nên phơi cái, những tinh trùng mang NST Y sẽ tạo ra phôi đực. Sự sai
khác về tỷ lệ tinh trùng mang nhiễm sắc thể X và Y là rất nhỏ dao động từ 3-4%.
Vì vậy trong thực tế tỷ lệ sinh bê đực và cái là tƣơng đƣơng nhau, tỷ lệ 50/50.
2.3. Sự thành thục in vitro tế bào trứng bò (IVM)
2.3.1.Sự thành thục nhân tế bào trứng
Trong giai đoạn thành thục nhân tế bào trứng, nhân có kích thƣớc rất lớn và
thƣờng đƣợc gọi là bóng phơi. Sau khi tiếp nhận kích dục tố, nhân nhanh chóng
thực hiện các kỳ cịn lại của Meiose. Các lƣỡng trị hội tụ trở lại và qua giai đoạn
cuối cùng của tiền kỳ. Đồng thời nhân di chuyển tới bề mặt trứng ở cực động
vật, sau đó màng nhân vỡ ra, dịch nhân hòa với tế bào chất, các lƣỡng trị sắp xếp
thành tấm trung kỳ của thoi phân chia. Thoi phân chia trực giao với bề mặt
trứng, các lƣỡng trị phân chia ở hậu kỳ và sau mặt kỳ hình thành nên hai tế bào.
Quá trình thành thục nhân tế bào trứng trƣớc khi chín và rụng gồm các
giai đoạn phát triển chính: Kỳ đầu I, tiền kỳ giữa I, kỳ giữa I, kỳ sau I, kỳ cuối I
và thành thục nhân. Kỳ đầu I là giai đoạn tế bào trứng có nhân ở trạng thái túi
mầm (GV), nhân to trịn có thể ở giữa hoặc lệch hoặc sát ngoại vi tùy thuộc vào
giai đoạn phát triển sớm hay muộn. Nhiễm sắc thể của tế bào ở giai đoạn này sẽ

biến đổi từ dạng sợi mảnh thành dạng co ngắn với hình dạng đặc trƣng. Do sự
bắt cặp NST đồng dạng nên phần lớn thời gian của tiền kỳ I, chúng tồn tại ở
trạng thái tứ trị. Giai đoạn kì trƣớc I bắt đầu khi màng nhân vỡ và dần biến mất,
NST co ngắn gần nhƣ tối đa và tâm động của mỗi NST sẽ đính với một sợi của
thoi phân bào. Kì giữa I: các NST của cặp tƣơng đồng xếp thành hàng trên mặt
phẳng xích đạo thoi phân bào. Trong kì sau I: NST trong cặp tƣơng đồng bắt đầu
tách ra, hai NST của mỗi cặp tiếp hợp chuyển động về 2 cực đối nhau. Kì cuối I
xảy ra khi một bộ NST đƣợc tách ra trong thể cực I (giai đoạn này diễn ra rất

10


nhanh), sau đó sẽ hình thành eo thắt tách rời thể cực I ra khỏi tế bào trứng. Tế
bào trứng chứa bộ NST đơn bội ở trạng thái kép dừng ở kỳ giữa giảm phân II sẽ
trở thành tế bào trứng thành thục. Nhƣ vậy sản phẩm của phân bào giảm nhiễm I
là tế bào trứng thứ cấp (noãn bào II) và thể cực thứ nhất nằm ở xoang quanh
noãn phía bên trong màng sáng. Với sự phân chia này, số NST trong tế bào
trứng thay đổi từ trạng thái lƣỡng bội (2n) xuống đơn bội (n). Tế bào trứng thứ
cấp giữ lại gần nhƣ toàn bộ nguyên sinh chất và một nửa vật chất nhân (NST)
của noãn bào I. Một nửa vật chất nhân khác đƣợc đẩy ra ngoài tạo thành thể cực
thứ nhất. Tế bào trứng sẽ đƣợc giải phóng khỏi sự ức chế phân bào, tiếp tục các
giai đoạn của phân bào giảm phân II ngay sau khi đƣợc thụ tinh. Kết quả của
hoạt động giảm phân này là tạo ra thể cực thứ 2 và bộ nhân nguyên đơn bội của
trứng để khi kết hợp với nhân tinh trùng sẽ tạo thành nhân lƣỡng bội của hợp tử.
Trong tự nhiên, thời gian tế bào trứng trải qua các giai đoạn tan biến túi
mầm, metaphase I và metaphase II ở các loài động vật khác nhau là khác nhau.
Ở trâu hoặc bò, thời gian từ khi tan biến túi mầm đến giai đoạn metaphase II là
19 giờ, cịn ở lợn là 38 giờ. Do đó, thời gian tối thiểu để nuôi thành thục in vitro
tế bào trứng bị vào khoảng 19 giờ tính từ khi chuyển tế bào trứng bị vào ni
trong mơi trƣờng ni thành thục in vitro.

2.3.2. Sự thành thục tế bào chất
Tế bào chất đóng vai trị quan trọng trong khả năng sinh sản của tế bào
mầm, điều tiết quá trình giảm phân và là một trong các yếu tố làm rối loạn quá
trình sinh sản. Tế bào trứng có tế bào chất chứa rất nhiều protein và cơ quan tế
bào, ty lạp thể, các cơ quan tế bào chất mang thông tin di truyền. Tế bào chất
của tế bào trứng liên quan đến sự thành cơng của q trình thụ tinh in vitro.
Q trình thành thục tế bào chất yêu cầu sự tái tổ chức cấu trúc nội bào
bên trong tế bào trứng. Đồng thời với các diễn biến của nhân trong quá trình
thành thục, tế bào chất cũng có nhiều biến đổi. Tế bào trứng trở nên mọng nƣớc,
tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất bề mặt trở nên có tính co

11


giãn và xuất hiện khả năng phân chia. Một trong những sự kiện quan trọng đánh
dấu sự thành thục của tế bào trứng là sự vỡ màng nhân. Màng nhân bị vỡ dƣới
ảnh hƣởng của tác nhân phá hủy màng nhân. Tác nhân này xuất hiện trong tế
bào trứng dƣới ảnh hƣởng của progesterone và khơng có sự tham gia của nhân.
Sau khi vỡ màng nhân các tác nhân hội tụ nhiễm sắc thể, tác nhân trƣơng nhân
tinh trùng, tác nhân phân bào xuất hiện để chuẩn bị cho các yếu tố cần thiết cho
quá trình thụ tinh, hình thành và phát triển phơi (Nguyễn Mộng Hùng, 1993).
2.3.3. Vai trị của tế bào cumulus đến sự thành thục tế bào trứng
Tế bào cumulus chỉ có ở tế bào trứng của động vật có vú, tế bào trứng và
lớp tế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng kết hợp với nhau để thực hiện
quá trình trao đổi chất bên trong tế bào chất của tế bào trứng thông qua các cầu
nối liên kết (Fatehi và cs., 2005). Tế bào cumulus hỗ trợ cho quá trình thành
thục nhân của tế bào trứng đến giai đoạn Metaphase II và quá trình thành thục tế
bào chất. Sự thành thục của tế bào chất giúp tế bào trứng hồn thành q trình
thụ tinh thơng thƣờng và phát triển tiếp theo của phôi (Van Soom và cs., 2002).
Tế bào cumulus đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển và trƣởng thành của

tế bào trứng. Tế bào cumus bảo vệ tế bào trứng dƣới sự tác động của q trình tự
thối hóa của nang trứng (meiotic arrest), tham gia vào q trình khơi phục q
trình phân bào giảm nhiễm, hỗ trợ sự thành thục tế bào chất, thu hút và lựa chọn
tinh trùng, tạo điều kiện cho tinh trùng xâm nhập vào trong tế bào trứng trong
q trình thụ tinh, ngăn cản sự hóa rắn sớm của màng trong suốt.
Tế bào cumulus chứa các thụ thể FSH và LH, giúp hấp thu các yếu tố tăng
trƣởng cho sự phát triển của tế bào trứng. Tuy nhiên, nồng độ các hormone có
ảnh hƣởng đến sự hoạt động của các nối liên kết ở tế bào cumulus. Việc hấp thu
LH làm tăng hoạt động của việc sản xuất inositol triphosphate (IP3), con đƣờng
phospholipase C, con đƣờng cAMP và PKC trong quá trình trƣởng thành của tế
bào trứng. Ở bị, những tế bào trứng có ít lớp màng cumulus chặt chẽ bao xung
quanh tế bào trứng sẽ có khả năng thành thục in vitro kém hơn so với những tế

12


bào trứng có đầy đủ lớp màng cumulus chặt chẽ bao xung quanh. Các tế bào trứng
khơng có màng cumulus khơng có khả năng thụ tinh (Van Soom và cs., 2002).
Tế bào trứng điều hịa sự tăng trƣởng, biệt hóa và nội cân bằng trong tế
bào trứng, cung cấp sản phẩm trao đổi chất và chuyển hóa phân tử. Vì tế bào
trứng khơng có khả năng tổng hợp glucose từ mơi trƣờng, nên tế bào cumulus
đóng vai trị quan trọng trong việc tổng hợp glucose cho tế bào trứng. Sự vận
chuyển glucose thông qua các kênh vận chuyển trên tế bào cumulus và chuyển
hóa các chất vào tế bào trứng thơng qua các cầu nối gap-juntion. Có 4 con
đƣờng tổng hợp glucose ở noãn: glycolysis, pentose phosphate pathway (PPP),
polyol pathway, hexosamine biosynthesis pathway (HBP). Thứ nhất, con đƣờng
glycolysis tạo ra pyruvate và lactate tham gia vào chu trình acid tricarboxylic
(TCA), dƣới tác động oxy hóa khử tạo ra năng lƣợng ATP. Thứ hai, con đƣờng
PPP chỉ có một lƣợng nhỏ glucose đƣợc chuyển hóa tạo ra NADPH cho q
trình tác động chuyển đổi qua lại của GSSG (oxidized glutathione) và GSH

(reduced glutathione) (đây là các chất chống quá trình oxi hóa). GSH bảo vệ tế
bào khỏi sự oxi hóa. Sau khi thụ tinh, GSH tham gia vào khử cực đầu tinh trùng,
xảy ra song song với sự hoạt hóa tế bào trứng, hỗ trợ q trình thụ tinh. Ngồi
ra, con đƣờng này còn tạo ra phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) tham gia
vào con đƣờng de novo, tổng hợp purin vào quá trình điều hòa sự giảm phân ở tế
bào trứng. Thứ ba, con đƣờng polyol sản xuất ra fructose và sorbitol. Cuối cùng,
con đƣờng HBP sản xuất cơ chất, hỗ trợ cho sự giãn nở của tế bào cumulus, để
đáp ứng với sự gia tăng LH và các yếu tố tăng trƣởng biểu bì, FSH.
2.3.4. Vai trị của mơi trường ni thành thục in vitro tế bào trứng bị
Mơi trƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay trong nuôi thành thục in vitro
tế bào trứng bị là TCM 199 (Mao và cs., 2002).Có nhiều loại môi trƣờng đƣợc
sử dụng để nuôi thành thục tế bào trứng, từ các mơi trƣờng có chức năng sinh lý
đơn giản đến mơi trƣờng phức tạp có chứa các amino axít, các vitamin, purine
và các hợp chất quan trọng để nuôi tế bào trứng. Môi trƣờng TCM-199 với các
13


bicacbonat hoặc HEPES, bổ sung các loại huyết thanh khác nhau và các
gonadotropin (nhƣ FSH và LH) hoặc các steroid hormone (nhƣ estradiol-17β)
đƣợc sử dụng phổ biến nhất để nuôi thành thục tế bào trứng bò và thu đƣợc sự
thành công khi nuôi thành thục tế bào trứng, thụ tinh và ni phơi in vitro.
Vì mơi trƣờng ni thành thục đƣợc thiết kế để tế bào trứng có thể hồn
thiện quá trình thành thục của mình giống nhƣ trong cơ thể mẹ nên thƣờng đƣợc
bổ sung thêm huyết thanh (10% - 20%), hormone và một số yếu tố kích thích
sinh trƣởng khác. Huyết thanh có vai trị cung cấp protein, các yếu tố chống oxy
hóa và phát triển; khơng ảnh hƣởng đến màng zona pellucida của tế bào trứng.
Để nâng cao hiệu quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng bò các nhà nghiên
cứu còn sử dụng kết hợp huyết thanh với hormone. Mặc dù tế bào trứng có thể
thành thục mà không cần bổ sung hormone vào môi trƣờng ni thành thục,
nhƣng việc có thêm gonadotropins và estradiol làm tăng tỷ lệ thành thục và thụ

tinh. Neglia và cs (2001) cho rằng khi sử dụng kết hợp FCS, LH và estradiol
trong môi trƣờng nuôi thành thục làm tăng tỷ lệ trứng bị thành thục in vitro.
Ngồi việc bổ sung hormone và huyết thanh vào trong môi trƣờng nuôi
thành thục, một số nhà nghiên cứu còn nhận thấy rằng việc bổ sung yếu tố kích
thích sinh trƣởng ở một liều lƣợng nhất định làm tăng hiệu quả của quá trình
ni thành thục in vitro. Một số yếu tố kích thích sinh trƣởng nhƣ IGF-I; IGF-II,
TGF-β cũng có thể đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi thành thục. Việc bổ sung
IGF-I cùng với FSH thúc đẩy sự giảm phân, quá trình steroid và tổng hợp
protein. Hơn nữa, việc bổ sung vào mơi trƣờng ni thành thục với nhân tố kích
thích giống nhƣ insulin (IGF-II) làm tăng đáng kể tỷ lệ thành thục và phân chia.
2.4. Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro)
2.4.1. Khái niệm thụ tinh
Thụ tinh là quá trình kết hợp hai giao tử đực và cái kèm với sự khôi phục
cơ cấu di truyền lƣỡng bội và hoạt hóa trứng cho sự phát triển tiếp sau. Kết quả
của quá trình thụ tinh là tạo nên một tế bào lƣỡng bội gọi là hợp tử. Thụ tinh là
14


q trình rất phức tạp và phải trải qua ít nhất 5 bƣớc: Tinh trùng gắn với lớp
màng trong suốt của trứng; Tinh trùng diễn ra phản ứng thể cực; Tinh trùng xâm
nhập vào bên trong màng trong suốt; Tinh trùng gắn với lớp bào tƣơng của
trứng; Cuối cùng là sự hợp màng giữa trứng và tinh trùng và hình thành tiền
nhân. Sự xâm nhập của tinh trùng hoạt hóa tế bào trứng, dẫn tới các biến đổi lí
hóa phức tạp trong tế bào trứng để chuẩn bị cho các bƣớc phát triển tiếp theo.
2.4.2. Quá trình thụ tinh in vitro
a. Hoạt hóa tinh trùng in vitro
Hoạt hóa tinh trùng in vitro là q trình mà ở đó tinh trùng diễn ra một
loạt các phản ứng sinh hóa và sinh lý phức tạp trƣớc khi có khả năng thụ tinh
với tế bào trứng thành thục. Giai đoạn đầu tiên của hoạt hóa tinh trùng có liên
quan đến việc loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh,

dịch hoàn phụ , ống dẫn tinh và tinh thanh.
b. Phương pháp hoạt hóa tinh trùng
- Phƣơng pháp thay đổi áp suất thẩm thấu và pH của môi trƣờng: Sử dụng
mơi trƣờng ƣu trƣơng (hypertonic) có áp suất thẩm thấu 380mosm (Brackett và
Oliphant, 1975).
- Phƣơng pháp sử dụng Albumin huyết thanh bò và dịch nang trứng: Tinh
trùng bò đƣợc tiếp xúc với huyết thanh bò trong một dung dịch muối sinh lý phù
hợp có thể hoạt hóa trong ống nghiệm và huyết thanh bò cũng đƣợc sử dụng
thƣờng xuyên trong môi trƣờng thụ tinh ống nghiệm.
- Phƣơng pháp dùng canxi ionophore (A23187): đây là phƣơng pháp giúp
tinh trùng vƣợt qua giai đoạn đầu của q trình hoạt hóa bằng cách tăng trực tiếp
lƣợng Ca2+của tế bào và gây phản ứng. Xử lý bằng ionophore làm tăng hoạt
động hô hấp của tinh trùng bò.
- Phƣơng pháp sử dụng heparin và các loại glycosaminoglycan khác để
hoạt hóa tinh trùng bị.
15