Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng, định tính vi khuẩn bacillus subtilis trong phân bón vi sinh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------🙡 🕮 🙣--------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG, ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
TRONG PHÂN BĨN VI SINH”

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ HỒNG

Khóa

: K63CNSHD

Ngành

: CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hƣớng dẫn

: TS. ĐẶNG THỊ THANH TÂM

Hà Nội – 2022


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong khóa
luận là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị
nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận đã
đƣợc cảm ơn, các thơng tin trích dẫn trong khóa luận này đều đƣợc ghi rõ nguồn
gốc.
Hà Nội, ngày 7 tháng 6 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng

i


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô TS. Đặng Thị Thanh Tâm
đã tận tình hƣớng dẫn, phân tích và tận tâm giúp đỡ trong suốt q trình làm
khóa luận.
Tiếp theo, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô tại Bộ mơn Cơng
nghệ Sinh học Thực vật nói riêng cũng nhƣ thầy cơ trong khoa Cơng nghệ Sinh
học nói chung đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kiến thức hữu ích trong
thời gian học tập tại Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.
Tơi cũng bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp
Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài này.
Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, ngƣời thân đã luôn ở
bên giúp đỡ động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc để tơi hồn thành khóa
luận này.
Hà Nội, ngày 7 tháng 6 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ......................................................................................... viii
TÓM TẮT ............................................................................................................. x
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích ......................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Khái quát chung về vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................... 3
2.1.1. Lịch sử phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................ 3
2.1.2. Phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis .............................. 3
2.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................... 4
2.3. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis.......................................... 4
2.4. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................. 5
2.4.1. Cấu tạo nội bào tử ....................................................................................... 6
2.4.2. Quá trình hình thành nội bào tử .................................................................. 7
2.4.3. Tác dụng nội bào tử..................................................................................... 8
2.5. Cấu trúc bộ gen vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................... 8

2.6. Lợi ích của vi khuẩn Bacillus subtilis đối với thực vật.................................. 9
2.7. Các chỉ thị phân tử xác định Bacillus subtilis .............................................. 10
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 13
3.1. Địa điểm, thời gian thực hiện đề tài ............................................................. 13
3.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 13
3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 14
iii


3.4. Trình tự mồi và điều kiện PCR để đánh giá sự có mặt của vi khuẩn
Bacillus subtilis trong phân bón vi sinh. ................................................. 17
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 21
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ, mơi trƣờng đến sự phát triển của
khuẩn lạc Bacillus subtilis theo thời gian ............................................... 21
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xây dựng đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi
khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................ 22
Thí nghiệm 3: Xây dựng hồ sơ đặc điểm sinh hóa trên chủng Bacillus
subtilis ATCC 6633 ................................................................................. 23
Thí nghiệm 4: Hiệu chỉnh phản ứng PCR trên mồi đặc hiệu .............................. 24
Thí nghiệm 5: Kiểm định phƣơng pháp xác định sự có mặt và định lƣợng
Bacillus subtilis trong dạng phân bón giải định ...................................... 27
Thí nghiệm 6: Kiểm định phƣơng pháp xác định sự có mặt và định lƣợng
Bacillus subtilis trong dạng phân bón vi sinh ......................................... 33
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................. 37
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 37
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 38

iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Diễn giải chữ viết tắt

1

B. subtilis

Bacillus subtilis

2

NA

Nutrient agar

3

LB

Luria Bertani

4

DNA

Deoxyribonucleic acid

5

PCR

Polymerase chain reaction

6

CFU

Conoly forming unit

7

CT

Công thức

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, môi trƣờng và thời gian nuôi cấy đến sự
phát triển của khuẩn lạc Bacillus subtilis ATCC 6633 theo thời
gian ...................................................................................................... 21
Bảng 4.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis với Bacillus

amyloliquefaciens................................................................................ 22
Bảng 4.3. So sánh hai quy trình hiệu chỉnh phản ứng PCR Conoly ................... 26
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của giai đoạn đun nóng trƣớc khi pha lỗng ................... 27
Bảng 4.5. Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình
thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) và
mật độ của mẫu phân bón vi sinh giả định loại 1 (CFU/g) ................. 30
Bảng 4.6. Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng của phân bón giả định
loại 2 .................................................................................................... 31
Bảng 4.7. Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình
thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) và
mật độ của mẫu phân bón giả định loại 2 (CFU/g)............................. 33
Bảng 4.8. Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng của phân bón vi sinh VELOX .. 33
Bảng 4.9. Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình
thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) và
mật độ của mẫu phân bón vi sinh VELOX (CFU/g) .......................... 35

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Nội bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. ................................................... 7
Hình 3.1. Phân bón vi sinh .................................................................................. 13
Hình 3.2. Phƣơng pháp pha lỗng nối tiếp.......................................................... 19
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis ATCC 6633 trên môi trƣờng
dinh dƣỡng thời gian khác nhau.......................................................... 21
Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng NA trong 20h ở 37oC ............... 23
Hình 4.3.Vi khuẩn bắt màu Gram (+) ................................................................. 23
Hình 4.4. Thử hoạt tính enzyme Catalase ........................................................... 23
Hình 4.5. Kết quả điện di thử nghiệm theo hai quy trình trên chủng ATCC
6633 với mồi B.sub trên gel agarose 2% ............................................ 24

Hình 4.6. Kết quả điện di với các thể tích dịch pha loãng khác nhau với mồi
B.sub trên gel agarose 1,2%................................................................ 24
Hình 4.7. Kết quả điện đi hiệu chỉnh quy trình B với mồi EN1 trên gel
agarose 2% .......................................................................................... 25
Hình 4.8. Kết quả nhuộm Gram 20 khuẩn lạc phân bón giả định loại 1 ............ 28
Hình 4.9. Kết quả thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón
giả định loại 1...................................................................................... 28
Hình 4.10. Kết quả điện di 5 khuẩn lạc bất kỳ với trình tự gen 16S rRNA
(mồi B.sub Common) trên gel agarose 2% ......................................... 29
Hình 4.11. Kết quả điện di 5 khuẩn lạc bất kỳ với trình tự gen
endoglucanase (mồi EN1) trên gel agarose 2% .................................. 29
Hình 4.12. Kết quả điện di các mẫu giả định với trình tự gen endoglucanase
(mồi EN1) trên gel agarose 2% ........................................................... 30
Hình 4.13. Kết quả nhuộm Gram 20 khuẩn lạc mẫu phân bón giả định loại 2 .. 32
Hình 4.14. Kết quả thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón
giả định loại 2...................................................................................... 32
Hình 4.15. Kết quả điện di 20 khuẩn lạc mẫu phân bón giả định loại 2 với
trình tự gen 16S rRNA trên gel agarose 2% ...................................... 32

vii


Hình 4.16. Kết quả nhuộm Gram 20 khuẩn lạc từ mẫu phân bón vi sinh
VELOX ............................................................................................... 34
Hình 4.17. Kết quả thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón
vi sinh VELOX ................................................................................... 34
Hình 4.18. Kết quả điện di 20 khuẩn lạc mẫu phân bón vi sinh VELOX với
trình tự gen 16S rRNAtrên gel agarose 2% ........................................ 35

viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. Thử nghiệm phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn B. subtilis .......... 26
Sơ đồ 2. Phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn B. subtilis trong phân bón
vi sinh .................................................................................................. 36

ix


TÓM TẮT

Nghiên cứu dựa vào chủng Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633
để xây dựng lên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hồ sơ sinh hóa và thử nghiệm
gen đặc hiệu để xây dựng các thông số kỹ thuật xác định vi khuẩn Bacillus
subtilis trong phân bón vi sinh.
Nghiên cứu đã xác định đƣợc môi trƣờng đặc hiệu là NA cho hình thái
khuẩn lạc B. subtilis trịn, bề mặt trơn dính, có đƣờng vịng trịn trên bề mặt
khuẩn lạc đồng tâm với đƣờng tròn viền, ria nhăn. Nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc
phát triển là 37oC và từ sau 20h ni cấy sẽ cho hình thái đặc trƣng. Thử nghiệm
hóa sinh sàng lọc cơ bản là vi khuẩn Gram (+) có hoạt tính enzyme Catalase của
vi khuẩn B. subtilis. Mồi EN1 đặc hiệu cho B. subtilis xác định sự có mặt của vi
khuẩn trong phân bón vi sinh. Cặp mồi EN1R và EN1F khuếch đại đặc biệt đoạn
DNA có kích thƣớc 1.311bp của gen endo-b-1,4-glucanase đƣợc xác định trong
gen endoglucanase kết hợp với xác định trình tự 16S rRNA xác định chính xác
sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis trong các mẫu nghiên cứu.
Đề tài áp dụng những thông số kỹ thuật đã nghiên cứu để kiểm định các
mẫu phân bón về sự có mặt của Bacillus subtilis.

x

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Ngày nay phân bón vi sinh đang đƣợc sử dụng ngày càng rộng rãi. Là cơ sở
cho nền nông nghiệp hữu cơ "thân thiện với môi trƣờng" phát triển. Đặc biệt là
phân vi sinh có thành phần vi khuẩn Bacillus subtilis có lợi ích quan trọng trong
việc thúc đẩy tăng trƣởng thực vật, sản sinh ra các loại enzyme cũng nhƣ kháng
sinh ngăn chặn mầm bệnh từ nấm và vi khuẩn gây bệnh.
Bacillus subtilis có sự tƣơng đồng lớn về hình thái và đặc tính sinh hóa với
các lồi vi khuẩn khác cùng nhóm Bacillus nhƣ: B. amyloliquefaciens, B.
licheniformis, B. vallismortis, B. atrophaeus, B. sonorensis, và B. mojavensis.
Việc xác định trực khuẩn thuộc nhóm B. subtilis chủ yếu dựa trên sự khác biệt
về hình thái, sử dụng các phƣơng pháp chẩn đoán và đặc tính sinh hóa. Các xét
nghiệm này thì tốn nhiều thời gian và thƣờng cho kết quả không rõ ràng, đặc
biệt là trong việc xác định các lồi có quan hệ họ hàng gần. Mức độ tƣơng đồng
cao của các gen ribosome của các sinh vật thuộc nhóm B. subtilis cũng làm cho
việc xác định vi khuẩn bằng trình tự gen 16S rRNA khơng hiệu quả. Có nhiều
chỉ thị phân tử để xác định B. subtilis, việc sử dụng gen đặc hiệu GyrA khơng
thể xác định chính xác do đó sự khác biệt về trình tự gen endo-b-1,4-glucanase
xác định trong gen endoglucanase đã kiểm chứng để nhận biết B. subtilis với các
vi khuẩn cùng nhóm đƣợc quan tâm. Sử dụng hai mồi PCR, EN1F và EN1R, đã
đƣợc dự đoán để khuếch đại đoạn 1.311bp DNA của B. subtilis (Ashe & cs.,
2014). Đồng thời sử dụng trình từ 16S rRNA để nhận biết các lồi cùng nhóm
Bacillus subtilis hỗ trợ cho việc xác định chính xác vi khuẩn B. subtilis.
Ở Việt Nam, có rất nhiều sản phẩm từ B. subtilis trong khi đó cơ quan quản
lý chất lƣợng chƣa có phƣơng pháp cụ thể nào xác định vi khuẩn B. subtilis
trong phân bón vi sinh. Để quản lý đƣợc chất lƣợng của các sản phẩm phân bón
vi sinh thì việc xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định số lƣợng và định tính cho

lồi B. subtilis là cần thiết. Vì vậy chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây

1


dựng phương pháp định lượng, định tính vi khuẩn Bacillus subtilis trong
phân bón vi sinh”.
1.2. Mục đích

Xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis
trong phân bón vi sinh.
1.3. Yêu cầu

-

Xác định đƣợc đặc trƣng về hình thái, phản ứng sinh hóa và mơi trƣờng

ni cấy của vi khuẩn Bacillus subtilis.
-

Định danh nhờ gen chỉ thị đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR.

-

Thử nghiệm xác định vi khuẩn Bacillus subtilis trên mẫu phân bón vi sinh

thực tế.

2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát chung về vi khuẩn Bacillus subtilis

2.1.1. Lịch sử phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis
Năm 1835, Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên do Christion
Erenberg, lúc bấy giờ tên của loài vi khuẩn này là “Vibrio subtilis”. Gần 30
năm sau, Casimir Davaine gọi loài vi khuẩn này là “Bacteridium”.
Năm 1941, Bacillus subtilis đƣợc phát hiện trong phân ngựa bởi Tổ chức y
học Nazi của Đức. Thời điểm này, B. subtilis đƣợc sử dụng để phòng bệnh lị ở
Bắc Phi chủ yếu cho các chiến sĩ Đức trong chiến đấu.
Từ năm 1949 – 1957 khi Henry và các cộng sự tách đƣợc các chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis sau đó chủng này đã đƣợc nghiên cứu ngày càng sâu
rộng. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapie” (có nghĩa là thuốc subtilin) ra đời
đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống
tiêu chảy do rối loạn tiêu hố…
Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy lồi trực khuẩn này có đầu
vng và đặt tên là Bacillus subtilis.
Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc chú ý và ứng dụng rộng rãi trong
chăn nuôi, y học, thực phẩm, nông nghiệp….
2.1.2. Phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
a) Phân loại:
Bacillus subtilis thuộc (theo khóa phân loại Bergey, 1974):
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Bacillaceae
Chi (Genus): Bacillus
Loài (Species): Bacillus subtilis

b) Phân bố:
3


Bacillus subtilis là vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy thích nghi, thuộc
nhóm tồn tại bắt buộc ở đƣờng ruột đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của
động vật nhai lại và con ngƣời, chúng phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ
khô, bụi, đất, nƣớc,... Phần lớn chúng có trong rơm rạ và cỏ khơ nên còn đƣợc
gọi là “trực khuẩn cỏ”. Trong đất trồng trọt chúng tồn tại khoảng 106 - 107 triệu
CFU/g. Đối với đất nghèo dinh dƣỡng nhƣ: sa mạc, đất hoang chúng gần nhƣ
khơng tồn tại.
Ngồi ra, B. subtilis cịn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất chế biến
nhƣ bột mì, bột gạo, mắm, tƣơng,…
2.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis

Trực khuẩn Bacillus subtilis có hình que đơn lẻ hoặc chuỗi ngắn, hai đầu
tròn, là vi khuẩn Gram (+) (Perez & cs., 2000) và có kích thƣớc 0,5 - 0,8µm x
1,5 – 3,0µm.
Vi khuẩn có 8 - 12 lơng nên có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục
nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào.
Thành tế bào của B. subtilis là một cấu trúc cứng bao bọc bên ngồi tế
bào. Nó đƣợc cấu tạo bởi peptidoglycan, là một polyme của đƣờng và axit
amin. Peptidoglycan đƣợc gọi là murein khi đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn. Các
thành phần khác trong thành tế bào là axit teichoic, axit lipoteichoic và
protein. Thành tế bào có vai trị quan trọng trong là rào ngăn giữa nguyên sinh
chất và mơi trƣờng bên ngồi của vi khuẩn. Nó cũng chịu trách nhiệm là khung
duy trì hình dạng của tế bào (Schaechter & cs., 2006)
Vi khuẩn B. subtilis có khả năng hình thành nội bào tử khi gặp điều kiện
mơi trƣờng khắc nghiệt, bào tử có kích thƣớc từ 0,8 – 1,8 µm. Nội bào tử phát
triển bằng cách nảy mầm khi gặp môi trƣờng thuận lợi mang lại một lợi thế cạnh

tranh cao trong mơi trƣờng có nhiều biến đổi nhƣ trong đất hay xảy ra hạn hán
hoặc thiếu chất dinh dƣỡng.
2.3. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên
vẫn thích nghi đƣợc trong mơi trƣờng kỵ khí.
4


Nhiệt độ tối ƣu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 - 7,4 (Khánh, 2006).
B. subtilis có khả năng lên men butanediol và các loại đƣờng glucose,
maltose, manitol, saccharose, salicin arabinose,… Nó có phản ứng thủy phân
chất béo trung tính nhƣng khơng thủy phân phospholipid hoặc casein. Ngồi ra
B. subtilis cịn tạo ra cytochrome c và citrate permease.
Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp các loại kháng sinh nhƣ:
polymyxin, bacitracin, difficidin, mycobacillin và subtilin.
Bacillus subtilis chứa loại enzyme Catalase MrgA và KatA, xúc tác cho
quá trình phân hủy hydrogen peroxide thành nƣớc và oxy. Một loại enzyme nữa
là superoxide dismutase xúc tác sự phân hủy superoxide thành oxy và hydrogen
peroxide (Bandow & cs., 2002).
Ngồi ra B. subtilis cịn tiết ra các enzyme nhƣ: amylase, pullulanase,
protease, chitinase, lipase, xylanase. Các enzyme này đã đƣợc thƣơng mại hóa,
việc sản xuất các enzyme này chiếm khoảng 60% lƣợng enzyme công nghiệp
đƣợc sản xuất thƣơng mại. (Morikawa, 2006).
2.4. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là một sinh mơ hình dùng để nghiên cứu sự hình thành nội
bào tử ở vi khuẩn. Nội bào tử ở vi khuẩn Bacillus subtilis hầu hết đƣợc hình
thành ở các chóp của bề mặt nhơ lên kéo dài xuống từ các tế bào bề mặt lỏng
(Schaechter & cs., 2006). Nhiều chủng tạo bào tử có sắc tố nâu. Sự cạn kiệt dinh

dƣỡng nhƣ nitơ, cacbon hoặc phốt pho là tiền đề cho quá trình hình thành bào tử
bắt đầu và quá trình này cần phải bắt đầu trƣớc khi cạn kiệt toàn bộ chất dinh
dƣỡng (Perez & cs., 2000). Khi sự hình thành bào tử diễn ra q muộn thì nội
bào tử sẽ khơng thể hồn thành do chất dinh dƣỡng quá thấp vì quá trình tạo bào
tử yêu cầu năng lƣợng.
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết trong thí nghiệm của
mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy rất sớm ở giai đoạn hình thành bào tử, một
vài tế bào Bacillus đã sản xuất ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn
ở bên cạnh chƣa bắt đầu quá trình này. Điều này sẽ làm phá vỡ màng tế bào vi
khuẩn bị tấn cơng, giải phóng chất dinh dƣỡng và đƣợc tế bào đang hình thành
5


bào tử tiêu thụ. Theo các nhà nghiên cứu trên, do quá trình tạo bào tử tiêu tốn
một lƣợng lớn năng lƣợng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì khơng thể đảo
ngƣợc. Đặc biệt, khi dinh dƣỡng trong môi trƣờng đã cạn kiệt bắt buộc vi khuẩn
sẽ tiêu diệt những kẻ xung quanh để hút chất dinh dƣỡng và kéo dài thời kì chờ
đợi này, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh.
2.4.1. Cấu tạo nội bào tử
Bào tử B. subtilis có dạng hình elip đến hình cầu, mỗi tế bào thƣờng có 1
bào tử. Nội bào tử nằm lệch tâm hay gần tâm nhƣng không làm biến dạng tế bào
mẹ, có kích thƣớc từ 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm và đƣợc bao bọc bởi nhiều lớp
màng với các thành phần là lipoprotein, peptidoglycan. Bào tử có khả năng chịu
đựng nhiệt độ, các hoá chất và những tác nhân vật lý khác. Nội bào tử đƣợc xác
nhận bằng cách chứng minh khả năng sống sót khi ni cấy sau khi xử lý ở 70 –
80oC trong 10 phút. Vi khuẩn thƣờng tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy (Vi, 2008).
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa nhiễm sắc thể, ribosome
và enzyme chuyển hố ở trạng thái khơng hoạt động. Trong khi hình thành bào
tử, trong tế bào chất xuất hiện acid dipicolinic ( mất đi khi tế bào nảy mầm nên ở
tế bào sinh dƣỡng khơng có loại acid này). Acid dipicolinic sẽ kết hợp với ion

canxi tạo hợp chất dipicolinatcanxi bền với nhiệt (Vi, 2008).
Ngoài cùng của nội bào tử là một lớp màng có cấu tạo chủ yếu là
lipoprotein, rất mỏng và không thấm nƣớc.
Dƣới lớp màng là vỏ, vỏ gồm nhiều lớp, bề mặt của các lớp xù xì, những
lớp này có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nƣớc và các chất hồ tan trong
nƣớc có thành phần hố học cơ bản là protein có sự tham gia của glyxin,
tyroxin, cystein và keratin, chúng tăng cƣờng khả năng bảo vệ bào tử trƣớc các
điều kiện bất lợi.
Dƣới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào
chất đồng nhất gọi là thể nhân. Thể nhân chứa bộ máy tổng hợp các enzyme,
protein, hệ thống tạo năng lƣợng của tế bào…
Giữa các bào tử tự do khơng tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy chúng có thể
giữ ở trạng thái bào tử trong nhiều năm.
6


Hình 2.1. Nội bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis.
(Nguồn: Bacillus Subtilis Bacterium With Spore Photograph by
Cnri/science Photo Library (fineartamerica.com))
2.4.2. Quá trình hình thành nội bào tử
 Sự hình thành nội bào tử xảy ra trong 5 giai đoạn:
1. Nucleoid dài ra, trở thành một sợi trục.
2. Tiếp theo tế bào tạo thành vách ngăn phân cực, bằng một phần tƣ chiều
dài tế bào từ một đầu và bắt đầu phân chia. Sản phẩm nhỏ hơn của quá trình
phân chia này đƣợc gọi là tiền bào tử và sản phẩm lớn hơn đƣợc gọi là tế bào mẹ
(Perez & cs., 2000). Tế bào mẹ có nhiệm vụ ni dƣỡng bào tử mới hình
thành. Khi vách ngăn hình thành, 30% nhiễm sắc thể đã ở phía tiền sản và 70%
nhiễm sắc thể còn lại xâm nhập vào tiền bào tử theo kiểu tƣơng tự nhƣ chuyển
DNA trong q trình tiếp hợp, nó đƣợc đẩy bởi một protein gọi là SpoIIIE
(Schaechter & cs., 2006).

3. Tế bào mẹ sau đó sẽ nhấn chìm tiền bào tử bằng cách hành động giống
nhƣ một tế bào thực bào.
4. Tiền bào tử hình thành hai màng tế bào chất với một lớp murein
dày. Một lớp áo bào tử protein và một lớp vỏ ngoài, một lớp màng hình thành
bên ngồi màng tiền bào tử.
5. Cuối cùng, tiền bào tử giả phóng khỏi tế bào mẹ (Perez & cs.,
2000). Một nội bào tử trƣởng thành khơng có hoạt động trao đổi chất, nó
7


trơ. Phần bên trong của nội bào tử - lõi, rất khơ và có khả năng chống ẩm
(Schaechter & cs., 2006).
2.4.3. Tác dụng nội bào tử
Nội bào tử giúp B. subtilis có thể tồn tại lâu dài trong trạng thái anabiosis
khi phải đối mặt với sự đói khát và điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt. Bào tử
bền với các yếu tố vật lý và hoá học nhƣ: nhiệt độ, độ ẩm, tia cực tím, tia phóng
xạ, áp suất và chất sát trùng. Lí do bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu nhƣ
vậy phụ thuộc vào các yếu tố sau (Khánh, 2006):
- Trong bào tử phần lớn nƣớc ở trạng thái liên kết, do đó khi tăng nhiệt độ
khơng có khả năng làm biến tính protein.
- Do bào tử có khối lƣợng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic (5 – 12% khối
lƣợng khô của bào tử), protein của bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành
một phức chất có tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ.
- Các hoạt chất sinh học và enzyme chứa trong bào tử đều tồn tại dƣới
dạng không hoạt động, chỉ hoạt động khi bào tử nảy mầm do vậy mà hạn chế sự
trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngồi.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp
màng làm cho các chất hố học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
2.5. Cấu trúc bộ gen vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis có một phân tử DNA trong tế bào, nhiễm sắc thể có hình
trịn. Tổng kích thƣớc của tất cả DNA là 4.214.814 bp (4,2 Mbp), có 4.100 gen
mã hóa cho protein, 53% gen mã hóa protein chỉ đƣợc nhìn thấy một lần trong
khi 25% gen liên quan đến các họ gen đã trải qua q trình nhân đơi gen (Kunst
& cs., 1997).
Có 192 trong số 4.100 gen đƣợc coi là không thể thiếu và 79 gen bổ sung
đƣợc cho là cần thiết. Hầu hết các gen thiết yếu đều tham gia vào quá trình trao
đổi chất. Một nửa số gen thiết yếu chịu trách nhiệm xử lý thông tin, một phần
năm trong số chúng chịu trách nhiệm tổng hợp thành tế bào, phân chia và hình
dạng tế bào, và một phần mƣời trong số đó chịu trách nhiệm về năng lƣợng của
tế bào. Các gen thiết yếu mã hóa các chức năng chƣa đƣợc biết đến là 4%
8


(Kobayashi & cs., 2003). Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tiết kháng sinh
với số lƣợng lớn ra bên ngoài tế bào (Ara & cs., 2007). Năm gen peptidase tín
hiệu đƣợc tìm thấy là quan trọng đối với chức năng bài tiết này. Nhiều gen
Bacillus subtilis của tế bào chịu trách nhiệm tổng hợp kháng sinh (Kunst & cs.,
1997).
2.6. Lợi ích của vi khuẩn Bacillus subtilis đối với thực vật

Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn rhizobacteria (Plant Growth
Promoting Rhizobacteria - PGPR) có cơ chế kiểm sốt sinh học trực tiếp và gián
tiếp để ngăn chặn dịch bệnh do mầm bệnh gây ra.
 Cơ chế trực tiếp:
B. subtilis tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp, hormone, kháng sinh,
enzym phân hủy thành tế bào và chất chống oxy hóa hỗ trợ cây trồng chống lại
sự tấn công của mầm bệnh (Hashem & cs., 2019).
B. subtilis tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân nhƣ: cellulase, protease
và β-glucanase. Nó có khả năng tiết ra chất kháng sinh và enzym thủy phân có

thể tự điều chỉnh mơi trƣờng theo cách có lợi và cũng tạo ra nội bào tử kháng
thuốc để tự duy trì trong những điều kiện bất lợi (Cazorla & cs., 2007).
Về kháng sinh B. subtilis sản sinh ra bacitracin chống lại vi khuẩn Gram
dƣơng (Jamil & cs., 2007). Polymyxin có tính kháng vi khuẩn Gram âm, trong
khi đó difficidin có phổ rộng hơn.
B. subtilis đƣợc biết có thể tổng hợp các lipopeptide kháng sinh nhƣ:
Fengycin, Surfactin và Iturin. Lipopeptide là các hợp chất có trọng lƣợng phân
tử thấp với các đặc tính amphiphilic. Các gen lipopeptide xuất hiện ở nhiều lồi
và chủng tác nhân kiểm sốt sinh học một số có khả năng tăng cƣờng sản xuất
kháng sinh và hạn chế nấm bệnh ở rễ (Joshi & Mcspadden Gardener, 2006).
Lipopeptide ức chế trực tiếp nấm gây bệnh bảo vệ thực vật trong cả điều kiện
trƣớc và sau thu hoạch (Romero & cs., 2007).
 Cơ chế gián tiếp:
Các cơ chế gián tiếp bao gồm: hình thành màng sinh học, thúc đẩy tăng
trƣởng thực vật (Plant Growth Promotion - PGP), cạnh tranh chất dinh dƣỡng và
9


không gian, khả năng ly giải tế bào sợi nấm gây bệnh và tạo ra đề kháng toàn
thân (Induced Systemic Resistance - ISR) (Wang & cs., 2018).
B. subtilis hình thành màng sinh học trên rễ cây giúp sản xuất lipopeptit và
tăng cƣờng hoạt động kháng khuẩn của chúng trong đất (Davey & cs., 2003).
B. subtilis đƣợc biết là có khả năng kích hoạt phản ứng phịng vệ của vật
chủ thực vật chống lại mầm bệnh. Tế bào vật chủ sẽ trải qua những thay đổi siêu
cấu trúc và tế bào hóa để phản ứng lại sự tấn cơng của mầm bệnh. B. subtilis
cũng có khả năng kích hoạt tính kháng toàn thân (ISR) ở vật chủ và làm tăng sức
đề kháng của vật chủ đối với các mầm bệnh. Sự kích hoạt ISR của B.
subtilis đƣợc biết là gây ra sự tổng hợp axit jasmonic (JA), ethylene và gen điều
hòa NPR1 ở thực vật (García-Gutiérrez & cs., 2013).
B. subtilis cũng có thể hịa tan P trong đất, tăng cƣờng cố định đạm. Vi

khuẩn này cũng cung cấp chất dinh dƣỡng cho đất bằng chu trình cacbon trên
cạn và chu trình nitơ.
B. subtilis còn tăng cƣờng khả năng chống chịu stress ở ký chủ thực vật của
chúng bằng cách gây ra sự biểu hiện của các gen phản ứng với stress,
phytohormone và các chất chuyển hóa liên quan đến stress (Hashem & cs.,
2019).
2.7. Các chỉ thị phân tử xác định Bacillus subtilis

Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu, nhiều chỉ thị đƣợc dùng để phân biệt B.
subtilis đã đƣợc phát triển từ việc xác định chi cho đến chính xác lồi, từ sử
dụng trình tự ribosome 16S RNA để xác định nhóm Bacillus subtilis (Wattiau
& cs., 2001) cho đến phƣơng pháp RAPD - PCR (Randomly Amplified
Polymorphic DNA - PCR) đƣợc phát triển để xác định nhanh các loài Bacillus,
đặc biệt là B. subtilis, B. licheniformis và B. amyloliquefaciens (Kwon & cs.,
2009) cuối cùng là phân tích các gen đặc hiệu. Ở đây chỉ quan tâm đến gen đặc
hiệu GyrA, mã hóa tiểu đơn vị alpha của DNA gyrase (Borshchevskaya & cs.,
2013) và gen endo-b-1,4-glucanase đƣợc xác định trong gen endoglucanase của
B. subtilis, G. stearothermophilus và P. campinasensis (Ashe & cs., 2014).
10


Wattiau & cộng sự vào năm 2001 đã làm một thử nghiệm PCR dựa trên
gen 16S rRNA đƣợc thiết lập có thể xác định bất kỳ lồi nào trong số năm lồi
thuộc “nhóm Bacillus subtilis” (B. subtilis, B. pumilus, B. atrophaeus, B.
licheniformis và B. amyloliquefaciens) trong các mẫu môi trƣờng. Do việc xác
định đặc điểm hình thái, sinh hóa hay định dạng axit béo metyl este đƣợc cho là
quá phức tạp trong việc xác định nhanh, trong khi đó trình tự 16S rRNA khá bảo
tồn đối với các loài Bacillus subtilis. Những điểm tƣơng đồng tồn tại đối với các
thành viên của “Bacillus 16S rRNA nhóm I”, bao gồm B. subtilis cho thấy sự
giống nhau 99,3% ở mức 16S rRNA với B. atrophaeus và 98,3% với B.

licheniformis và B. amyloliquefaciens (Ash & cs., 1991). Vì vậy mà trình tự
ribosome 16S RNA đƣợc quan tâm sử dụng làm gen mục tiêu. Trong bài báo
này sử dụng hai mồi PCR là Bsub5F có kích thƣớc từ nucleotide 59 - 79 (miền
biến đổi I) và Bsub3R kích thƣớc từ nucleotide 625 - 646 (miền biến đổi II)
khuếch đại đoạn DNA đặc biệt có kích thƣớc 595bp trong trình tự 16S rRNA
của “nhóm B. subtilis”. Phƣơng pháp PCR với chỉ thị 16S rRNA đã chỉ ra đƣợc
B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus và B. atrophaeus
với các nhóm Bacillus khác nhau. Nó đƣợc chứng minh là nhạy, chỉ yêu cầu một
lƣợng rất nhỏ vật liệu sinh học trên các khuẩn lạc đơn lẻ khi thực hiện phản ứng.
Đến năm 2009, Kwon và cộng sự phát triển phƣơng pháp RAPD - PCR để
xác định các lồi Bacillus phân lập từ Cheonggukjang, một món ăn truyền thống
của Hàn Quốc. RAPD - PCR sử dụng 10 mồi (S30, S32, S49 và S347, Bionics,
Seoul, Korea, 16S rRNA, 16 - 23S, recA) từ đó chọn ra đƣợc một sản phẩm
RAPD - PCR 0,5 kb đặc hiệu cho các chủng B. subtilis sau khi đƣợc tinh chế,
nhân bản và giải trình tự bộ mồi sẽ thiết kế dựa trên sự liên kết của trình tự gen
ytcP 0,5 kb. Cặp mồi là ytcP-F và ytcP-R. Đoạn 0,5 kb có ở các chủng B.
subtilis, đƣợc xác định là một phần bên trong của gen ytcP mã hóa chất vận
chuyển kiểu ABC giả định đƣợc phân tích bằng BLAST. Từ đó thiết kế cặp mồi
đặc hiệu cho loài B. subtilis dựa trên trình tự ytcP và phản ứng PCR sử dụng cặp
mồi trên tạo ra đoạn 0,46 kb chỉ có ở lồi B. subtilis. Do đó có thể phân lập đƣợc
11


loài B. subtilis với các loài Bacillus khác trong các thực phẩm lên men trong thời
gian ngắn.
Đáng quan tâm tiếp theo là việc sử dụng trình tự gen đặc hiệu GyrA để
phân biệt B. subtilis với các lồi trong “nhóm Bacillus subtilis” của
Borshchevskaya và cộng sự (2013). Khi mà việc xác định bằng 16S rRNA
không hiệu quả do mức độ tƣơng đồng cao của các gen ribosome thì họ hƣớng
tới xác định B. subtilis bằng các gen mục tiêu. Trong bài báo này họ nghiên cứu

phát triển một phƣơng pháp xác định bảy lồi từ nhóm B. subtilis có quan hệ
chặt chẽ về mặt di truyền trên cơ sở sự khác biệt về thành phần nucleotide của
gen GyrA, mã hóa tiểu đơn vị alpha của DNA gyrase. Cặp mồi PCR là Bsub-5f
và Bsub-3r khuếch đại đoạn 268bp của B. subtilis. Kết quả của nghiên cứu này
cho thấy khả năng sử dụng kỹ thuật dựa trên phân tích PCR của gen GyrA đối
với các chủng Bacillus đặc biệt là B. subtilis có liên quan chặt chẽ với lồi mà
khơng cần nhân bản và giải trình tự, giúp tiết kiệm thời gian và nguồn nguyên
liệu.
Sau đó là nghiên cứu Ashe và cộng sự (2014) sử dụng đoạn mồi
oligonucleotide cụ thể phát hiện gen endoglucanase có trong B. subtilis. Trình tự
gen endoglucanase (EC, 3.2.1.4) của B. subtilis đƣợc truy xuất từ cơ sở dữ liệu
nucleotide của GenBank và đƣợc căn chỉnh bằng cách sử dụng chƣơng trình
Clustal W (1.82). Hai mồi PCR là EN1F (103 - 124 bp) và EN1R (1,413 - 1,393
bp) đƣợc thiết kế bằng cách phân tích các vùng bảo tồn của các trình tự đƣợc
căn chỉnh. Qua nhiều sự sắp xếp cho thấy gen endo-b-1,4-glucanase đƣợc xác
định trong gen endoglucanase của B. subtilis, G. stearothermophilus và P.
campinasensis khuếch đại đặc biệt đoạn 1.311bp DNA cụ thể đã phân biệt đƣợc
B. subtilis với các lồi trong nhóm. Để phân biệt B. subtilis với G.
stearothermophilus và P. campinasensis cần phải sử dụng đến trình tự 16S
rRNA. Trong phƣơng pháp này tính đặc hiệu của đoạn mồi đã đƣợc chứng minh
tuy nhiên phải sử dụng đến hai cặp mồi để phân biệt B. subtilis với các lồi
trong “nhóm Bacillus subtilis”.
12


PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Địa điểm, thời gian thực hiện đề tài

a) Địa điểm:
Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật - Khoa Công nghệ sinh học - Học

viện Nông Nghiệp Việt Nam, thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, Tp.Hà Nội.
b) Thời gian thực hiện:
Từ tháng 10/2021 đến tháng 04/2022.
3.2. Vật liệu nghiên cứu

a) Nguồn mẫu:
Chủng Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633, đang lƣu trữ tại Khoa
Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Chủng TO55.1: Bacillus subtilis đã đƣợc định danh bằng giải trình tự 16S,
đang lƣu trữ tại phịng thí nghiệm.
Chủng TO55.4: Bacillus subtilis đã đƣợc định danh bằng giải trình tự 16S,
đang lƣu trữ tại phịng thí nghiệm.
Chủng NT1.8: Bacillus amyloliquefacion đã đƣợc định danh bằng giải trình
tự 16S, đang lƣu trữ tại phịng thí nghiệm.
Phân bón vi sinh là:
- Hai loại phân bón giả định đƣợc cung cấp bởi cơng ty phân bón: Loại 1 chƣa
biết mật độ, loại 2 có mật độ Bacillus sp. là 106 CFU/g
- Phân bón vi sinh VELOX của cơng ty Plantbiotix, có mật độ Bacillus sp. là
1,0.108 CFU/g.

Hình 3.1. Phân bón vi sinh
a. Phân bón vi sinh VELOX
b. Phân bón vi sinh giả định
13


b) Dụng cụ, thiết bị:
Dụng cụ và thiết bị phòng bao gồm: đĩa petri, que cấy, bình tam giác, pipet,
đèn cồn, ống eppendorf, ống PCR, cân, tủ nuôi, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng, kính
hiển vi, box cấy, tủ sấy, máy ly tâm, lị vi sóng, máy PCR,…

c) Hóa chất:
Một số loại hóa chất sử dụng: Dung dịch 0,85% NaCl, glycerol, Fuschine,
Lugol, cồn 90º, cồn 70 º, nƣớc cất, dung dịch 3% H2O2 , hóa chất PCR,…
d) Mơi trƣờng ni cấy:
- Môi trƣờng NA (Nutrient agar):
Peptone

: 5,0g

Sodium chloride

: 5,0g

Beef extract

: 3,0g

H2O

: 1.000ml

Agar

: 20,0g

- Môi trƣờng LB (Luria Bertani)
Trytone

: 10,0g

Sodium chloride

: 10,0g

Yeast extract

: 5,0g

H2O

: 1.000ml

Agar

: 15,0g

3.3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định các thông kỹ thuật để xây dựng phƣơng pháp định
lƣợng, định tính vi khuẩn Bacillus subtilis.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường nuôi cấy đến
sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian.
Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ, mơi trƣờng đến hình thái
khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633.
- CT1: Môi trƣờng NA, nuôi ở 30 oC
- CT2: Môi trƣờng NA, nuôi ở 37 oC
- CT3: Môi trƣờng LB, nuôi ở 30 oC
14