Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh dieback trên nho ở một số địa phương việt nam (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------  ----------

KH A U N T T NGHIỆP
T I
PH N
C AN

P V NGHI N C U

C I

SINH HỌC

G

ỆNH DIEBACK TR N NHO

S

A PH

NG VIỆT NA

H N I – 2022

T

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------- -------

KH A U N T T NGHIỆP
T I
PH N
C AN

P V NGHI N C U

C I

SINH HỌC

G

ỆNH DIEBACK TR N NHO

S

A PH

S

NG VIỆT NA

T

MSV

H

: 637318
: K63CNSHD

Gả g

g

: ThS Ng

H N I – 2022

T

H

T


ỜI CA

OAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của
nấm gây bệnh dieback trên nho ở m t s đ a phương Việt Nam” là cơng trình
nghiên cứu cá nhân của tơi trong thời gian qua. Mọi s liệu, hình ảnh, kết quả
nghiên cứu là do tơi tự tìm hiểu, phân tích m t cách khách quan, trung thực, có

nguồn g c rõ ràng và chưa được cơng b dưới bất kỳ hình thức nào.
Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và các thơng
tin trích dẫn trong đề tài đều được ghi nguồn g c rõ ràng.
Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022
Sinh viên

T

H

i


ỜI C

N

Sau m t thời gian thực tập tại B môn Công nghệ vi sinh (từ tháng 3/2022
đến tháng 9/2022), được sự quan tâm, dìu dắt tận tình của các thầy cơ giáo, các
cán b tại phịng thí nghiệm của B môn, cùng sự c gắng và nỗ lực của bản
thân, tơi đã hồn thành khóa luận t t nghiệp của mình.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cơ giáo trong và ngồi khoa Cơng nghệ
Sinh học đã truyền đạt cho tôi nh ng kiến thức vô cùng quan trọng, qu báu
trong su t thời gian học tập và r n luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Tôi xin được bày t lòng biết ơn sâu sắc tới cô ThS. Nguy n Thanh Huyền
đã đ nh hướng đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đ ng viên tơi trong q trình
thực hiện đề tài và hồn thành bản khóa luận này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cơ ThS. Trần Th

ào, tồn thể các

anh ch , bạn bè và các em đang thực tập, nghiên cứu tại phịng thí nghiệm B
mơn Cơng nghệ Vi sinh đã giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi
trong su t q trình làm đề tài t t nghiệp.
Cu i cùng, với tất cả lòng thành kính và biết ơn vơ hạn, tơi xin gửi lời cảm
ơn đến b mẹ, người đã sinh thành, nuôi nấng, đ ng viên và tạo đ ng lực cho tôi
trong su t q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022
Sinh viên

T

H

ii


C

C

LỜI CAM OAN................................................................................................... i
LỜI C M N ...................................................................................................... ii
M C L C ............................................................................................................ iii
DANH M C B NG ............................................................................................. v
DANH M C H NH ............................................................................................ vi
DANH M C CH

VI T T T........................................................................... vii

T M T T KH A LU N ................................................................................. viii
PH N I

U ..............................................................................................1

1.1.

ặt vấn đề .................................................................................................1

1.2.

M c đích nghiên cứu ................................................................................ 2

1.3.

N i dung nghiên cứu ................................................................................ 2

PH N II T NG QUAN T I IỆU ................................................................. 3
2.1.

Giới thiệu chung về cây nho ..................................................................... 3

2.1.1. Phân b ..................................................................................................... 3
2.1.2. Mơ tả đặc điểm hình thái của cây nho ...................................................... 4
2.1.3. Thành phần dinh dưỡng và công d ng của quả nho ................................ 5
2.2.2. Nấm bệnh trên cây nho ............................................................................. 7
2.3.

Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước ............................................ 10

2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 10
2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................ 11
PH N III V T IỆU V PH

NG PH P NGHI N C U ..................... 13

3.1.

i tượng nghiên cứu ............................................................................. 13

3.2.

Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 13

3.3.

a điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 13

3.4.

D ng c , thiết b và hóa chất thí nghiệm................................................ 13

3.5.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 14

3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu nho nhi m bệnh .......................................... 14

iii

3.5.2. Phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu nho b bệnh .................................... 15
3.5.4. Phương pháp xác đ nh đặc điểm hình thái nấm ..................................... 15
3.5.5.

ánh giá ảnh hưởng của m t s yếu t đến khả n ng sinh trưởng
của nấm (môi trường nuôi cấy, nhiệt đ , pH) ........................................ 16

3.5.6.

ánh giá khả n ng sinh enzyme ngoại bào ............................................ 17

3.5.7. Phương pháp đ nh danh chủng nấm gây bệnh ....................................... 17
PH N IV K T QU V TH O U N ....................................................... 20
4.1.

Kết quả phân lập nấm gây bệnh ............................................................. 20

4.2.

Kết quả tái lây nhi m các chủng nấm phân lập ...................................... 21

4.3.

ặc điểm hình thái của chủng nấm tuyển chọn ..................................... 23

4.4.

Kết quả ảnh hưởng của m t s điều kiện nuôi cấy đến sự sinh

trưởng của chủng nấm tuyển chọn ......................................................... 25

4.4.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng
của chủng nấm tuyển chọn ..................................................................... 25
4.4.2. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt đ nuôi cấy đến sự sinh trưởng của
chủng nấm tuyển chọn ........................................................................... 27
4.4.3. Kết quả ảnh hưởng của đ pH đến sự sinh trưởng của chủng nấm
tuyển chọn ............................................................................................. 29
4.5.

ánh giá khả n ng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm tuyển
chọn ........................................................................................................ 30

4.6.

Kết quả tách chiết DNA và đ nh danh chủng nấm gây bệnh ................ 32

4.6.1. Tách chiết DNA t ng s và khuếch đại trình tự DNA b ng phản ứng
PCR ........................................................................................................ 32
4.6.2.

nh danh và phân tích b ng phương pháp giải trình tự đoạn gen
ITS rDNA ............................................................................................... 33

PH N V K T U N V

NGH ............................................................. 35

5.1.

Kết luận .................................................................................................. 35

5.2.

ề ngh ................................................................................................... 35

TÀI LIỆU THA
PH

KH O ................................................................................ 36

C .......................................................................................................... 41

iv


ANH

C

NG

Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR .............................................................. 18
Bảng 4.1.

ặc điểm khu n lạc của các chủng nấm phân lập ............................ 21

Bảng 4.2.

ường kính và hình thái khu n lạc của chủng nấm CK1 trên

các môi trường khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy .............................. 26

Bảng 4.3. Khả n ng sinh enzyme ngoài bào của chủng nấm CK1 ................... 30

v


ANH

C H NH

Hình 2.1.

Hình ảnh cây nho ............................................................................ 5

Hình 2.2.

Hình ảnh của các triệu chứng bệnh dieback trên cây nho ............ 10

Hình 4.1.

Các mẫu nho nhi m bệnh dieback ................................................ 20

Hình 4.2.

Hình ảnh 3 chủng nấm phân lập từ mẫu nho nhi m bệnh ............ 21

Hình 4.3.

Hình ảnh tái lây nhi m các chủng nấm phân lập được sau 7 ngày .... 22

Hình 4.4.

ặc điểm hình thái của chủng nấm CK1. ..................................... 24

Hình 4.5.

Sự phát triển của chủng nấm CK1 trên các môi trường khác
nhau sau 3 ngày nuôi cấy. ............................................................. 26

Hình 4.6.

Sự phát triển của chủng nấm CK1 ở các nhiệt đ khác nhau
sau 3 ngày nuôi cấy ...................................................................... 28

Hình 4.7.

Sự phát triển của chủng nấm CK1 ở các pH khác nhau sau 3
ngày ni cấy ................................................................................ 29

Hình 4.8.

Khả n ng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm CK1 ............... 31

Hình 4.9.

PCR của chủng nấm CK1 trên gel agarose 1

Hình 4.10.

So sánh trình tự nucleotide chủng nấm CK1 trên GenBank ......... 33

Hình 4.11.

Cây phân loại dựa trên trình tự 18S rRNA của chủng nấm CK1 ..... 33

............................ 32

vi


ANH
C ữ

C CH

VI T T T

ế ắ

T

µl

microliter

µm

Micrometer

C

đầ đủ

i chứng

CDA

Czapek Dox Agar

PDA

Potato Dextrose Agar

SDA

Sabouraud Dextrose Agar

ISP2

International Streptomyces Project 2

WA

Water Agar

MEA

Malt Extract Agar

CMC

Carboxymethyl cellulose

PCR

Polymerase Chain Reaction

ITS

Internal Trascription Spacer regions

cs

C ng sự

sp.

species

vii


T

T T KH A U N

Nghiên cứu này được thực hiện với m c đích phân lập và nghiên cứu đặc
điểm sinh học của nấm gây bệnh dieback trên nho ở m t s đ a phương Việt
Nam. Các chủng nấm đã được phân lập từ các mẫu nho có các triệu chứng của

bệnh dieback, sau đó tái lây nhi m lên lá, quả và cành nho kh e mạnh để xác
đ nh được chủng nấm có khả n ng gây bệnh dieback trên nho. Chủng nấm bệnh
tuyển chọn được tiếp t c nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh học cũng như
các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm. Chủng nấm này sau đó được
đ nh danh b ng phương pháp phân tử.
Từ các mẫu nho có các triệu chứng của bệnh dieback thu thập tại Viện
nghiên cứu và phát triển cây trồng ở Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà N i và vườn nho
ở Thanh

ặng - Minh Hải - V n Lâm - Hưng Yên, đã phân lập được 3 chủng

nấm (CK1, CK2 và N). Chủng nấm CK1, CK2 khu n lạc dạng sợi mảnh, bông
x p và màu sắc khu n lạc từ trắng chuyển dần sang đen. Chủng nấm

N khu n

lạc dạng sợi, bông m n, màu sắc khu n lạc chuyển dần từ trắng sang xám; tản
nấm hình trịn, đường kính tản nấm t ng dần theo từng ngày. Các chủng này
được thực hiện tái lây nhi m trên cành, lá và quả nho. Kết quả cho thấy, ch có
chủng nấm CK1 và CK2 khiến cho thân, lá và quả nho có nh ng triệu chứng
của bệnh dieback; trên cành và lá có triệu chứng bệnh rõ nhất. Hơn thế n a
chủng nấm này cũng có nh ng đặc điểm hình thái khu n lạc gi ng với nấm
Lasiodiplodia theobromae. Vì chủng nấm CK1 và CK2 có đặc điểm hình thái và
tái lây nhi m gi ng nhau nên chọn chủng nấm (CK1) cho các thí nghiệm tiếp.
Dựa trên các kết quả khảo sát về điều kiện nuôi cấy, cho thấy, chủng nấm CK1
phát triển t t nhất trên môi trường PDA, nhiệt đ 30 - 35⁰C, pH 6 - 7.

ồng thời

chủng nấm này cũng thể hiện khả n ng sinh enzyme amylase, protease, cellulase,

chitinase, xylanase và pectinase. Qua phương pháp đ nh danh phân tử với cặp mồi
ITS1/ITS4, chủng nấm CK1 được xác đ nh là Lasiodiplodia theobromae khi so sánh
trình tự nucleotide với đoạn gen 18S rRNA trên cơ sở d liệu NCBI.

viii


PH N I

U

đ

1.1.

Cây nho (Vitis vinifera), thu c họ Vitaceae là loại cây n quả lâu n m
được trồng r ng rãi trên tồn thế giới có giá tr dinh dưỡng và giá tr thương mại
cao. Sản ph m thu hoạch chính là trái nho dùng để n tươi, chế biến làm rượu
vang, ngồi ra cịn làm nho khơ và nước giải khát. Theo s liệu của FAO (2014),
diện tích trồng nho của toàn thế giới là 8.485.000 ha và đang có xu hướng gia
t ng với t c đ 2
chiếm 17,5

mỗi n m, với sản lượng hàng n m đạt 60,473 triệu tấn,

t ng sản lượng trái cây trên toàn thế giới. Khoảng 71

nho được dùng làm nguyên liệu cho chế biến rượu, 27

sản lượng

dùng n tươi và 2

sấy

khô (nho không hạt). Ở Việt Nam nho được trồng từ Bắc tới Nam, miền Bắc nho
trồng lẻ tẻ, n ng suất và chất lượng kém. Nho trồng tập trung ở Ninh Thuận với
diện tích 2.000 ha, ngồi ra có trồng khá ph biến ở Bắc Bình Thuận và Nam
Khánh Hịa. Ở Ninh Thuận, cây nho có thể thu hoạch quả m t n m 2 v hoặc 2
n m 5 v . V nho đông xuân thu hoạch vào tháng 2 - 3 cho n ng suất và chất
lượng t t nhất, sau đó là v hè thu vào tháng 7 - 8; v thu đông vào tháng 10 11 n ng suất và chất lượng thấp nhất do gặp mưa lớn. Tại Ninh Thuận, cây nho
có tiềm n ng n ng suất cao, n ng suất có thể đạt 30 - 40 tấn/ha/n m; n ng suất
này có thể so sánh với các nước có n ng suất cao trên thế giới, nhưng lại không
n đ nh (Gà Con, 2019).
Mặc dù có giá tr kinh tế cao nhưng hiện nay n ng suất và chất lượng cây
nho b giảm sút do m t s bệnh như bệnh nấm trắng (Uncinula necator), sương
mai (Plasmopara viticola), thán thư (Elsinoe ampelina Shear), đ m lá
(Phomopsis viticola), nấm cu ng (Diplodia), g sắt (Kuehneola vitis), dieback
(Lasiodiplodia theobromae),... Trong đó bệnh dieback là m t bệnh khá ph biến
và làm giảm n ng suất cây nho m t cách đáng kể. Hiện nay, có nhiều biện pháp
phòng trừ bệnh hại nho nhưng biện pháp sử d ng thu c hóa học được áp d ng
r ng rãi vì hiệu quả nhanh. Tuy nhiên, việc sử d ng thu c hóa học trong thời
gian dài gây ra nh ng hậu quả nghiêm trọng cho sức kh e.
1


Vì nh ng l do trên, đề tài “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của
nấm gây bệnh dieback trên nho ở m t s đ a phương Việt Nam” được thực hiện
nh m đánh giá đặc điểm của chủng nấm gây bệnh. Từ đó có thể cung cấp nh ng
thơng tin h u ích để tìm ra giải pháp phòng bệnh hiệu quả mà vẫn gi nguyên

giá tr dinh dưỡng của nho và không ảnh hưởng đến sức kh e người dùng.
đ

1.2.

g

- Phân lập được chủng nấm có khả n ng gây bệnh dieback trên nho.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm tuyển chọn.
1.3. N

g g

- Phân lập và tuyển chọn chủng nấm gây bệnh dieback trên nho.
- Xác đ nh các đặc điểm hình thái của chủng nấm tuyển chọn.
-

ánh giá ảnh hưởng của m t s yếu t : môi trường nuôi cấy, nhiệt đ ,

pH đến sự sinh trưởng của chủng nấm nghiên cứu.
-

ánh giá khả n ng sinh m t s enzyme ngoại bào của chủng nấm tuyển chọn.

- Tách chiết DNA và đ nh danh chủng nấm có khả n ng gây bệnh
dieback trên nho.

2

PH N II T NG QUAN T I IỆU
G

g
Cây nho (Vitis vinifera) thu c họ Vitaceae, bao gồm khoảng 60 lồi Vitis

hoang dã được tìm thấy ở Châu Á, Bắc Mỹ và Châu Âu trong điều kiện khí hậu
cận nhiệt đới,

a Trung Hải và l c đ a - ôn đới.

ây là lồi Vitis đơn lẻ có giá

tr dinh dưỡng và giá tr thương mại cao. V. vinifera là loài duy nhất được sử
d ng r ng rãi trong ngành cơng nghiệp rượu vang tồn cầu. Ngày nay có khoảng
10.000 gi ng V. vinifera, nhưng ch m t s ít trong s đó chiếm lĩnh th trường
sản xuất rượu vang. Các loại cây trồng thường được phân loại dựa trên việc
chúng sản xuất nho làm rượu vang, nho để bàn hay nho khô (K. Kris Hirst,
2018). Thật vậy, phần lớn các gi ng cây được trồng r ng rãi để lấy quả, nước
trái cây và chủ yếu để làm rượu vang được phân loại là Vitis vinifera L. subsp.
Vinifera (hoặc Sativa), có nguồn g c từ cây nho dại (Vitis vinifera L. subsp.
Sylvestris) (Rossetto, McNally và cs., 2002; Sefc, Steinkellner và cs., 2003;
Wojciech Granoszewski và cs., 2004; This, Jung và cs., 2004).
2.1.1
Theo s liệu của FAO (2014), diện tích trồng nho của tồn thế giới là
8.485.000 ha và đang có xu hướng gia t ng với t c đ 2
hàng n m đạt 60,473 triệu tấn, chiếm 17,5
giới. Khoảng 71
27

mỗi n m, với sản lượng

t ng sản lượng trái cây trên toàn thế

sản lượng nho được dùng làm nguyên liệu cho chế biến rượu,

dùng n tươi và 2

sấy khô (nho không hạt). Hiện nay, cây nho được trồng

trên cả 5 châu l c, ở nh ng vùng có điều kiện khí hậu phù hợp. Các nước có diện
tích trồng nho đứng hàng đầu thế giới là Tây Ban Nha (1.175.000 ha), Nga, Italia,
Pháp, Th Nhĩ Kỳ, Bồ ào Nha và Mỹ. Châu Âu chiếm trên 60

sản lượng nho

thế giới. Tại châu Á, diện tích và sản lượng nho đã t ng lên trong nh ng n m gần
đây, hiện nay t ng diện tích đạt khoảng 1,7 triệu ha (Gà Con, 2019).
Các nước châu Á có diện tích trồng nho đáng kể là: Trung Qu c, Ấn

,

Nhật Bản, Hàn Qu c, Pakistan, Thái Lan và Việt Nam. Theo h i thảo sản xuất
nho ở các nước châu Á Thái Bình Dương gồm 8 nước tham gia: Trung Qu c,
Ấn

, Hàn Qu c, Nhật Bản, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam thì diện tích
3

trồng nho của các nước tham gia là 393.725 ha, sản lượng hàng n m đạt 5,432
triệu tấn, n ng suất nho trung bình đạt 13,6 tấn/ha/n m (Gà Con, 2019).
Ở Việt Nam nho được trồng từ Bắc tới Nam, miền Bắc nho trồng lẻ tẻ,
n ng suất và chất lượng kém. Nho trồng tập trung ở Ninh Thuận với diện tích
2.000 ha, ngồi ra có trồng khá ph biến ở Bắc Bình Thuận và Nam Khánh Hịa.
N ng suất nho của Việt Nam thấp hơn so với trung bình của khu vực, ch đạt
11,2 tấn/ha/n m. Vùng Bắc Bình Thuận đến Nam Khánh Hòa, đặc biệt t nh Ninh
Thuận n m trong vùng khơ hạn nhất cả nước, gió nhiều, đ

m khơng khí thấp

(trung bình từ 70 - 75 ), lượng mưa thấp (< 800mm/n m), đây là điều kiện
thuận lợi để cây nho có thể sinh trưởng và phát triển t t. Ở Ninh Thuận, cây nho
có thể thu hoạch quả m t n m 2 v hoặc 2 n m 5 v . V nho đông xuân thu
hoạch vào tháng 2 - 3 cho n ng suất và chất lượng t t nhất, sau đó là v h thu
vào tháng 7 - 8; v thu đông vào tháng 10 - 11 n ng suất và chất lượng thấp nhất
do gặp mưa lớn. Tại Ninh Thuận, cây nho có tiềm n ng n ng suất cao, n ng suất
có thể đạt 30 - 40 tấn/ha/n m; n ng suất này có thể so sánh với các nước có n ng
suất cao trên thế giới, nhưng lại không n đ nh (Gà Con, 2019).
2.1.2.

nho
Cây nho thu c họ Nho (Ampelidaceae), là loại cây n quả lâu n m. Thân cây

nho thu c loại thân thảo và thân gỗ, dạng cây leo. Thân cây nho khi mới mọc khá
mềm, cần có cọc đỡ, khi cây vào giai đoạn trưởng thành, trên 1 n m tu i, thân cây
nho hóa gỗ. Từ thân và cành mọc ra các tua cu n ở v trí đ i diện với lá, tua cu n
có thể phân nhánh để bám vào giàn leo gi cho cây được v ng chắc. Lá cây nho là
lá đơn, mọc so le, hình tim, phiến lá r ng 5 - 25 cm chia 5 - 7 thùy, có r ng cưa ở
mép lá, cu ng lá dài. R cây nho thu c loại r chùm, phần lớn ở đ sâu 30 - 60 cm

và trải r ng quanh vùng tán cây. Chồi của cây nho có 2 dạng: chồi nách và chồi
quả. Hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các đ t cành, kích thước nh , màu xanh
nhạt, hoa có n m cánh, có mùi thơm, m t s loài nho (phần lớn nguồn g c từ Mỹ)
có nh ng dạng hoa khơng hồn tồn, ch mang tính cái hoặc tính đực, bao phấn mở
nhiều vào khoảng 8 giờ sáng, trùng với thời gian hoa nở t i đa nên khả n ng th
phấn khá cao, có thể đạt 80 - 90 . Thời gian từ khi nảy chồi đến hình thành hoa
4


trung bình 30 - 40 ngày. Cây nho có quả mọng hình trứng hoặc hình cầu; kích
thước nh đường kính trung bình 1,5 - 3,0 cm, v m ng hơi dính vào th t quả, khi
chín có màu đ tím hoặc xanh nhạt tùy gi ng. Trong quả có m t s hạt nh hình
quả lê, cũng có gi ng nho không hạt. Thời gian từ đậu quả đến quả chín hồn tồn
trung bình 50 - 60 ngày. Quả có v thơm, ngọt, mát hoặc chua.

H

H

ả

2.1.3

nho
Trong thành phần dinh dưỡng của quả nho có nhiều chất ch ng oxy hóa,

giúp phòng ngừa và loại b các g c tự do gây hại cho cơ thể. Nh ng chất ch ng
oxy hóa này chứa nhiều trong hạt và v của quả nho. Sau đây là các tác d ng
của nho đ i với cơ thể (Bạch Dương, 2021).
 S ng thọ hơn, ch ng lão hóa da

Resveratrol là chất có đặc tính ch ng oxy hóa có nhiều trong nho đã được
chứng minh là kéo dài tu i thọ ở nhiều lồi đ ng vật, Resveratrol kích thích
sirtuins, có liên quan đến tu i thọ.
 Ch ng lại ung thư
M t trong nh ng tác d ng nho mang đến cho cơ thể đó chính là ng n
ngừa ung thư, trong quả nho tươi chứa resveratrol, resveratrol có thể làm chậm

5


hoặc ng n chặn sự phát triển của kh i u trong bạch huyết, gan, dạ dày, vú, đại
tràng, ung thư da và bệnh bạch cầu.
 T t cho tim mạch, huyết áp
Nho chứa chất xơ và kali, cả hai đều hỗ trợ sức kh e tim mạch. Hiệp h i
Tim mạch Hoa Kỳ (AHA) khuyến ngh t ng lượng kali trong khi giảm tiêu th
natri để cải thiện huyết áp và sức kh e tim mạch.
 Giảm cholesterol, mỡ máu, tiểu đường
Các chất dinh dưỡng trong quả nho làm giảm sự hấp th cholesterol.
Ngồi ra, resveratrol có nhiều trong nho đã được chứng minh là làm t ng đ
nhạy của insulin, có thể cải thiện khả n ng sử d ng glucose của cơ thể và do đó
làm giảm lượng đường trong máu. T t cho bệnh nhân b tiểu đường.
 Giảm nguy cơ táo bón
Nho chứa nước và chất xơ. Nh ng chất này có thể giúp cơ thể gi nước,
gi cho nhu đ ng ru t đều đặn và giảm nguy cơ táo bón.
 Giảm các triệu chứng d ứng
Do tác d ng ch ng viêm của quercetin giúp giảm bớt các triệu chứng d
ứng, bao gồm s mũi, chảy nước mắt và n i mề đay.
 T t cho mắt
Nho chứa chất ch ng oxy hóa lutein và zeaxanthin, chúng có thể làm
giảm c ng thẳng và t n thương võng mạc, giúp ng n ngừa đ c thủy tinh thể và

các điều kiện khác.
 T t cho xương
Nho chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của xương , bao
gồm canxi, magie , kali, ph t pho, mangan và vitamin K.
 Ch ng lại vi khu n, t t cho hệ mi n d ch
Trong quả nho có chứa nhiều vitamin C, khi hấp th sẽ tác đ ng có lợi
cho hệ th ng mi n d ch. Ngoài ra chiết xuất v nho bảo vệ ch ng lại vi-rút cúm.

6


 Long đờm
Tác d ng của nho có thể giúp các tế bào trong ph i giải đ c và long đờm,
làm giảm các triệu chứng của viêm đường hô hấp.
ế trên cây nho
2.2.1. S

ệ

ên cây nho

Rầy, rệp sáp : hút nhựa, bám trên đọt non, lá, cành, chùm, cu ng quả làm
cho ngọn héo đi, lá qu n queo, chùm nh , trái nh không phát triển b nứt ngay
cả khi chưa chín. Tr b ng các loại thu c sau: Bi 58 ND 1,5 - 2 lít/ha nồng đ
pha 1/500. Monitor 60 DD 1 - 1,5 lít/ha, nồng đ pha 1/800 Methyl parathion 50
ND 1 - 1,5 lít/ha - nồng đ pha 1/800 - 1/1000.
Nhện đ : bám ở mặt dưới lá gặm các tế bào biểu bì hút lấy nhựa, thiệt hại
lớn khi nhện phá hại sớm, lúc chồi vừa n y. Lá b hại không quang hợp được và
có thể b r ng. Nh ng thời kỳ ít mưa nắng nóng, đất khơng tưới k p b khô tác
hại càng lớn. Tr b ng các thu c sau: Bi 58 ND 1,5 - 2 lít/ha, nồng đ pha :

1/500; Phosalone 35 ND 2,5 - 3,5 lít/ha, pha 1/500 - 1/600.
Sâu n lá, sâu đ c thân, đ c quả. Tr b ng các thu c sau: Sherpa 25 ND
0,8 - 1 lít thu c/ha, pha 1/600 - 1/800; Decis 2,6 ND 500 - 700 gam/ha, pha 10 15 cc trong bình x t 8 lít nước. Monitor 60 DD, 1 - 1,5 lít/ha, nồng đ 1/800.
2.2.2.

ệ

trên cây nho

M t s bệnh nấm ph biến nhất trên cây nho là bệnh nấm trắng (Uncinula
necator), bệnh đ m lá (Phomopsis viticola), bệnh g sắt (Kuehneola vitis), (bệnh
dieback (Lasiodiplodia theobromae),…
2.2.2.

n n m tr ng

n inu

n

tor

Ở Ninh Thuận bệnh nấm trắng được gọi là bệnh nấm xám hay b t xám do
nấm Uncinula necator gây ra. Hiện nay, bệnh nấm trắng gây hại trên tất cả các
vùng nho trên thế giới bao gồm cả các nước có khí hậu nhiệt đới. Nếu khơng
được phịng trừ, bệnh sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và n ng suất của cây
nho. Nấm Uncinula necator ch gây hại trên nh ng loài cây thu c họ nho
Vitaceae. Nhiều báo cáo cho thấy, bệnh nấm trắng là m t trong nh ng bệnh khá
7

ph biến và nguy hiểm trên cây nho ở nước ta. Trong điều kiện ở Ninh Thuận,
nấm phát triển hầu như quanh n m, trừ các tháng mưa lớn. Nh ng giàn nho
thiếu ánh sáng phù hợp cho sự phát sinh và lây lan của bệnh. Nấm tấn công vào
các b phận như cành, lá bánh tẻ, lá già và quả. Trên cành và quả thấy xuất hiện
các đám m c màu xám tro, trên quả có thể thấy các vết màu trắng hơi xám.
Bệnh nấm trắng đặc biệt nguy hiểm cho giai đoạn quả từ khi đậu được 5 - 7
ngày cho đến khi chín.

ể phịng trừ bệnh nấm trắng sử d ng nước lưu huỳnh -

vôi (canxi polisunfua) 0,05 – 0,1 0B.
2.2.2.2.

n gỉ s t (Kuehneola vitis)

Bệnh g sắt là bệnh nguy hiểm trên nho, chúng xuất hiện đầu tiên ở vùng
nhiệt đới. Ở các nước châu Mỹ thì từ Colombia, Venezuela và Trung Mỹ tới
Miền Nam Florida và các bang khác của Mỹ. Bệnh hại nặng đặc biệt ở vùng
châu Á và Trung Mỹ, nếu không được phịng trừ thì cây nho sẽ b tàn l i. Tác
nhân gây bệnh do nhiều loài nấm, nhưng ở Việt Nam tác nhân gây bệnh được
xác đ nh là nấm Kuehneola vitis gây ra. Nấm chủ yếu gây hại trên lá bánh tẻ và
lá già, chính vì thế mà thường thấy nấm xuất hiện vào cu i v . ể phịng trừ có
hiệu quả nên phun thu c sớm ngay khi thấy có vết bệnh b ng m t trong nh ng
loại thu c sau: Anvil 5 SC liều lượng 1,0 - 1,2 lít/ha; Score 250 ND, liều lượng
0,15 - 0,2 lít/ha; Viben C liều lượng 1,5 - 2,0 kg/ha.
2.2.2.

nh dieback (Lasiodiplodia theobromae)
Bệnh dieback là m t trong nh ng bệnh khá ph biến trên thân cây nho với

các vết bệnh đặc trưng trên thân và cành. ây là m t trong nh ng bệnh phá hoại
nặng nề nhất trên mô gỗ của nho. M t s loại nấm trên thân cây có thể là nguyên
nhân gây ra nh ng bệnh này, ảnh hưởng đến cả hai gi ng Vitis vinifera L.
và Vitis labrusca. Trong s các loại nấm này, chi Lasiodiplodia là tác nhân gây
bệnh dieback trên cây nho, còn được gọi là cánh tay chết đen. Trong các lồi
thực vật có triệu chứng, họ Lasiodiplodia theobromae được báo cáo là ph biến
nhất (Úrbez - Torres, 2011). Ở Brazil, L. theobromae (Pat.) Griff. & Maubl

8


(Correia và cs., 2013) và Lasiodiplodia brasiliense (Correia và cs., 2015) đã
được phân lập từ các cây nho có triệu chứng bệnh.
Nh ng mầm bệnh này thường lây nhi m cho cây qua vết thương cắt t a
(Úrbez-Torres & Gubler, 2009). Hơn n a, chúng có thể được truyền từ cây nho
mẹ sang cây nho con thông qua vết ghép hoặc các quá trình nhân gi ng khác tại
vườn ươm (Gramaje & Armengol, 2011). Sự lây nhi m cũng được ưa chu ng
bởi các điều kiện làm giảm sức s ng của cây, chẳng hạn như sương giá, nhiệt đ
cao trong nh ng tháng mùa h , dinh dưỡng kém và việc cắt t a không được thực
hiện t t. Triệu chứng của bệnh dieback là: lá úa, cây phát triển còi cọc; chồi chết
hoặc suy chồi, các vết th i m c hoặc vết sọc hoại tử trong thân cây thường phát
triển ở nh ng b phận của v cây đã b t n thương (Larignon & Dubos, 2001).
ể giảm tỷ lệ mắc bệnh dieback trên cây nho ta cần chọn trồng các gi ng
ít mẫn cảm với bệnh dieback; vệ sinh sạch vườn nho, không để lại tàn dư cây
trồng và gỗ chết trong vườn nho; tránh cắt t a cây trong thời tiết m ướt và hạn
chế t i đa s vết thương được tạo ra trên cây; đánh dấu cây b nhi m bệnh và
loại b các cành nhánh hoặc toàn b giàn nho đã nhi m bệnh (Weber, Trouillas,
& Gubler, 2007). M t s nghiên cứu đã được thực hiện in vitro và in vivo để thu
được các sản ph m thúc đ y việc kiểm soát các mầm bệnh này, chẳng hạn như

các sản ph m hóa học hoặc sinh học. Tuy nhiên, tùy theo lồi được nghiên cứu
mà có hiệu quả khác nhau (Rolshausen và cs., 2010; Amponsah, Jones,
Ridgway, & Jaspers, 2012; Díaz & Latorre, 2013).
Việc sử d ng m t s tác nhân kiểm soát sinh học để kiểm soát nấm bệnh
dieback cũng đã được thử nghiệm, chứng minh hiệu quả in vitro và in vivo của
các tác nhân này. Alfonzo, Conigliaro, Torta, Burruano, và Moschetti (2009) đã
đánh giá in vitro Bacillus subtilis, kiểm soát Phaeoacremonium aleophilum,
Phaeomoniella chlamydospora , Verticillium dahliae và Botryosphaeria rhodina.
Sử d ng các tác nhân kiểm soát sinh học kích hoạt sự xâm nhập của các vết
thương trên cây, ng n chặn sự xâm nhập của các mầm bệnh trên thân cây. Do đó,
nh ng tác nhân này trở thành m t lựa chọn bảo vệ thực vật theo thời gian
9


(Mutawila, Fourie, Halleen, & Mostert, 2011). Mutawila, Halleen, & Mostert
(2016 ) báo cáo loài Trichoderma làm giảm nhi m trùng vết thương do bệnh
dieback gây trên thân cây nho. Việc bảo vệ vết thương b ng các sản ph m hóa học
hoặc sinh học cũng có thể làm giảm sự hiện diện của d ch bệnh trong khu vực
(Halleen, Fourie, & Lombard, 2010; Díaz & Latorre, 2013; Sosnowski, Loschiavo,
Wicks, & Scott, 2013).

H
i

2.3. T

2.2. H
i

g

ả
t

A

B

C

D

ủ

g
Ho i t một p n
o i t trong thân cây

g

cây nho
t

ng m

t

n

g

2.3.
Trên thế giới đã có m t s cơng trình nghiên cứu về chủng nấm bệnh
Lasiodiplodia theobromae. Trong thí nghiệm của José Ramón

rbez-Tores.

(2011) thực hiện tái lây nhi m trên cành nho ở các nhiệt đ khác nhau 10, 15,
20, 25, 30, 35 và 40oC thì ở 35oC cành nho có triệu bệnh rõ nhất, cành th i m c
nấm mọc toàn b cành nho. Ở thí nghiệm của E. Rodríguez-Gálvez và cs. (2015)
các triệu chứng của bệnh dieback bao gồm r ng chồi, úa lá, các triệu chứng này
10


luôn đi k m với hoại tử mạch thân. Abdullah H. Al-Saadoon và cs. (2012) thực
hiện tái lây nhi m b ng phương pháp tưới dung d ch bào tử nấm L. theobromae
vào đất, lá héo rũ sau 2 tuần. Trong nghiên cứu của P Latha và cs. (2013) và
Carina Félix và cs. (2016), chủng nấm L. theobromae gây bệnh dieback trên
nho, nấm phát triển t t nhất trên môi trường PDA, môi trường Czapek nấm phát
triển kém. Carina Félix và cs. (2016) đã công b nhiệt đ t i ưu cho sự sinh
trưởng của nấm L. theobromae là 30oC (Carina Felix và cs., 2016). Trong
nghiên cứu của A Saha và cs. (2008) nấm L. theobromae phát triển trong khoảng
pH từ 3 - 8, ở pH 6 chủng nấm phát triển t t nhất (A Saha và cs., 2008). Nghiên
cứu của Carina Félix và cs. (2018) đã cho biết nấm L. theobromae có khả n ng
sinh các enzyme amylase, gelatinase, caseinase, cellulase, lipase, laccase,
xylanase, pectinase and pectin liase (Carina Félix và cs., 2018).
Theo Carine Rusin và cs. (2020) kết quả của các thử nghiệm in vitro, các
chất chiết xuất từ t i và cây đinh hương, các hóa chất tebuconazole, mancozeb,
fosetyl - Al, pyraclostrobin, difeconazole và các chất kiểm soát sinh học T.
Harzianum, B. subtilis có khả n ng kìm hãm sự phát triển của nấm L.

theobromae trong cây nho (Carine Rusin và cs., 2020).
2.3.

ghiên c

ệ

Ở Việt Nam đã có m t s nghiên cứu về nấm L. theobromae trên m t s
cây trồng trong nước. Trong nghiên cứu của Nguy n Vũ Mai Linh và cs. (2021)
đã khảo sát khả n ng ức chế nấm L. theobromae gây bệnh th i cu ng trên xoài
của nano bạc và đồng. L. theobromae - m t thành viên của họ nấm
Botryosphaeriaceae, là tác nhân có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng và
chất lượng trái xồi trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Trong nghiên cứu này,
chủng nấm XB1 được phân lập từ trái xoài b th i cu ng. Nghiên cứu phân loại
dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự gen vùng 5,8S RNA cho kết quả chủng
nấm XB1 có đ tương đồng cao (99 ) với lồi L. theobromae. Sử d ng chế
ph m nano kim loại Ag và Cu ở các nồng đ khác nhau trong việc đánh giá khả
n ng ức chế sự phát triển của nấm L. theobromae XB1 trên đĩa thạch. Sau 7
11


ngày, chế ph m nano Cu ở nồng đ 2000 ppm và 4000 ppm ức chế được 17,9
và 52,4

sự phát triển của nấm. Nano Ag ở nồng đ 400 ppm cho kết quả ức

chế sự phát triển của nấm L. theobromae XB1 cao nhất sau 4 ngày (80 ). Chế
ph m Nano AgH ở nồng đ 20 ppm ức chế nấm tương đương với hiệu quả của
carbemdazin 400 ppm và hexanconazole 400 ppm (~90 ). Từ 25 ppm, nano
AgH có khả n ng tiêu diệt hoàn toàn nấm L. theobromae XB1.

12


PH N III V T IỆU V PH

NG PH P NGHI N C U

g g
Gi ng nho sử d ng trong thí nghiệm là nho Ninh Thuận. Các mẫu nho có
triệu chứng bệnh dieback thu thập tại Viện nghiên cứu và phát triển cây trồng ở
Trâu Qùy - Gia Lâm - Hà N i và vườn nho ở Thanh

ặng - Minh Hải - V n

Lâm - Hưng Yên.
V

g
- Cành, lá và quả nho.
đ

g

g

a điểm nghiên cứu: B môn Công nghệ Vi sinh - khoa Công nghệ

-

Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 3/2022 – 9/2022.
g
*

ế

g

g

ế

g

- Tủ cấy vô trùng

- Tủ ấm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Máy lắc n nhiệt 30⁰C

- Máy đo pH

- Máy vortex

- Máy khuấy từ

- ĩa petri (90 mm)

- Máy ly tâm lạnh

- Ống nghiệm

- Kính hiển vi quang học

- Tủ lạnh, tủ mát

- Tủ sấy vô trùng

- Lamen, lam kính

- Nồi hấp vơ trùng

- Ống eppendorf

- Micropipet loại 1000 µl, 100 µl

-

- Máy PCR

- Máy điện di

*H

n cồn, que cấy

g

ô

g

ô

ủ g

g

- PDA (Potato Dextrose Agar): D ch chiết khoai tây 200g/l; D-glucose
20g/l; nước cất 1000ml; agar 20g/l; pH = 5,6 ± 0,2.

13


un s i 200g

Ch
qu v i t

y

o it y

t t trong

sung vào

it

n

t trong 0 p t

u

o i t y 20g D-glucose, 20g agar.

- SDA (Sabouraud Dextrose Agar): Peptone 10g/l; D - glucose 40g/l;
nước cất 1000ml; agar 15g/l; pH = 6,0 ± 0,2.
- ISP2 (International Streptomyces Project 2): Cao nấm men 4g/l; d ch
chiết malt 10g/l; D - glucose 4g/l; nước cất 1000ml; agar 20g/l, pH= 7.2 ± 0.2.
- CDA (Czapek Dox Agar): NaNO₃ 2g/l; K₂HPO₄ 1g/l; MgSO₄ 0,5g/l; KCl
0,5g/l; FeSO₄ 0,01g/l; sucrose 30g/l; nước cất 1000ml; agar 15g/l; pH = 7.3 ± 0.2.
- WA (Water Agar): Nước cất 1000ml; agar 20g/l.
- MEA (Malt Extract Agar): D ch chiết malt 20g/l; peptone 6g/l; D glucose 20g/l; nước cất 1000ml; agar 15g/l; pH 6,0 ± 0,2.
*

ơ

g

ử

ạt tính sinh

+ Amylase: Agar 2 , tinh b t 1
+ Cellulase: Agar 2 , CMC 1

z

g ạ

trong đệm phosphat 0,1M, pH 7.
trong đệm phosphat 0,1M, pH 7.

+ Protease: Agar 2 , gelatin 0,5

trong đệm phosphat 0,1M, pH 7.

+ Xylanase: Agar 2 , xylan 0,5

trong đệm phosphat 0,1M, pH 7.

+ Pectinase: Agar 2 , pectin 0,5

trong đệm phosphat 0,1M, pH 7.

+ Chitinase: Agar 2 , chitin 1

trong đệm phosphat 0,1M, pH 7.

+ Thu c nhu m Lugol 1
+ Thu c nhu m Amino đen 10B 0,1

trong methanol, acetic acid, nước

cất (t lệ 3:1:6).
P

g

g
ệ h

Các mẫu nho có triệu chứng của bệnh dieback được thu thập tại Viện
nghiên cứu và phát triển cây trồng ở Trâu Qùy - Gia Lâm - Hà N i và vườn nho
ở Thanh ặng - Minh Hải - V n Lâm - Hưng Yên.
Từng mẫu được bảo quản riêng trong túi polyethylen vô trùng, mang tới
phịng thí nghiệm b mơn Cơng nghệ Vi Sinh (Học viện Nông nghiệp Việt Nam)
và được bảo quản trong tủ lạnh trước khi phân lập mầm bệnh (Paul và cs., 2021).
14


3.5.2. P

ệ

ệ

Các mẫu nho có triệu chứng bệnh được làm sạch b ng nước nước cất vô
trùng, khử trùng bề mặt b ng cồn 70⁰ trong 1 phút, rửa lại ba lần b ng nước cất
khử trùng, sau đó để khơ tự nhiên trong khơng khí. Cắt mẫu bệnh thành các m u
nh có kích thước 5 x 5 mm, đặt trên mơi trường PDA (có b sung kháng sinh
Streptomycin 1g/l) và ủ ở 30 oC trong 3 - 5 ngày. Quan sát sự xuất hiện khu n
lạc nấm theo từng ngày và cấy chuyển nhiều lần trên môi trường PDA, ở 30oC
trong 5 - 7 ngày để làm thuần đến khi trên đĩa ni cấy ch cịn m t chủng nấm
duy nhất (Edgar Rodriiguez-Gaslvez và cs., 2015; Paul và cs., 2021). Cu i cùng
các chủng nấm phân lập được chọn lọc và bảo quản tại b môn Công nghệ Vi

sinh (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) ở - 20 ℃.
3.5.3
Các chủng nấm được nuôi trên môi trường PDA ở 30oC trong 5 ngày. Sau
đó tiến hành tái nhi m theo các bước sau: Rửa sạch lá, cành và quả nho b ng
nước máy, khử trùng b ng cồn 70o trong 1 phút và rửa sạch b ng nước cất vô
trùng 3 lần.

ể lá, thân, quả nho ráo nước, dùng kim vơ trùng tạo vết thương ở

các v trí khác nhau rồi đặt nấm lên.

i với mẫu đ i chứng, thí nghiệm được

thực hiện tương tự, tuy nhiên ch đặt mơi trường PDA khơng chứa nấm lên v trí
đã được tạo vết thương cơ giới. Các mẫu sau khi thực hiện tái lây nhi m được đặt
trong h p có chứa giấy lọc vô trùng được làm m và nuôi ở 35oC (José Ramón
rbez-Tores, 2011). Quan sát lá, cành và quả nho từng ngày và so sánh với mẫu
đ i chứng (Ruvishika Shehali Jayawardena và cs., 2016; Kim và cs., 2013).
Thí nghiệm đánh giá khả n ng gây bệnh dieback trên nho được lặp lại ba lần.
3.5.4
Quan sát các đặc điểm hình thái nấm nhờ kính hiển vi quang học: Chủng
nấm nghiên cứu được nuôi trên môi trường PDA ở 30⁰C. Lamen vơ trùng được
g m m t góc 45⁰ trên môi trường thạch đĩa PDA đã cấy nấm. Sau 12 giờ, 14
giờ, 16 giờ,… quan sát đặc điểm hình thái sợi nấm (có vách ng n, khơng vách
ng n, có mẫu và khơng có mấu); cu ng sinh bào tử (hình dạng, màu sắc...); bào
15