Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài Lan Kim Tuyến (anoectochilus setaceus blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN







Phí Thị Cẩm Miện






NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN
KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)
NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN







Phí Thị Cẩm Miện





NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN
KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)
NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ


Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Trung Thành



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP 6-benzylaminopurin
CT Công thức
CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance)
ĐC Đối chứng
IBA indol-3-acetic acid
MS Murashige và Skoog, 1962
LSD
0,05
Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P - 0,5
(Leant Significant Difference)
ND Nước dừa
αNAA α-naphthylacetic acid

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC 5

MỞ ĐẦU 7

1.1. Đặt vấn đề 7

CHƯƠNG I 8

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến 8

1.1.1. Đặc điểm hình thái 9

1.1.2. Đặc điểm phân bố 11

1.2. Nhân giống cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) 13

1.2.1. Nhân giống bằng hạt 13

1.2.2. Nhân giống bằng cây con 13

1.2.3. Phương pháp giâm cây 14

1.2.4. Nhân giống in vitro 14

1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro 14

1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro 15

1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính 18

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 18

1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy 18

1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học 19

1.3. 3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý 23

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây 24

1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô 25

1.5. Tình hình nghiên cứu trên cây Lan Kim tuyến 26

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 26

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 27

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.2. Mục tiêu nghiên cứu 28

2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 29



2.4. Nội dung nghiên cứu 29

2.5. Phương pháp nghiên cứu 29

2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 30

2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu 35

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào
mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro 39

3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp 39

3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số
nhân chồi in vitro 42

3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch 42

3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro 44

3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp 45

3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A.
setaceus) 45

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và
phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân 47

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số
nhân 47

3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và
hệ số nhân Lan Kim tuyến (A. setaceus) 50

3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự
phát sinh hình thái và hệ số nhân 53

3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 56

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh
trưởng) đến sự ra rễ 56

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ 58

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

4.1. Kết luận 67

4.2. Đề nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 75



MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của
bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế
kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế
giới. Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn
1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng,
Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, lan Việt Nam đẹp thanh cao lại
chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia
chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati).
Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của
Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được
sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc.
Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài,
trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác
Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả
nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị
làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan
Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự
nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim
tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm
cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng
đang
nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt
Nam 2007.
Vì vậy, nghiên cứu kỹ

thuật nhân
giống
loài lan Kim tuyến - Anoectochilus setaceus Blume được
triển khai sẽ cung cấp những cơ sở
khoa
học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt
những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển
loài
dược
liệu nguy cấp, quí hiếm này.
Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu
đề tài:“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến
Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp
hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ
Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê
được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được
biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.
Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)
Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.)
Họ: Phong lan (Orchidaceae)
Bộ: Phong lan (Orchidales)
Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng
nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần
tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, mặt trên màu nâu
thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt.

Cuống lá dài 2 - 3 cm. Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá
bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm;
môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình
thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa.
Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh
trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán
rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 - 1600m. Mọc rải rác vài ba
cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng.
Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh
Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè),
Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng) Thế giới: Trung
Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…
Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng
tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các
bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này
được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương,
viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan
Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu,


dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958).
Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của
loại thảo dược này.
Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được
cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan
Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3,
tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8
hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng
làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc

biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả
năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất
mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất.
a. Thân rễ
Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng,
bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ
từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là
4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường
có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.
b. Thân khí sinh
Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất,
ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường
kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều
lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4
lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân
khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng,
đôi khi có màu hồng nhạt.
c. Rễ
Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng
được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông
thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một


mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số
rễ trên một cây thường từ 3 - 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ
0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm,
chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm.
d. Lá

Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình
trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5 cm,
trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 - 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu
đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim,
thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ.
Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với
5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới
không rõ. Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi
hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6,
thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây
thường có kích thước khác nhau rõ rệt.
e. Hoa, quả
Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa
mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài
khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8
dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 - 12. Mùa quả chín tháng 12 - 3 năm
sau.











Hình 2.1. Cây (A) và hoa (B)
lan

Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume
1.1.2. Đặc điểm phân bố
1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay
lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới
núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim
tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới.
- Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây
gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay
(ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona
surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo
thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc
bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng
(Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.),
Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của
tầng A2 từ 15-25 m.
- Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài
cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera
sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron
balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya
lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum
Thân khí sinh
Thân ngầm
A
B


bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào
(Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 8-
15m.
- Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt

sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng
(Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…
- Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa
febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum),
Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus
speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre
(Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus
rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…
- Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền
(Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang
(Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu
(Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy
(Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển
hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim
cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng
(Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis),
Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm
bép (Tetrastigma rupestre), v.v…
- Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình
khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên
cứu.
1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh
- Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến
phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn
quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi
và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp
thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng
từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi
cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng
đang bị phân huỷ.

-
Về sinh cảnh
:
Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát
ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí
ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các
tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan
Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn,
hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng.
1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao
- Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như
chân núi, sườn núi, đỉnh núi.
- Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập
trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình.
1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (
Anoectochilus setaceus
)

1.2.1. Nhân giống bằng hạt
Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên
nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích
ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc
của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao
phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn
của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi
thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để
thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa.
Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra

các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ
phấn có thể cùng cây, có thể khác cây.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều
cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được
những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan
Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời
gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt.
1.2.2. Nhân giống bằng cây con
Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách
để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.


1.2.3. Phương pháp giâm cây
Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các
đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những
cây con có thể đem trồng vào các chậu mới.
Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh
nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có
một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không
cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và
phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a].
1.2.4. Nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công
nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình,
1997)
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác
tạo giống.
Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các
loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa,

cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.
Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc
ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ.
Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm
sạch virus.
Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong
ngân hàng gen.
1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người
Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để
chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được
lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành
một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang
thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế
bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.


Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật
là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến
đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ
quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào
chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế
bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa
của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống
mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra.
Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ
ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974).
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng
sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu

gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời,
công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân
giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng
ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại.


1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống
vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh
học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính
in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật
nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống
vô tính in vitro là do:
Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân
giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân
giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái
và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn
trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất
lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối
với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm
lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định,
không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc
nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần
hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng


tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến
78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và
thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray,
1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính
được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn.
Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân
giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng
đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989),
nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút
ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản
lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy,
phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều
nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức
tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 - 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3
(Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc
để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền
thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng
như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có
nhiều ưu điểm nổi trội như:
- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành
hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 3
6

đến 10
12
/ năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ
khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di
truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô
tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987).
- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống
hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt
nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn

chế.
- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ
được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề
được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp


nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch
virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được
giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn
toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống
sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus
M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958;
Wang and Huang, 1975).
- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt
kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 10-
15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới
rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể
cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky,
1970).
- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và
chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản
xuất liên tục.
- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.
- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi
một số nhược điểm như:
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể
tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh
thực vật.

- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại
và lao động có tay nghề.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị
soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là
khi nuôi cấy từ callus).
Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản
biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc
tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả


cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức
chung cho tất cả các thực vật.
1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro
Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo
Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng
được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các
phương thức sau:
- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.
- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.
• Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm
tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con
này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn
đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and
Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm
trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong
trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào
mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.
• Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích
hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ
chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể

được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển
sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển
nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử
dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng
quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong
môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể
tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu
nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo.
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy
1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy
Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì
mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất
nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau


và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử
trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban
đầu.
Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào
nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên
bề mặt của mô cấy.
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng
loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite,
người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl
2
thường có thời
gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể
gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu
dễ bị nhiễm.
Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây

giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh
hưởng quyết định tới nuôi cấy.
1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong
các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung
cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid
và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải
được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí,
ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi
trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường
Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó
môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng,
bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi
trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:
Các nguyên tố khoáng
Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm
là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.
• Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng
khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối


vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid
nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm
thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò
tín hiệu tế bào,…
• Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh
trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo,
mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được
tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành

phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử,
sinh tổng hợp diệp lục,…
Chất hữu cơ bổ sung
• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và
cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin
B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy
nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi
cấy.
• Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái,
amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng
nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết.
Nguồn cacbon
Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp
hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ
sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó
những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài
ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể
được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường
saccharose.
Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn
tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng
50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000).
Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng
nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy
khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây
cảm ứng stress nước).


Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp
hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích

hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn
carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana
kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường.
Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in
vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí
cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở
của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường.
Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có
diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển
từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn
ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80
% theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).
Chất điều tiết sinh trưởng
Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe
trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết
sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất
tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic
acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến
nhất.
• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử.
Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự
phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi
chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan,
1983).
Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10
-6
– 10
-1
M tùy theo từng
chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự

phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.
Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin
tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi
trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy,
các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm


giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử
dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA.
• Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của
tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như
Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự
phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ
cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994).
Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi
cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng
phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp
tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học
không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như
cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi
sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử
dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ
auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng
về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành
mô sẹo.
Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng
mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi

trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong
môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất
phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường
saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng
hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter,
1990).
Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy
trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi
cấy phụ thuộc vào cả ion H
+
và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau
khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ
đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở
môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).


Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy,
nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích
tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê
Thị Kim Đào, 2001)…
Các chất hữu cơ bổ sung
Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi
cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn
hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai
tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều
hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin,
cytokinin.
Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy.
Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et
al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA,

DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20
%.
Tác nhân làm đặc môi trường
Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở
dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực
vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử
dụng phổ biến nhất. Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose
có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.
1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý
Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi
trường,…
Ánh sáng
Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động
cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để
điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây. Tùy từng loại
nuôi cấy, yêu cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như
khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng. Ánh sáng còn ảnh hưởng tới
sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của
các chất điều hòa sinh trưởng cũng như dinh dưỡng khoáng. Thông thường trong


phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/
ngày với cường độ 2000 lux.
Nhiệt độ
Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ
22
0
C đến 25
0
C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự

điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo,
huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh
nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các
hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới
cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA
3
,…
pH môi trường
pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng
thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly
của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở
mức 5,5 - 5,8.
Trạng thái môi trường
Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên
một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng
tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện
tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy
chuyển và ra cây.
1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro.
Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra
ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh
sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng.
Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần
nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất
mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…
Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi
chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che
phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung

cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh
hưởng không tốt cho cây.
Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy
in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để
tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới
cho cây.
1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô
Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:
a) Lấy mẫu và xử lý mẫu
Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc
tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần
chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn
cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá
non…
Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và
điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo
quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 25
0
C, độ
ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and
Zimmerman, 1991).
b) Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả
năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi
của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng
lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế
bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như
phôi hữu tính.
c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy
thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu
nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng
(cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh
sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 - 30
0
C.
Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng


1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt
khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi
ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây
chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây
sau 7 - 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau
một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu.
d) Tái sinh rễ
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng
thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để
kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA,
2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình
thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng.
e) Chuyển cây ra vườn ươm
Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra
ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần
huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường.
1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến
1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung
Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả

năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu,
Lai Wan Nian, 2005).
Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân
sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và
CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992,
Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy.
Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen,
Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim
tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào
mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được
sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết
chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.