Nuôi cấy mô thực vật cây lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA NƠNG HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT CÂY LAN KIM
TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)

Giáo viên hướng dẫn

: TS. PHẠM PHÚ LONG

Bộ môn

: THỰC VẬT

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN KHÁNH

Mã sinh viên

: 632124

Lớp

: K63RHQMC

HÀ NỘI, 2022

LỜI CAM ĐOAN
Tơi là Nguyễn Khánh, sinh viên khố 63 Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, chuyên ngành Quản lý sản xuất trong nhà có mái che, xin cam đoan:
1. Đây là khố luận tốt nghiệp do bản thân tơi trực tiếp thực hiện dưới sự
hướng dẫn của TS. Phạm Phú Long;
2. Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam;
3. Các số liệu và thơng tin trong khố luận có nguồn gốc rõ ràng, đã
công bố theo đúng quy định.
Nếu có bất kỳ gian lận nào, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Khánh

i


LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hồn thành khố luận tốt nghiệp, với lịng kính trọng và biết ơn
sâu sắc, tơi xin được bày tỏ lời cảm ơn tới:
Quý thầy, cô giáo Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã
tận tình truyền đạt những kiến thức hữu ích cho tơi trong suốt q trình học tập
tại trường.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: TS.
Phạm Phú Long, Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Cây dược liệu, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tơi
trong suốt q trình học tập và cho tơi nhiều ý kiến q báu trong tồn bộ q
trình thực hiện và hồn thiện khố luận tốt nghiệp này.

Tơi xin chân trân trọng cảm ơn tập thể phòng Nghiên cứu và Chọn
tạo giống Cây dược liệu đã luôn tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong suốt q
trình nghiên cứu, hồn thiện khố luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới người thân, gia
đình và bạn bè đã luôn đồng hành, chia sẻ, động viên tôi vượt qua những
khó khăn, trở ngại để tơi có thể n tâm học tập và hồn thành được khố
luận tốt nghiệp này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Khánh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
TĨM TẮT ........................................................................................................... vii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài ...................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ...................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3

2.1. Tổng quan về cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) ............... 3
2.2. Phân loại ......................................................................................................... 4
2.3. Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 4
2.3.1. Thân ............................................................................................................. 4
2.3.2. Rễ................................................................................................................. 4
2.3.3. Lá ................................................................................................................. 5
2.3.4. Hoa và quả ................................................................................................... 5
2.4. Điều kiện sinh thái và phân bổ ....................................................................... 5
iii


2.5. Giá trị của cây lan kim tuyến ......................................................................... 6
2.6. Các phương pháp nhân giống lan kim tuyến ................................................. 7
2.6.1. Nhân giống hữu tính bằng hạt ..................................................................... 7
2.6.2. Nhân giống bằng phương pháp giâm cây ................................................... 8
2.6.3. Nhân giống in vitro ..................................................................................... 8
2.7. Một số nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến trong và ngoài
nước ....................................................................................................................... 9
2.7.1. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến trên thế giới .................. 9
2.7.2. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến ở Việt Nam .................. 9
2.8. Nhân giống nuôi cấy mô in vitro ................................................................. 10
2.8.1. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 11
2.8.2. Môi trường vật lý ...................................................................................... 16
2.8.3. Điều kiện vô trùng ..................................................................................... 16
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18
3.1. Địa điểm ....................................................................................................... 18
3.2. Thời gian ...................................................................................................... 18
3.3. Vật liệu ......................................................................................................... 18
3.4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18
3.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 19

3.6. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 19
3.6.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình
hình thành PLBs từ vật liệu ban đầu. .................................................................. 19

iv


3.6.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến q trình
nhân nhanh PLBs. ............................................................................................... 20
3.6.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến q trình tái
sinh chồi từ PLBs. ............................................................................................... 21
3.6.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của chồi............................................................................... 21
3.6.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình tạo
rễ. ......................................................................................................................... 22
3.7. Các chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 23
3.8. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................ 23
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 24
4.1. Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình hình
thành PLBs từ vật liệu ban đầu ........................................................................... 24
4.2. Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân
nhanh PLBs ......................................................................................................... 27
4.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình tái sinh
chồi từ PLBs ........................................................................................................ 30
4.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đối với sự sinh trưởng
và phát triển của chồi .......................................................................................... 35
4.5. Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đối với khả năng tạo
rễ .......................................................................................................................... 39
4.6. Trồng lan kim tuyến ra giá thể ..................................................................... 45
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 48

5.1. Kết luận ........................................................................................................ 48

v


5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50
KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ......................................................................... 53

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CT

Công thức

ĐC

Đối chứng

MS

Murashige & Skood medium, 1962

6-BA

6-Benzulaminopurine

-NAA

-Naphthaleneacetic acid

MT

Môi trường

PLBs

Protocorm-like bodies

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Môi trường cảm ứng tạo PLBs ...........................................................20
Bảng 3.2. Môi trường nhân nhanh PLBs ............................................................ 20
Bảng 3.3. Môi trường tái sinh chồi từ PLBs ....................................................... 21
Bảng 3.4. Môi trường sinh trưởng và phát triển chồi ......................................... 22
Bảng 3.5. Môi trường tạo rễ ................................................................................ 22
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của mơi trường đến q trình hình thành PLBs của vật liệu
ban đầu sau 30 ngày nuôi cấy ............................................................................. 25
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của mơi trường đến q trình nhân nhanh PLBs sau 30
ngày nuôi cấy mô ................................................................................................ 28
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của mơi trường đối với q trình tái sinh chồi sau 30 ngày
nuôi cấy mô ......................................................................................................... 31
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi
sau 30 ngày nuôi cấy mô ..................................................................................... 36
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của mơi trường đến sự hình thành và phát triển của rễ sau
30 ngày nuôi cấy mơ ........................................................................................... 42

Bảng 4.6. Sinh trưởng và phát triển ngồi vườn ươm của lan kim tuyến ........... 45

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)............................. 3
Hình 4.1. Mẫu tạo PLBs từ thân cây lan kim tuyến sau 30 ngày ni cấy mơ ... 27
Hình 4.2. Mẫu PLBs sau 1 tháng sau 30 ngày nuôi cấy mơ ............................... 30
Hình 4.3. Mẫu tái sinh chồi sau 30 ngày ni cấy mơ ........................................ 34
Hình 4.4. Mẫu sinh trưởng và phát triển của chồi sau 30 ngày nuôi cấy mơ ..... 39
Hình 4.5. Mẫu tạo rễ sau 1 tháng ........................................................................ 44
Hình 4.6. Cây lan kim tuyến sau 30 ngày trồng ngoài vườn ươm ...................... 46

vi


TĨM TẮT
Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) là lồi dược liệu quý, có
tác dụng trong điều trị ung thư, điều trị bệnh tiểu đường, điều trị các bệnh về
gan, tác dụng bồi bổ cơ thể, giảm mệt mỏi, căng thẳng. Tuy nhiên, do số lượng
ít, mọc rải rác và bị khai thác quá mức nên cây lan kim tuyến trong tự nhiên có
nguy cơ bị tuyệt chủng. Nghiên cứu được tiến hành nhằm xây dựng quy trình
nhân giống in vitro để bảo tồn loài lan quý hiếm. Vật liệu ban đầu là mẫu đốt
thân cây lan kim tuyến non được khử trùng 10 phút bằng dung dịch HgCl2 0,1%.
Đối với giai đoạn cảm ứng tạo PLBs từ vật liệu ban đầu: mơi trường ½MS thêm
1 ppm 6-BA là mơi trường tối ưu cho cảm ứng tạo PLBs từ thân cây lan kim
tuyến non với tỉ lệ mẫu sống là 100% và tỉ lệ cảm ứng tạo PLBs là 94,29%. Đối
với giai đoạn nhân nhanh PLBs: mơi trường ½MS thêm 1,5 ppm 6-BA và 0,1
ppm -NAA là môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh PLBs với hệ số

nhân nhanh PLBs là 11,2 PLBs. Đối với giai đoạn tái sinh chồi từ PLBs: môi
trường MS thêm 0,5 ppm 6-BA và 0,2 ppm -NAA là môi trường tối ưu để kéo
dài chồi từ cụm PLBs, có số chồi tái sinh là 18,6 chồi và độ dài chồi là 1,76 cm.
Đối với giai đoạn sinh trưởng và phát triển chồi: môi trường MS thêm 0,8 ppm
6-BA và 0,3 ppm -NAA là môi trường tối ưu cho sinh trưởng phát triển của
chồi, có chiều dài chồi là 4,04 cm, đường kính thân là 0,206 cm, số lá là 3,8 lá,
chiều dài lá là 1,38 cm, chiều rộng lá là 1,02 cm, trọng lượng là 0,084 g. Đối với
giai đoạn tạo rễ thành cây hồn chỉnh: mơi trường MS thêm 0,5 ppm 6-BA và
0,5 ppm -NAA là mơi trường tối ưu để hình thành rễ, có số rễ là 3,8 rễ và
chiều dài rễ là 2,14 cm.
Từ khố: Anoectochilus setaceus Blume, đốt thân, ni cấy in vitro, hệ số
nhân chồi, protocorm-like bodies (PLBs), phát triển, sinh trưởng.

vii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Lan kim tuyến, Anoectochilus setaceus Blume, thuộc họ Phong lan
(Orchidaceae), được biết đến nhiều do khả năng ứng dụng trong y dược. Qua
các nghiên cứu, người ta thấy rằng lan kim tuyến có chứa hợp chất chuyển hố
arachidonic acid; liên quan đến chức ngăng của hệ tim mạch, kháng virus, kháng
sưng viêm và các chất bảo vệ gan, chống lipase máu (Mak et al., 1990; Huang et
al., 1991; Lin et al., 1993; Du et al., 2001).
Sự phát triển của ngành công nghiệp được kết hợp với sự bùng nổ của các
loại thuốc có nguồn gốc thực vật dẫn đến việc khai thác q mức, đe doạ sự
sống cịn của nhiều lồi cây quý, trong đó có lan kim tuyến. Hiện nay, lan kim
tuyến được đưa vào danh mục các loài đang nguy cấp thuộc nhóm IA của Nghị
định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và được xếp
vào nhóm thực vật rừng đang nguy cấp (EN A1 a, c, d) trong Sách Đỏ Việt Nam

2007 [1]. Hiện tại, ở Việt Nam đã thống kê được 12 loài lan kim tuyến, trong đó
lồi Anoectochilus setaceus Blume thường gặp nhất và có giá trị thương mại cao
nhất, gấp hàng chục lần các lồi khác [2].
Cho đến nay, đã có một số cơng trình nghiên cứu về nhân giống in vitro
trong và ngoài nước trên đối tượng lan này như Shiai et al., (2006); Phùng Văn
Phê và cộng sự (2010); Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện, 2012;
Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự (2013). Tuy nhiên dựa trên cơ sở các chương
trình nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro đã được
thực hiện thành công, ta cần đánh giá kỹ hơn về sự ảnh hưởng của các chất điều
tiết sinh trưởng để có thể đạt kết quả nhân giống tối ưu. Vì vậy, chúng tơi tiến
hành thực hiện đề tài: “Nuôi cấy mô thực vật cây lan kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume)” với mục đích nhằm phát triển loài lan quý hiếm này.

1


1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng 6-BA và -NAA
đến quá trình nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng
phương pháp nuôi cấy mô in vitro. Từ đó đạt được hệ số nhân giống cao hơn,
góp phần bảo về lồi dược liệu q hiếm của Việt Nam tránh khỏi nguy cơ bị
tuyệt chủng.
1.2.2. Yêu cầu
Xác định được nồng độ chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho quá trình
hình thành PLBs từ vật liệu ban đầu.
Xác định được nồng độ chất điều tiết sinh trưởng thích hợp để nhân nhanh
PLBs.
Xác định được nồng độ chất điều tiết sinh trưởng thích hợp để tái sinh
chồi từ PLBs.

Xác định được nồng độ chất điều tiết sinh trưởng thích hợp để sinh trưởng
và phát triển chồi.
Xác định được nồng độ chất điều tiết sinh trưởng thích hợp để cảm ứng
tạo rễ.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Chi Anoectochilus (Orchidaceae), trong đó bao gồm hơn 40 loài, phân bố
rộng khắp các vùng nhiệt đới (Teuscher, 1978). Trong chi Anoectochilus có một
số lồi được sử dụng để làm thuốc ở Trung Quốc như: A. formosanus Hayata, A.
koshunensis Hayata và A. setaceus Blume. Trong các lồi này thì hai lồi A.
formosanus Hayata và A. koshunensis Hayata chỉ phân bố ở Đài Loan và
Okinawa-Nhật Bản. A. setaceus Blume phân bố ở miền Nam Trung Quốc, Nhật
Bản, Srilanka, Ấn Độ, Nepal và Việt Nam (Zhong HJ và cộng sự, 2000).
Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) phân bố ở các nước Châu
Á: Trung Quốc, Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn Độ, Nepal và Việt Nam… Tại Việt
Nam, thống kê được 12 loài phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc tới Nam
(Phạm Hoàng Hộ, 2000). Loài Anoectochilus setaceus Blume phân bố tại Huế,
Tam Đảo, Lào Cai, Quảng Trị, Kon Tum, Gia Lai. Chúng mọc rải rác trong rừng
núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe suối, ở độ cao 300-1800 m.

Hình 2.1. Cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
3


2.2. Phân loại
Lan kim tuyến có tên khoa học là: Anoectochilus setaceus Blume

Tên gọi khác: Kim tuyến Tơ, Giải Thủy Tơ, Sứa Hồng, Lan Gấm, Cỏ
Nhung,
Chi: Kim tuyến (Anoectochilus)
Họ: Phong lan (Orchidaceae)
Bộ: Phong lan (Orchidales)
2.3. Đặc điểm hình thái
2.3.1. Thân
Cây thân thảo, mọc ở đất có thân rễ mọc dài; cây cao 10-20 cm, thân màu
tím, mọng nước, phần cây non có nhiều lơng mềm, mang 2-6 lá mọc cách, xòe
trên mặt đất. Gồm các bộ phận: thân rễ, thân khí sinh, rễ, lá, hoa và quả.
Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, thường có màu xanh trắng, đơi khi có màu
nâu đỏ, thường nhẵn, khơng phủ lơng. Chiều dài từ 5-12 cm. Đường kính từ 3-4
mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03
lóng, với chiều dài của lóng từ 1-6 cm.
Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, thường mọng nước,
nhẵn, khơng phủ lơng, thường có màu xanh trắng, đơi khi có màu hồng nhạt.
Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3-5 mm. Thân
khí sinh mang nhiều lóng, số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng. Chiều
dài mỗi lóng từ 1-4 cm.
2.3.2. Rễ
Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ, đôi khi rễ cũng được hình thành
từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thơng thường mỗi mấu chỉ có
một rễ, đơi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng
4


và kích thước rễ cũng thay đổi tùy theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3–
10 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5–8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm và
ngắn nhất là 1,22 cm.
2.3.3. Lá

Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ, đơi khi rễ cũng được hình thành
từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thơng thường mỗi mấu chỉ có
một rễ, đơi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng
và kích thước rễ cũng thay đổi tùy theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3–
10 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5–8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm và
ngắn nhất là 1,22 cm.
2.3.4. Hoa và quả
Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ, đôi khi rễ cũng được hình thành
từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thơng thường mỗi mấu chỉ có
một rễ, đơi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng
và kích thước rễ cũng thay đổi tùy theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3–
10 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5–8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm và
ngắn nhất là 1,22 cm.
2.4. Điều kiện sinh thái và phân bổ
Lan kim tuyến sinh trưởng trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối,
dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500–1600m. Cây ưa độ ẩm cao và
bóng râm, kị ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thống khí (Liu, Su,
1978 và Teuscher, 1978). Chúng thường mọc rải rác hoặc thành các đám nhỏ lẫn
trong lớp thảm mục hoặc ở hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm. Cây sinh
trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, chịu được thời tiết có sương mù dài ngày.

5


Khí hậu nơi lồi lan kim tuyến phân bố thc khí hậu nhiệt đới ẩm.
Lượng mưa trung bình năm là 1,826 mm. Độ ẩm khơng khí trung bình 85%.
Nhiệt độ trung bình năm từ dưới 20C đến 22C-23C.
Trong nước: Lào Cai (Sa Pa: Phan Xi păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà
Tĩnh (Hương Sơn: Rào An), Quảng Trị, Kom Tum (Đắk Glie: núi Ngọc Linh,
Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Không Bông: núi Chư Yang Sinh), Lâm

Đồng (Lạc Dương: núi Bà Đúp).
Thế giới: Ấn Độ, Nepal, Butan, Trung Quốc, Myanmar, Thái Lan, Lào,
Cambodia, Malaysia, Indonesia.
2.5. Giá trị của cây lan kim tuyến
Tác dụng dược lý: lan kim tuyến là cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tang
cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thơng, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh
viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài này được
dùng làm thuốc chữa bệnh lao phổi, phong thấp, đau nhức xương khớp, viêm dạ
dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan kim tuyến
là một trong những thảo dược quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa nóng phổi
và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã
phát hiện ra khả năng chống ung thư của loài thảo dược này.
Theo các tài liệu của Trung Quốc mới công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc
ký lỏng, sắc ký cột vã kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc
hóa học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong lan kim tuyến (tạp
chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc’’, tập 48 số 3, tháng 3 năm 2006,
trang 359-363). Bằng kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hóa học.
Các chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự
do trong cơ thể, nên có khả năng phịng chống bệnh rất tốt. Đặc biệt có 2 axit

6


hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung
thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn.
Tác giả Bùi Bảo Thịnh và cộng sự trên Tạp chí Nghiên cứu Dược và
Cơng nghệ 2021 nghiên cứu về hoạt động chống ung thư của chiết xuất lan kim
tuyến (Anoectochilus setaceaus Blume) chống lại dòng tế bào ung thư vú BT474
và tế bào ung thư phổi với 3 hợp chất gồm: quercetin, isorhamnetin và axit
ferolic cho hiệu quả cao.

Ở Việt Nam, lan kim tuyến có phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể
không nhiều, tái sinh chậm đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo và ngày càng
hiếm. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan kim tuyến
đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngồi tự nhiên nếu
khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan kim tuyến được xếp trong
nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích
thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN Al a, c, d (Sách đỏ Việt Nam,
2007).
2.6. Các phương pháp nhân giống lan kim tuyến
2.6.1. Nhân giống hữu tính bằng hạt
Lan kim tuyến là một có hoa lưỡng tính, với cấu trúc của hoa và sự chín
của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên bắt buộc phải giao phấn nhờ
cơn trùng. Nhờ có mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ thu hút côn trùng và cấu tạo
của hoa giúp cây thụ phấn trong môi trường tự nhiên.
Trong nuôi trồng, để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các
giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn
có thể cùng cây, có thể khác cây.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm: dễ làm, giá thành thấp, thu được nhiều
cây khoẻ, không bị bệnh, ngồi ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được
7


những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên có một số hạn chế: hạt
lan kim tuyến rất hiếm, kết hạt sau thời gian dài, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ
nảy mầm ít, để cây ra hoa có chất lượng tốt phải mất khá nhiều thời gian.
2.6.2. Nhân giống bằng phương pháp giâm cây
Lan kim tuyến là cây có thân giả, lợi dụng điều đó có thể nhân giống từ
thân hay cành con, đây cũng là phương thức sinh sản trong tự nhiên của loài lan
này; thân giả được cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn
này vào một nơi ẩm có cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có

thể đem trồng vào các chậu mới.
Đây là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của
người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số khó
khăn: mất nhiều thời gian, chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị
thối hố, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm
phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
2.6.3. Nhân giống in vitro
Phương pháp này có ưu điểm:
Hệ số nhân giống cao.
Các cây đồng nhất về mặt di truyền.
Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống.
Có thể nhân giống quanh năm.
Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng.
Chất lượng giống cao, tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất.
Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.

8


2.7. Một số nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến trong và
ngoài nước
2.7.1. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến trên thế giới
Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứu tìm
các biện pháp nhân giống lồi lan kim tuyến quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt
chủng.
Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) được nghiên cứu chủ yếu ở Trung
Quốc một cách tồn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả
năng trồng, thành phần hóa học và cơng dụng phịng, chữa bệnh (Lai Wan Yu,
Lai Wan Nian, 2005). Chow và cộng sự (1982) đã nghiên cứu về vật liệu sử
dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng.

Năm 1987, Liu và cộng sự đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987,
Ho và cộng sự, 1992, Lee và cộng sự đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu
nuôi cấy. Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-chin Chen,
Shu-ru Yang và Hsin-sheng Tsay đã nghiên cứu thành cơng lồi lan kim tuyến
(A. formosanus Hayata) từ hạt với cơng thức mơi trường vào mẫu là ½ MS +
0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Mơi trường được sử dụng để nhân
nhanh chồi là ½ MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP
+ 0,5 mg/l NAA. Năm 2002, Tsay và cộng sự đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây
A. formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml
+ 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 2% than hoạt tính.
2.7.2. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến ở Việt Nam
Việt Nam được xếp thứ 16 trong số các nước có đa dạng sinh học cao
nhất thế giới. Nhưng sự đa dạng sinh học của nước ta đang bị suy thối ở mức
báo động. Diện tích rừng bị giảm rất nhanh kéo theo nguy cơ tuyệt chủng của
nhiều loài động thực vật q hiếm trong đó có các lồi lan nói chung và lan kim

9


tuyến nói riêng. Con người đang khai thác tự nhiên một cách quá mức, thậm chí
huỷ diệt nguồn tài nguyên thiên nhiên để phục vụ nhu cầu trước mắt mà quên
mất những hiểm họa kéo theo sau đó trong tương lai. Việc duy trì đa dạng sinh
học có vai trị rất quan trọng trong đời sống vật chất và tinh thần của con người,
cũng như trong việc duy trì các chu trình tự nhiên và sự cân bằng sinh thái.
Các kết quả nghiên cứu nhân giống lan kim tuyến ở Việt Nam còn rất hạn
chế. Phổ biến với những phương pháp nhân giống truyền thống cho hiệu quả
thấp, hệ số nhân thấp, thời gian dài của người dân địa phương.
Ở Việt Nam, những cơng trình nghiên cứu về phương pháp nhân giống in
vitro lan kim tuyến cịn ít. Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt đã đưa ra quy trình
nhân giống in vitro thành cơng cho lồi lan kim tuyến A. formosanus với vật liệu

ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu
khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P - 19K 1g/l + 20N - 20P - 20K 1g/l) + 2g/l
peptone. Môi trường nhân nhanh là H3 + 1g/l BAP (hoặc 1–2mg/l TDZ) + 1%
than hoạt tính. Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn
Trung Thành đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in
vitro loài lan kim tuyến - A. roxburghii (Wall.) Lindl. Năm 2010, Phan Ngọc
Khoa, trường Đại học khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích
thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan kim tuyến (A.setaceus Blume).
2.8. Nhân giống nuôi cấy mô in vitro
Nhân giống in vitro thực vật là một phương pháp nhân giống vơ tính, giúp
giải quyết khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính đối với nhiều loại thực vật
quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao.
Phương pháp nhân giống in vitro được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng
như ở Việt Nam đã khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vơ
tính truyền thống, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như: Hệ số nhân

10


giống cao, từ một cây trong vịng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây mà
khơng tốn diện tích cho nhân giống. Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao,
các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Nâng cao chất lượng
giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus,
nấm bệnh. Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt
kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Bảo quản và lưu giữ được tập
đồn gen. Có tiềm năng cơng nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và
chiếu sáng, nhiệt độ nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản
xuất liên tục.
Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công
nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình,

1997).
Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống: Tính tồn năng của tế bào
thực vật. Sự phân hoá và phản phân hố tế bào.
Các nhân tố ảnh hưởng tới q trình nhân giống in vitro:
2.8.1. Môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển
hình thái của tế bào và mơ thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường
nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy
theo lồi và bộ phận ni cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục
đích thí nghiệm thì thành phần mơi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn
phân hóa của mẫu cấy (Dương Cơng Kiên, 2002).
Có rất nhiều loại mơi trường ni cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có
một số mơi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm
lượng khống đa lượng cao. Mơi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất
đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa

11


lượng và vi lượng. Nguồn cacbon. Các vitamin. Các chất điều hòa sinh trưởng.
Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây…
a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Khoáng đa lượng: nhu cầu khống của mơ, tế bào thực vật tách rời không
khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng
cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg (Trần Văn Minh, 2010).
Khoáng vi lượng: nhu cầu khống vi lượng trong ni cấy mơ thực vật in
vitro là lĩnh vực cịn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kĩ thuật nuôi cấy mô
mới ra đời, người ta khơng nghĩ tới việc bổ sung khống vi lượng vào môi
trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn,
Cu, B, Co, I, … (Trần Văn Minh, 2010).

b. Nguồn cacbon
Trong mơi trường ni cấy, các mơ khơng có khả năng tự dưỡng do
không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngồi, do
vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ,
giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là
saccharose, d-glucose, d-fructose. Saccharose là nguồn các cacbon được sử dụng
rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2–3% hoặc cao
hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí
nghiệm (Dodds và Roberts, 1985).
c. Các vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau.
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và
phát triển của chúng. Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung
vào môi trường và trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như:
thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Trần Văn
12


Minh, 2010). Thiamine là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả
các tế bào. Vitamin C đôi khi được sử dụng ở nồng độ cao như là một chất
chống oxi hóa. myo-inositol có vai trị quan trọng cho sự phân chia tế bào vì
thúc đẩy sự hình thành thành tế bào. Thường sử dụng ở nồng độ cao 50–100
ppm (Trần Văn Minh, 2010).
d. Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa
học là phytohormon, là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ
nhằm tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành
mới các cơ quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Cho đến
nay người ta đã tìm được rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất
mạnh đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Người ta chia các

phytohormon ra làm 5 nhóm chính: Auxin, Gibberrellin, Cytokinin, Abcisic acid
và Ethylene (Nguyễn Văn Uyển, 1993). Trong đó, auxin và cytokinin là hai
nhóm được sử dụng phổ biến nhất.
Nhóm các auxin: Auxin là nhóm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được
sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt
chẽ với các thành phần khác của mơi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng
trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái, đặc biệt
là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin. Các auxin sử dụng có thể là
auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm (IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được
sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá
cao dễ tạo ra các đột biến (Hồng Minh Tấn và CS, 1993).
Vai trị sinh lý của Auxin: Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào.
IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi
đỉnh. Kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phơi vơ tính.

13


2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo. Tạo và nhân nhanh mơ
sẹo (callus). Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.
Nhóm các cytokinin:
Trong ni cấy mơ thực vật, cytokinin dùng để kích thích sự phát sinh
chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin
cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong
mơi trường ni cấy, tỉ lệ Auxin/Cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích
thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỉ
lệ trung gian sẽ hình thành mơ sẹo. Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin,
TDZ.
Kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm
DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi.

Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo
chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng.
BAP có hoạt tính cao hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin.
Vai trị sinh lý của nhóm Cytokinin:
Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro.
Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây.
Ức chế sự hình thành rễ.
Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ.
Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh.
e. Các chất hữu cơ bổ sung
Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ,
chất khống và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích

14