Luận văn : NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) part 6 pdf

37
Trong các tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng, chỉ có tương tác giữa yếu tố
giống – xử lí nhiệt và giống – kích thước mẫu ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (P
0,05); các tương tác còn lại đều không có ý nghĩa (P 0,05). Tương tác giữa giống –
xử lí nhiệt kéo dài thời gian tái sinh và mức độ ảnh hưởng khác nhau tùy theo giống.
Tương tác giữa giống – kích thước mẫu làm thay đổi thời gian tái sinh trung bình. Tuy
nhiên mẫu có kích thước từ 0,5 – 1 mm vẫn tái sinh sớm hơn so với mẫu có kích thước
từ 0,3 – 0,5 mm.








Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi
soi nổi SZ40
4.1.2 Tỷ lệ tái sinh
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh (TLTS) của ĐST chồi
dứa Cayenne như sau:
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu đến tỉ lệ tái
sinh (TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne
Yếu tố ảnh hƣởng
Nghiệm thức
TLTS trung bình (%)
Giống
TQ
1, 4, 7, 10

55,56
a

TL
2, 5, 8, 11
58,33
a

LĐ
3, 6, 9, 12
69,44
a

Xử lí nhiệt
-
1, 2, 3, 7, 8, 9
59,26
a

+
4, 5, 6, 10, 11, 12
62,96
a

Kích thƣớc
mẫu (mm)
0,3 – 0,5
1, 2, 3, 4, 5, 6
42,59
a

0,5 – 1
7, 8, 9, 10, 11, 12
79,63
b




38
Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống
nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả phân tích thống kê cho thấy tỉ lệ tái sinh trung bình của ĐST chồi dứa
Cayenne in vitro là 61,11% (Phụ lục 4). Qua Bảng 4.2 có thể thấy tỉ lệ tái sinh ở các
nghiệm thức xét theo yếu tố giống và xử lí nhiệt không có sự khác biệt về mặt thống
kê (P 0,05). Sự khác biệt có ý nghĩa của tỉ lệ tái sinh do kích thước mẫu tác động.
Các nghiệm thức với kích thước mẫu từ 0,5 – 1 mm có tỉ lệ tái sinh là 79,63% trong
khi với kích thước mẫu từ 0,3 – 0,5 mm tỉ lệ tái sinh thấp chỉ đạt 42,59%. Theo kết quả
phân tích thống kê (Phụ lục 4) sự tương tác giữa các yếu tố xem xét (giống, xử lí nhiệt
và kích thước mẫu) không ảnh hưởng đến tỉ lệ tái sinh của ĐST.
4.1.3 Hệ số nhân chồi
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) của ĐST
chồi dứa Cayenne như sau:
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt đến hệ số nhân chồi (HSNC)
của ĐST chồi dứa Cayenne
Yếu tố ảnh hƣởng
Nghiệm thức

HSNC trung bình
Giống
TQ
1, 4, 7, 10
1,19
a

TL
2, 5, 8, 11
1,05
a

LĐ
3, 6, 9, 12
1,08
a

Xử lí nhiệt
-
1, 2, 3, 7, 8, 9
1,06
a

+
4, 5, 6, 10, 11, 12
1,17
a

Kích thƣớc
mẫu (mm)

0,3 – 0,5
1, 2, 3, 4, 5, 6
1,02
a

0,5 – 1
7, 8, 9, 10, 11, 12
1,20
b

Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống
nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).



39
Nhìn chung hệ số nhân chồi của chồi dứa tái sinh từ ĐST rất thấp. Theo kết quả
thống kê, hệ số nhân chồi trung bình của các nghiệm thức là 1,11 (Phụ lục 4). Xét theo
yếu tố giống và xử lí nhiệt, sự khác biệt hệ số nhân chồi ở các nghiệm thức là do sai số
ngẫu nhiên, không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05). Sự khác biệt hệ số nhân chồi
có ý nghĩa chủ yếu do kích thước mẫu chi phối (P 0,05). Các nghiệm thức với kích
thước mẫu từ 0,5 – 1mm có hệ số nhân chồi là 1,20 trong khi với kích thước mẫu từ
0,3 – 0,5mm hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,02. Ngoài ra, sự tương tác giữa 2 yếu tố xử lí
nhiệt – kích thước mẫu cũng ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi của các nghiệm thức (P
0,05). Các nghiệm thức có xử lí nhiệt và kích thước mẫu từ 0,5 – 1mm có hệ số nhân
chồi cao hơn các nghiệm thức còn lại.
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng

của cây tái sinh từ ĐST
4.2.1 Chiều cao chồi
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiếu cao chồi của ĐST chồi dứa
Cayenne như sau:
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến chiều cao chồi dứa tái
sinh từ ĐST
Yếu tố ảnh
hƣởng
Nghiệm thức
Chiều cao trung bình (cm)
30 ngày
50 ngày
70 ngày
Giống
TQ
1, 4
0,66
b

1,05
b

1,90
b

TL
2, 5
0,58
ab

0,80
ab

1,16
a

LĐ
3, 6
0,46
a

0,65
a

0,87
a

Xử lí
nhiệt
-
1, 2, 3
0,57
a

0,92
a

1,45
a

+
4, 5, 6
0,55
a

0,75
a

1,17
a

Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo
sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).

Kết quả xử lí số liệu cho thấy chiều cao trung bình của chồi dứa tái sinh sau 30
ngày, 50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 0,56 cm, 0,83 cm và 1,31 cm (Phụ lục
4). Sự khác biệt có ý nghĩa về chiều cao (P 0,05) ở các nghiệm thức chủ yếu do


40
giống chi phối. Bảng 4.4 cho thấy chồi dứa Cayenne Trung Quốc và Thái Lan tăng
trưởng chiều cao nhanh hơn so với Cayenne Lâm Đồng. Sự khác biệt về chiều cao xét
theo yếu tố xử lí nhiệt là do sai số ngẫu nhiên (P > 0,05).
Sự tương tác giữa yếu tố giống và xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến chiều cao
của các nghiệm thức 30 ngày và 50 ngày sau khi cấy nhưng ảnh hưởng của tương tác
này thể hiện rõ ở chồi dứa tái sinh 70 ngày sau khi cấy. Ảnh hưởng của tương tác thay
đổi tùy theo giống. Theo kết quả xử lí số liệu (Phụ lục 4), đối với giống Cayenne

Trung Quốc, chồi được xử lí nhiệt cao hơn so với chồi không xử lí nhiệt. Đối với
giống Cayenne Thái Lan, chồi dứa được xử lí nhiệt thấp hơn so với chồi không xử lí
nhiệt; trong khi ở giống Cayenne Lâm Đồng việc xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến
chiều cao của chồi dứa tái sinh.








Hình 4.2 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 30 ngày nuôi cấy cuả NT1 - NT6









Hình 4.3 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy cuả NT1 – NT6
4.2.2 Số lá


41
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến số lá của chồi dứa Cayenne tái sinh
từ ĐST như sau:

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số lá của chồi dứa tái sinh
từ ĐST
Yếu tố ảnh
hƣởng
Nghiệm thức
Số lá trung bình
30 ngày
50 ngày
70 ngày
Giống
TQ
1, 4
3,39
a

5,17
a

7,17
b

TL
2, 5
3,22
a

4,83
a

6,11
ab

LĐ
3, 6
3,50
a

4,44
a

5,56
a

Xử lí
nhiệt
-
1, 2, 3
2,70
a

4,52
a

6,22
a

+
4, 5, 6

4,04
b

5,11
a

6,33
a


Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo
sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả xử lí số liệu cho thấy số lá trung bình của chồi dứa tái sinh sau 30 ngày,
50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 3,37; 4,81 và 6,28 lá (Phụ lục 4). Xét theo yếu
tố giống, sự khác biệt về số lá của các nghiệm thức ở 30 ngày và 50 ngày sau khi cấy
là do sai số ngẫu nhiên; ở thời gian 70 ngày sau khi cấy giá trị trung bình của các
nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (P 0,05). Sau 70 ngày có thể thấy chồi
dứa tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan có số lá nhiều hơn so với
Cayenne Lâm Đồng. Yếu tố xử lí nhiệt chỉ ảnh hưởng đến chồi tái sinh 30 ngày; chồi
tái sinh 30 ngày được xử lí nhiệt có số lá nhiều hơn so với chồi không xử lí nhiệt.
Sự tương tác giữa giống và xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến số lá trung bình
của các nghiệm thức.
4.4.3 Số rễ


42
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến số lá của chồi dứa Cayenne tái sinh

từ ĐST như sau:




Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa
tái sinh từ ĐST
Yếu tố ảnh
hƣởng
Nghiệm thức
Số rễ trung bình
30 ngày
50 ngày
70 ngày
Giống
TQ
1, 4
0
1,83
b

3,17
a

TL
2, 5
0
0,94
a

2,67
a

LĐ
3, 6
0
1,00
ab

2,67
a

Xử lí
nhiệt
-
1, 2, 3
0
1,11
a

3,19
a

+
4, 5, 6
0
1,40
a

2,48

a

Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt
Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo
sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả xử lí số liệu cho thấy số rễ trung bình của chồi dứa tái sinh sau 50 ngày
và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 1,26 và 2,83 rễ (Phụ lục 4). Xét theo yếu tố giống, sự
khác biệt về số rễ chỉ có ý nghĩa về mặt thống kê ở chồi dứa tái sinh 50 ngày; chồi tái
sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc có số rễ cao nhất 1,83 rễ khác biệt rất ý nghĩa
so với giống Cayenne Thái Lan có số rễ trung bình chỉ đạt 0,94. Xét theo yếu tố xử lí
nhiệt, sự khác biệt giữa giá trị trung bình của các nghiệm thức là do sai số ngẫu nhiên.
Sự tương tác giữa yếu tố giống và xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến số rễ trung
bình của các nghiệm thức.
4.2.4 Chiều dài rễ
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiều dài rễ của chồi dứa Cayenne
tái sinh từ ĐST như sau:



43

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa
tái sinh từ ĐST
Yếu tố ảnh
hƣởng
Nghiệm thức
Chiều dài rễ trung bình (cm)
30 ngày
50 ngày
70 ngày
Giống
TQ
1, 4
0
0,46
b

0,77
b

TL
2, 5
0
0,24
a

0,82
b

LĐ
3, 6

0
0,17
a

0,39
a

Xử lí
nhiệt
-
1, 2, 3
0
0,29
a

0,79
b

+
4, 5, 6
0
0,29
a

0,54
a

Ghi chú:
TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng
(-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt

Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo
sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Kết quả xử lí số liệu cho thấy chiều dài rễ trung bình của chồi dứa tái sinh sau
50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 0,29 cm và 0,66 cm (Phụ lục 4). Xét theo yếu
tố giống, chiều dài rễ trung bình của các nghiệm thức 50 ngày và 70 ngày sau khi cấy
đều có sự khác biệt về mặt thống kê. Trong thời gian 50 ngày sau khi cấy, chồi tái sinh
thuộc giống Cayenne Trung Quốc có chiều dài rễ trung bình cao nhất đạt 0,46 cm khác
biệt rất ý nghĩa so với chồi tái sinh của hai giống còn lại. Trong khi đó ở chồi tái sinh
70 ngày thì giống Cayenne Thái Lan có chiều dài rễ trung bình cao nhất đạt 0,82 cm,
kế đến là giống Cayenne Thái Lan; chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Lâm Đồng có
chiều dài rễ trung bình thấp nhất và khác biệt rất có ý nghĩa so với chồi tái sinh thuộc
giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan. Xét theo yếu tố xử lí nhiệt, sự khác biệt ý
nghĩa về chiều dài rễ trung bình giữa các nghiệm thức chỉ có ở chồi tái sinh 70 ngày;


44
các nghiệm thức với chồi không xử lí nhiệt có chiều dài rễ trung bình cao hơn và khác
biệt có ý nghĩa so với chồi đã xử lí nhiệt.
Kết quả xử lí số liệu cho thấy ảnh hưởng của sự tương tác giữa yếu tố giống và
xử lí nhiệt thể hiện rõ ở chồi dứa tái sinh 70 ngày. Đối với chồi tái sinh thuộc giống
Cayenne Trung Quốc, việc xử lí nhiệt làm tăng chiều dài rễ trung bình nhưng làm
giảm chiều dài rễ trung bình của chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Thái Lan; trong khi
chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Lâm Đồng không bị ảnh hưởng bởi việc xử lí nhiệt.
4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST
4.3.1 Kết quả kiểm tra PMWaV-1
Sau khi kiểm tra PMWaV -1 bằng kĩ thuật RT- PCR ta có kết quả như sau:



1500bp

589 bp



Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST
không qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1.
. Giếng 1: thang chuẩn với các kích thước từ 100 – 1500 bp
Giếng 2,3,4: mẫu Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng
Giếng 5: đối chứng âm không chứa RNA khuôn mẫu
Giếng 6: đối chứng dương
Kết quả điện di của mẫu chồi dứa tái sinh từ ĐST không xử lí nhiệt (Hình 4.4)
cho thấy cả 3 mẫu kiểm tra đều có PMWaV-1. Ở giếng 2, 3 và 4 đều xuất hiện band
kích thước 589 bp đặc trưng của PMWaV-1. Những vạch trắng mờ ở cuối gel có thể là
những RNA bị đứt gãy hay RNA tạp được khuếch đại một cách ngẫu nhiên bởi primer.
Vệt trắng mờ ở giếng đối chứng âm có thể do gắn kết dimer của primer. Hiện tượng
này có thể khắc phục được bằng cách tăng nhiệt độ bắt cặp làm tăng tính đặc hiệu của
primer. Hình 4.3 cho thấy các mẫu chồi dứa tái sinh từ ĐST không qua xử lí nhiệt vẫn
còn PMWaV-1.
1 2 3 4 5 6


45

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST
đã qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1
Giếng 1: thang chuẩn với các kích thước từ 100 – 1500 bp
Giếng 2, 3, 4: mẫu Cayenne Trung Quốc
Giếng 5: đối chứng dương
Giếng 6, 7, 8: mẫu Cayenne Thái Lan
Giếng 9, 10, 11: mẫu Cayenne Lâm Đồng
Giếng 12: đối chứng âm không có RNA khuôn mẫu
Hình 4.5 cho thấy trong 9 mẫu chồi tái sinh từ ĐST đã xử lí nhiệt chỉ có 3 mẫu
có kết quả PMWaV-1 dương tính. Ở giếng 2, 4, và 9 xuất hiện band kích thước 589 bp
giống như giếng đối chứng dương. Như vậy các mẫu còn nhiễm PMWaV-1 bao gồm 2
mẫu Cayenne Trung Quốc và 1 mẫu Cayenne Lâm Đồng; cả 3 mẫu Cayenne Thái Lan
đều không nhiễm PMWaV-1.
4.3.2 Kết quả kiểm tra PMWaV-2
Sau khi kiểm tra PMWaV -2 bằng kĩ thuật RT- PCR kết quả đạt được như sau:




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1500bp
589bp


46

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sử
dụng primer đặc trưng cho PMWaV-2
Giếng 1, 2, 3: mẫu Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng không qua xử
lí nhiệt.
Giếng 4: thang chuẩn từ 100 – 1500 bp
Giếng 5, 6, 7: mẫu Cayenne Trung Quốc đã qua xử lí nhiệt
Giếng 8, 9, 10: mẫu Cayenne Thái Lan đã qua xử lí nhiệt
Giếng 11,12, 13: mẫu Cayenne Lâm Đồng đã qua xử lí nhiệt
Giếng 14: đối chứng PMWaV-2 dương tính
Giếng 15: đối chứng PMWaV-2 âm tính (không chứa RNA khuôn mẫu)
Hình 4.6 cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra đều âm tính với PMWaV-2. Kết quả
này có độ chính xác cao do mẫu đối chứng dương và đối chứng âm đều thể hiện tốt.
Như vậy 100% mẫu kiểm tra đều có kết quả PMWaV-2 âm tính.
Kết quả kiểm tra PMWaV của các mẫu chồi tái sinh từ ĐST được tóm tắt qua
bảng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15
609 bp

1500bp