Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium l) có khả năng đối kháng nấm phomopsis sp um254 gây bệnh thối quả xoài (khóa luận tốt nghiệp)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4 MB, 90 trang )
HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
--------------
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY TRINH
NỮ HỒNG CUNG (CRINUM LATIFOLIUM L.) CĨ
KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM PHOMOPSIS SP.
UM254 GÂY BỆNH THỐI QUẢ XOÀI”
HÀ NỘI – 2022
HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
--------------
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN NỘI SINH CÂY TRINH
NỮ HỒNG CUNG (CRINUM LATIFOLIUM L.) CĨ
KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM PHOMOPSIS SP.
UM254 GÂY BỆNH THỐI QUẢ XOÀI”
Sinh viên thực hiện
: TRẦN THỊ HỒNG ĐIỆP
Lớp
: K63-CNSHD
Mã SV
: 637313
Ngƣời hƣớng dẫn
: ThS. NGUYỄN THANH HUYỀN
Bộ mơn
: CƠNG NGHỆ VI SINH
HÀ NỘI – 2022
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp
đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022
Sinh viên
Trần Thị Hồng Điệp
i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn ban Giám đốc Học viện, khoa
Công nghệ Sinh học và các thầy, cơ trong khoa đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ
tơi trong suốt q trình học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam,
giúp tôi trưởng thành hơn về nhân cách và trình độ chun mơn.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến cơ ThS. Nguyễn Thanh Huyền – Bộ môn
Công nghệ Vi sinh, khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi trong q trình triển khai đề tài, hồn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Nhân dịp này tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người
thân, bạn bè, những người ln tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi vượt qua
mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hồn thành bài
khóa luận tốt nghiệp này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2021
Sinh viên
Trần Thị Hồng Điệp
ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
TĨM TẮT ............................................................................................................ ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1. Tổng quan về xạ khuẩn .................................................................................. 4
1.1.1. Xạ khuẩn ..................................................................................................... 4
1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh........................................................................................ 8
1.1.3. Sự phân bố của xạ khuẩn nội sinh thực vật............................................... 10
1.1.4. Cách thức xâm nhập của xạ khuẩn nội sinh .............................................. 11
1.1.5. Vai trò của xạ khuẩn nội sinh .................................................................... 13
1.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam......... 18
1.2.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới .............................. 18
1.2.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam ............................... 21
1.3. Giới thiệu về cây Trinh nữ hoàng cung........................................................ 22
1.3.1. Cây Trinh nữ hoàng cung .......................................................................... 22
1.3.2. Phân bố ...................................................................................................... 23
1.3.4. Vai trị của cây Trinh nữ hồng cung ........................................................ 23
1.4. Tổng quan về nấm Phomopsis sp. (Diaporthe sp.) gây bệnh ...................... 25
1.4.1. Giới thiệu chung về nấm Phomopsis sp. ................................................... 25
1.4.2. Cây chủ ...................................................................................................... 25
1.4.3. Triệu chứng bệnh ...................................................................................... 25
1.4.3. Một số bệnh phổ biến do Phomopsis sp. gây ra ở các cây trồng Việt Nam27
Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 30
2.1. Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................. 30
iii
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 30
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất thí nghiệm .................................................. 30
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................. 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 32
2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu............................................................................... 32
2.2.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu ................................................................ 32
2.2.3. Phương pháp phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh ................................ 33
2.2.4. Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn nội sinh ............. 33
2.2.5. Đánh giá đặc điểm hình thái của xạ khuẩn đối kháng .............................. 34
2.2.6. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn đối kháng ............................... 34
2.2.7. Định danh chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm năng dựa trên giải trình tự gen
16S rRNA ........................................................................................................... 38
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................ 41
3.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Trinh nữ hoàng cung ............ 41
3.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn nội sinh với nấm Phomopsis sp. 42
3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn. ............................. 43
3.3.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 43
3.3.2. Đặc điểm sinh hóa của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn ........................... 47
3.3.3. Khả năng sinh trưởng trên các điều kiện nuôi cấy khác nhau .................. 51
3.3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng (IAA) của
các chủng xạ khuẩn nội sinh ............................................................................... 53
3.3.6. Khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm Anthracycline của HN04 và HN05.. 55
3.3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................................. 56
3.4. Định danh chủng xạ khuẩn HN05 dựa trên giải trình tự gen 16S rRNA ..... 57
3.4.1. Tách chiết và xác định nồng độ DNA tổng số .......................................... 57
3.4.2. Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA ........................................................... 58
3.4.3. Giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh loài .................... 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 62
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 72
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh trên
thực vật những năm gần đây ............................................................................... 19
Bảng 2. 2. Chỉ số OD 530nm ở các nồng độ khác nhau ..................................... 36
Bảng 2. 3. Trình tự mồi cho phản ứng PCR........................................................ 39
Bảng 2. 4. Thành phần cho phản ứng PCR ......................................................... 39
Bảng 3. 1. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn nội sinh trên môi trường
Gause I (sau 7 ngày nuôi cấy) ............................................................................. 41
Bảng 3. 2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của xạ khuẩn HN04 ........................... 44
Bảng 3. 3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của xạ khuẩn HN05 ........................... 45
Bảng 3. 4. Khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau của hai chủng xạ
khuẩn nội sinh HN04 và HN05 ........................................................................... 49
Bảng 3. 5. Khả năng sử dụng các nguồn nitro khác nhau của hai chủng xạ
khuẩn HN04 và HN05 ......................................................................................... 50
Bảng 3. 6. Khả năng sinh IAA của HN04 và HN05 ........................................... 54
Bảng 3. 7. Hoạt tính enzyme của hai chủng HN04 và HN05 ............................. 56
Bảng 3. 8. Tỷ số A260/A280 và nồng độ DNA có trong mẫu HN05 ................. 57
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 2. Sơ đồ biểu diễn vịng đời của xạ khuẩn ............................................... 5
Hình 1. 3. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR-5 trên
lá đỗ quyên sau 60 ngày quan sát ........................................................................ 11
Hình 1. 4. Các giai đoạn hình thành tế bào ung thư ............................................ 14
Hình 1. 5. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline:
DOX, DNR, EPI và IDA ..................................................................................... 16
Hình 1. 6. Cây Trinh nữ hồng cung ................................................................... 22
Hình 1. 7. Cấu tạo cây Trinh nữ hồng cung ...................................................... 23
Hình 1. 8 Một số bệnh do các loài Phomopsis gây ra trên các cây trồng ........... 26
Hình 1. 9. Đặc điểm nấm Phomopsis mangiferae gây thối cuống quả xồi
(Galsurker et al., 2018) ....................................................................................... 27
Hình 1. 10. Đặc điểm nấm Phomopsis asparagi gây bệnh khô than khơ cành trên
măng tây .............................................................................................................. 28
Hình 1. 11. Đặc điểm của nấm Phomopsis longicolla gây bệnh trên đậu tương 29
Hình 2. 1. Đường chuẩn IAA .............................................................................. 36
Hình 3. 1. Hình ảnh một số chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên môi trường
Gause I sau 7 ngày nuôi cấy. ............................................................................... 41
Hình 3. 2.. Đánh giá khả năng đối kháng của HN04 và HN05 với nấm P01 sau 7
ngày cấy nấm ....................................................................................................... 42
Hình 3. 3. Hiệu lực ức chế của các chủng xạ khuẩn đối kháng nấm kiểm định
P01 sau 7 ngày cấy nấm ...................................................................................... 43
Hình 3. 4. Hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn nội sinh HN04 trên các mơi
trường ................................................................................................................. 44
Hình 3. 5. Hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn nội sinh HN05 trên các môi
trường ................................................................................................................. 45
Hình 3. 6. Hình thái hệ sợi (A), Cuống sinh bào tử và bào tử (B và C) của xạ
khuẩn HN04 ........................................................................................................ 46
vi
Hình 3. 7. Hình thái hệ sợi (A), Cuống sinh bào tử và bào tử (B và C) của xạ
khuẩn HN05 ........................................................................................................ 47
Hình 3. 8. Hình. Khả năng đồng hóa nguồn carbon của chủng xạ khuẩn HN04
A. Đối chứng dương; B. Đối chứng âm; C. D – Xylose ..................................... 48
Hình 3. 9. Khả năng đồng hóa nguồn carbon của chủng xạ khuẩn HN05 .......... 48
Hình 3. 10. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn HN04 ............ 49
Hình 3. 11. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn HN05 ............ 50
Hình 3. 12. Khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn nội sinh HN04 và
HN05 ở nhiệt độ 25oC, 35oC và 45oC ................................................................. 52
Hình 3. 13. Khả năng sinh IAA của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ................ 54
Hình 3. 14. Kết quả đánh giá khả năng sinh anthracycline của chủng HN04 .... 55
Hình 3. 15. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của HN04 và HN05 ................... 56
Hình 3. 16. Kết quả điện di sản phẩm PCR của chủng xạ khuẩn HN05 trên gel
agarose 1.5 % ...................................................................................................... 58
Hình 3. 17. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen 16S rRNA .............. 59
vii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ
Chữ viết tắt
CMC
Carboxymethyl Cellulose
Cs.,
Cộng sự
DNA
Deoxyribonucleic Acid
et al.
et alii hoặc et aliae
ISP
International Streptomyces Project (Hệ thống phân
loại xạ khuẩn quốc tế)
OD
Optical density (mật độ quang)
PDA
Potato Dextrose Agar
PIRG
Percentage inhibition of radial growth (Phần trăm
ức chế phát triển)
rRNA
Ribosomal Ribonucleic Acid
SCA
Starch Casein Agar
SFM
Mannitol Soya Flour
sp.
Species
ssp.
Subspecies
viii
TĨM TẮT
Đối tượng chính của đề tài này là phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ
cây Trinh nữ hoành cung, nghiên cứu các đặc điểm sinh học và định danh các
chủng có khả năng đối kháng với nấm Phomopsis sp. UM245 gây bệnh thối trên
quả xoài. Sáu chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu rễ, thân, lá cây Trinh
nữ hồng cung thu thập tại Thái Bình. Phương pháp đồng nuôi cấy đã được sử
dụng để tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm năng. Hai chủng xạ khuẩn
có hoạt tính kháng nấm mạnh mẽ nhất là HN04 và HN05 đã được tuyển chọn để
nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, cuống sinh bào tử và bào tử. Sau đó
hai chủng xạ khuẩn này được đánh giá một số đặc điểm sinh hóa như khả năng
sử dụng nguồn carbon, nitơ, sinh sắc tố melanin, sinh trưởng trên các điều kiện
nuôi cấy khác nhau, khả năng sinh IAA, anthracycline và enzyme ngoại bào.
Chủng HN05 tiếp tục được tách chiết DNA tổng số, chạy chuỗi phản ứng (PCR)
trình tự gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và 1492R, sau đó được đem đi giải
trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Dựa trên các đặc điểm hình thái,
sinh hóa và trình tự gen 16S rRNA, chủng xạ khuẩn HN05 có hoạt tính đối
kháng nấm Phomopsis sp. UM254 gây bệnh thối quả xoài thuộc chi
Streptomyces và có họ hàng gần gũi với lồi Streptomyces ardesiacus.
ix
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nông nghiệp với diện tích đất nơng nghiệp chiếm
khoảng 80,4% tổng diện tích đất của Việt Nam (Hoàng Xuân Lâm, 2020) với
các loại cây trồng đa dạng như cây lương thực, cây ăn quả, cây công nghiệp và
các loại cây khác… Bệnh hại cây trồng là một vấn đề nan giải của người nông
dân bởi nó ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng của sản phẩm nông
nghiệp. Bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 80% bệnh hại ở cây trồng với các
dạng triệu chứng cơ bản là thối rữa, hoại tử và héo rũ. Một số loại nấm gây
bệnh cịn có thể sản sinh ra nhiều loại độc tố có hại cho người và động vật, dẫn
đến các vấn đề về an tồn thực phẩm (Zain, 2011). Trong số đó, nấm
Phomopsis sp. Là một loại nấm có tiềm năng gây bệnh trên rất nhiều đối tượng
thực vật đặc biệt là trên quả xoài ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả
sau thu hoạch. Để phòng trừ các loại nấm bệnh thì việc sử dụng các thuốc bảo
vệ thực vật có nguồn gốc hóa chất để diệt nấm bệnh ngày càng phổ biến. Tuy
nhiên, việc sử dụng lâu dài các sản phẩm hóa chất sẽ gây hại khơng chỉ cho cây
trồng mà cịn làm ơ nhiễm mơi trường nghiêm trọng, gây hại cho các loài thiên
địch và sức khỏe con người. Do đó, việc ứng dụng các tác nhân kiểm sốt sinh
học ức chế nấm bệnh là một hướng giải quyết tiềm năng. Tác nhân kiểm soát
sinh học là vi sinh vật ngăn chặn mầm bệnh thực vật (Pal & Gardener, 2006),
có hiệu quả cao trong việc kiểm sốt mầm bệnh và an tồn với mơi trường hơn
so với sử dụng biện pháp hóa học. Một trong những vi sinh vật tiềm năng được
quan tâm đến nhiều đó là xạ khuẩn. Trong những năm gần đây, xạ khuẩn được
đặc biệt quan tâm bởi khả năng sinh tổng hợp được nhiều hợp chất có hoạt tính
sinh học cao.
Cây dược liệu ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng, các bài thuốc cổ
truyền từ xa xưa để lại đã cho thấy tầm quan trọng của cây dược liệu trong điều
trị bệnh. Trong đó, Trinh nữ hồng cung là loại cây dược liệu có nhiều cơng
dụng như ức chế phát triển của khối u, kháng nấm, kháng viêm,…Có những
1
giả thuyết về các chất trong cây dược liệu với những hoạt tính sinh học bắt
nguồn từ vi sinh vật nội sinh. Ngồi ra cịn có các giả thuyết cho rằng có sự
trao đổi gene giữa thực vật và các vi sinh vật nội sinh thực vật, trong đó có
những gene liên quan đến việc tổng hợp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh học. Như vậy, một kho tàng các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh
học từ các chủng vi sinh vật nội sinh nói chung và Streptomyces nội sinh nói
riêng đang chờ được khám phá và khai thác. Có khả năng lớn là các chủng vi
sinh vật nội sinh trong cây Trinh nữ hoàng cung cũng có thể sản sinh các chất
chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học q cùng lúc kháng nấm và kháng
ung thư.
Khơng chỉ có tác dụng sản sinh các chất kháng nấm, các chủng xạ
khuẩn nội sinh còn có khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây bằng cách sản
xuất các chất kích thích sinh trưởng và bảo vệ cây khỏi sự tác động của một số
tác nhân lạ. Với hiện trạng lạm dụng chất kích thích sinh trưởng hóa học như
hiện nay đã gây ra rất nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con
người. Do đó, xạ khuẩn nội sinh đang là đối tượng tiềm năng trong tương lai để
giải quyết vấn đề tăng trưởng thực vật.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập
và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn nội sinh cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) có khả năng đối kháng nấm
Phomopsis sp. UM254 gây bệnh thối quả xồi”.
* Mục đích nghiên cứu
- Phân lập được chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây có khả năng đối kháng
nấm Phomopsis sp. UM254 gây bệnh thối trên xoài.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn đối kháng
* Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh đối kháng nấm
Phomopsis sp. gây bệnh thối trên xoài;
- Nghiên cứu khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ;
2
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào;
- Nghiên cứu khả năng sinh trưởng trên các điều kiện môi trường;
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA;
- Khảo sát sơ bộ khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline;
- Định danh chủng xạ khuẩn đối kháng bằng phương pháp sinh học phân tử.
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về xạ khuẩn
1.1.1. Xạ khuẩn
1.1.1.1. Giới thiệu chung
Xạ khuẩn (Tên khoa học: Actinobacteria, tên tiếng Anh: Actinomycetes)
là vi khuẩn Gram dương thuộc bộ Actinomycetales trong lớp Actinobacteria,
bao gồm các chi vi khuẩn dạng sợi như Amycolatopsis sp., Micromonospora sp.,
Pseudonocardia sp., Saccharopolyspora sp., Streptomyces sp. và các vi khuẩn
đơn bào bao gồm Corynebacterium sp. và Mycobacterium sp. (Barka et al., 2015).
Xạ khuẩn thường có tỷ lệ GC trong DNA cao hơn 55%. Trong số khoảng
1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã cơng bố có khoảng 100 chi và 1000
lồi xạ khuẩn. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng thường
sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử. Một số xạ khuẩn cịn hình thành
túi bào tử như Streptosporangium sp., Micromonospora sp. và bào tử di động
như Actinoplane sp., Kineosporia sp. (Nguyễn Lân Dũng & cs., 1977).
Tên xạ khuẩn bắt nguồn tử tiếng Hy Lạp cổ đại ἀκτίς có nghĩa là hình tia
phóng xạ (aktís hay actino) và μύκης có nghĩa là dạng sợi nấm (mukēs hay
myces) (Nguyễn Lân Dũng & cs., 1977). Xạ khuẩn được coi như là dạng
chuyển tiếp giữa nấm và vi khuẩn. Khi quan sát về hình thái bên ngồi có thể
thấy, nhiều xạ khuẩn tạo ra hệ sợi giống như nấm và có khả năng sinh bào tử.
Tuy nhiên xạ khuẩn lại là sinh vật đơn bào và có thành phần peptidoglycan ở
thành tế bào giống với vi khuẩn.
4
Hình 1. 1. Hình thái khuẩn lạc xạ khuẩn
(Quiđones-Aguilar et al., 2016)
Hầu hết xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí và sống hoại sinh, phần lớn
bào tử xạ khuẩn tồn tại dưới dạng bán định hình (semidormant spores), đặc
biệt trong các điều kiện hạn chế về dinh dưỡng. Xạ khuẩn có khả năng thích
nghi với nhiều loại mơi trường sinh thái như: môi trường đất, nước ngọt, nước
mặn, và khơng khí, …, tuy nhiên, xạ khuẩn được tìm thấy nhiều nhất ở trong
đất, đặc biệt là đất kiềm và đất giàu chất hữu cơ. Xạ khuẩn có thể được tìm
thấy trên mặt đất và ở độ sâu cách mặt đất hơn 2m, tùy thuộc vào môi trường
sống và các điều kiện khí hậu mà 1g đất có thể có từ 106 đến 109 tế bào. Các
nghiên cứu cho thấy, phần lớn xạ khuẩn thuộc chi Streptomycetes (chiếm hơn
95% các chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất) (Barka et al., 2015).
Hình 1. 1. Sơ đồ biểu diễn vịng đời của xạ khuẩn
(Barka et al., 2015)
5
Xạ khuẩn là loài ưa nhiệt, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 25 đến 30oC. Xạ
khuẩn thường phát triển ở độ ẩm thấp, pH trung tính. Cụ thể là, ở pH từ 6 đến 9
các chủng xạ khuẩn phát triển mạnh nhất. Bên cạnh đó, cũng có nhiều chủng
xạ khuẩn có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ cao (50 – 60oC) hay đất chua có
độ pH 3.5 (Barka et al., 2015). Như vậy, có thể thấy rằng, xạ khuẩn là sinh vật
có mơi trường sống rất đa dạng và phong phú.
1.1.1.2. Phân loại xạ khuẩn
Có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu
phát triển để phân loại các xạ khuẩn như khóa phân loại của Waksman, khóa
phân loại của Krassilnhilov (Nga), khóa phân loại của Gause, … Các khóa
phân loại chia lớp xạ khuẩn (Actinomycetes) thành lớp phụ (hoặc bộ)
Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn (like Organisms). Lớp phụ
Actinomycetales được chia thành các họ: Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,
Streptomycetaceae, Micromonosporaceae,… Khóa phân loại Streptomyces
thuộc Hệ thống phân loại xạ khuẩn quốc tế (International Streptomyces
Project) do Shirling và Gottlieb đề xuất (1970) đã được sử dụng rộng rãi để
phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae.
Trong khóa phân loại này, các chủng xạ khuẩn được phân loại dựa trên một số
đặc điểm sau: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố
hịa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử (chụp ảnh kính hiển vi điện tử),
khả năng tiêu thụ đường arabinose, xylose, inositol, mannitol, fructose,
rhamnose, saccarose, raffinose,….
Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kỹ thuật phân tử để phân loại xạ khuẩn
đã và đang được áp dụng rộng rãi. Hiện tại, một lồi mới khơng thể được
khẳng định nếu khơng có phân tích di truyền dựa trên giải trình tự gen 16S
rRNA và lai DNA-DNA, thậm chí việc giải trình tự gen là bắt buộc khi muốn
định danh bất kỳ chủng vi sinh vật nào. Mỗi lồi đều có trinh tự bảo thủ riêng.
Ví dụ, trình tự 16S rRNA cịn được dùng để phân biệt vi khuẩn thực (bacteria)
và vi khuẩn cổ (archae) hoặc để nhận dạng loài vi khuẩn chưa biết. Các tiêu
6
chí về phân tích di truyền, đặc điểm hình thái và thành phần hóa học đều được
sử dụng để phân loại. Hơn nữa, việc giải trình tự các gen 16S rRNA đã định
danh được 39 họ và 130 chi xạ khuẩn. Tất cả các nhóm trước đây có thứ hạng
phân loại được cho là “bộ” đã được phân loại là các ngành dựa trên các tiêu chí
về sinh học phân tử và hóa học này.
1.1.1.3. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc:
Hình thái khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đa dạng. Kích thước và hình dạng
của chúng thay đổi tùy thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ,
pH, nồng độ các chất…). Trên môi trường rắn, xạ khuẩn hình thành khuẩn lạc
khơ. Mặt khuẩn lạc xạ khuẩn thường khơ, rắn chắc, xù xì, có dạng đá vơi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu.
Khuẩn lạc có màu sắc khác nhau: trắng, xám, nâu, hồng, vàng, da cam, tím, …
Đường kính mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5- 2mm, có một số trường hợp, khuẩn lạc
có thể đạt tới 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc thường có 3 lớp: lớp vỏ ngồi có các
sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong (Li et al., 2016).
* Khuẩn ty
Trên môi trường rắn, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại
cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất- Substrate
mycelium) với chức năng thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường, một loại
phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh – Aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản, ngồi ra cịn làm nhiệm vụ thu
nhận dinh dưỡng khi trong trường hợp chỉ có 1 loại hệ sợi khí sinh (như chi
Sporichthya sp.) (Li et al., 2016).
* Cuống sinh bào tử
Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty
khí sinh gọi là cuống sinh bào tử - cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn.
Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là những đặc điểm quan trọng trong
phân loại xạ khuẩn.
7
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RectusFlexibilis, RF), dạng xoắn lị xo (Spira, S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc
xoắn đơn giản có hình móc câu (Retinaculum-Apertum, RA) (Li et al., 2016).
* Bào tử
Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử
theo hai cách: kết đoạn hoặc cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép
nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông. (Li et al., 2016).
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysccharide giàu protein
với độ dày khoảng 300-400 A0 chia thành 3 lớp để tránh cho bào tử khỏi những
tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH,…Hình dạng, kích
thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn
định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn (Nguyễn Thành
Đạt & cs, 1974).
Khi khuẩn ty khí sinh sinh trưởng đến mức sẽ kích thích sự hình thành
bào tử ở xạ khuẩn. Tuy nhiên, môi trường quá giàu dinh dưỡng có thể dẫn đến
sự kìm hãm của q trình sinh bào tử. Trong nhiều trường hợp, khi kích thích
sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh giảm đi.
1.1.2. Xạ khuẩn nội sinh
Cây dược liệu được coi như một nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính
sinh học trong y dược và các vi sinh vật liên quan đến cây dược liệu cũng đã
được chứng minh là tạo ra các hợp chất có giá trị dược lý. Các vi sinh vật tồn
tại trong các mơ cây, có mối quan hệ cộng sinh với cây, bao gồm nhiều nhóm
đối tượng khác nhau như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn.v.v… (Pimentel et al.,
2011). Các vi sinh vật nội sinh sống cộng sinh với thực vật một cách bình
thường mà khơng làm ảnh hưởng xấu đến cây. Xạ khuẩn nội sinh đã được
chứng minh mang lại nhiều lợi ích như cải thiện hoặc thúc đẩy quá trình tăng
trưởng cây, làm giảm các triệu chứng bệnh thực vật thông qua một loạt các cơ
chế sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp có khả năng tiêu diệt các loại mầm
bệnh do nấm hay côn trùng gây ra (Igarashi et al., 2002). Nhiều chất kháng
8
sinh mới đã được xác định là do một số loại xạ khuẩn Streptomyces spp. sinh
tổng hợp như allnumycin, munumbicin A, D hay coronamycin (Nalini &
Prakash, 2017). Ngoài ra, nhiều cơng trình nghiên cứu về phân lập xạ khuẩn
nội sinh mới đã được cơng bố nhằm tìm ra các chủng xạ khuẩn nội sinh có
nhiều ứng dụng trong sản xuất và đời sống con người (Qin et al., 2011;
Golinska et al., 2015; Nalini & Prakash, 2017).
Thuật ngữ nội sinh “ endophytic” lần đầu tiên được De Bary định nghĩa
và năm 1866, rằng “ Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong
các mô thực vật và có sự khác biệt đáng kể so với những loại vi sinh vật được
tìm thấy trên bề mặt thực vật”. Sau đó, khái niệm về xạ khuẩn nội sinh được
Smith (1957) đưa ra khi phân lập thành công chủng xạ khuẩn
Micromonosppora sp. có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum
từ mô cây cà chua không nhiễm bệnh. Tuy nhiên, chỉ có định nghĩa về vsv nội
sinh của Bacon và White (2000) mới được thừa nhận rộng rãi nhất: “ Vi sinh
vật nội sinh là vi sinh vật sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra
những ảnh hưởng xấu đến thực vật” (Bacon & White, 2000).
Vi sinh vật nội sinh không những không gây ảnh hưởng xấu mà cịn tăng
cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, chống cơn trùng, miễn
dịch cho cây chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất (Staniek et al.,
2008). Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng
minh là rất đa dạng về số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát
sinh học, chất kháng vi sinh vật gây bệnh, kháng nấm, ức chế phát triển tế bào
ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh
trưởng,… (Qin et al., 2011; Kaishing et al., 2018)
Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh thu hút sự quan tâm của các
nhà khoa học. Nhiều báo cáo khoa học về xạ khuẩn nội sinh trên nhiều loại
thực vật khác nhau đã được công bố như cây lương thực (lúa mì, ngũ cốc, lúa,
cà chua, cà rốt, khoai và cam…) (Araújo, 2000; Coombs & Franco, 2003); các
loại cây dược liệu (Golinska et al., 2015; Nalini & Prakash, 2017). Xạ khuẩn
9
nội sinh được phân lập chủ yếu thuộc chi Streptomyces sp., Microbispora sp.,
Micromonospora sp., Nocardioides sp., Nocardia sp. và Streptosporangium sp..
Có thể thấy, xạ khuẩn nội sinh đang là đối tượng rất có tiềm năng trong
việc khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học mới và được ứng dụng rộng
rãi đối với lĩnh vực nông nghiệp cũng như lĩnh vực y học.
1.1.3. Sự phân bố của xạ khuẩn nội sinh thực vật
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, số lượng xạ khuẩn nội sinh được phân
lập nhiều nhất từ rễ, tiếp theo là thân và ít nhất ở lá (Qin et al., 2009; Gangwar
& Khushboo, 2014). Các cây thân gỗ có sự xuất hiện của xạ khuẩn nội sinh
nhiều hơn cây thân thảo. Tỷ lệ xuất hiện của xạ khuẩn nội sinh ở rễ cao hơn so
với các mô khác bởi thực tế xạ khuẩn sống tự nhiên trong đất, dễ dàng tiếp xúc
với rễ cây và có thể hình thành mối liên kết cộng sinh bằng cách xâm nhập vào
các mô thực vật. Sự đa dạng của quần thể xạ khuẩn nội sinh phụ thuộc vào các
yếu tố như: lồi thực vật, vị trí mơ thực vật (rễ, thân, lá) và ví trí địa lý (khí
hậu, độ ẩm, dinh dưỡng) (Nimnoi et al., 2010). So với thân và lá, các chủng xạ
khuẩn phân lập từ rễ đa dạng hơn. Các nghiên cứu về số lượng xạ khuẩn trên
các bộ phận của các loài dược liệu thường mang lại kết quả trái ngược nhau.
Taechowisan và cộng sự (2003) đã phân lập được 212 chủng xạ khuẩn ở rễ, 97
chủng ở lá và 21 chủng ở thân (Taechowisan et al., 2003). Tương tự xạ khuẩn
nội sinh từ cây Azadirachta indica cho số lượng xạ khuẩn nội sinh ở rễ là cao
nhất 54,6%, thân và lá lần lượt là 23,6% và 21,8% (Verma et al., 2009). Ở một
số nghiên cứu khác, xạ khuẩn nội sinh phân lập từ lá lại được chứng minh là
thấp nhất, thậm chí, khơng thể phân lập được chủng xạ khuẩn nào từ lá (Zhao
et al., 2011; Akshatha et al., 2016). Mặt khác, một số nghiên cứu phân lập xạ
khuẩn nội sinh nhiều nhất từ thân, đặc biệt trên các mô lớn (Bascom- Slack et
al., 2009).
10
1.1.4. Cách thức xâm nhập của xạ khuẩn nội sinh
Đã có rất nhiều nhà khoa học đưa ra các hình ảnh mô tả sự xâm nhập của
xạ khuẩn vào trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội
sinh của vi sinh vật nội sinh vẫn còn là một ẩn số.
Hình 1. 2. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR5 trên lá đỗ quyên sau 60 ngày quan sát
(Masafumi Shimizu, 2011)
Chú thích: (a) q trình xâm nhập vào lỗ khí. Khuẩn ty được gắn trên vật liệu electron (G:
tế bào bảo vệ). (b) các tế bào hệ sợi (mũi tên) trong khoang gian bào bên dưới lớp biểu bì
(E: tế bào biểu bì; IS: khoang gian bào; M: tế bào mesophyll).
Suzuki và cộng sự (2005) đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá
và thân cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 bằng cách quan sát qua kính
hiển vi điện tử. Cụ thể là Suzuki và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm đưa hệ
11
khuẩn ty của chủng S. galbus MBR-5 vào lá thông qua các lỗ khí (Hình 1.3.)
(Suzuki et al., 2005). Với khả năng sinh tổng hợp được một số enzyme ngoại
bào như xylanase, cellulase và pectinase mà chủng MBR-5 có thể dễ dàng phân
hủy lớp thành tế bào của cây chủ, từ đó giúp chúng dễ dàng xâm nhập vào cây
chủ. Vi sinh vật nội sinh đã tự thích nghi trong suốt thời gian dài cùng với sự
đồng tiến hóa của thực vật qua sự biểu hiện của một số gen điều hòa (Qin et
al., 2010). Một giả thuyết được đưa ra rằng, gen mã hóa cho các chất có hoạt
tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa vi sinh vật và thực vật
thông qua chuyển gen ngang (HGT - horizontal gene transfer). Vi sinh vật nội
sinh sản sinh ra một số hợp chất để duy trì mối quan hệ cộng sinh với thực vật,
thúc đẩy sự phát triển của thực vật và giúp chúng tồn tại được trong thực vật
(Golinska et al., 2015).
Một số tác giả cho rằng vi sinh vật bám được lên bề mặt rễ nhờ một số
thành phần trên bề mặt tế bào của chúng như lông tơ (pilli), liposaccharide
hoặc exopoly, … Những vị trí mà vi sinh vật lựa chọn để bám và xâm nhập
thường là vùng đầu rễ, nơi đỉnh sinh trưởng của rễ có lớp thành tế bào mỏng,
hoặc vùng lơng rễ, gốc rễ nơi có những vết nứt nhỏ để rễ phụ trồi ra. Tại những
vị trí đó, vi sinh vật sinh trưởng thành các khuẩn lạc siêu nhỏ gồm vài trăm tế
bào. Để có thể xâm nhập vào rễ dễ dàng thì các vi sinh vật nội sinh phải có hệ
enzyme phân hủy cellulose để phá lớp ngồi thành tế bào.
Sau khi tế bào vi sinh vật đã xâm nhập được vào lớp biểu bì ngồi, chúng
có thể tiếp tục tồn tại ở đó, hoặc di chuyển sâu hơn và xâm chiếm khoảng giữa
các tế bào (apoplast) trong vỏ cây. Vi sinh vật nội sinh và vi khuẩn nốt sần cây
họ Đậu khác nhau ở chỗ vi sinh vật nội sinh không xâm nhập vào bên trong tế
bào thưc vật và tạo ra các tổ chức hình thái đặc biệt như trường hợp của vi
khuẩn nốt sần. Tuy vậy, cũng có trường hợp vi sinh vật nội sinh cũng tạo ra các
nốt sần. Chỉ có một số vi sinh vật có thể xâm nhập hệ mạch dẫn (xylem) của
thực vật. Tại đây vi sinh vật có thể sử dụng các chất dinh dưỡng được vận
chuyển trong hệ mạch như nước, ion và một số chất hữu cơ có phân tử lượng
12
thấp như đường, axit amin và axit hữu cơ. Mặc dù nồng độ các chất dinh
dưỡng trong hệ mạch là rất thấp nhưng cũng đủ để duy trì sự sinh trưởng của
quần thể vi sinh vật nội sinh.
Vi sinh vật nội sinh có khả năng sử dụng các nguồn carbon mà thông
thường vi sinh vật vùng rễ không sử dụng được, ví dụ D-sorbitol, Dgalacturonic acid và L-arabinose là nguồn carbon có sẵn trong hệ mạch dẫn của
cây. Như vậy để trở thành thể nội sinh thì điều kiện tiên quyết là vi sinh vật đó
phải có khả năng sử dụng một số hợp chất trao đổi chất của thực vật. Thơng
thường thì nồng độ của chất dinh dưỡng trong hệ mao dẫn thực vật giảm dần
theo độ cao của cây, do đó, sự đa dạng và mật độ quần thể vi sinh vật nội sinh
giảm dần theo khoảng cách từ rễ trở lên, và chỉ một phần nhỏ vi sinh vật tồn tại
ở những phần trên của thực vật như lá và cơ quan sinh sản (hoa, quả và hạt).
Một số vi sinh vật có thể xâm nhập vào thực vật qua các vị trí khác như khí
khổng trên lá và trở thành nội sinh. Chúng cũng có thể xâm nhập vào cây tư
hoa quả và hạt, nhưng trường hợp này thì thường là vi sinh vật gây bệnh
(Malfanova et al., 2013).
1.1.5. Vai trò của xạ khuẩn nội sinh
Xạ khuẩn nội sinh được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều về khả
năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thư, sinh enzyme, chất kích thích sinh
trưởng thực vật, ức chế và kiểm soát bệnh thực vật,…
1.1.5.1. Khả năng sinh chất kháng sinh
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật rất có tiềm năng hình thành nhiều loại chất
kháng sinh sử dụng trong y học. Nhiều loại kháng sinh mới được tổng hợp từ
xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và
virus. Các hợp chất kháng khuẩn từ lâu đã được nghiên cứu từ các xạ khuẩn
nội sinh có hiệu quả đặc biệt chống lại các mầm bệnh đa kháng thuốc. Hơn
80% các loại kháng sinh được sinh ra từ xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (Ilic et
al., 2007). Đã có rất nhiều các hợp chất thứ cấp được tách từ xạ khuẩn nội sinh
như 2,5 – bis (hydroxymethyl) furan monoacetate (BHMF-OAc), kinamycin,
13
actinomycin, cedarmycins,… Trong đó, BHMF-OAc là một hợp chất ức chế
quá trình lây nhiễm của nấm Alternaria brassicicola trong bắp cải được tách từ
dịch lọc xạ khuẩn Streptomyces sp. CEN26, có tác dụng thay thế thuốc kháng
nấm hóa học (Phuakjaiphaeo et al., 2016). Kháng sinh kinamycin hoạt động
mạnh chống lại vi khuẩn gram dương, được phân lập từ môi trường nuôi cấy
của Streptomyces murayamaensis (Kumamoto, 2010). Cedarmycins A và B là
kháng sinh phổ rộng thu được từ môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces
sp. TP-A0456, chống lại các vi khuẩn Gram dương, gram âm và nấm men.
Cedarmycins được phát hiện có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nấm
Candida glabrata (Sasaki et al., 2001). Thuốc kháng sinh actinomycin X2, D
và Xobeta đã được sản xuất từ Streptomyces NRRL 30562, là những kháng
sinh phổ rộng có hoạt tính chống lại cả vi khuẩn và nấm gây bệnh cho người và
thực vật (Castillo et al., 2006). Xạ khuẩn nội sinh cây dược liệu là đối tượng
cung cấp nguồn kháng sinh vơ cùng đa dạng và có tiềm năng cao.
1.1.5.2. Khả năng sinh các hợp chất kháng ung thư
Ung thư là một nhóm bệnh đặc biệt được hình thành khi các tế bào phát
triển khơng kiểm sốt được và lây lan một cách bất thường trong cơ thể. Các
bệnh này thường có nguy cơ dẫn đến tử vong cao nếu khơng được phát hiện và
điều trị một cách kịp thời.
Hình 1. 3. Các giai đoạn hình thành tế bào ung thƣ
(Nguồn: ungthutuyengiap.org)
14
