Xây dựng quy trình vi nhân giống cây lan huệ (hippeastrum sp ) bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“XÂY DỰNG QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY LAN
HUỆ (Hippeastrum sp.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY LÁT MỎNG TẾ BÀO”

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Yến

MSV

: 637194

Lớp

: K63CNSHB

Giảng viên hướng dẫn

: PGS.TS.Nguyễn Thanh Hải

HÀ NỘI – 03/2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng quy trình vi nhân giống

Lan Huệ bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào” là kết quả quá trình
nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.Nguyễn Thanh Hải.
Các số liệu nghiên cứu trung thực, khơng sao chép kết quả của bất kì khóa luận
nào trước đó. Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thị Yến

i


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng quy trình nhân giống Lan Huệ bằng
phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào” là cột mốc quan trọng nhất trong những
tháng năm sinh viên của tơi. Để có thể bắt đầu thực hiện và hồn thành khóa
luận, tơi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc Học viện, Ban chủ
nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học cùng tồn thể thầy cơ giáo đã tận tình dạy bảo,
truyền đạt những kiến thức quan trọng và quý báu cũng như tạo mọi điều kiện
thuận lợi nhất cho tơi trong q trình học tập nghiên cứu và cho đến khi thực
hiện đề tài này.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS.Nguyễn Thanh Hải đã dành nhiều thời gian, công sức để trực tiếp hướng
dẫn và chia sẻ kinh nghiệm để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình,
người thân và những người bạn đã luôn sát cánh, động viên, ủng hộ tơi trong
q trình thực hiện đề tài. Trong q trình nghiên cứu khơng tránh khỏi thiếu sót
và hạn chế, kính mong nhận được sự góp ý của q thầy (cơ) để đề tài được
hồn thiện hơn.

Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thị Yến

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................... vi
DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................... vii
TÓM TẮT .......................................................................................................... viii
I. MỞ ĐẦU............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề. .................................................................................................. 1
1.2. Mục đích...................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu........................................................................................................ 2
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung về cây Lan Huệ. .............................................................. 3
2.1.1. Nguồn gốc. ............................................................................................... 3
2.1.2. Hệ thống phân loại thực vật. .................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật của cây Lan Huệ. ....................................................... 3
2.1.4. Điều kiện ngoại cảnh................................................................................ 4
2.1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống vơ tính cây Lan Huệ. ......................... 4
2.2. Khái quát về vi nhân giống. ........................................................................ 6
2.2.1. Khái niệm. ................................................................................................ 6

2.2.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô............................................................... 6
2.2.3. Các bước nhân giống in vitro. .................................................................. 6
2.2.4. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan Huệ. ...................................... 10
2.2.5. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào. ........................................................ 13
III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 18
3.1. Đối tượng, địa điểm, vật liệu và phương pháp nghiên cứu. ..................... 18
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................... 18
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu. ............................................................................... 18

iii


3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. ......................................................... 18
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. ..................................................... 18
3.2.1. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................. 18
3.2.2. Các phương pháp nghiên cứu ................................................................ 20
3.3. Các chỉ tiêu theo dõi.................................................................................. 21
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 22
4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu .......................................... 22
4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ presept tới hiệu quả khử trùng
mẫu củ Lan Huệ. .............................................................................................. 22
4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới hiệu quả khử
trùng củ Lan Huệ.............................................................................................. 23
4.2. Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng
đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ của cây Lan huệ. ........................... 24
4.2.1. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái lát mỏng
đế củ Lan Huệ. ................................................................................................. 25
4.2.2. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái lát mỏng
đế củ lan huệ..................................................................................................... 28
4.2.3. Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ lan huệ... 31

4.3. Nội dung 3: Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh............................................. 34
4.3.1. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của IBA tới q trình tạo cây Lan Huệ in
vitro hồn chỉnh................................................................................................ 34
4.3.2. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của α- NAA tới quá trình tạo cây Lan Huệ in
vitro hồn chỉnh................................................................................................ 35
4.3.3. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng than hoạt tính tới q trình tạo cây Lan Huệ
in vitro hoàn chỉnh ........................................................................................... 37
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 39
5.1. Kết luân. .................................................................................................... 39
5.2. Kiến nghị. .................................................................................................. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ presept tới hiệu quả khử trùng mẫu củ Lan
Huệ sau 6 tuần theo dõi. ...................................................................... 22
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới hiệu quả khử trùng cây Lan
Huệ. ..................................................................................................... 23
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan
Huệ sau 8 tuần ..................................................................................... 25
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan
Huệ sau 8 tuần .................................................................................... 29
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái lát mỏng đế củ Lan
Huệ sau 8 tuần ..................................................................................... 31
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của IBA tới q trình tạo cây Lan Huệ in vitro hồn
chỉnh sau 4 tuần................................................................................... 34
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của α- NAA tới q trình tạo cây Lan Huệ in vitro hồn
chỉnh sau 4 tuần................................................................................... 35

Hình 4.6. Cây Lan Huệ hồn chỉnh sau 4 tuần trên các môi trường bổ sung αNAA .................................................................................................... 36
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới q trình tạo cây Lan Huệ in vitro
hồn chỉnh sau 3 tuần .......................................................................... 37

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 4.1 Mẫu lan huệ in vitro phát triển tốt chuẩn bị cho các thì nghiệm tiếp
theo ...................................................................................................... 24
Hình 4.2. Hình ảnh mẫu lát mỏng tế bào Lan Huệ bổ sung 2,4 D sau 8 tuần. ... 27
Hình 4.3. Hình ảnh mẫu ni cấy lát mỏng tế bào bổ sung BAP sau 8 tuần ...... 30
Hình 4.4. Hình ảnh mẫu ni cấy lát mỏng tế bào bổ sung TDZ sau 8 tuần ...... 33
Hình 4.5. Cây Lan Huệ hồn chỉnh sau 4 tuần trên các mơi trường bổ sung
IBA. ..................................................................................................... 35
Hình 4.7. Cây Lan Huệ hồn chỉnh sau 4 tuần trên các môi trường bổ sung
than hoạt tính ....................................................................................... 38

vi


DANH MỤC VIẾT TẮT
BAP

:

Benzyl-amino-purine

CT

:

Cơng thức

CV (%)

:

Sai số thí ngiệm

ĐC

:

Đối chứng

MS

:

Mơi trường Murashige and Sknoog

α- NAA

:

α-naphtalene acetic acid

IBA

:

Indole-3 butyric acid

TDZ

:

Thidiaruzon

NL

:

Nhắc lại

TN

:

Thí nghiệm

vii


TĨM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Xây dựng quy trình vi nhân giống Lan Huệ
(Hippeastrum sp.) bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào” với mục đích
bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Lan Huệ, sử dụng phương
pháp nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật để tiến hành. Thí nghiệm được bố

trí ngẫu nhiên, tối thiểu 30 mẫu/công thức, các chỉ tiêu được quan sát và đo đếm
hàng tuần. Sau quá trình nghiên cứu thu được kết quả như sau:
Nồng độ chất khử trùng Presept tốt nhất cho bước khử trùng mẫu là
0,75%. Bên cạnh đó, thời gian khử trùng tốt nhất là 15 phút. Môi trường MS bổ
sung TDZ với nồng độ 1,5 mg/l có tác động tốt nhất đến khả năng nhân nhanh
chồi. Mơi trường bổ sung than hoạt tính với nồng độ 1 mg/l là môi trường tối ưu
cho việc ra rễ.

viii


I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Cây hoa Lan huệ (Hippeastrum sp.) có nguồn gốc từ Nam Mỹ nên có khả
năng thích ứng với nhiều vùng sinh thái ở Việt Nam (Nguyễn Thị Đỏ, 2007;
Phạm Hoàng Hộ, 2000). Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Minh Phượng và
cộng sự (2014), Trịnh Thị Mai Dung và cộng sự (2015) cho thấy chủng loại
giống Lan huệ hiện phổ biến trồng làm cảnh tại các tỉnh/thành phố trên cả nước
là 11 loại với nhiều màu sắc, hình dáng khác nhau và thuộc nhóm hoa cánh đơn.
Những năm gần đây, cây hoa Lan huệ đã nhận được nhiều sự quan tâm
của người chơi hoa và nhà nghiên cứu ở trong và ngoài nước. Màu sắc, hình
dạng và chủng loại Lan huệ trên thị trường ngày càng đa dạng, tuy nhiên nguồn
cung cấp giống còn hạn chế, giá giống mới ngoại nhập cao nên thị trường hoa
Lan huệ chưa được phát triển như mong đợi và chưa đáp ứng được nhu cầu của
người chơi hoa. Để làm phong phú tập đoàn Lan huệ Việt Nam, một số nghiên
cứu lai tạo giống đã được công bố như các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị
Minh Phượng và cộng sự (2014), Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự (2014), Phạm Thị
Minh Phượng (2016). Tuy nhiên, các nghiên cứu trên chủ yếu tạo ra các dòng lai
Lan huệ cánh đơn (hoa 6 cánh) trong khi đó, trên thị trường dạng hoa bán kép
hoặc cánh kép với số cánh >6 đang được người chơi hoa ưa chuộng, giá bán củ

giống hoa Lan huệ cánh kép thường cao hơn so với các giống hoa cánh đơn.
Trên thế giới, Lan huệ cánh kép được thương mại hóa từ đầu những năm
1990. Đến đầu thế kỷ XXI chỉ có khoảng 30 giống Lan huệ cánh kép được
thương mại ở một số quốc gia như Úc, Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ và Nam Mỹ
(Read, 2005). Xu hướng lai tạo hoa Lan huệ cánh kép của mỗi khu vực rất khác
nhau. Tại Hà Lan và Úc, hoa cánh kép được lai tạo có kích thước hoa lớn, ngồng
hoa cao, cánh hoa dày còn ở Nhật Bản hoa thường nhỏ và thấp cây (Read,
2005). Gần đây, Ming-Chung Liu và Der-Ming Yeh (2015) đã tạo được giống
hoa Lan huệ cánh kép có hương thơm đặt tên “T.S.S. No.1- Pink Pearl” bằng

1


phương pháp lai thông qua thụ phấn in vitro tại Đài Loan. Để có thể tạo ra các
giống Lan huệ cánh kép từ nguồn gen hoa Lan huệ trong nước đáp ứng nhu cầu
của người chơi hoa thì việc nghiên cứu lai tạo giống hoa Lan huệ cánh kép Việt
Nam là thực sự cần thiết.
1.2. Mục đích.
Xây dựng quy trình để nâng cao hiệu quả trong vi nhân giống Lan Huệ
bằng kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào.
1.3. Yêu cầu.
Xác định được thời gian khử trùng và nồng độ chất khử trùng trong gian
đoạn tạo vật liệu ban đầu.
Xác định được mơi trường nhân nhanh thích hợp cho hệ số nhân in vitro
chồi Lan Huệ.
Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới sự tạo rễ của chồi Lan Huệ.

2

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Lan Huệ.
2.1.1. Nguồn gốc.
Các lồi Lan Huệ (Hippeastrum) có nguồn gốc tập trung nhiều nhất ở
hai trung tâm đa dạng lồi (centre of diversity), một ở miền đơng Brazil và một
còn lại ở trung tâm miền nam Andes thuộc Peru, Bolivia và Argentina, tại sườn
đơng gần foothill. Vài lồi sống xa lên phía bắc tại Mexico và miền tây Đơng
Ấn. Chi này được cho là có gốc ở Brazil, nơi ít nhất 34 được phát hiện. Môi
trường sống chủ yếu là nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nhiều loài sống ở các tầng
cây thấp, trong khi nhiều loài lại ưa nắng. Hippeastrum angustifolium là ví dụ
cho lồi thích vùng lũ. Cũng có các lồi thực vật biểu sinh như Hippeastrum
aulicum, Hippeastrum calyptratum, Hippeastrum papilio và Hippeastrum
arboricola thuộc chi Omphalissa.
2.1.2. Hệ thống phân loại thực vật.
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Angiospermae (Thực vật hạt kín)
Lớp: Monocots (Thực vật một lá mầm)
Phân lớp: Liliidae (Hành)
Bộ: Asparagales (Măng Tây)
Họ: Amaryllidaceae ( Hoa Loa Kèn Đỏ)
Chi: Hippeastrum (Lan Huệ)
2.1.3. Đặc điểm thực vật của cây Lan Huệ.
Cây hoa Lan Huệ có dạng giả hành, củ được cấu tạo bởi các bẹ dạng mo
cong bao quanh, có nhiều lớp, xếp tầng. Các lớp vỏ bọc đều mọng nước. Rễ của
Lan Huệ là dạng rễ chùm và nhiều rễ phụ khác, kích thước gần như nhau.
Cây Lan Huệ có dạng thân đứng, là dạng thân giả mọc từ củ, thân có màu
xanh. Thân cây Lan Huệ cứng cáp, bên ngồi có các vân sọc dài song song mờ.

3

Lá của Lan Huệ có màu xanh, lá thn dài và nhọn ở đầu, trên lá có các
vân sọc dài hết lá. Cây Lan Huệ có hình thức mọc giống thân hành, mọc đối
nhau và ôm sát từ gốc thân giả lên.
Hoa của Lan Huệ có nhiều màu khác nhau như đỏ, đỏ cam, hồng, vàng,
trắng xanh…vv Ngày nay có nhiều loại được phối màu lẫn với nhau rất
đẹp. Hoa mọc thành từng cụm, mỗi cụm có khoảng từ 3 đến 4 hoa mọc ra và tạo
gần như khối hình cầu. Các hoa nở xòe như hoa loa kèn và lộ nhị hoa dài ra
ngoài. Cuống hoa dài mọc từ nách lá.
Hoa được kết hợp bởi các cánh hoa dài và mịn. tùy vào từng loại hoa mà
số cánh hoa khác nhau. Loại hoa đơn có 2 lớp cánh hoa sắp xếp sole nhau được
đan xem từ 6 cánh hoa. Cịn ở hoa kép thì số được sắp xếp so le 3 lớp bởi 9 cánh
hoa đan lại.
Quả của Lan Huệ là dạng quả nang, hình cầu, ở quả có các khe chia dạng
3 mảnh, bên trong có chứa các hạt, nhỏ, dẹt màu đen tuyền.
2.1.4. Điều kiện ngoại cảnh.
Lan Huệ là lồi cây ưa sáng, vì vậy chúng phát triển tốt nhất với ít nhất
năm đến sáu giờ nhận ánh sáng mặt trời mỗi ngày. Lan Huệ ra hoa quanh năm,
nhưng chủ yếu vào mùa hè cịn mùa đơng thì chúng cho ít hoa, hoa nhỏ và ngắn
hơn. Vì vậy, để huệ có thể ra hoa vào mùa đơng, phải đảm bảo lượng ánh sáng
thích hợp và nên sử dụng ánh sáng nhân tạo để đảm bảo cung cấp đủ nguồn
sáng. Huệ cần 16 giờ chiếu sáng bằng ánh sáng nhân tạo mỗi ngày.
2.1.5. Một số nghiên cứu về nhân giống vơ tính cây Lan Huệ.
Theo Phạm Thị Minh Phượng, Vũ Văn Liết năm 2016 đã nghiên cứu về
“Chọn tạo giống Lan Huệ (Hippeastrum sp.) cánh kép thích nghi trong điều kiện
miền Bắc Việt Nam”. Để tạo được các giống hoa Lan huệ cánh kép sử dụng
nguồn gen hoa Lan huệ Việt Nam, sáu phép lai hữu tính giữa 6 mẫu giống Lan
huệ Việt Nam (sử dụng làm mẹ) với 2 giống Lan huệ cánh kép nhập nội (sử
dụng làm bố) đã được thực hiện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ năm

4


2012. Kết quả đã tạo được 6 quả lai với số hạt trên quả từ 92 hạt (TH3) đến 145
hạt (TH1), tỉ lệ nảy mầm của hạt đạt từ 33,3% (TH14) đến 85,7% (TH9) và tạo
được 286 cây lai. Qua đánh giá 111 cây Lan huệ lai trong năm 2015 về các chỉ
tiêu phù hợp mục đích sử dụng làm hoa chậu hoặc hoa cắt cành, nghiên cứu đã
lựa chọn được 29 cây lai trong đó 13 cây bán kép và 16 cây kép. Các cây lai có
sự đa dạng về màu sắc (màu đỏ cam, đỏ cờ, đỏ nhung, hồng, trắng sọc đỏ hoặc
đỏ sọc trắng…). Số cánh hoa trên bông dao động từ 7,7 cánh đến 17,0 cánh, hoa
có mùi thơm hoặc khơng. Đường kính bơng hoa từ 12,2cm (TH1-25) đến
18,2cm (TH12- 17) và độ bền hoa trên cụm từ 5 ngày (TH12-49) đến 14 ngày
(TH3-3 và TH12-23). Đây là các vật liệu có giá trị cho cơng tác đánh giá, chọn
tạo giống Lan huệ cánh kép Việt Nam và nghiên cứu xây dựng biện pháp kỹ
thuật để phổ biến giống ra sản xuất.
“Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vơ tính cây Lan Huệ bằng phương pháp
chẻ củ” của nhóm tác giả Phạm Thị Minh Phượng, Trần Thị Minh Hằng năm
2014. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích tìm ra các biện pháp kỹ
thuật phù hợp để nhân giống vơ tính Lan Huệ bằng phương pháp chẻ củcho hệ
số nhân giống cao. Kết quả cho thấy phương pháp chẻ củ Lan Huệ thành 32
mảnh có hệ số nhân giống cao nhất (trung bình đạt 53,3 chồi/củ), chất lượng cây
giống đảm bảo.Sử dụng giá thể phối trộn theo tỷ lệ 2:1:1 về thể tích gồm đất:
cát: Pecilit có tác dụng rút ngắn thời gian tạo chồi (cịn 28 ngày) và làm tăng
chất lượng cây giống Lan Huệ (sau 4 tháng cây cao 26,2 cm, trung bình \5,2
lá/cây, đường kính củ 1cm). Sử dụng chế phẩm kích thích ra rễ N3M (10g/l
trong 10 giây) rút ngắn được thời gian ra rễ của mảnh củ, tăng chất lượng cây
giống (trung bình 4,0 rễ/mảnh; chiều dài bộ rễ là 27,1 cm và số củ trung bình
trên một mảnh củ là 1,25).Từ các kết quả đạt được bước đầu đã đưa ra quy trình
nhân giống vơ tính cây Lan Huệ bằng phương pháp chẻ củ gồm 4 bước. Các kỹ
thuật trong quy trình đơn giản dễ thực hiện ở trong điều kiện ở Việt Nam.

5


2.2. Khái quát về vi nhân giống.
2.2.1. Khái niệm.
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương
thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa mơi trường xác
định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp
như muối khống, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công
Kiên, 2002).
2.2.2. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô.
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vơ cùng to lớn
đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực
tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống.
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số
lĩnh vực như:
Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp
(nuôi cấy tế bào trần).
Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế
bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside,
các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong cơng nghiệp thực phẩm,
những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nơng nghiệp.
Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây
con thay vì chọn lọc cây ngồi đồng ruộng (ni cấy tế bào đơn).
Sản xuất dịng cây đồng hợp tử (ni cấy bao phấn và túi phấn).
Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.
Bảo quản phơi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.
Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
Nuôi cấy quang tự dưỡng.

2.2.3. Các bước nhân giống in vitro.
Bước 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

6


Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ
phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phịng
tăng trưởng.
Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào
thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ.
Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu
cấy vơ trùng và vẫn cịn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao
gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy.
Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa
mẫu bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy.
Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để
khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng
để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite
calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm
Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì
sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô
thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn.
Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô
trùng trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu,
những phần bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt
theo kích thước thích hợp.
Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng
cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử
lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng.

Mẫu cấy của vài lồi thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ
khi bắt đầu ni cấy. Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu
ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa
một lượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mơ non thường ít

7


bị hóa nâu hơn mơ trưởng thành hay mơ già. Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là
do hoạt động của enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và
tryosinase), nó được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong
suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu.
Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng
hóa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra.
Lượng thường dùng 0,5 – 5 g/l. Ngồi ra cịn có một số chất khác như: polyvinyl
pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 –
ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol.
Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt
động mạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ
giảm được hiện tượng hóa nâu.
Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện
tượng hóa nâu của mẫu cấy nên: Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non. Gây vết
thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất. Ngâm mẫu vào dung dịch acid
ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môi trường. Nuôi cấy mẫu trong môi
trường lỏng có lượng O2 thấp, khơng có ánh sáng trong 1 – 2 tuần đầu.
Chuyển mẫu từ mơi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp
sang mơi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao.
Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu
ni cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ khơng tích tụ.
Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy được cấy trên mơi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích
tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên
của cây trồng. Tuy nhiên, có những lồi cây trồng khơng có khả năng nhân
giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo.

8


Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin,
GA3 và các chất hữu cơ khác.
Bước 3: Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống
với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù
hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện ni cấy thích hợp giúp cho q
trình tăng sinh được nhanh. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và
được duy trì trong thời gian vơ hạn.
Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị
chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi
ra mơi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào
đó là các chất kích thích q trình tạo rễ. Điều kiện ni cấy tương tự với điều
kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều
kiện in vitro.
Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N,
ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để
kích thích q trình ra rễ in vitro.
Bước 5: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong q trình nhân giống vơ tính. Cây in
vitro được ni cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ,
độ ẩm… Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác hẳn như
dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con
dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm
cây cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ khơng khí mát, ẩm độ
cao…cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thốt nước,

9


tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm
q trình thốt nước ở lá (thường 7-10 ngày) kể từ ngày ra ngôi. Rễ được tạo ra
trong q trình cấy mơ sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường
được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn
thời gian ra rễ.
2.2.4. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan Huệ.
2.2.4.1. Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô Lan Huệ trên thế giới.
Nghiên cứu “Nhân nhanh Lan Huệ trong ống nghiệm của Janet E. A.
Seabrook and Bruce G. Cumming năm 1977”. Một kỹ thuật mới, nhanh chóng
để nhân giống amaryllis iHippeastrum spp. lai) bằng phương pháp nuôi cấy mô
được báo cáo. Gốc lá, vảy, cuống lá, vảy củ bên trong và vỏ quả đã được nuôi
cấy thành công trong ống nghiệm và cây con đã được tạo cảm ứng dễ dàng ở các
nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. Một số cây con cũng được tạo ra
khi khơng có chất điều hịa sinh trưởng. Các mơ có năng suất cao nhất để nhân
giống là các vảy và cuống ngược, được nuôi cấy trong dung dịch muối
Murashige và Skoog đã được sửa đổi với các thành phần hữu cơ bổ sung và 1
mg/l 2,4-D và 1 mg/l (BAP). Cây con gây ra theo trục cũng phát triển rễ trên
môi trường tạo chồi tổng quát nên không cần môi trường tạo rễ đặc biệt. Mặc dù
mô sẹo bở được thu nhận từ mô hoa được nuôi cấy trên môi trường mơi trường

có chứa 2 mg/l NAA và 4 mg/l BAP, nó tạo ra chồi sau 8 tuần cấy phụ tiếp trên
cùng một mơi trường. Trung bình thu được 10 cây con ra rễ từ mỗi mô tế bào
hoặc mẫu cấy trên môi trường nhân giống chồi. Như vậy, nếu thu được 45 mẫu
từ mỗi củ, 450 cây con thô sơ có thể được cắt bỏ từ mỗi củ mẹ trong 8 tuần nuôi
cấy. Đây là một sự gia tăng đáng kể so với các phương pháp nhân giống thông
thường.
Đề tài nghiên cứu “Vi nhân giống in vitro và các alkaloid của cây Lan
Huệ” của Rawia Zayed & H. El-Shamy & Strahil Berkov & Jaume Bastida &
Carles Codina cho ta thấy Các nồng độ khác nhau của methyl jasmonate,

10


spermine, casein hydrolysate, hoặc progesterone kết hợp với 16 mg/l 2 iP + 4
mg/l axit naphthalene acetic (NAA) đã được nghiên cứu để thu được tỷ lệ nhân
lên và tăng trưởng cao hơn của củ Lan Huệ trong ống nghiệm trên môi trường
bazơ MS. Tỷ lệ nhân giống cao nhất (8,2 củ / mẫu) đạt được với 80 mg/l
spermine, trong khi khối lượng củ tươi cao nhất (1,23g /củ) thu được với 4 mg/l
metyl jasmonat. Progesterone ở 20 mg/l hoặc casein thủy phân ở 2,0g/l cho
chiều dài lá cao nhất (tương ứng là 14,1 và 13,2 cm). Vì vậy, có thể khuyên
dùng tinh trùng 80mg/l kết hợp với 16 mg/l 2 iP + 4 mg/l NAA để thu được số
củ cao nhất trên mỗi mẫu với chiều dài lá vừa phải và trọng lượng củ tươi. Phân
tích hóa học cho thấy có sự thay đổi tỷ lệ loại alkaloid và số lượng các hợp chất
trong củ được xử lý bằng methyl jasmonate (4 mg /l).
Tháng 12, năm 1992 M.H. De Bruyn và cộng sự nghiên cứu đề tài “Nhân
giống trong ống nghiệm của Lan Huệ”. Cây Lan Huệ được nhân giống thành
công bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Các bộ phận khác nhau của cây đã được thử
nghiệm làm vật liệu cấy ghép, nhưng cây con chỉ có thể được tạo ra từ vảy đôi
và vảy chưa trưởng thành. Những cây con được hình thành trong ống nghiệm
này được chia thành bốn phần và được sử dụng để nhân lên. Các mẫu cấy quy

mơ kép có tỷ lệ nhân cao nhất khi mơi trường với 22,2 µM benzyladenine và
0,54 p.M axit naphthaleneacetic đã được sử dụng. Nồng độ đường sucrose đóng
một vai trị quan trọng trong việc bắt đầu trồng cây con mới, và kết quả tốt nhất
thu được khi nồng độ đường sucrose 2-3% đã được sử dụng. Các quan sát giải
phẫu được thực hiện trong quá trình bắt đầu những cây con mới.
Đề tài “Ảnh hưởng của các Phytohormom khác nhau đến sự tái sinh của
cây Lan Huệ” được đăng trên Tạp chí ạp chí Khoa học Pakistan. Tháng 3 năm
2012 của nhóm tác giả Aslam, F; Habib, S; Naz, S đã cho ta thấy việc nuôi cấy
mô của cây củ đã được thiết lập thành công và cây con được tái sinh với số
lượng lớn từ kỹ thuật này. Một phương pháp hiệu quả để nhân giống nhanh cây
Lan Huệ bằng kỹ thuật in vitro đã được phát triển trong nghiên cứu này bằng

11


cách sử dụng thực hành vi nhân giống. Trong kỹ thuật này, mẫu cấy cũng được
cấy trên môi trường đã tăng cường các chất dinh dưỡng và kích thích tố tăng
trưởng khác nhau. Vảy và mô phân sinh của củ ngầm dùng làm mẫu cấy được
nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ và sự kết hợp khác nhau
của cytokinin và auxin. Ảnh hưởng của các phytohormone này đối với sự hình
thành thực vật của cây Lan Huệ đã được nghiên cứu. Kết quả tốt nhất để tạo
chồi được thu được bằng cách sử dụng Thidiazurone (TDZ) 10 μM/l + axit
axetic Alpha-Naphthalene (NAA) 1,0 mg/l tức là (90%) tần suất bắt đầu tạo chồi
đối với mẫu cấy vảy và 80% tần suất khởi phát chồi đối với mẫu mô phân sinh
với 3,6 ± 0,0632 cm chiều dài chồi cho cả hai mẫu. Kết quả tốt nhất cho việc tạo
nhiều chồi thu được từ sự kết hợp của 6-benzyl amino purine (BAP) 5 mg/l +
Alpha-Naphthalene acetic acid NAA 0,1 mg/l với tần suất hình thành chồi 80%
Sự hình thành chồi được thúc đẩy trong MS bazơ vừa được tăng cường BAP 4
mg/l và NAA 0,1 mg/l NAA + 60% sucrose. Các cây con tái sinh được chuyển
sang các giá thể khác nhau trong nhà lưới xanh để thích nghi.

2.2.4.2. Một số nghiên cứu về ni cấy mơ cây Lan Huệ ở Việt Nam.
Đề tài “Nghiên cứu quy trình nhân nhanh In vitro cây Lan Huệ Mạng
Heppeastrum Reticulatum Herb.var Striatiforlium Herb” của Ninh Thị Thảo,
Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Hạnh Hoa năm 2010. Nghiên cứu được tiến
hành nhằm tìm ra các thơng số thích hợp để hướng tới xây dựng quy trình nhân
giống in vitro cây Lan huệ mạng (H. reticulatum var. striatifolium). Kết quả cho
thấy: Trên môi trường MS có chứa 3 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo chồi và củ
nhỏ. Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh. Hệ số
nhân đạt được cao nhất khi sử chồi in vitro làm vật liệu nhân nhanh là 1,50
chồi/mẫu trên môi trường bổ sung 0,5 mg/l IBA, trong khi đó sử dụng củ nhỏ để
nhân nhanh trên môi trường chứa 5 mg/l BA thì hệ số nhân đạt được là 7,17
chồi/mẫu. Đa số các chồi đều ra rễ (83,33%) trên môi trường chứa 1 mg/l IBA.
Các cây in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích nghi với điều kiện in vivo trên giá

12


thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 (v/v). Tỷ lệ cây sống sót là 100%, cây sinh
trưởng phát triển khoẻ mạnh. Sử dụng vảy củ đôi làm vật liệu vào mẫu khởi đầu
trên mơi trường MS có bổ sung 3mg/l BA sau 5 tuần nuôi cấy cho 100% mẫu
tạo chồi, đạy 1,91 chồi/mẫu. Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng để nhân nhanh
chồi. Hiệu quả nhân chồi đạt cao nhất khi sử dụng củ nhỏ in vitro cắt thành 4
phần và nuôi trên môi trường MS có chứa 5mg/l BA, hệ số nhân chồi là 7,17
chồi/ mẫu sau 4 tuần. Có thể sử dụng mơi trường MS chứa 1mg/l IBA để kích
thích chồi in vitro Lan Huệ Mạng hình thành rễ. Cây in vitro hồn chỉnh được
thích nghi ở vườn ươn trên giá thế cát và trấu hun với tỷ lệ 1:1.
2.2.5. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào.
2.2.5.1. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào.
Hệ thống TCL chứa những mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt ra từ các
cơ quan thực vật khác nhau. Chúng được cắt theo chiều dọc – được gọi là lTCL

hoặc ngược lại, Theo chiều ngang – được gọi là tTCL. Dạng lTCL ( 1mm0,5mm), chỉ bao gồm 1 lồi tế bào, ví dụ 1 lớp các tế bào biểu mơ có thể tách ra
từ một số các cơ quan hoặc vài lớp từ các tế vỏ; trong khi đó, dạng tTCL ( kích
thước 0,2/0,5mm hay vài mm bề dày ) bao gồm một số lượng nhỏ các dạng tế
bào từ các biểu mô khác nhau ( biểu mô, vỏ, vùng tượng tầng, mô mạch, cũng
như nhu mô). Một đặc tính phổ biến của lTCL, tTCL là tính mỏng, có nghĩa là
mảng cấy có số lượng tế bào càng ít càng tốt. Đặc tính “mỏng” đóng vai trị cực
kì quan trọng bởi những phân tử market dự tuyển cho sự biệt hóa có thể được
xác định in situ trong những tế bào địch. Sự xác định vị trí như vậy cho phép
giới hạn những tế bào đáp ứng.
2.2.5.2.Các nghiên cứu về nuôi cấy lát mỏng tế bào.
Nghiên cứu “Thidiazuron cảm ứng sự tạo chồi hiệu quả cao từ lát cắt
ngang lớp mỏng tế bào cuống lá Thu hải đường (Begonia tuberous) (Nhut và
cộng sự, 2005)”. Thidiazuron (TDZ) là chất có cấu trúc thuộc nhóm chất phenyl
urea có hoạt tính giống cytokinin (Mok và cộng sự, 1982; Thomas và

13


Katterman, 1986). TDZ được sử dụng cho nhân giống thực vật thông qua con
đường phát sinh cơ quan và phát sinh phôi trên nhiều đối tượng thực vật khác
nhau (Maik vad Saxena, 1992; Zhou và cộng sự, 1994). TDZ có thể kích thích
cảm ứng và nhân chồi cả khi được sưe dụng riêng lẻ và khi dùng kết hợp với các
chất điều hòa khác. Kết quả nghiên cứu cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp (0,1-0,2
mg/l) cho tỷ lệ tạo chồi cao (76,67%-86,33%) có hiệu quả đối với sự tạo mô sẹo
ở lát cắt ngang cuống lá Thu hải đường. Gill và Sexena (1992) đã nhấn mạnh vai
trò quan trong của TDZ trong đáp ứng hoocmone thực vật nội sinh đối với các
chương trình phát sinh hình thái cơ quan hoặc phát sinh phôi thông qua việc tăng
cường biến đổi chất, ức chế auxin in situ, đặc biệt đóng vai trò điều hòa các
enzyme chủ chốt và liên quan đến điều hịa protein. Vì vậy, trong nghiên cứu
này sử dụng TDZ trong nuôi cấy tTCL để nhanh nhanh chồi là phương pháp

hiệu quả để tạo nguyên liệu cho chuyển gen và nhân sinh khối về sau.
Đề tài “Sự phát sinh phơi vơ tính thơng qua ni cấy lát mỏng tế bào giả
hành cắt dọc của cây Lily (Lilium longiflorum)(Nhựt và cộng sự, 2002)” cho ta
thấy ảnh hưởng của độ dày mẫu cấy lên hiêu quả cảm ứng phát sinh chồi (ELS)
trên mơi trường MS có bổ sung 5,4µM NAA và 1,1µM TDZ cho hiệu quả phát
sinh phơi vơ tính cao tỷ lệ hình thành phơi 60% với mẫu cấy có độ dày 0,5- 0,7
mm, 85% với mẫu cấy có độ dày 0,8- 1mm, 65% với mẫu cấy có độ dày 1,21,5mm. Các mẫu cấy tTCL có độ dày 0,8-1,0mm cho số lượng ELS cao nhất so
với các mẫu cấy có độ dày 0,5- 0,7 và 1,2- 1,5mm. Tiến hành cấy chuyển ELS
sang mơi trường MS có bổ sung 5,4µM NAA và TDZ (0,2; 0,4; 0,7; 0,9 và
1,1µM) để tạo các khối. Sau 90 ngày nuôi cấy, các cụm ELS nuôi cấy trên mơi
trường MS có bổ sung 5,4µM NAA và 0,4 µM TDZ hoặc 5,4µM NAA và 0,7
µM TDZ có khối lượng cao nhất trong các mơi trường cịn lại (2401,1mg;
2420,4mg). Các kết quả cho thấy NAA và TDZ kích thích sự cảm ứng tạo mơ
sẹo trên các mẫu cấy tTCL giả hành và sự hình thành trực tiếp của phơi vơ tính.

14


“Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây Đương Quy
Nhật Bản (Angelica acutiloba) nuôi cấy invitro” của Hoàng Ngọc Nhung ,
Nguyễn Thị Quỳnh , Nguyễn Vũ Ngọc Anh , Nguyễn Lê Anh Thư , Toyoki
Kozai tại Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Trường đại học Chiba, Nhật Bản. Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba)
có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ
của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong nhiều đơn
thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự
phát sinh cơ quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của
chồi ngọn. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được ni cấy
trên mơi trường MS có bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1;
0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất phát từ lớp mỏng chồi ni cấy

trên mơi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel bằng
vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi
tăng rõ rệt. Phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh
là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ bất định. Trên mơi trường MS có
bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), hoặc
IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) ni cấy trong
điều kiện tối đã có đáp ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và
vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số
rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên mơi
trường khống Gamborg B5, vitamin Gamborg B5. Sự tạo chồi trực tiếp của cây
đương quy Nhật Bản có thể được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy lớp
mỏng chồi ngọn trên mơi trường khống MS, vitamin Gamborg B5, bổ sung 0,1
mg/l NAA, 1 mg/1 TDZ, 30 g/l đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l
adenine.
Nghiên cứu “Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân
giống in vitro cây Lan Hoàng Thảo thân gãy (Dendrobium Aduncum)” của

15


Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị Bích
Phượng, Trường đại học Y Dược, Đại học Huế, Trường đại học Khoa học, Đại
học Huế, Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại học Huế.
Bài báo đã trình bày kết quả thí nghiệm ni cấy lát mỏng tế bào cây lan Hoàng
thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) - một lồi lan rừng có giá trị của Việt
Nam. Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang (tTCL traverse thin cell layer) của chồi in vitro. Các tTCL được cảm ứng tạo protocorm
- like bodies (PLB) trên mơi trường cơ bản ½ MS có bổ sung riêng lẻ BAP hay
bổ sung kết hợp BAP và NAA. Môi trường tối ưu cảm ứng protocorm - like
bodies là mơi trường ½ MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho 29,85 protocorm - like
bodies/lát mỏng sau 8 tuần nuôi cấy. Cụm protocorm - like bodies được cấy lên

mơi trường MS có bổ sung TDZ, kinetin, NAA riêng lẻ hay kết hợp để tái sinh
chồi. Môi trường MS bổ sung kinetin 3,0 mg/l kết hợp với NAA 0,3 mg/l cho tỷ
lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67 chồi/mẫu. Chồi in vitro được cấy lên môi
trường MS bổ sung NAA để cảm ứng tạo rễ. Nồng độ NAA 2,0 mg/l là thích
hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro với kết quả 9,18 rễ/chồi. Cây con in vitro tái
sinh đầy đủ được huấn luyện và trồng lên giá thể, sau 6 tuần tỷ lệ sống đạt 90%.
Từ kết quả thí nghiệm, chúng tơi bước đầu đưa ra quy trình nhân giống in vitro
lan Hồng thảo thân gãy thơng qua nuôi cấy lát mỏng tế bào. Lát cắt mỏng đoạn
thân (1,0 - 1,5 mm) được nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung 0,5 mg/l BAP
sau 8 tuần nuôi cấy đạt 50% tTCL phát sinh PLB với 29,85 PLB/tTCL. Cụm
PLB (0,3 x 0,3 cm với 4 - 6 PLB) được nuôi cấy trên môi trường MS đầy đủ bổ
sung 3,0 mg/l kinetin kết hợp với 0,3 mg/l NAA sau 6 tuần ni cấy cho số chồi
hình thành là 5,67 chồi/mẫu với chiều cao chồi đạt 5,68 cm. Chồi in vitro tạo rễ
trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l NAA sau 4 tuần ni cấy đạt trung bình
9,18 rễ/chồi với chiều dài 1,37 cm. 4. Cây con in vitro hoàn chỉnh (2 - 3 cm; 2 3 rễ; 4 - 5 lá) được huấn luyện và trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ (1:1)
sau 4 tuần có tỷ lệ sống sót là 90%.

16