Luận văn : NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) part 5 potx

27
Các phƣơng pháp phát hiện PMWaV
Sether và c.s. (2001) đã sử dụng kĩ thuật RT-PCR và Southern Blot để phát hiện
PMWaV. Mô lá hay rệp được nghiền trong nitơ lỏng và tách chiết RNA tổng số sử
dụng Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Mẫu RNA tinh sạch
được bảo quản ở -80
0
C cho đến khi sử dụng. cDNA thứ nhất dựa trên vùng gene mã
hóa HSP 70 của PMWaV-1 và PMWaV-2 được tổng hợp từ 2,5 – 7 g RNA sử dụng
primer tái tổ hợp 223 và 226 cho PMWaV-1 và PMWaV-2; việc tổng hợp thực hiện ở
42
0
C (45 phút) sau đó bất hoạt ở 95
0
C (5 phút). Sau đó phản ứng PCR được tiếp tục
trong cùng tube với primer 224 và 225 với chương trình nhiệt như sau: giai đoạn biến
tính 94
0
C (4 phút); 45 chu kì 94
0
C (1 phút), 54
0
C (1 phút), 72
0
C (1 phút) và giai đoạn
kéo dài cuối cùng 72
0
C (10 phút). Sản phẩm PCR được quan sát trên gel agarose 1%
được nhuộm ethidium bromide.

Gel chứa sản phẩm khuếch đại được làm biến tính, trung hòa và chuyển lên
màng Zeta- Probe GT (Biorad, Hercules, CA) thực hiện Southern blot. Kháng thể đơn
dòng đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng trong kĩ thật TBIA; Mab 35-6-5 cho
PMWaV-1 và Mab 63-2-2 cho PMWaV-2. RT-PCR và TBIA được sử dụng song song
để phát hiện PMWaV.
Loại bỏ virus
Theo Sether và c.s. (2001), PMWaV-1 ở chồi dứa nhiễm bệnh được loại bỏ
bằng xử lí nhiệt. Quá trình xử lí nhiệt gồm 2 giai đoạn: 35
0
C trong 24 giờ tiếp theo
ngay sau đó là 58
0
C trong 40 phút hay 56
0
C trong 60 phút trong bồn nước (water
bath). Lá được cắt khỏi chồi 24 giờ sau giai đoạn 2 xử lí nhiệt. Thực hiện vô mẫu với
các khối vuông cắt ra từ chồi ngọn và chồi đỉnh có kích thước 1mm . Các môi trường
nuôi cấy khác nhau đã được sử dụng để tái sinh mẫu cấy. Khi rễ phát triển, cây tái sinh
hoàn chỉnh được chuyển ra trồng ngoài đất. Thực hiện việc kiểm tra PMWaV bằng
RT-PCR trước đó. Thử nghiệm TBIA đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng 1 – 2 tháng
sau khi trồng cây ngoài đất. Kết quả thực hiện cho thấy 92% cây hồi phục ở tất cả các
nghiệm thức.
2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
Nhìn chung, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều về bệnh đỏ đầu lá. Các đề tài
nghiên cứu chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan mật số rệp và mức độ bệnh ở
dứa. Theo kết quả điều tra tình hình bệnh wilt của nhóm điều tra bệnh hại trên dứa


28
thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 cho thấy bệnh wilt xuất hiện ở

tất cả các ruộng với tỉ lệ bệnh cao: nông trường Thọ Vực (Đồng Nai) có tỉ lệ bệnh cao
nhất: 12,1%, tiếp theo là nông trường Phạm Văn Hai 6% và nông trường Lê Minh
Xuân 7%; còn ở Bến Lức (Long An), Tân Phước (Tiền Giang) và Đức Trọng (Lâm
Đồng) tỉ lệ bệnh lần lượt là 9,3%, 8,1% và 4,1% (Phạm Văn Khánh, 2004; Võ Thị Mỹ
Hân, 2004; và Võ Thị Thúy Huệ, 2004).
Phòng trừ bệnh
Theo Nguyễn Văn Kế (2000), để phòng chống bệnh wilt cần áp dụng biện pháp
phòng trừ tổng hợp như: chọn giống ít nhiễm bệnh để trồng (giống Cayenne rất dễ
nhiễm bệnh). Với các giống trong nước thì dứa Kiên Giang ít bệnh hơn dứa Bến Lức.
Lưu ý không lấy chồi ở những vườn bị bệnh kết hợp với sử dụng thuốc trừ sâu để xử lí
chồi trước khi trồng. Khử đất để trừ kiến và rệp. Làm sạch cỏ và các cây dứa của mùa
trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và kiến.


29
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung
Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung như sau:
Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus bằng nuôi cấy ĐST và xử lí nhiệt.
Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV-1 và PMWaV-2 trên cây dứa in vitro nuôi cấy từ
ĐST đã qua xử lí nhiệt bằng kĩ thuật RT-PCR.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 1/3 – 30/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và
Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử
lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Thí nghiệm tiến hành trên chồi dứa Cayenne in vitro có nguồn gốc khác nhau:
Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Cây dứa in vitro cao từ 4 – 5 cm được xử lí nhiệt
trong thời gian 30 ngày. Sau đó tiến hành tách ĐST các cây đã xử lí nhiệt để nuôi cấy.

Chồi dứa tái sinh từ đỉnh sinh trưởng sau 70 ngày nuôi cấy được kiểm tra virus
PMWaV bằng RT-PCR để đảm bảo là cây sạch virus.
3.3.1. Vật liệu
3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy
Sử dụng chồi dứa Cayenne bị bệnh wilt gồm 3 giống như sau:
Giống 1: giống Trung Quốc do Nông trường Thọ Vực, Đồng Nai cung cấp.
Giống 2: giống Thái Lan do Nông trường Phạm Văn Hai, Tp HCM
cung cấp.
Giống 3: giống Lâm Đồng do Chi cục BVTV Đơn Dương, Lâm Đồng cung
cấp.
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như Autoclave, tủ cấy vô trùng, đèn
UV, dụng cụ nuôicấy mô…
Bình nuôi cấy 500ml, ống nghiệm 2,5x 10 cm
Tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350
Kính hiển vi soi nổi Olympus SZ40


30
3.3.1.3. Hóa chất
Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962)
Chất điều hòa tăng trưởng N
6
-benzyladenine [BA] (2mg/l)
3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành
Tạo nguyên liệu ban đầu
Dùng môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung BA (2mg/l) để nhân chồi 3 giống
dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Sử dụng bình nuôi cấy 500ml, mỗi
bình chứa 50 ml môi trường được hấp tiệt trùng bằng Autoclave ở điều kiện 121
0

C, 1,2
atm trong 25 phút trước khi sử dụng. Sau 1 tháng, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy
vô trùng.
Các bình nuôi cấy được bảo quản trong phòng tăng trưởng ở điều kiện như sau:
Nhiệt độ: 24 + 2
0
C
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ ( từ 6 giờ – 21 giờ)
Cường độ ánh sáng: 1000 – 2000 lux
Ẩm độ: 55% – 60%
Xử lí nhiệt
Cây dứa in vitro cao khoảng 4 – 5 cm được cấy chuyền sang môi trường MS
trước xử lí nhiệt 2 tuần. Các bình nuôi cấy được đặt trong tủ xử lí nhiệt Environmental
Test Chamber MLR-350 (ETC) của TT PTTN ĐH Nông Lâm. Nút đậy cao su của
bình được thay bằng nylon chịu nhiệt để tạo điều kiện trao đổi nhiệt tốt.
Điều kiện xử lí
Nhiệt độ: 37
0
C + 0,1
.Ẩm độ: 55%
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
Thời gian xử lí: 30 ngày
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Mẫu nuôi cấy là ĐST chồi dứa Cayenne in vitro đã qua xử lí nhiệt và đối chứng
là ĐST không xử lí nhiệt. Các thao tác nuôi cấy mô được tiến hành trong tủ cấy vô
trùng. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy được hấp tiệt trùng ở 121
0
C, 1,2 atm trong 25
phút. Quan sát bằng kính hiển vi soi nổi Olympus, dùng dao lam tách ĐST kích thước

31
0,3 – 1 mm và đặt nhẹ lên bề mặt môi trường. Mỗi ĐST được cấy vào một ống nghiệm
chứa 10 ml môi trường MS .
Các ống nghiệm chứa ĐST được bảo quản ở điều phòng tăng trưởng và ghi
nhận các chỉ tiêu theo dõi sau 30, 50 và 70 ngày.
3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh của
ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely
Randomized Design, CRD), 3 yếu tố, 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại.
Mỗi nghiệm thức gồm 3 chồi tái sinh từ ĐST.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của
ĐST chồi dứa Cayenne
Nghiệm thức
Giống
Xử lí nhiệt
Kích thƣớc mẫu
1
TQ
-
*
2
TL
-
*
3
LĐ

-
*
4
TQ
+
*
5
TL
+
*
6
LĐ
+
*
7
TQ
-
**
8
TL
-
**
9
LĐ
-
**
10
TQ
+
**

11
TL
+
**
12
LĐ
+
**
Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí
nhiệt; (*): mẫu ĐST có kích thước từ 0,3 - 0,5 mm; (**): mẫu ĐST có kích thước từ 0,5 –
1mm.



32

Các chỉ tiêu theo dõi
Thời gian tái sinh: được tính từ khi cấy ĐST đến khi lá đầu tiên của chồi tái
sinh xuất hiện.
Tỉ lệ sống: tỉ lệ giữa số ĐST tái sinh và số ĐST cấy ban đầu. Tỉ lệ này được
ghi nhận 30 ngày sau khi cấy ĐST.
Hệ số nhân chồi 70 ngày sau khi cấy.
Hệ số nhân chồi = tổng số chồi đếm được/ tổng số mẫu cấy ban đầu.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự
sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely
Randomized Design, CRD), hai yếu tố, 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại.
Mỗi nghiệm thức gồm 3 chồi tái sinh từ ĐST.
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên

sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST
Nghiệm thức
Giống
Xử lí nhiệt
1
TQ
-
2
TL
-
3
LĐ
-
4
TQ
+
5
TL
+
6
LĐ
+
Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt
(+): xử lí nhiệt
Các chỉ tiêu theo dõi
Chiều cao chồi (cm): tính từ mặt thạch đến đầu lá dài nhất khi được vuốt
thẳng.
Số lá: tổng số lá của chồi
Số rễ: tổng số rễ của chồi.

33
Chiều dài rễ (cm): tính theo chiều dài của rễ dài nhất.
Các số liệu được ghi nhận sau 30, 50 và 70 ngày nuôi cấy.
Xử lí số liệu
Sử dụng phần mềm Statgraphics 7.0 để xử lí số liệu.
3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh
trƣởng
Cây dứa tái sinh từ ĐST ở Nội dung 1 được kiểm tra virus PMWaV-1 và
PMWaV-2 bằng kĩ thuật RT-PCR.
3.4.1. Vật liệu
Mẫu kiểm tra
Mẫu lá của chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng.
Thiết bị và dụng cụ
Máy điện di
Máy PCR
Máy ly tâm
Tủ lạnh -20
0
C, tủ mát 4
0
C
Pipet, cối nghiền mẫu
Hóa chất
Kit tách chiết RNA: Arum Total RNA Mini Kit (Bio- rad).
Primer chuyên biệt để nhận biết PMWaV-1 và PMWaV-2.
Primer đặc trưng cho PMWaV-1 có trình tự như sau:
5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’
5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’
Primer đặc trưng cho PMWaV-2 có trình tự như sau:

5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’
5’-CCATCCACCAATTTTACTAC-3’
Access RT-PCR kit (Promega)
Tris-Acetic acid-EDTA (TAE) 0,5X
3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành
Ly trích RNA tổng số


34
Sử dụng qui trình ly trích RNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 2) để
thu RNA tổng số. Dịch ly trích RNA được sử dụng trong các phản ứng RT-PCR. RNA
của PMWaV (nếu có) sẽ được khuếch đại nhờ các primer đặc hiệu với đoạn gen HSP
70 của virus. Sản phẩm khuếch đại RT-PCR được thể hiện trên gel điện di. Nhuộm
ethidium bromide và chụp hình gel bằng tia UV để đọc kết quả.
Thực hiện RT-PCR
Bƣớc 1: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Các hoá chất cần chuẩn bị như sau:
Nuclease –free light mineral oil (Sigma Cat # M5904)
Hỗn hợp phản ứng (reaction mix)
Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT - PCR
Thành phần mix RT - PCR
Thể tích sử dụng
Nuclease – Free water
X l
MMV/Tfl 5X ( ủ ở 65
0
C 15 phút trước khi pha)
10 l
dNTP (*)
1 l
Primer xuôi và ngược (**)

50 pmol/loại
25 nM MgSO
4
(*)
2 l
AMV RT ( 5 u / l )
2 l
Tfl DNA polymerase ( 5 u / l )
1 l
Dịch ly trích RNA
2 l
Thể tích cuối
V = 50 l
Ghi chú:
(*) Vortex trước khi sử dụng
(**) Primer đặc trưng cho HSP 70 của PMWaV-1,2 do IDT (Intergrated of
DNA technologies, USA) cung cấp
Pha mix trong tube 0,5 ml và trộn đều bằng pipet. Sau khi thêm AMV RT và
Tfl DNA polymerase vào, vortex hỗn hợp trong 10 giây.
Phủ lên mỗi tube 1- 2 giọt Nuclease – free mineral oil.
Đặt tube vào bồn giữ nhiệt ủ ở 45
0
C trong 45 phút.
Bƣớc 2 Thực hiện phản ứng RT- PCR


35
Cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước gồm quá trình
tổng hợp cDNA và khuếch đại RNA.
Chu kì nhiệt cho phản ứng

Giai đoạn 1 (thực hiện phiên mã ngược)
Tổng hợp sợi cDNA : 45
0
C/ 45 phút (1 chu kì); 94
0
C/2 phút (1 chu kì)
Giai đoạn 2 (phản ứng PCR)
cDNA được khuếch đại theo chương trình nhiệt sau:
92
0
C/30 giây, 58
0
C/1 phút, 68
0
C/90 giây (10 chu kì); 92
0
C/30
giây, 54
0
C/1 phút, 68
0
C/90 giây (35chu kì).
68
0
C/8 phút (1 chu kì).
Điện di sản phẩm
Chuẩn bị hỗn hợp điện di 5 l/ giếng (3,5 l mẫ + 1,5 l loading dye)
Load hỗn hợp lên gel agarose 1,5% và chạy điện di trong 60 phút ở 50V cho
đến khi vạch màu loading dye chạy đến 2/3 chiều dài gel.
Buffer điện di là TAE 0,5X.

Nhuộm Ethidium bromide 15 phút và chụp hình gel dưới tia UV và đọc kết
quả.
Mẫu kiểm tra
Gồm 12 mẫu lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau:
Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ
thuật RT-PCR
Giống
Xử lí nhiệt
Số mẫu kiểm tra
TQ
-
1
TL
-
1
LĐ
-
1
TQ
+
3
TL
+
3
LĐ
+
3
Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt,
(+): xử lí nhiệt.

36


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS
4.1.1 Thời gian tái sinh
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (TGTS) của ĐST
chồi dứa Cayenne như sau:
Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lý nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của
ĐST chồi dứa Cayenne
Yếu tố ảnh hƣởng
Nghiệm thức
TGTS trung bình (ngày)
Giống
TQ
1, 4, 7, 10
12,56
a
TL
2, 5, 8, 11
12,78
a
LĐ
3, 6, 9, 12
12,56
a
Xử lí nhiệt
-

1, 2, 3, 7, 8, 9
12,50
a
+
4, 5, 6, 10, 11, 12
12,76
a
Kích thƣớc
mẫu (mm)
0,3 – 0,5
1, 2, 3, 4, 5, 6
13,44
b
0,5 – 1
7, 8, 9, 10, 11, 12
11,81
a
Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống
nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).

Kết quả Bảng 4.1 cho thấy sự khác biệt về thời gian tái sinh xét theo yếu tố
giống và xử lí nhiệt là do sai số ngẫu nhiên (P 0,05). Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt
thống kê do ảnh hưởng của kích thước mẫu (P 0,05). Các nghiệm thức với kích
thước mẫu từ 0,3 – 0,5 mm có thời gian tái sinh trung bình là 13 ngày trong khi với
kích thước mẫu từ 0,5 – 1 mm thời gian tái sinh trung bình là 11 ngày. Nhìn chung
thời gian tái sinh là 12,62 ngày (xem Phụ lục).