Tổng hợp và đánh giá khả năng kháng ung thư đại trực tràng hướng ức chế egfr tyrosin kinase của các chất tương đồng curcumin

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒN QUỐC HỒI NAM

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ
KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
HƯỚNG ỨC CHẾ EGFR TYROSIN KINASE
CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒN QUỐC HỒI NAM

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ
KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
HƯỚNG ỨC CHẾ EGFR TYROSIN KINASE
CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN

NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. TRƯƠNG NGỌC TUYỀN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa được cơng bố trong các
cơng trình nghiên cứu khác. Nếu khơng đúng như đã nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu
trách nhiệm.
Tác giả luận văn

Đoàn Quốc Hoài Nam

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học - Khoá 2020-2022
TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC
TRÀNG HƯỚNG ỨC CHẾ EGFR TYROSIN KINASE CỦA CÁC CHẤT
TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN
Đoàn Quốc Hoài Nam
Người hướng dẫn: PGS. TS. Trương Ngọc Tuyền
Đặt vấn đề
Ung thư đại trực tràng (CRC) là ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới và thứ năm
ở Việt Nam. Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) được xem là một đích
tác động trong điều trị ung thư nói chung và CRC nói riêng. Việc kết hợp cấu trúc
chung của các chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) với cấu trúc
có nhiều hoạt tính tiềm năng như 1H-pyrazol để hình thành các hợp chất mới có thể
là một hướng nghiên cứu hứa hẹn trong điều trị CRC thông qua việc ức chế EGFR.
Đối tượng và Phương pháp
Đối tượng nghiên cứu: Các MACs chứa 1H-pyrazol được đánh khả năng kháng
CRC theo hướng ức chế hoạt động của EGFR qua các thử nghiệm in vitro và in silico.
Tổng hợp các MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon: Các MACs được tổng
hợp bằng phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt giữa 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (j-n) và (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4). Độ tinh khiết
được kiểm tra bằng các phương pháp TLC, MP và HPLC. Cấu trúc hoá học được xác
định bằng các phương pháp IR, HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và ROESY.
Đánh giá khả năng gây độc tính trên các dịng tế bào ung thư in vitro: Phương
pháp MTT với tế bào SW480, MDA-MB-231 và A549 được xử lý trong 72 giờ.
Đánh giá khả năng ức chế EGFR và các protein tyrosin kinase in vitro: Phương
pháp phát quang luciferin với EGFRWT, EGFRL858R, HER2 và VEGFR2.
Đánh giá khả năng kích hoạt q trình apoptosis in vitro trên SW480: Phương

.


.

pháp nhuộm Hoechst 33342 (1), nhuộm FITC Annexin V / Propidium iodid (2) và
xác định hoạt độ caspase-3 (3) với tế bào SW480 được xử lý trong 24 và 48 giờ.
Đánh giá khả năng gây ảnh hưởng lên chu kỳ của SW480 in vitro: Phương
pháp nhuộm Propidium iodid với tế bào SW480 được xử lý trong 24 và 48 giờ.
Đánh giá khả năng gắn kết với EGFR in silico: Phương pháp mô phỏng gắn kết
phân tử và động lực học phân tử, đánh giá trên các dạng EGFRWT, EGFRL858R,
EGFRG719S và EGFRG724S.
Đánh giá hồ sơ dược động học và độc tính in silico: Dự đoán bởi SwissADME
và ADMETlab2.0.
Kết quả và Bàn luận
Tổng hợp các MACs: 18 MACs (j1-n3) với hiệu suất 20,1-88,1%, có độ tinh
khiết cao và có cấu trúc phù hợp với dự kiến.
Đánh giá khả năng gây độc tính trên các dòng tế bào ung thư in vitro: 12
MACs thể hiện độc tính mạnh (IC50 3,22-10,28 µM). Các MACs gồm a2, a4, b1, b2,
c1, c2, g2, h1, h2 và i2 được chọn sử dụng trong nội dung nghiên cứu tiếp theo.
Đánh giá khả năng ức chế EGFR và các protein tyrosin kinase in vitro: Hợp
chất a4 thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất trên EGFRWT (IC50 15,19 ± 0,84 µM) và
EGFRL858R (IC50 7,21 ± 1,28 µM).
Đánh giá khả năng kích hoạt q trình apoptosis in vitro trên SW480: Hợp
chất a4 kích hoạt q trình apoptosis của tế bào SW480, được chứng minh làm thay
đổi hình thái học, tăng tỷ lệ tế bào apoptosis và tăng hoạt động của caspase-3.
Đánh giá khả năng gây ảnh hưởng lên chu kỳ của SW480 in vitro: Hợp chất
a4 bắt giữ tế bào SW480 tại pha G2/M.
Đánh giá khả năng gắn kết với EGFR in silico: Hợp chất a4 duy trì ổn định

trạng thái gắn kết thuận nghịch tại vị trí gắn kết cạnh tranh ATP của các dạng EGFR,
nhờ vào tương tác hiệu quả với strand S711-720, vùng bản lề và strand S843-847, đặc biệt

.


là liên kết hydro với M793. Phân tích năng lượng gắn kết tự do gợi ý rằng a4 có khả
năng ức chế hoạt động của EGFRG719S mạnh hơn so với EGFRL858R và EGFRWT.
Đánh giá hồ sơ dược động học và độc tính (ADMET) in silico: Hợp chất a4
được dự đốn là sở hữu các đặc tính ADMET tiềm năng.
Kết luận
Nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của hợp chất a4 trong khả năng kháng CRC
hướng ức chế EGFR tyrosin kinase.

R3
H

H

B
R4
R5

A

80
60
50
40

SW480
MDA-MB-231

20

R1

0.5

1.0

1.5

60
50
40

2.5

-5.0

-4.0

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

log[Nồng độ, µM]

Hoạt tính kích hoạt apoptosis

O
O
N
N

2.0

log[Nồng độ, µM]

-20

Osi

80

20

A549

-0.5

MACs chứa dây nối
aceton (a1-i4)

a4

100

Mức độ cảm ứng
hoạt tính caspase-3

N
N

120

100

Tỷ lệ ức chế (%)

O

Tỷ lệ ức chế (%)

C

L858R

Hoạt tínhEGFR

ức chế EGFRL858R

Độc tính tế bào

120

R2

OH
O

4
3

***
***

2

a4

***

1
0

10.0

5.0

*

*

2.5

0.5

*** *** **

10.0

5.0

24 giờ

Hợp chất a4

Nhuộm Hoechst 33342

2.5

Cam

0.5

48 giờ

Nồng độ (µM)

Khả năng gắn kết với EGFR
R2

K745
K728

C

G719S

O
R3
N
N
A

B
R4
R5

R1

w1104

M793
F795

MACs chứa dây nối
cyclohexanon (j1-n3)

C797

R841

D800

Các từ khoá: chất tương đồng curcumin, 1H-pyrazol, ngưng tụ Claisen-Schmidt,
ung thư đại trực tràng, độc tính tế bào, EGFR, apoptosis, chu kỳ tế bào, gắn kết phân
tử, động lực học phân tử, ADMET.


.

Thesis for Master’s Degree of Pharmacy - Course 2020-2022
SYNTHESIS AND EVALUATION OF ANTI-COLORECTAL CANCER
ACTIVITIES OF CURCUMIN ANALOGUES AS EGFR TYROSINE
KINASE INHIBITORS
Doan Quoc Hoai Nam
Supervisor: Assoc. Prof. Ph.D. Truong Ngoc Tuyen
Introduction
Colorectal cancer (CRC) is the third and the fifth most common cancer in the
world and in Vietnam, respectively. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is
considered as a promising target in the treatment of various types of cancer, including
CRC. A combination of the common structure of MACs with 1H-pyrazole containing
multi-biological activities to create novel curcumin analogues could lead to a
promising research direction in the treatment of CRC through the inhibition of EGFR.
Subjects and Methodology
Research subjects: MACs containing 1H-pyrazole were evaluated their antiCRC activity targeting EGFR via several in vitro and in silico experiments.
Synthesis of MACs containing cyclohexanone linker: MACs were synthesized
by the condensation between a 1,3-diphenyl-1H-pyrazole-4-carbaldehyde (j-n) and

an (E)-2-(phenylmethylene)cyclohexan-1-one (1-4). Their purity was checked by
TLC, MP, and HPLC methods. Their structure was determined by IR, HR-MS, 1HNMR, 13C-NMR, and ROESY methods.
Evaluation of in vitro cytotoxicity against cancer cell lines: MTT method with
SW480, MDA-MB-231, and A549 cells treated for 72 hours.
Evaluation of in vitro inhibition against EGFR and tyrosine kinases: Luciferinbased luminescent method with EGFRWT, EGFRL858R, HER2, and VEGFR2.
Evaluation of in vitro apoptosis-inducing activity on SW480 cells: Hoechst

.


.

33342 staining (1), FITC Annexin V / Propidium iodide staining (2), and identifying
the activity of caspase-3 methods with SW480 cells treated for 24 and 48 hours.
Evaluation of in vitro effect on the SW480 cell’s cycle: Propidium iodide
staining method with SW480 cells treated for 24 hours and 48 hours.
Evaluation of in silico binding ability with EGFR: Molecular docking and
molecular dynamics simulation with EGFRWT, EGFRL858R, EGFRG719S, and
EGFRG724S.
Evaluation of in silico prediction of pharmacokinetic and toxicity profile:
Predictions were conducted by employing SwissADME và ADMETlab2.0 platforms.
Results and Discussions
Synthesis of MACs: 18 MACs (j1-n3) with final yields varying from 20.1 to
88.1%, high purities and spectral data consistent with the designed structures.
Evaluation of in vitro cytotoxicity against cancer cell lines: 12 MACs
demonstrated strong cytoxicities (IC50 3.22-10.28 µM). MACs including a2, a4, b1,
b2, c1, c2, g2, h1, h2 and i2 were selected for the subsequent experiment.
Evaluation of in vitro inhibition of EGFR and tyrosine kinases: Compound a4
demonstrated the greatest inhibitions against EGFRWT (IC50 15.19 ± 0.84 µM) and
EGFRL858R (IC50 7.21 ± 1.28 µM).

Evaluation of in vitro apoptosis-inducing activity on SW480 cells: Compound
a4 induced apoptosis in SW480 cells due to cellular morphological changes,
increases in the percentage of apoptotic cells, and increases in caspase-3 activity.
Evaluation of in vitro effect on the SW480 cell’s cycle: Compound a4 arrested
SW480 cells at G2/M phase.
Evaluation of in silico binding ability with EGFR: Compound a4 maintained its
reversible binding state in the ATP binding site of EGFR forms due to its effective
interactions with strand S711-720, hinge region and strand S843-

.

847

, especially the


hydrogen bonding with M793. The analysis of free binding energy suggested that a4
could inhibit EGFRG719S more effectively than EGFRL858R and EGFRWT.
Evaluation of in silico prediction of pharmacokinetic and toxicity (ADMET)
profile: Compound a4 was predicted to possess proper ADMET properties.
Conclusion
The research has shown the promising anti-CRC and anti-EGFR activities of
compound a4.
120

R2

L858R
EGFRL858REGFR
inhibitory

activity

Cytotoxicity

120

O
R3
N
N

H

H

B
R4
R5

A

80
60
50
40

SW480
MDA-MB-231

20

R1

-0.5

MACs with
acetone linker (a1-i4)

1.0

1.5

2.0

Osi

80
60
50
40
20

A549
0.5

-20

a4

100

%Inhibition

C

%Inhibition

100

2.5

-5.0

-4.0

-3.0

log[Concentration, µM]

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

log[Concentration, µM]

Apoptosis-inducing activities
Fold increase in
caspase-3 activity

4

O
O
N
N

OH
O

3

***
***

2

a4

***

1
0

10.0

5.0

*

*

2.5

0.5

*** *** **

10.0

5.0

24 hours

Compound a4

Hoechst 33342 staining

2.5

Cam

0.5

48 hours

Concentration (µM)

Binding mode into EGFR
R2

K745
K728

C

G719S

O
R3
N
N
A

B
R4
R5

R1

w1104

M793

F795

MACs with cyclohexanon linker (j1-n3)

C797

R841

D800

Keywords: curcumin analogues, 1H-pyrazole, Claisen-Schmidt condensation,
colorectal cancer, cytotoxicity, EGFR, apoptosis, cell cycle, molecular docking,
molecular dynamics, pharmacokinetics.


.

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..............................................i
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ.................................................................. vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .............................................. 3
1.2. THỤ THỂ CỦA YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ VÀ ĐÍCH TÁC ĐỘNG
TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ............................................... 6
1.3. CURCUMIN VÀ CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG KIỂU MONOCARBONYL 11
1.4. DỊ VÒNG 1H-PYRAZOL ................................................................................. 18
1.5. THIẾT KẾ THUỐC DỰA TRÊN CẤU TRÚC ................................................ 22
1.6. DỰ ĐOÁN HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH............................... 26

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 27
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 27
2.2. TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON ...... 32
2.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN
VITRO ....................................................................................................................... 37
2.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN
KINASE KHÁC IN VITRO ...................................................................................... 38
2.5. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT Q TRÌNH APOPTOSIS IN VITRO
TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 ..................................... 39
2.6. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG LÊN CHU KỲ TẾ BÀO UNG
THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO ..................................................................... 42

.


.

2.7. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO ......................... 43
2.8. ĐÁNH GIÁ HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH IN SILICO ........... 51
2.9. XỬ LÝ THỐNG KÊ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU ............................................ 51
Chương 3. KẾT QUẢ ............................................................................................. 53
3.1. TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON ...... 53
3.2. KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA
CÁC MACs THỬ NGHIỆM .................................................................................... 87
3.3. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC
IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM ......................................................... 89
3.4. KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DỊNG TẾ BÀO
UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 CỦA HỢP CHẤT a4 ......................................... 89
3.5. KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG
SW480 IN VITRO CỦA HỢP CHẤT a4 .................................................................. 94

3.6. KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO CỦA HỢP CHẤT a4 ........... 95
3.7. HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA HỢP CHẤT a4 ............. 109
Chương 4. BÀN LUẬN......................................................................................... 110
4.1. TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON .... 110
4.2. KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA
CÁC MACs THỬ NGHIỆM .................................................................................. 114
4.3. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC
IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM ....................................................... 116
4.4. KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DÒNG TẾ BÀO
UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 CỦA HỢP CHẤT a4 ....................................... 117
4.5. KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG
SW480 IN VITRO CỦA HỢP CHẤT a4 ................................................................ 118

.


.

4.6. KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO CỦA HỢP CHẤT a4 ......... 119
4.7. HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA HỢP CHẤT a4 ............. 123
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 124
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 124
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 125
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.

.

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Ý nghĩa tiếng Anh

Ý nghĩa tiếng Việt

A

Absorbance

Độ hấp thu

Ac

Acetyl

Acetyl

Acc

Hydrogen bond acceptor

Nhóm nhận của liên kết hydro

ADMET

Absorbtion - Distribution -

Hấp thu - Phân bố - Chuyển hoá

Metabolism - Excretion - Toxicity - Thải trừ - Độc tính
ADN

Deoxyribose nucleic acid

Acid deoxyribose nucleic

ADP

Adenosine diphosphate

Adenosin diphosphat

ATP

Adenosine triphosphate

Adenosin triphosphat

ARN

Ribose nucleic acid

Acid ribose nucleic

Cam

Camptothecin

Camptothecin

CC

Column chromatography

Sắc ký cột

CRC

Colorectal cancer

Ung thư đại trực tràng

CTPT

Chemical formula

Công thức phân tử

ĐKT

Co-crystallization

Đồng kết tinh

DCM

Dichloromethane

Dicloromethan

DMF

N,N-Dimethylformamide

N,N-Dimethylformamid

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dimethyl sulfoxid

Don

Hydrogen bond donor

Nhóm cho của liên kết hydro

DTT

1,4-Dithiothreitol

1,4-Dithiothreitol

EGF

Epidermal growth factor

Yếu tố tăng trưởng biểu bì

Ell

Ellipticine

Ellipticin

.


.

ii

Ký hiệu

Ý nghĩa tiếng Anh

Ý nghĩa tiếng Việt

Erl

Erlotinib

Erlotinib

Et

Ethyl

Ethyl

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh bào thai bê

FDA

Food and Drug Administration

Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ

FITC

Fluorescein isothiocyanate

Fluorescein isothiocyanat

Gef

Gefitinib

Gefitinib

GLOBOCAN Global cancer observatory
HEPES

HPLC

Báo cáo thực trạng ung thư

4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazine Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1ethane sulfonic acid

piperazin ethan sulfonic

High perfomance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
IC50

Half maximal inhibitory

Nồng độ ức chế tối đa 50%

concentration
JBJ

JBJ-09-063

JBJ-09-063

LA-GA

Lamarckian genetic algorithm

Thuật toán di truyền Lamarckian

LU

Luminescence unit

Đơn vị phát quang

mAbs

Monoclonal antibodies

Kháng thể đơn dòng

MACs

Monocarbonyl analogues of

Chất tương đồng curcumin kiểu

curcumin

monocarbonyl

MAPK

Mitogen-activated protein kinase Kinase protein được kích hoạt
bởi mitogen

MDs

Molecular dynamics simulation

.

Mơ phỏng động lực học phân tử


.

iii

Ký hiệu

Ý nghĩa tiếng Anh

Ý nghĩa tiếng Việt

Me

Methyl

Methyl

MMPBSA

Molecular mechanics Poisson-

Diện tích bề mặt cơ học phân tử

Boltzmann surface area

Poisson-Boltzmann

MP

Melting point

Điểm chảy, nhiệt độ nóng chảy

MR

Molar refractivity

Hệ số khúc xạ mol

MTT

3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]diphenyltetrazolium bromide

2,5-diphenyltetrazolium bromid

mw

Microwave

Vi sóng

MW

Molecular weight

Khối lượng phân tử

NMR

Nuclear magnetic resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

s

Singlet

Đỉnh đơn

d

Doublet

Đỉnh đôi

dd

Doublet of doublets

Đỉnh đôi - đôi

t

Triplet

Đỉnh ba

dt

Doublet of triplets

Đỉnh đôi - ba

tt

Triplet of triplets

Đỉnh ba - ba

quint

Quintet

Đỉnh năm

m

Multiplet

Đỉnh đa

mc

Center of multiplet

Đỉnh đa xác định được độ dời
hoá học trung tâm

J

Coupling constant

Hằng số ghép

NPT

Isothermal - isobaric ensemble

Cân bằng đẳng nhiệt - đẳng áp

.


.

iv

Ký hiệu

Ý nghĩa tiếng Anh

Ý nghĩa tiếng Việt

NVT

Isothermal - isochoric ensemble

Cân bằng đẳng nhiệt - đẳng tích

Osi

Osimertinib

Osimertinib

PAINS

Pan assay interference

Chất có thể gây dương tính giả

compounds

trong nghiên cứu sàng lọc

PBS

Photphate buffer saline

Nước muối đệm phosphat

PDA

Photodiode array

Dãy diode quang

PI3K

Phosphatidylinositol 3-kinase

Phosphatidylinositol 3-kinase

PI

Propidium iodide

Propidium iodid

iPr

Isopropyl

Isopropyl

PS

Phosphatidyl serine

Phosphatidyl serin

PTSA

p-Toluenesulfonic acid

Acid p-toluensulfonic

QSAR

Quantitative structure activity

Liên quan định lượng cấu trúc

relationship

và tác dụng

RMSD

Root mean square deviation

Độ lệch gốc bình phương

RMSF

Root mean square fluctuation

Độ dao động gốc bình phương

ROESY

Rotating-frame nuclear

Quang phổ tương quan hiệu ứng

Overhauser effect correlation

Overhauser của hạt nhân quay

spectroscopy
SASA

Solvent accessible surface area

Diện tích bề mặt tiếp cận dung
mơi

SDH

Succinate dehydrogenase

Succinat dehydrogenase

TBUT

Cancer cell

Tế bào ung thư

TGF

Transformational growth factor

Yếu tố tăng trưởng chuyển đổi

.


.

v

Ký hiệu

Ý nghĩa tiếng Anh

Ý nghĩa tiếng Việt

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

TIP3P

Transferable intermolecular

Thế năng liên phân tử truyền

potential with 3 points

được với 3 điểm

TK

Tyrosine kinase

Tyrosin kinase

TKIs

Tyrosine kinase inhibitors

Chất ức chế tyrosin kinase

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TPSA

Topological polar surface area

Diện tích bề mặt phân cực

tR

Retention time

Thời gian lưu

VEGF

Vascular endothelial growth

Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch

factor

máu

X-ray diffraction

Phương pháp nhiễu xạ tia X

XRD

.


.

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tóm tắt về các thế hệ TKIs đối kháng EGFR. ......................................... 14
Bảng 2.1. Cấu trúc hóa học của các MACs được sử dụng trong nghiên cứu........... 29
Bảng 2.2. Các thông số grid box và docking được sử dụng trong các giai đoạn docking
mù và docking tập trung vào các vị trí gắn kết cạnh tranh ATP hoặc allosteric. ..... 45
Bảng 2.3. Các quá trình gắn kết phân tử vào khoang gắn kết của EGFR để đánh giá
lại khả năng tái tạo dữ liệu thực nghiệm. .................................................................. 47
Bảng 3.1. Phân bố của quần thể TBUT SW480 ở các giai đoạn apoptosis khi được
xử lý với hợp chất a4 trong các khoảng thời gian 24 giờ và 48 giờ. ........................ 93
Bảng 3.2. Mức độ cảm ứng caspase-3 của hợp chất a4 khi xử lý với TBUT SW480
trong hai khoảng thời gian 24 giờ và 48 giờ. ............................................................ 94
Bảng 3.3. Phân bố của quần thể tế bào ở các giai đoạn của chu kỳ TBUT SW480 khi
được xử lý với hợp chất a4 trong các khoảng thời gian 24 giờ và 48 giờ. ............... 95

.


.

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Mức độ phổ biến của các loại ung thư theo GLOBOCAN 2020. .............. 4
Hình 1.2. Tình hình các ung thư phổ biến ở Việt Nam theo GLOBOCAN 2020...... 5
Hình 1.3. EGFR kích hoạt hai con đường tín hiệu chính RAS/RAF/ MEK/MAPK và
PI3K/Akt/mTOR đóng vai trị quan trọng trong ung thư. .......................................... 7
Hình 1.4. Các thành phần trong cấu trúc vùng TK của EGFR (703-984), vị trí gắn kết
của ATP và vị trí của ba đột biến G719S, G724S và L858R29-32. .............................. 9
Hình 1.5. Curcumin và chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs). .. 16
Hình 1.6. Tổng hợp các MACs chứa cyclohexanon có khả năng ức chế hoạt động của
EGFR TK. ................................................................................................................. 17

Hình 1.7. Đa dạng về hoạt tính sinh học của dị vòng 1H-pyrazol qua sự hiện diện
trong cấu trúc phân tử của một số hoạt chất. ............................................................ 20
Hình 1.8. Các hoạt chất kháng ung thư chứa dị vịng 1H-pyrazol. .......................... 21
Hình 2.1. Định hướng thiết kế các chất tương đồng curcumin. ............................... 28
Hình 2.2. Tổng hợp các dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n). ... 33
Hình 2.3. Tổng hợp các dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4). . 34
Hình 2.4. Tổng hợp các MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon (j1-n3). ............... 35
Hình 2.5. Đánh giá và lựa chọn cluster từ docking mù (blind docking) và docking tập
trung (focused docking). ........................................................................................... 46
Hình 2.6. Hai giai đoạn chính của q trình mơ phỏng gắn kết phân tử.................. 48
Hình 2.7. Bốn giai đoạn chính của một q trình MDs. .......................................... 52
Hình 3.1. Kết quả độc tính trên ba dịng TBUT của các MACs thử nghiệm. .......... 88
Hình 3.2. Kết quả khả năng ức chế EGFRWT, EGFRL858R, HER2 và VEGFR2 của 10
MACs được lựa chọn. ............................................................................................... 90

.


.

viii

Hình 3.3. Thay đổi hình thái học của TBUT SW480 khi xử lý với hợp chất a4. .... 91
Hình 3.4. Cluster được chọn và vị trí gắn kết của ligand ĐKT trên EGFR TK....... 96
Hình 3.5. Vị trí gắn kết và kiểu gắn kết của các ligand ĐKT từ re-docking và crossdocking tập trung trên các dạng EGFR..................................................................... 98
Hình 3.6. Vị trí gắn kết và kiểu gắn kết thuận nghịch và không thuận nghịch của hợp
chất a4 trên các dạng EGFR. .................................................................................... 99
Hình 3.7. Động lực học của các dạng apo-EGFRWT/L858R và các phức hợp tương ứng
trong khoảng 30-100 ns của mơ phỏng................................................................... 101
Hình 3.8. Động lực học của các dạng apo-EGFRG719S/G724S và các phức hợp tương

ứng trong khoảng 30-100 ns của mơ phỏng. .......................................................... 105
Hình 3.9. Phân tích tương tác giữa a4 và Erl với các dạng EGFR trong mơ phỏng
động lực học phân tử. ............................................................................................. 108
Hình 3.10. Biểu đồ radar biểu diễn các đặc tính lý hóa của hợp chất a4. .............. 109
Hình 4.1. Xác nhận cấu hình (E) của các dẫn chất 1-4 dựa trên phổ ROESY. ...... 111
Hình 4.2. Xác nhận cấu hình (2E,6E) của MACs j1-n3 dựa trên phổ ROESY. .... 113
Hình 4.3. Tóm tắt các nhận xét về SAR về độc tính trên TBUT của các MACs... 116

.


.

1

MỞ ĐẦU
Ung thư đại trực tràng (CRC), khởi phát ở đại tràng hoặc trực tràng, là một trong
những dạng ung thư phổ biến ở hầu hết các quốc gia. Theo GLOBOCAN 2020, CRC
là ung thư phổ biến đứng hàng thứ ba trên thế giới và đứng hàng thứ năm ở Việt Nam,
với 16.426 ca mắc, 8.203 ca tử vong và có xu hướng ngày càng phổ biến ở giới trẻ.
Mặc dù với việc khám phá và phát triển thuốc mới diễn ra nhanh, các thuốc điều trị
ung thư nói chung và CRC nói riêng có thể dùng hiện nay dường như vẫn chưa đáp
ứng được tính an tồn, hiệu quả và chọn lọc, và do đó trở thành vấn đề tồn tại chưa
thể giải quyết được. Liệu pháp điều trị dựa vào đích tác động là phương pháp hữu
hiệu của hóa trị liệu để ngăn chặn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư (TBUT),
bằng cách hướng mục tiêu đến gen hay protein cụ thể. Thụ thể của yếu tố tăng trưởng
biểu bì (EGFR), một glycoprotein xuyên màng hoạt động như một trung gian quan
trọng trong quá trình tín hiệu cần thiết cho q trình tăng trưởng và phát triển của tế
bào, đặc biệt là các TBUT. Với vai trò thiết yếu, EGFR được xem như một đích tác
động cơ bản trong điều trị ung thư nói chung và CRC nói riêng. Các kháng thể đơn

dịng (mAbs) và các phân tử nhỏ ức chế tyrosin kinase (TKIs) là hai cách tiếp cận
lâm sàng chủ chốt trong liệu pháp ức chế EGFR. Cho đến nay, hàng trăm TKIs đã
được tổng hợp và phân loại thành bốn thế hệ, tuy nhiên sự đề kháng do đột biến của
EGFR khiến việc điều trị theo liệu pháp này gặp nhiều khó khăn và là thách thức lớn
trong điều trị các loại ung thư có liên quan. Nhiều nghiên cứu được thực hiện để khám
phá ra các chất ức chế chuyên biệt trên EGFR đột biến.
Ở một khía cạnh khác, curcumin, thành phần chính trong thân rễ cây nghệ vàng
(Curcuma longa L. Zingiberaceae), sở hữu nhiều hoạt tính sinh học như kháng ung
thư, kháng viêm, kháng HIV, chống oxy hóa,... Tuy nhiên với các hạn chế về tính tan,
tính bền, sinh khả dụng,… sự phát triển thay thế của các chất tương đồng monocarbonyl của curcumin (MACs) chứa divinyl ceton, nhìn chung làm cải thiện dữ liệu
dược động học và hoạt tính sinh học hơn so với curcumin. Hơn nữa, cho đến nay, số
lượng các MACs chứa dị vòng 1H-pyrazol còn hạn chế, mặc dù là cấu trúc dị vịng
có nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng. Do đó, cân nhắc về tính khả thi và lợi ích trong

.


.

2

tổng hợp và tiềm năng về hoạt tính sinh học của các MACs chứa các cấu trúc đa dạng
hơn của dị vòng 1H-pyrazol, tác giả tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu “Tổng hợp
và đánh giá khả năng kháng ung thư đại trực tràng hướng ức chế EGFR tyrosin
kinase của các chất tương đồng curcumin” với các mục tiêu:
Mục tiêu tổng quát: Đánh giá khả năng kháng CRC của các MACs chứa dị vòng
1H-pyrazol, theo hướng ức chế EGFR tyrosin kinase qua các thử nghiệm in vitro và
in silico.
Mục tiêu cụ thể:
1. Tổng hợp các MACs mới chứa cấu trúc 1,3-diphenyl-1H-pyrazol và cấu trúc nối

cyclohexanon. Sử dụng các MACs tổng hợp này cùng với 36 MACs trong các
nghiên cứu trước đây cho các thử nghiệm tiếp theo.
2. Sàng lọc khả năng kháng ung thư của các MACs qua thử nghiệm độc tính tế bào
trên các dịng TBUT ở người, gồm TBUT đại tràng SW480, TBUT vú MDA-MB231 và TBUT phổi A549, qua đó lựa chọn các MACs gây độc tế bào mạnh trên
hầu hết các dòng TBUT, đặc biệt là trên dòng TBUT đại tràng ở người SW480;
3. Đánh giá khả năng ức chế hoạt động EGFR tyrosin kinase, bao gồm dạng tự nhiên
EGFRWT và dạng đột biến EGFRL858R, của các MACs được lựa chọn từ mục tiêu
số 2, qua đó sẽ lựa chọn tiếp các MACs có khả năng ức chế EGFR;
4. Đánh giá khả năng kích hoạt quá trình apoptosis của các MACs tiềm năng, được
lựa chọn từ mục tiêu số 3, trên dòng TBUT đại tràng ở người SW480;
5. Phân tích ảnh hưởng của các MACs tiềm năng, được lựa chọn từ mục tiêu số 3,
lên chu kỳ tế bào của dòng TBUT đại tràng ở người SW480;
6. Đánh giá khả năng gắn kết của các MACs tiềm năng, được lựa chọn từ mục tiêu
số 3, với dạng tự nhiên EGFRWT và các dạng đột biến bắt gặp trong CRC gồm
EGFRL858R, EGFRG719S và EGFRG724S bằng phương pháp mô phỏng gắn kết phân
tử và phương pháp động lực học phân tử.
7. Dự đốn tính chất dược động học - độc tính của MACs tiềm năng được lựa chọn
từ mục tiêu số 3.

.


.

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Ung thư là tên gọi chung của một tập hợp các bệnh có liên quan, đặc trưng bởi
sự phân chia khơng kiểm sốt của các tế bào bất thường1. Ung thư đại trực tràng

(CRC), có liên quan đến các tế bào bất thường khởi phát ở đại tràng hoặc trực tràng,
là một trong các dạng ung thư phổ biến và gây tử vong. Nguy cơ diễn tiến và phát
triển của CRC đến từ các yếu tố môi trường và di truyền. Theo GLOBOCAN 2020,
mặc dù có tỷ lệ mắc và tử vong thay đổi đáng kể giữa các vùng trên thế giới, nhìn
chung, CRC đứng thứ ba, đối với nam giới, và đứng thứ hai, đối với nữ giới, trong số
các loại ung thư phổ biến nhất, trong đó tỷ lệ mắc và tử vong ở nam đều cao hơn đáng
kể so với nữ2. Hàng năm, có xấp xỉ 149.500 ca mắc mới được chẩn đoán, với 104.270
ca ung thư đại tràng và phần còn lại là ung thư trực tràng1. Ở Việt Nam, CRC là loại
ung thư phổ biến đứng hàng thứ tư ở nam giới và đứng hàng thứ ba ở nữ giới, với số
trường hợp mắc mới tương ứng là 8.887 và 7.539 trường hợp, gồm 9.399 ca ung thư
trực tràng và 6.448 ca ung thư đại tràng2.
1.1.1. Tỷ lệ mắc mới và các yếu tố ảnh hưởng
Nhìn chung, tỷ lệ mắc mới giữa các vùng địa lý có thể biến động trên 10 lần, cao
nhất ở Australia, New Zealand, các nước châu Âu và Bắc Mỹ, trong khi thấp nhất ở
các nước châu Phi và Trung-Nam Á3. Sự khác biệt theo địa lý có thể là do sự khác
biệt trong chế độ ăn uống và tiếp xúc với môi trường xung quanh, trên nền tảng của
các yếu tố di truyền. Tình trạng kinh tế xã hội thấp cũng liên quan với nguy cơ phát
triển CRC, trong đó các thói quen như lười vận động, chế độ ăn khơng lành mạnh,
hút thuốc, béo phì và tỷ lệ khám sàng lọc CRC thấp cũng đóng góp tỷ lệ không nhỏ,
từ 33 đến 50%, vào nguy cơ khởi phát CRC4.
Tuổi tác cũng là một yếu tố nguy cơ chính đối với CRC, vốn khơng phổ biến
trước 40 tuổi và bắt đầu tăng đáng kể trong độ tuổi từ 40 đến 50. Sự gia tăng này chủ
yếu với ung thư ở phần đại tràng bên trái nói chung và ung thư ở trực tràng nói riêng5.
Các lý do cơ bản cho xu hướng này có thể là do nhiều yếu tố như tiền sử mắc CRC

.


.

4

của người thân, tăng lipid máu, béo phì và uống rượu bia6. Hầu hết các hướng dẫn
hiện hành đều không khuyến nghị sàng lọc những người dưới 50 tuổi không có triệu
chứng, trừ khi có yếu tố tiền sử gia đình hoặc hội chứng di truyền7. Tuy nhiên, việc
xem xét giảm độ tuổi khám sàng lọc đang được cân nhắc trong bối cảnh tỷ lệ mắc
CRC khởi phát sớm ngày càng tăng, đặc biệt là những người ở độ tuổi từ 40 đến 49.
A

Vú
2.261.419 (11,7%)

Phổi
2.206.771 (11,4%)

Đại trực tràng
1.931.590 (10,0%)

Ung thư khác
10.389.647 (53,9%)

Tuyến tiền liệt
1.414.259 (7,3%)

Dạ dày
1.089.103 (5,6%)

Tổng cộng: 19.292.789

B

Gan
26.418 (14,5%)

Ung thư khác
73.996 (40,5%)

Phổi
26.262 (14,4%)

Vú
21.555 (11,8%)

Đại trực tràng
16.426 (9,0%)

Dạ dày
17.906 (9,8%)

Tổng cộng: 182.563

Hình 1.1. Mức độ phổ biến của các loại ung thư theo GLOBOCAN 2020.
(A) Trên thế giới. (B) Ở Việt Nam2.
Mặt khác, CRC hiện nay dần thay đổi vị trí khởi phát ở phần bên phải của đại
tràng với tỷ lệ mắc tăng tương đối cao8. Sự thay đổi trong phân bố giải phẫu này của
CRC, một phần có thể liên quan đến những cải thiện trong chẩn đoán và điều trị, cũng
như trong khả năng sàng lọc và loại bỏ sớm các polyp. Nội soi đại tràng có hiệu quả
hơn trong việc ngăn ngừa CRC ở phần bên trái so với phần bên phải, có thể góp phần
vào sự thay đổi phân bố của CRC. Có khả năng một phần của sự khác biệt là do các

.


.

5

khía cạnh chất lượng của nội soi hoặc do các yếu tố sinh học khác nhau giữa các vị
trí bên phải và bên trái của đại tràng8.
1.1.2. Tỷ lệ tử vong
Tỷ lệ tử vong do CRC đã giảm dần kể từ giữa những năm 1980 ở Hoa Kỳ và ở
nhiều nước phương Tây khác1. Sự cải thiện này một phần nhờ vào việc phát hiện và
loại bỏ các polyp đại tràng, phát hiện CRC ở giai đoạn sớm, cũng như các phương
pháp điều trị và hỗ trợ hiệu quả. Tuy nhiên, việc tỷ lệ tử vong nhìn chung giảm dần,
đang che lấp xu hướng gia tăng tỷ lệ tử vong ở người trẻ tuổi. Sự gia tăng này chỉ giới
hạn ở người trẻ da trắng với khoảng 1,4% mỗi năm (2004-2014). Ngược lại, giữa các
cá thể da đen và các chủng tộc khác, tỷ lệ tử vong ổn định hoặc giảm nhẹ trong khoảng
thời gian này9. Trái ngược với những dữ liệu của các nước phát triển, tỷ lệ tử vong có
xu hướng tiếp tục tăng ở nhiều quốc gia có nguồn lực và cơ sở hạ tầng y tế hạn chế,
đặc biệt là ở Trung-Nam Mỹ và Đông Âu, theo GLOBOCAN2.
A

B

Hình 1.2. Tình hình các ung thư phổ biến ở Việt Nam theo GLOBOCAN 2020.
(A) So sánh tỷ lệ mắc mới được chuẩn hố theo tuổi của giới tính nam và nữ.
(B) So sánh tỷ lệ mắc mới với tỷ lệ tử vong2.

.