Phân lập và định danh chủng nấm men saccharomyces boulardii trong một số chế phẩm probiotic (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN
SACCHAROMYCES BOULARDII TRONG MỘT SỐ CHẾ
PHẨM PROBIOTIC

HÀ NỘI – 2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN
SACCHAROMYCES BOULARDII TRONG MỘT SỐ CHẾ
PHẨM PROBIOTIC

Sinh viên thực hiện

: Trƣơng Thị Ngọc Ánh

Mã sinh viên

: 637306

Lớp

: K63CNSHD

Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Quốc Trung

HÀ NỘI – 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan rằng khố luận này đƣợc thực hiện và hoàn thành bằng
sự nỗ lực của bản thân dƣới sự dìu dắt, hỗ trợ nhiệt tình của ThS. Nguyễn Quốc
Trung – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Tôi xin cam đoan các số liệu, hình ảnh và kết quả trong báo cáo này là
trung thực, khách quan và chƣa từng đƣợc cơng bố trong bất kỳ một cơng
trình khoa học nào. Tất cả sự giúp đỡ, ủng hộ cho việc thực hiện khóa luận tốt
nghiệp đã đƣợc cảm ơn và các thơng tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đều đƣợc
ghi rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo của khóa luận. Tơi xin chịu
trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc hội đồng và nhà trƣờng.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Sinh viên

Trƣơng Thị Ngọc Ánh

i


LỜI CẢM ƠN

Khố luận này đƣợc hồn thành khơng chỉ bởi sự cố gắng của bản thân
mà còn nhận đƣợc vơ vàn tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của các Thầy Cô, bạn
bè.
Lời đầu tiên, cho phép tôi đƣợc gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các
phòng ban của Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ Sinh học, Bộ
môn Sinh Phân tử và Công nghệ Sinh học ứng dụng, các thầy cơ đã tận tình
giảng dạy và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu
và hồn thành khóa luận.
Bằng tình cảm chân thành, tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giảng
viên ThS. Nguyễn Quốc Trung – ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, vun đắp cho tôi
niềm tin, hy vọng đồng thời truyền cảm hứng, động lực để tôi có thể thực hiện
khố luận một cách thuận lợi nhất, đặc biệt là giúp tôi trƣởng thành hơn, trang bị
cho tôi nhiều hành trang để chuẩn bị bƣớc vào đời.
Cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi muốn gửi lời
cảm ơn đến bố mẹ, những ngƣời thân của tơi và tồn thể bạn bè đã giúp đỡ,
động viên tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện, bản thân tơi đã dành nhiều sự cố gắng để hồn
thành khố luận một cách hồn chỉnh nhất có thể. Tuy nhiên, do năng lực có hạn
của mình cũng nhƣ kinh nghiệm, kỹ năng bị hạn chế nên vẫn còn tồn tại những
thiếu sót mà bản thân chƣa nhận thức đƣợc. Chính vì vậy, tơi rất mong nhận
đƣợc sự đóng góp ý kiến và phản hồi của quý Thầy Cô giáo để khố luận này
đƣợc hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Sinh viên

Trƣơng Thị Ngọc Ánh
ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………...vii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... viii
DANH MỤC VIẾT TẮT…………………………………………………….......x
TÓM TẮT ............................................................................................................ xi
PHẦN I: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu của đề tài .......................................................................................... 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces boulardii. ............................. 3
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Saccharomyces boulardii ............................................ 3
2.1.2. Phân loại ...................................................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm về hình thái, kích thƣớc, cấu tạo tế bào ...................................... 4
2.1.4. Cấu trúc hệ gen nấm .................................................................................... 4
2.1.5. Đặc điểm sinh học của nấm men Saccharomyces boulardii ....................... 5
2.1.6. Sinh sản ở nấm men……………………………………………………….6
2.1.7. Vai trò của nấm men Saccharomyces boulardii .......................................... 8
2.2. Một số phƣơng pháp định danh nấm men ...................................................... 9
2.2.1. Phƣơng pháp định danh bằng hình thái, sinh lý, sinh hố .......................... 9
2.2.2. Phƣơng pháp định danh bằng cơng nghệ khối phổ MALDI-TOF ............ 12
2.2.3. Phƣơng pháp định danh tự động bằng máy VITECK ............................... 13
2.2.4. Định danh bằng giải trình gen vùng ITS ................................................... 14
2.3. Một số nghiên cứu về nấm men Saccharomyces boulardii ......................... 14
2.3.1. Nghiên cứu về môi trƣờng nuôi cấy, đặc điểm sinh trƣởng và phân lập
iii

nấm men Saccharomyces boulardii……………………………………...14
2.3.1.1. Nghiên cứu về tối ƣu hoá môi trƣờng lên men Saccharomyces boulardii
sử dụng ma trận Plackett-Burman và phƣơng pháp đáp ứng bề mặt thiết kế cấu trúc có tâm………………………………………………..14
2.3.1.2. Phân lập và xác định nấm men Saccharomyces cerevisiae var. boulardii
và việc sử dụng chúng nhƣ một lợi khuẩn……………………………..15
2.3.2. Nghiên cứu về một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của nấm men
Saccharomyces boulardii………………………………………………...15
2.3.2.1. Nghiên cứu về tính bám dính và khả năng chống chịu dƣới tác động của
pH acid, enzyme tiêu hoá và muối mật của Saccharomyces boulardii…15
2.3.2.2. Nghiên cứu về tính kháng khuẩn của Saccharomyces boulardii………16
2.3.2.3. Nghiên cứu về đặc điểm giống và khác nhau trong cấu trúc phân tử và
đặc điểm sinh lý giữa Saccharomyces boulardii và S. cerevisiae……...17
2.3.2.4. Xác định vị trí phân loại của Saccharomyces boulardii bằng việc phân
tích trình tự vùng D1/D2 của 26s rDNA, ITS1-5.8S rDNA ITS2 và gen
COX2 của ti thể………………………………………………………...17
2.3.2.5. Nghiên cứu về đột biến PGM2 biến đổi galactose làm giảm hiệu quả
probiotic Saccharomyces boulardii…………………………………….18
2.3.3. Nghiên cứu về dƣợc động học của nấm men Saccharomyces
boulardii…………………………………………………………………18
2.3.3.1. Nghiên cứu về việc bổ sung Saccharomyces boulardii trên chuột và
ngƣời trong điều trị bệnh tiêu hoá………………………………………19
2.3.3.2. Sử sụng Saccharomyces boulardii làm thay đổi hệ vi sinh vật đƣờng ruột
và giảm nhiễm mỡ gan, viêm mức độ thấp hay tỷ lệ béo phì hay tiểu
đƣờng loại 2 db/db chuột………………………………………………19
2.3.3.3. Sự đa dạng của Saccharomyces boulardii CNCM I-745 trong cơ chế
hoạt động chống lại nhiễm trùng đƣờng ruột…………………………..20

iv

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 22
3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 22
3.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 22
3.1.2. Địa điểm thực hiện .................................................................................... 23
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 24
3.2.1. Phƣơng pháp phân lập và làm thuần nấm men Saccharomyces boulardii từ
mẫu nghiên cứu (chế phẩm probiotic)…………………………………...24
3.2.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng .............................................................................. 25
3.2.1.2. Chuẩn bị mẫu thử ................................................................................... 25
3.2.1.3. Cấy trải trên đĩa thạch ............................................................................ 26
3.2.2 Phƣơng pháp xác định mật độ và một số đặc tính sinh học của nấm men
Saccharomyces boulardii…………………………………………………26
3.2.3. Phƣơng pháp định danh Saccharomyces boulardii bằng giải trình tự gen
vùng ITS với cặp mồi ITS1 và ITS4…………………………………….28
3.2.3.1. Tách chiết DNA của nấm ....................................................................... 27
3.2.3.2. Chạy PCR ............................................................................................... 28
3.2.3.3. Điện di .................................................................................................... 29
3.2.3.4. Giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger ........................................... 29
PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHÊN CỨU............................................................... 30
4.1. Khảo sát nồng độ kháng sinh thích hợp cho môi trƣờng chọn lọc nấm men
Saccharomyces boulardii…………………………………………………..30
4.1.1. Kết quả 4 mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy trên mơi trƣờng chọn
lọc YPDA có bổ sung 0,005% kháng sinh Chloramphenicol……………30
4.1.2. Kết quả 4 mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy trên mơi trƣờng chọn
lọc YPDA có bổ sung 0,01% kháng sinh Chloramphenicol……………..32
4.1.3. Kết quả 4 mẫu chế phẩm probiotic đƣợc ni cấy trên mơi trƣờng chọn
lọc YPDA có bổ sung 0,015% kháng sinh Chloramphenicol……………33

v

4.1.4. Kết quả 4 mẫu chế phẩm probiotic đƣợc nuôi cấy trên mơi trƣờng chọn
lọc YPDA có bổ sung 0,02% kháng sinh Chloramphenicol……………..34
4.2. Phân lập chủng nấm Saccharomyces boulardii trong các mẫu men probiotic
............................................................................................................................. 35
4.2.1. Kết quả phân lập nấm men Saccharomyces boulardii trong mẫu BF ....... 36
4.2.2. Kết quả phân lập nấm men Saccharomyces boulardii trong mẫu BM ..... 36
4.2.3. Kết quả phân lập nấm men Saccharomyces boulardii trong mẫu BL ...... 37
4.2.4. Kết quả phân lập nấm men Saccharomyces boulardii trong mẫu BZ ...... 37
4.3. Định danh nấm men phân lập bằng phƣơng pháp giải trình tự vùng ITS . 39
4.3.1. Tách chiết DNA......................................................................................... 39
4.3.2. Khuếch đại trình tự vùng ITS bằng phản ứng PCR .................................. 40
4.3.3. Định danh bằng phân tích kết quả giải trình tự gen vùng ITS .................. 40
4.3.3.1. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS ở mẫu BF…………………………42
4.3.3.2. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS ở mẫu BM………………………...42
4.3.3.3. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS ở mẫu BL…………………………43
4.3.3.4. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS ở mẫu BZ…………………………44
4.4. Xác định nồng độ pha lỗng thích hợp để tính mật độ nấm men
Saccharomyces boulardii trong 4 mẫu chế phẩm probiotic……………….45
4.4.1. Mật độ nấm men trong mẫu BF với độ pha loãng 10-6 – 10-9 ................... 45
4.4.2. Mật độ nấm men trong mẫu BM với độ pha loãng 10-3-10-5 .................... 47
4.4.3. Mật độ nấm men trong mẫu BL ở nồng độ 10-5-10-8 ................................ 49
4.4.4. Mật độ nấm men trong mẫu BZ ở nồng độ 10-2-10-4…………………….52
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 54
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 54
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 55
PHỤ LỤC……………………………………………………………..60

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Một số mẫu men vi sinh nghiên cứu………………………………..22
Bảng 3.2. Mơi trƣờng ni cấy chọn lọc có bổ sung kháng sinh
Chloramphenicol…………………………………………………….25
Bảng 4.1. Môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc YPDA có bổ sung kháng sinh ở 4 nồng
độ khác nhau…………………………………………………………30
Bảng 4.2. Hình ảnh kết quả ni cấy các mẫu trong mơi trƣờng YPDA + 0,005%
Chloramphenicol…………………………………………………… .31
Bảng 4.3. Hình ảnh kết quả nuôi cấy các mẫu trong môi trƣờng YPDA + 0,01%
Chloramphenicol..................................................................................32
Bảng 4.4. Hình ảnh kết quả ni cấy các mẫu trong mơi trƣờng YPDA + 0,015%
Chloramphenicol……………………………………………………..33
Bảng 4.5. Hình ảnh kết quả nuôi cấy các mẫu trong môi trƣờng YPDA + 0,02%
Chloramphenicol……………………………………………………..34
Bảng 4.6. Hình ảnh các đĩa ni cấy mẫu BF ở độ pha loãng 10-6 – 10-9 .......... 45
Bảng 4.7. Số lƣợng tản nấm mẫu BF đếm đƣợc ở độ pha loãng 10-6 – 10-9 ....... 46
Bảng 4.8. Hình ảnh các đĩa ni cấy mẫu BM ở nồng độ 10-3-10-5.................... 47
Bảng 4.9. Số lƣợng tản nấm mẫu BM đếm đƣợc ở độ pha loãng 10-3 – 10-5 ...... 48
Bảng 4.10. Hình ảnh các đĩa ni cấy mẫu BL ở nồng độ 10-5-10-8 .................. 49
Bảng 4.11. Số lƣợng tản nấm mẫu BL đếm đƣợc ở độ pha loãng 10-5 – 10-8 ..... 50
Bảng 4.12. Hình ảnh các đĩa ni cấy ở mẫu BZ ở nồng độ 10-2 – 10-4 ............. 51
Bảng 4.13. Số lƣợng tản nấm mẫu BZ đếm đƣợc ở độ pha loãng 10-2 – 10-4 ..... 52

vii


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Hình ảnh minh hoạ nấm men ................................................................ 4
Hình 2.2. Cấu trúc hệ gen Saccharomyces boulardii. ........................................... 5
Hình 2.3. Một số hình thức sinh sản ở nấm men .................................................. 7
Hình 2.4. Quá trình nảy chồi ở nấm men .............................................................. 7
Hình 2.5. Một số kiểu nảy chồi điển hình ở nấm men .......................................... 8
Hình 2.6. Sinh sản bằng hình thức nảy chồi ở nấm men. ................................... 10
Hình 2.7. Hình thức sinh sản qua quá trình phân cắt tế bào. .............................. 10
Hình 2.8. Sinh sản bằng hình thức tạo bào tử hay thông qua vỏ nhày ở nấm men.
........................................................................................................... 10
Hình 2.9. Một số hình dạng tế bào nấm men. ..................................................... 11
Hình 2.10. Quy trình định danh bằng khối phổ MALDI TOF. ........................... 13
Hình 2.11. Hình ảnh về giải trình tự gen bằng phƣơng pháp Sanger. ................. 14
Hình 3.1. Phân lập nấm men từ các mẫu chế phẩm probiotic. ........................... 25
Hình 3.2. Các mẫu thử đƣợc pha lỗng tới nồng độ thích hợp ........................... 26
Hình 4.1. Hình ảnh nấm men phân lập ở mẫu BF............................................... 36
Hình 4.2. Hình ảnh nấm men phân lập ở mẫu BM ............................................. 37
Hình 4.3. Hình ảnh nấm men phân lập ở mẫu BL .............................................. 37
Hình 4.4. Hình ảnh nấm men phân lập ở mẫu BZ. ............................................. 38
Hình 4.5. Kết quả điện di DNA tổng số của nấm men tách chiết. ...................... 39
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 4 mẫu .......................................... 40
Hình 4.7. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS mẫu BF đƣợc hiển thị bằng cơng cụ
Blastn trên NCBI............................................................................... 41
Hình 4.8. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS mẫu BM đƣợc hiển thị bằng công
cụ Blastn trên NCBI .......................................................................... 41
Hình 4.9. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS mẫu BL đƣợc hiển thị bằng công cụ
Blastn trên NCBI............................................................................... 42
Hình 4.10. Kết quả giải trình tự gen vùng ITS mẫu BZ đƣợc hiển thị bằng công
cụ Blastn trên NCBI. ......................................................................... 43
viii

Hình 4.11. Hình ảnh thơng tin cho chủng Saccharomyces boulardii phân tích
trên Blastn của NCBI. ....................................................................... 44
Hình 4.12. Số lƣợng tản nấm mẫu BF ở nồng độ 10-8 ........................................ 46
Hình 4.13. Số lƣợng tản nấm mẫu BM ở nồng độ 10-4 ....................................... 48
Hình 4.14. Số lƣợng tản nấm mẫu BL ở nồng độ 10-6 ........................................ 50
Hình 4.15. Số lƣợng tản nấm mẫu BZ ở nồng độ 10-3 ........................................ 52

ix


DANH MỤC VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải thích nghĩa

BF

BioFlora

BM

Bioacimin

BL

BoLabio

BZ

BioZyme

CFU

Colony Forming unit

C. difficile

Clostridium difficile

DNA

Deoxyribonucleic Acid

FAO

Food and Agriculture Organization
of the United Nations

ITS

Internal Transcibed Spacer

IgA

Immunoglobulin A

kDa

Kilo Dalton

KOAc

Potassium Acetate

MALDI-TOF

Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization/Time

PCR

Polymerase Chain Reaction

RSM-CCD

Response Surface MethodologyCentral Composite Design

RNA

Ribonucleic Acid

rRNA

Ribosomal Ribonucleic Acid

VSV

Vi sinh vật

S. boulardii

Saccharomyces boulardii

WHO

World Health Organization

x


TÓM TẮT
Nghiên cứu đƣợc thực hiện với mục tiêu phân lập các chủng nấm men
Saccharomyces boulardii trên môi trƣờng YPDA bổ sung 0,005% kháng sinh
Chloramphenicol từ 4 mẫu chế phẩm probiotic. Kết quả định danh sơ bộ bằng
hình thái và kết quả giải trình tự gen vùng ITS với cặp mồi ITS1&ITS4 đã
chứng minh 4 mẫu BF, BM, BL, BZ đều thuộc loài nấm men Saccharomyces
boulardii. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra đƣợc nồng độ pha lỗng thích hợp
cho từng loại mẫu BF, BM, BL, BZ lần lƣợt là: 10-8; 10-4; 10-6 và 10-3. Dựa trên
cơ sở đó, xác định đƣợc mật độ nấm trong các mẫu: BF là 9,7.1010; BM là
5,1.106; BL là 2,1.109; BZ là 4,4.105 (đơn vị: CFU/g). Với kết quả trên, ta thấy
mật độ thu đƣợc ở 4 mẫu có sự tƣơng đồng với số liệu mà nhà sản xuất đã cơng
bố. Từ đó, số liệu thu đƣợc sẽ phục vụ cho các công tác kiểm định chỉ tiêu vi
sinh và nghiên cứu thành phần vi sinh có trong các loại chế phẩm probiotic.

xi


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Ngày nay với sự phát triển vƣợt bậc của khoa học cũng nhƣ y học, con
ngƣời đã đƣợc tiếp cận, sử dụng nhiều hơn các sản phẩm sinh học, chế phẩm
probiotic trong việc điều trị và phòng ngừa một số loại bệnh nhằm hƣớng tới
hiệu quả và an toàn cao hơn so với các loại thuốc thông thƣờng. Probiotic theo
định nghĩa của FAO/WHO là các vi sinh vật sống khi đƣợc sử dụng với một
lƣợng thích hợp sẽ mang lại lợi ích cho sức khoẻ vật chủ. Bởi vậy mà ngày càng
có nhiều nghiên cứu về probiotic và các chế phẩm thƣơng mại có nguồn gốc từ
chúng. Một trong số đó khơng thể khơng kể đến chủng nấm men probiotic là
Saccharomyces boulardii.
Trên thế giới, Saccharomyces boulardii hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi
trong sản xuất men tiêu hố để phịng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy ở
ngƣời và vật nuôi. Đây cũng là loại men vi sinh duy nhất đƣợc chiết xuất từ nấm
men.
Ngoài khả năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột tƣơng tự vi khuẩn
lactic, nấm men này cịn mang một ƣu điểm vƣợt trội là có thể đề kháng kháng
sinh. Bên cạnh đó, Saccharomyces boulardii cũng đƣợc biết đến với khả năng
ức chế các cytokine gây viêm bằng việc tiết ra nhiều loại proteases.
Một số nghiên cứu mới đây còn chỉ ra rằng khác với các loại nấm men họ
hàng, S. boulardii có thể tồn tại đƣợc trong các môi trƣờng khắc nghiệt nhƣ: môi
trƣờng axit dịch vị (pH thấp), axit mật hay ở mơi trƣờng có nhiệt độ chênh lệch
so với nhiệt độ phát triển bình thƣờng của vi sinh vật. Đây chính là cơ sở để
Saccharomyces boulardii đƣợc lựa chọn làm thành phần trong các loại chế phẩm
probiotic nhƣ: men vi sinh, phân bón vi sinh,… phục vụ đắc lực cho đời sống
của con ngƣời.
Chính vì những đặc tính hữu ích mà Saccharomyces boulardii mang lại nên
việc nghiên cứu phát triển, kiểm tra và phát hiện sự có mặt của S. boulardii chứa
trong các chế phẩm probiotic là một khâu vô cùng quan trọng và cần thiết. Bởi
1

vậy, trong đề xuất này chúng tôi đã tiến hành phân lập và định danh các chủng
Saccharomyces boulardii để hiểu rõ hơn về đặc điểm hình thái, phân loại cũng
nhƣ xác định đƣợc mật độ của chúng trong một số chế phẩm probiotic.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và định danh chủng nấm men Saccharomyces boulardii từ một
số mẫu chế phầm probiotic đồng thời xác định đƣợc mật độ của nấm S.
boulardii chứa trong các mẫu nghiên cứu.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Phân lập đƣợc nấm Saccharomyces boulardii, định danh các chủng S.
boulardii bằng phƣơng pháp giải trình tự gen vùng ITS.
Xác định đƣợc một số đặc tính sinh học của nấm đồng thời kiểm tra mật độ
nấm men Saccharomyces boulardii trong các mẫu chế phẩm probiotic bằng
phƣơng pháp đếm tản nấm trên đĩa thạch.

2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về nấm men Saccharomyces boulardii.
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Saccharomyces boulardii
Vào những năm 1920, nhà sinh học ngƣời Pháp Henri Boulard đã thực
hiện một chuyến đi vòng quanh Châu Á với mục đích tìm kiếm chủng vi sinh
vật chịu nhiệt đƣợc dùng trong sản xuất rƣợu vang. Khi đặt chân đến Đông Nam
Á, ông đã tận mắt chứng kiến đợt bùng phát ổ dịch tả lớn trong một ngôi làng.
Nhờ sự kiện này, ông đã phát hiện ra ngƣời dân bản địa dùng một loại trà làm từ
vỏ của trái vải và măng cụt để kiểm soát các triệu chứng của bệnh tả. Sau đó,
ơng tiến hành nghiên cứu và phân lập đƣợc một chủng nấm men nhiệt đới thuộc
loài Saccharomyces và dặt tên cho loài nấm men này là Saccharomyces
boulardii.
Bắt đầu từ năm 1980, hàng loạt các cuộc nghiên cứu về Saccharomyces

boulardii đã đƣợc tiến hành để tìm hiểu về lợi ích của lồi nấm này đối với vật
chủ và cơ chế hoạt động của chúng.
2.1.2. Phân loại
Nguồn gốc phân loại của Saccharomyces boulardii dựa trên một số nghiên
cứu (McFarland (1996); Mccullough et al. (1998); Hennequin et al. (2001);
Mitterdorfer et al. (2002)), cho thấy Saccharomyces boulardii thuộc:

Giới

: Nấm

Ngành

: Ascomycota

Phân ngành : Saccharomycotina
Lớp

: Saccharomycetes

Bộ

: Saccharomycetales

Họ

: Saccharomycetaceae

3

2.1.3. Đặc điểm về hình thái, kích thƣớc, cấu tạo tế bào

(Nguồn: />
Hình 2.1. Hình ảnh minh hoạ nấm men
Tế bào nấm men có hình elip, hình bầu dục hay đơi khi là hình cầu với
vách tế bào dày (5 – 10 μm). Thành tế bào chiếm khoảng 30% trọng lƣợng khô
của tế bào, đƣợc cấu trúc bởi polysaccharide (85%) và protein (15%). Trong
thành phần polysaccharomyces có glucose (80-91%), N – acetyglucosamine
(GlcNAc) (1-2%), mannose (10 – 20%). Tế bào chất có chứa các aminoacid,
vitamin B, enzyme và nhiều hợp chất khác (Lesage và cs., 2006).
2.1.4. Cấu trúc hệ gen nấm
Hệ gen của Saccharomyces boulardii gần giống với S. cerevisiae – sinh
vật có nhân điển hình. Trình tự bao gồm 13.000.000 cặp base, 6.275 gen, trong
đó có 5885 gen mã hố cho protein. Khoảng 140 gen mã hoá cho RNA ribosome
(rRNA), 40 gen cho RNA thông tin (mRNA) và 275 gen cho RNA vận chuyển
(tRNA). Khoảng 23% hệ gen của Saccharomyces boulardii giống hệt với bộ gen
của con ngƣời (Goffcau và cs., 1996).

4


(Nguồn: />&ved=2ahUKEwja2eCum-z4AhUDTPUHHfHbAygQ2-cCegQIABAA&oq)

Hình 2.2. Cấu trúc hệ gen Saccharomyces boulardii.
2.1.5. Đặc điểm sinh học của nấm men Saccharomyces boulardii
Saccharomyces boulardii là một loại nấm men nhiệt đới, chúng sinh
trƣởng và phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 37 độ C (nhiệt độ sinh lý bình thƣờng của
cơ thể vật chủ, theo Czrucka và cs., 2007). Hơn nữa, S. boulardii cịn có thể tồn
tại đƣợc trong môi trƣờng khắc nghiệt (môi trƣờng axit dịch vị - pH thấp ở dạ

dày, môi trƣờng muối mật ở ruột, mơi trƣờng có phạm vi nhiệt độ rộng) và có
khả năng đề kháng với kháng sinh. Do đó nên Saccharomyces boulardii đã đƣợc
lựa chọn là thành phần của nhiều loại chế phẩm probiotic, mang lại nhiều lợi ích
cho sức khoẻ con ngƣời.
Saccharomyces boulardii là loài nấm men yếm khí khơng bắt buộc (chúng
có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí).
Loại nấm men này khơng có khả năng đồng hố hay lên men đƣờng lactose
nhƣng lại sinh trƣởng và phát triển tốt trên cơ chất chứa galactose hay glucose.
Trong q trình chuyển hố carbohydrate, có sinh một lƣợng nhỏ acid lactic
(1,04%) và rƣợu (0,5%).

5


Ngồi ra, Saccharomyces boulardii cịn chuyển hố đƣợc các monosaccharide,
polysaccharide, oligosaccharide, ethanol, acetate, glycerol, pyruvate và lactate.
Saccharomyces boulardii là vi sinh vật (VSV) dị dƣỡng, sử dụng năng lƣợng từ
glucose qua con đƣờng glycolysis. Lồi nấm men này cũng khơng thích sử dụng
một số acid hữu cơ nhƣ: acid citric và acid succinic nhƣng tăng trƣởng tốt trên
môi trƣờng chứa acid lactic và không thuỷ phân các hợp chất protein, lipid.
2.1.6. Sinh sản ở nấm men
Nấm men có 3 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dƣỡng, sinh sản đơn tính
và sinh sản hữu tính. Sinh sản sinh dƣỡng là hình thức sinh sản đơn giản nhất.
Ở nấm men, có hai hình thức sinh sản sinh dƣỡng đó là nảy chồi và phân
đôi tế bào theo chiều ngang tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn. Tuy nhiên, nảy chồi là
hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện nhất định, nấm men
sinh sôi nảy nở với tốc độ rất nhanh. Lối phân cắt tế bào ở nấm men cũng tƣơng
tự nhƣ ở vi khuẩn, quá trình này bắt đầu xuất hiện khi tế bào dài ra và ở giữa
mọc ra vách ngăn chia tế bào làm hai phần bằng nhau, mỗi tế bào con chứa một
nhân.

Sinh sản đơn tính là q trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào đơn mà
khơng cần qua q trình tiếp hợp.
Sinh sản hữu tính thƣờng hiếm thấy ở nấm men, nhƣng chúng lại mang một
ƣu điểm là có thể tái tổ hợp các tính trạng di truyền từ thế hệ trƣớc. Quá trình
sinh sản này xảy ra khi hai tế bào nấm men kết hợp với nhau để tạo thành hợp
tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử trong nang. Sau đó, các bào tử sẽ tiếp tục
phân chia và phát tán cho đến khi hai tế bào có kích thƣớc giống nhau tiếp hợp
với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp đẳng giao. Còn nếu hai tế bào nấm men khác
nhau tiếp hợp với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp dị giao.

6


(Nguồn: />
Hình 2.3. Một số hình thức sinh sản ở nấm men

(Nguồn: />
Hình 2.4. Quá trình nảy chồi ở nấm men
(A: Tế bào nấm men trưởng thành; B: Chồi mới bắt đầu hình thành trên chồi
mẹ; C: Quá trình phân chia nhân và tế bào chất diễn ra; D: Chồi mới phát triển
tới kích thước nhất định và chuẩn bị tách khỏi chồi mẹ; E: Chồi mới tách khỏi
chồi mẹ khi đủ lớn).

7


a

b

c

(Nguồn: />
Hình 2.5. Một số kiểu nảy chồi điển hình ở nấm men
(a): Nảy chồi đơn cực
(b): Nảy chồi lưỡng cực (c): Nảy chồi đa cực
2.1.7. Vai trò của nấm men Saccharomyces boulardii
Các nghiên cứu đã chứng minh rằng Saccharomyces boulardii không chỉ
mang lại hiệu quả đối với các bệnh liên quan đến đƣờng ruột mà còn là trợ thủ
đắc lực đối với hệ miễn dịch:
S. boulardii giữ vai trò quan trọng trong việc phát triển và hoạt động của hệ
miễn dịch niêm mạc ruột, nó giúp hệ miễn dịch ruột sản sinh kháng thể IgA
chống lại độc tố khi ruột nhiễm vi khuẩn gây bệnh (80% hệ miễn dịch của cơ thể
nằm ở ruột).
Theo nghiên cứu của Qamar và cs. (2000), nấm men Saccharomyces
boulardii kích thích sản sinh một lƣợng lớn IgA – đóng vai trị quan trọng trong
miễn dịch niêm mạc ruột. Sự có mặt của S. boulardii sẽ tạo ra lƣợng kháng thể
IgA lớn hơn so với các tác nhân khác.
S. boulardii tiết ra polyamine (spermine và spermidine) trong quá trình vận
chuyển qua đƣờng ruột để điều chỉnh tổng hợp gen và protein, kích thích hoạt
động các enzyme ở niêm mạc đại tràng.
Kích thích hệ miễn dịch tự nhiên: Kích hoạt hệ thống lƣới nội mơ, gia tăng
sự di cƣ của bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt. Hơn nữa, chúng còn làm gia tăng
số lƣợng tế bào Kupfer (đại thực bào hình sao).

8


Ngăn ngừa dị ứng, Saccharomyces boulardii giúp hệ miễn dịch cơ thể phân
biệt đƣợc giữa kháng nguyên bệnh và kháng ngun vơ hại. Nhờ đó ngăn ngừa

hệ miễn dịch đáp ứng quá mẫn đối với kháng nguyên vô hại và không gây dị
ứng.
Theo Pothoulakis và cs. (1993); Castagliuolo và cs. (1996), S. boulardii tiết
ra protease 54kDa có vai trị ức chế độc tố (A và B) gây tiêu chảy ở ngƣời.
Saccharomyces boulardii ức chế tăng trƣởng của C. dificile, có khả năng kích
thích hoạt động niêm mạc của vật chủ để tăng cƣờng phản ứng miễn dịch niêm
mạc ruột.
Tăng cƣờng các enzyme thuỷ phân đƣờng đôi nhƣ maltase, sucrase,
lactase…ở niêm mạc ruột làm giảm tiêu chảy do rối loạn men tiêu hoá và kém
hấp thu đƣờng. Tăng hấp thu nƣớc và chất điện giải ở ngƣời đang bị tiêu chảy.
Duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho sự hấp thu nƣớc và chất điện giải.
Ngoài ra, Saccharomyces boulardii có thể làm giảm các phản ứng tiền viêm
của tế bào biểu mơ đƣờng ruột.
Đặc biệt, Saccharomyces boulardii là lồi nấm men có khả năng kháng lại
kháng sinh và sulfamide. Do đó, S. boulardii đã trở thành thành phần khơng thể
thiếu trong việc phòng trị tiêu chảy do mất cân bằng hệ vi sinh đƣờng ruột với
những bệnh nhân phải điều trị kháng sinh lâu ngày.
Hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới, Saccharomyces boulardii đƣợc sử
dụng dƣới dạng đông khô trong các dƣợc phẩm giúp hỗ trợ tiêu hoá nhƣ
Normagut, Bioflora hay Ultra-levure,…
2.2. Một số phƣơng pháp định danh nấm men
2.2.1. Phƣơng pháp định danh bằng hình thái, sinh lý, sinh hố
Ni cấy, định danh vi nấm dựa trên các tính chất về hình thái, cấu tạo,
màu sắc và một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của nấm.
Dựa vào giáo trình nấm men cơng nghiệp của Lƣơng Đức Phẩm (2006), tế
bào nấm men có hình dạng phổ biến nhƣ hình cầu, hình ovan, hình elip, hình trụ
hoặc đơi khi kéo dài thành hình sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dạng, kích
9

thƣớc trong các giai đoạn của quá trình phát triển và tuỳ vào điều kiện môi
trƣờng dinh dƣỡng xung quanh. Kích thƣớc tế bào có thể thay đổi từ 1,5-12μm.
Một số đặc điểm về hình thức sinh sản ở nấm men:

(Nguồn: />
Hình 2.6. Sinh sản bằng hình thức nảy chồi ở nấm men.

(Nguồn: />
Hình 2.7. Hình thức sinh sản qua quá trình phân cắt tế bào.

Bào tử túi

Bào tử màng dày

Bào tử đốt

(Nguồn: />
Hình 2.8. Sinh sản bằng hình thức tạo bào tử hay thông qua vỏ nhày ở nấm
men.

10


Bên cạnh đó, cũng cần dựa vào một số đặc điểm về sinh lý, sinh hoá của
nấm nhƣ: khả năng lên men 13 loại đƣờng, đồng hóa 46 nguồn carbon. Đồng
thời cũng có khả năng đồng hố đƣợc 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine
hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatin. Có thể sinh trƣởng
trong điều kiện thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate,
biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, paminobenzoic acid). Sinh trƣởng trong phổ nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37,
42 (0C), tạo thành tinh bột. Sản sinh acid từ glucose. Thủy phân ure, phân giải

arbutin, phân giải lipid, sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa 50% và 60% glucose,
hóa lỏng gelatine, Phản ứng với Diazonium Blue, phát triển trên môi trƣờng
chứa acid acetic 1%.
a

e

b

c

f

d

g

(Nguồn:Nguyễn Văn Vũ, Nguyễn Văn Thành-“Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men
trong lên men rƣợu vang dâu Hạ Châu” số 7B tập 54, 22-32 (2018)).

Hình 2.9. Một số hình dạng tế bào nấm men.
(a) tế bào hình cầu lớn; (b) tế bào hình cầu nhỏ; (c) tế bào hình ovan lớn; (d)
tế bào hình ovan nhỏ; (e) tế bào hình elip dài; (f) tế bào hình elip ngắn;
(g) tế bào hình elip nhọn.

11


2.2.2. Phƣơng pháp định danh bằng công nghệ khối phổ MALDI-TOF
Công nghệ khối phổ MALDI TOF (matrix assisted laser desorption

ionization-time of flight) ra đời giúp cho việc định danh trở nên dễ dàng hơn.
MALDI là thuật ngữ chỉ phƣơng pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ
trợ của các chất nền và năng lƣợng laser (Matrix-assisted laser desorption
ionization, MALDI). MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dƣới
tác dụng của năng lƣợng laser lớn.
Ban đầu, mẫu đƣợc xử lý, làm tinh sạch bằng nhiều phƣơng pháp khác
nhau. Sau đó mẫu phân tích sẽ đƣợc trộn với các chất nền (các axit yếu nhƣ
sinapinic) chứa các phân tử hữu cơ nhỏ có khả năng hấp thụ năng lƣợng ánh
sáng ở những bƣớc sóng nhất định. Hỗn hợp mẫu và chất nền đƣợc đƣa lên khay
và bay hơi tạo thành các hạt tinh thể bám với peptide. Dƣới tác dụng của nguồn
năng lƣợng laser cực lớn chiếu vào làm cho các chất nền (axit yếu) hấp thụ năng
lƣợng và bật ra các proton. Mẫu đƣợc hấp thụ proton và năng lƣợng sẽ đƣợc đi
vào hệ thống khối phổ TOF. Các ion dƣơng thƣờng đƣợc tạo ra đối với mẫu
dạng các peptide/protein. Mỗi peptide có xu hƣớng hấp thụ một proton kết quả
là ion peptide sẽ tích điện dƣơng +1.
MALDI TOF MS sử dụng công nghệ khối phổ protein định danh vi sinh
vật nhằm so sánh sự tƣơng đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu dựa
trên cơ sở dữ liệu của hơn 8000 chủng vi sinh vật khác nhau. Phân tích MALDI
TOF MS cho phép định danh chính xác lồi vi sinh vật (vi khuẩn gram âm, gram
dƣơng, vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc,...). Đây là cơng nghệ cho
phép định danh vi sinh vật trực tiếp từ môi trƣờng thạch hoặc mẫu bệnh phẩm
trong thời gian 30 phút với 96 mẫu vi sinh vật. Ngồi ra, cơng nghệ MALDI
TOF MS cịn có ƣu điểm là cho kết quả chẩn đốn vi sinh vật nhanh và cho độ
chính xác cao. Dữ liệu đƣợc quản lý, cập nhật thƣờng xuyên từ ngân hàng vi
sinh vật thế giới, có giá trị khoa học cao.

12