Khóa Luận Tốt Nghiệp - Đề Tài -Phân Tích Trình Tự Nucleotit Gen Mã Hóa Protein Kháng Nguyên Orf5 Của Virus Gây Hội Chứng Hô Hấp Và Sinh Sản Ở Lợn Từ Một Số Mẫu Thu Thập Ở Việt Nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--------------***--------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“Phân tích trình tự nucleotit gen mã hóa
protein kháng ngun ORF5 của virus gây Hội chứng
hơ hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus)
từ một số mẫu thu thập ở Việt Nam”


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan tồn bộ kết quả trong luận văn là do chính tơi trực tiếp
thực hiện.
Các số liệu và kết quả được công bố trong luận văn là hồn tồn trung thực,
chính xác và chưa được cơng bố ở bất kỳ cơng trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả

Bùi Phương Linh

năm 2012

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và gửi lời cảm ơn chân thành tới
TS. Nguyễn Hữu Đức – Phó Trưởng khoa Cơng nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ
Sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà
Nội và TS. Nguyễn Thị Diệu Thúy, Phó Trưởng phịng Công nghệ Gen động vật,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là các Thầy, Cơ
đã trực tiếp hướng dẫn, đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới KS. Nguyễn Thị Thu – Cán bộ
nghiên cứu phịng Cơng nghệ Gen Động vật – Viện Công nghệ sinh học, người
luôn tận tình chỉ bảo, động viên và cho tơi những lời khuyên quý báu công việc và
trong cuộc sống.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ nghiên cứu, kỹ thuật
viên phịng Cơng nghệ Gen Động vật – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện
để tơi hồn thành khóa luận của mình một cách thuận lợi.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Công nghệ
sinh học, Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội, đã tận tình chỉ bảo cho tơi trong
suốt q trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn đến những người thân
trong gia đình cùng bạn bè đã ln hỗ trợ, động viên, khuyến khích tơi trong suốt
thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2012

Bùi Phương Linh

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................ii
MỤC LỤC...................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG.............................................................................................v
DANH MỤC HÌNH.....................................................................................vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT............................................................vii
TĨM TẮT.............................................................................................................1
PHẦN I: MỞ ĐẦU..............................................................................................2
1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................2
1.2. Mục tiêu..................................................................................................3
1.3. Yêu cầu...................................................................................................3
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................4
2.1. Một vài nét khái quát về hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn................4
2.1.1. Sự xuất hiện của bệnh..........................................................................4
2.1.2. Triệu chứng lâm sàng..........................................................................5
2.1.3. Tác hại của bệnh..................................................................................6
2.1.4. Đường truyền lây.................................................................................7
2.2. Đặc điểm và cấu trúc của PRRSV..........................................................7
2.2.1. Đặc điểm của virus..............................................................................7
2.2.2. Cấu trúc virus......................................................................................8
2.2.3. Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng..............................................9
2.2.4. Protein kháng nguyên ORF5.............................................................10
2.3. Một số kỹ thuật dùng cho phân tích di truyền..............................................11
2.3.1. Kỹ thuật tách chiết ARN...........................................................................11
2.3.2. Kỹ thuật RT – PCR hai bước tạo cDNA sao chép ngược.................11
2.4. Tình hình nghiên cứu PRRSV và gen ORF5 trên thế giới và Việt Nam
13
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới....................................................13

2.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam...................................................19


PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.................................................22
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................22
3.2. Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................22
3.2.1. Mẫu bệnh...................................................................................................22
3.2.2. Mồi sử dụng.......................................................................................23
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất............................................................24
3.3. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................25
3.3.1. Tách ARN..................................................................................................25
3.3.2. RT – PCR hai bước...........................................................................26
3.3.3. Tinh sạch đoạn ORF5 gửi mẫu giải trình tự..............................................28
3.3.4. Phân tích trình tự gen và axít amin tương ứng của các chủng PRRSV
28
PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................30
4.1. Kết quả tách ARN................................................................................30
4.2. Kết quả thực hiện phản ứng RT – PCR................................................30
4.3. Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các mẫu phân lập.........................31
4.4. Kết quả giải trình tự gen ORF5 của các mẫu phân lập.........................34
4.5. Kết quả so sánh trình tự và sự tương đồng axít amin giữa 23 mẫu phân
lập với nhau và với một số chủng trên thế giới...................................................43
4.6. Kết quả phân tích cây phả hệ của gen ORF5 trên các mẫu phân lập. . .50
4.7. Kết quả phân tích trình tự cây phả hệ so sánh với các chủng trên thế
giới

52
4.8. Đăng ký trình tự vào Ngân hàng gen....................................................55

PHẦN VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................57

5.1. Kết luận........................................................................................................57
5.2. Đề nghị................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................58
PHỤ LỤC...................................................................................................62


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Ký hiệu và địa điểm thu mẫu của các mẫu ORF5 được phân lập........22
Bảng 3.2 Trình tự để giải trình tự ORF5.............................................................23
Bảng 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm...................................................23
Bảng 3.4 Các dung dịch đệm...............................................................................24
Bảng 3.5 Các hóa chất sử dụng...........................................................................25
Bảng 3.6 Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA.........................................26
Bảng 3.7 Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA.........................................26
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA....................................26
Bảng 3.9 Thành phần của phản ứng khuếch đại cDNA......................................27
Bảng 3.10 Chu trình phản ứng khuếch đại cDNA..............................................28
Bảng 3.11 Danh sách các chủng lựa chọn so sánh với các mẫu phân lập tại Việt Nam.29
Bảng 4.1 Phần trăm tương đồng về nucleotit của gen ORF5 giữa các chủng
PRRSV phân lập tại Việt Nam với một số chủng thế giới..................................38
Bảng 4.2 Vị trí và nucleotit đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng nguyên
thủy dòng Bắc Mỹ VR2332.................................................................................40
Bảng 4.3 Vị trí và nucleotit đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng vắc xin
JXA1 – R.............................................................................................................42
Bảng 4.4 Vị trí và nucleotit đột biến của mẫu HG2012.RV1 so với chủng vắc
xin JXA1 – R.......................................................................................................43
Bảng 4.5 Phần trăm tương đồng về axít amin của gen ORF5 giữa các chủng
PRRSV phân lập tại Việt Nam với một số chủng thế giới..................................47
Bảng 4.6 Vị trí và axít amin đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng VR2332...50
Bảng 4.7 Vị trí và axít amin đột biến của mẫu HG2012.RV so với chủng vắc xin

JXA1 – R.............................................................................................................51
Bảng 4.8 Vị trí và axít amin đột biến của 22 mẫu phân lập so với chủng vắc xin
JXA1 – R.............................................................................................................52
Bảng 4.9 Haplotype của 23 mẫu phân lập...........................................................55
Bảng 4.10 Tên và mã số đăng ký trên Ngân hàng gen của các mẫu lựa chọn so sánh..56
Bảng 4.11 Ký hiệu chủng và số đăng ký Ngân hàng gen của các mẫu phân lập 59


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Điểm tụ máu trển phổi và thận của lợn bị nhiễm bệnh..........................5
Hình 2.2 Đại thực bào của tế bào bị nhiễm PRRSV và tế bào bình thường.........8
Hình 2.3 Cấu trúc genome PRRSV.......................................................................8
Hình 2.4 Cây phân loại và lịch sử tiến hóa của tất cả các dịng thuộc virus dịng
Bắc Mỹ................................................................................................................17
Hình 3.1 Sơ đồ vị trí vùng gen ORF5.................................................................23
Hình 4.1 Kết quả điện di ARN tổng số...............................................................30
Hình 4.2 Kết quả diện di sản phẩm RT – PCR gen ORF5..................................31
Hình 4.3 Giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotit của
gen ORF5 mẫu HG2012.RV1.............................................................................32
Hình 4.4 So sánh trình tự nucleotit chuỗi gen ORF5 của PRRSV phân lập tại
Việt Nam với một số chủng trên thế giới............................................................36
Hình 4.5 So sánh thành phần axít amin gen ORF5 của 23 mẫu phân lập tại Việt
Nam với một số chủng của thế giới.....................................................................46
Hình 4.6 Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng PRRSV của Việt Nam và
một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotit gen ORF5.........54
Hình 4.7 Cây phả hệ của các chủng PRRSV của Việt Nam và một số chủng khác
trên thế giới sử dụng thành phần nucleotit của gen ORF5..................................57


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

(Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành)

Tên
µl
bp
ADN
ARN
dNTP

Tên tiếng Anh
Microlitre
Base pair
Deoxyribonucleic acid
Ribonucleic acid
Deoxynucleoside Triphosphate

HAAT

Hyperthermie Avortements dé Truies

kb
MSD
ORF
PCR

Kilo base
Mystery swine disease
Open reading frame
Polymerase Chain Reaction
Porcine Reproductive and

lợn
Kilô bazơ
Bệnh bí hiểm trên lợn
Khung đọc mở
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô

Respiratory Syndrome
Porcine Reproductive and

hấp ở lợn
Virus gây Hội chứng rối loạn sinh

Respiratory Syndrome Virus
Reverse transcription polymerase

sản và hô hấp ở lợn
Phản ứng chuỗi đồng phân hóa

chain reaction
Swine infertility ADN Respiratory

sao chép ngược
Hội chứng hô hấp và sẩy thai ở

Syndrome
Tris – Ethylen Diamin Tetra Acetic

lợn

PRRS
PRRSV
RT – PCR
SIRS
TE

Tên tiếng Việt
Mi – crơ – lít
Cặp bazơ
Axít Đeoxyribonucleic
Axít Ribonucleic
Đeoxynucleosit triphotphat
Bệnh sốt cao, biếng ăn, sảy thai ở


TĨM TẮT
Đề tài: “Phân tích trình tự nucleotit gen mã hóa protein kháng ngun
ORF5 của virus gây Hội chứng hơ hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive
and Respiratory Syndrome Virus) từ một số mẫu thu thập ở Việt Nam” thực
hiện nhằm mục đích giải trình tự vùng gen cấu trúc mã hóa protein kháng nguyên
ORF5 và đánh giá, so sánh với các chủng đang lưu hành trong khu vực và trên thế
giới. Đoạn gen ORF5 dài 603 bp của 23 mẫu thu tại các tỉnh Đồng Nai, Hậu Giang,
thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ, Bình Dương và một mẫu vắc xin JXA1 – R đã
được phân lập và giải trình tự hồn chỉnh.
Kết quả phân tích cho thấy 23 mẫu phân lập có sự tương đồng với nhau từ
87,5% đến 100,0% về trình tự nucleotit và từ 86,5% đến 100,0% về trình tự axít
amin. Trong khi 23 mẫu so sánh có sự tương đồng 87,5% đến 100,0% về trình tự
nucleotit, 87,0% đến 100,0% về trình tự axít amin khi so sánh với chủng nguyên
thủy dòng Bắc Mỹ VR2332 thì chỉ có 61,0% đến 62,1% sự tương đồng về nucleotit

và 55,5% đến 57,0% sự tương đồng về axít amin so với chủng nguyên thủy dòng
châu Âu Lelystad. Điều này chúng tỏ 23 mẫu phân lập trong nghiên cứu này đều
thuộc virus dòng Bắc Mỹ.
Mặt khác, 23 mẫu phân lập có sự tương đồng 89,2% đến 98,6% về trình tự
nucleotit, 87,5 % đến 98% về trình tự axít amin so với chủng vắc xin JXA1 – R;
87,2% đến 99,6% về trình tự nucleotit, 85,0% đến 98,5% về trình tự axít amin so
với chủng vắc xin BSL – PS100; so với chủng vắc xin MLV là 86,8% đến 99,3% về
trình tự nucleotit, 85,5% đến 99,0% về trình tự axít amin.
Dựa theo cây phả hệ, 23 mẫu phân lập được tạo thành 10 haplotype và được
chia thành hai nhóm. Trong đó, nhóm thứ 1 bao gồm mẫu HG2012.RV1 cùng nhóm
với chủng nguyên thủy VR2332, chủng vắc xin MLV, chủng vắc xin BSL – PS100
và thuộc dòng phụ 5.1 – dòng phụ tiêu biểu cho chủng có độc lực thấp; nhóm thứ 2
gồm 22 mẫu còn lại thuộc dòng phụ 8.7 – dòng phụ tiêu biểu cho chủng có độc lực
cao bùng nổ tại Trung Quốc năm 2006. Điều đặc biệt là 22 mẫu này có sự tương
đồng lên đến 89,0% – 99,0% về trình tự nucleotit và 88,5% – 100,0% về trình tự
axít amin so với chủng độc lực cao HUB1 tại Trung Quốc.


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Hội chứng hô hấp và rối loạn sinh sản (PRRS: Porcine reproductive and

respiratory syndrome) còn gọi là bệnh “tai xanh” (Blue Ear) là bệnh truyền nhiễm
cấp tính nguy hiểm xảy ra trên lợn, do PRRSV (Porcine reproductive and
respiratory syndrome virus), thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh
xảy ra lần đầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này được tìm thấy ở châu Âu,
và xuất hiện ở châu Á vào đầu những năm 1990. Vào thời điểm đó, do chưa xác
định được căn nguyên bệnh nên được gọi là “bệnh bí hiểm ở lợn” (MSD), một số

người căn cứ theo triệu chứng gọi là “bệnh tai xanh ở lợn”. Sau đó, bệnh lây lan
rộng trên toàn thế giới và được gọi bằng nhiều tên. Năm 1992, Hội nghị quốc tế về
bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota đã nhất trí dùng tên PRRS (hội chứng
hô hấp và sinh sản ở lợn) và đã được Tổ chức Thú y Thế giới công nhận.
Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nước trên thế giới, gây
tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997
trên đàn lợn nhập từ Mỹ. Đại dịch hội chứng hô hấp và sinh sản lợn liên tục xảy ra
từ năm 2007 – 2010 ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn ni lợn nói riêng và
nền kinh tế nói chung. Ngay cả khi khơng có dịch bệnh xuất hiện thì các nghiên cứu
về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết
thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%, vì thế, việc quản
lý kịp thời diễn biến bệnh là vô cùng cần thiết.
Vật chất di truyền của PRRSV là ARN mạch đơn có kích thước phân tử
khoảng 15 kb mã hóa cho các protein cấu trúc và protein khơng cấu trúc. PRRSV có
gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau, mã hóa cho 7 protein của virus gồm: GP1, GP2,
GP3, GP4, GP5, M và N. Trong đó, GP5 là protein vỏ chính của virus, nằm trên bề
mặt màng virus, chính là vị trí tiếp xúc của PRRSV khi nó nhiễm vào vật chủ. GP5
là đích đến chủ yếu của các kháng thể trung hồ, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh”
đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV. Ngồi ra, GP5 cịn tham gia hiện
tượng “chết theo chương trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm


PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm tăng khả năng
lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp,
vì điều đó làm giảm hiệu quả phịng bệnh của các vắc xin phịng bệnh đang lưu
hành. Việc giải trình tự gen mã hóa protein vỏ GP5, phân tích các đặc điểm tiến hóa
phân tử sẽ góp phần cung cấp thông tin về biến đổi cấu trúc di truyền của PRRSV
đang lưu hành tại Việt Nam, so sánh với các chủng chuẩn và các chủng đang lưu
hành trên thế giới và khu vực. Bên cạnh đó, so sánh với các chủng vắc xin đang lưu
hành góp phần khuyến cáo việc sử dụng chủng vắc xin hiệu quả nhằm kiểm soát tốt

dịch bệnh hạn chế tổn thất kinh tế.
Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích trình tự
nucleotit gen mã hóa protein kháng ngun ORF5 của virus gây Hội chứng hô
hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)
từ một số mẫu thu thập ở Việt Nam”.
1.2.

Mục tiêu
 Giải và phân tích trình tự vùng gen cấu trúc mã hóa cho protein kháng

nguyên ORF5 của các mẫu phân lập được.
 Đánh giá, so sánh sự biến đổi di truyền của các chủng phân lập với các
chủng đang lưu hành trong khu vực và trên thế giới.
1.3.

Yêu cầu
 Tách được ARN tổng số của các mẫu phân lập.
 Tổng hợp cDNA và khuếch đại đoạn gen ORF5.
 Giải trình tự đoạn gen ORF5 và phân tích trình tự nucleotit, axít amin suy

diễn.
 Xây đựng cây phả hệ và phân tích được mối quan hệ di truyền dựa trên
trình tự nucleotit của các mẫu phân lập.


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Một vài nét khái quát về hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn

2.1.1. Sự xuất hiện của bệnh
 Trên thế giới
PRRS được mô tả lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 (Keffaber, 1989), sau đó,
đến năm 1990 lan đến châu Âu (Wensvoort et al., 1991) và sau cùng là châu Á. Ban
đầu dựa vào vào các biểu hiện đầu tiên của bệnh và cũng do chưa xác định được căn
bệnh mà PRRS được gọi là “bệnh bí hiểm” sau đó có tên lần lượt như: Hội chứng
hô hấp và sẩy thai ở lợn (SIRS); bệnh sốt cao, biếng ăn, sảy thai ở lợn (HAAT);
bệnh tai xanh (blue ear disease). Năm 1992, tổ chức Thú y thế giới cơng nhận tên
chính thức là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS).
Bệnh xảy ra ở hầu hết quốc gia có chăn ni lợn trên tồn thế giới và có tác
động rất lớn về mặt kinh tế đối với ngành chăn nuôi. Tại Trung Quốc, chủng virus
đang lưu hành chủ yếu là chủng thuộc dòng Bắc Mỹ, chúng được chia thành hai
dạng, gồm chủng cổ điển tiêu biểu là Ch-1a (gây chết, ít lợn mắc bệnh) và chủng
độc lực cao tiêu biểu là JXA1, HUB1 (gây chết, nhiều lợn nhiễm bệnh). Vào năm
2006 một dạng độc tính cao của virus đã ảnh hưởng đến hơn 2 triệu lợn và gây ra
cái chết của ít nhất 400.000 con lợn từ tháng 6 đến tháng 9 trên 6 tỉnh thành của
Trung Quốc ( /> Tại Việt Nam
PRRSV đã xâm nhập vào Việt Nam từ năm 1997 trên đàn giống lợn nhập từ
Mỹ, tuy nhiên từ thời điểm đó đến năm 2006 hầu như vẫn chưa có thơng tin nào về
đại dịch (Tơ Long Thành, 2007). Đến đầu năm 2007, diễn biến của dịch tại Việt
Nam ngày càng trở nên phức tạp.
Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam được bắt đầu từ ngày
12/03/2007, hàng loạt đàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường
và có những triệu chứng lâm sàng tương tự như bệnh sốt cao ở lợn cái xảy ra ở
Trung Quốc trong suốt năm 2006. Ngày 26/03/2007, Trung tâm Chẩn đoán Thú y
Trung ương – Cục Thú y đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dương


tính với PRRSV. Bệnh ngay lập tức lan ra 6 tỉnh thành của vành đai sông Hồng là
Hưng Yên, Quảng Ninh, Hải Phịng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang với hàng

ngàn con lợn bị nhiễm. Vào năm 2007, dịch bệnh đã tác dộng đến khoảng 65.000
con lợn và phải tiêu hủy hơn 15.000 con (Tô Long Thành, 2007). Trong năm 2008 –
2009 dịch bệnh đã bùng phát trở lại ở cả 3 miền với thiệt hại nặng nề (Đậu Ngọc
Hào và cộng sự, 2008) với hơn nửa triệu con lợn nhiễm bệnh và hàng trăm nghìn
con lợn bị chết. Đến thời điểm tháng 6 năm 2012, PRRSV tiếp tục lây lan trên 11
tỉnh thành với 33.778 con lợn nhiễm bệnh và 21.707 con lợn bị tiêu hủy.
2.1.2. Triệu chứng lâm sàng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh trên lợn là thân nhiệt cao, ốm và suy nhược
(Albina et al., 1994), lợn mắc bệnh với biểu hiện run rẩy, co giật, khập khễnh và
phát ban đỏ ở tai, triệu chứng nổi mụn nhọt và xuất huyết da, lợn nái chết do bệnh,
hay sảy thai, chết lưu, lợn con đẻ ra yếu. Ngoài ra, tiến hành kiểm tra những con lợn
bị ảnh hưởng thể hiện các biểu hiện lâm sàng của bệnh sốt cao và run rẩy, nội tạng
của chúng bị tổn thương nghiêm trọng, ví dụ, điểm máu trong thận và xuất huyết
trong phổi, kết quả tương tự như những gì quan sát thấy trong năm 2006 do dịch
PRRS bùng phát ở Trung Quốc.

Hình 2.1 Điểm tụ máu trển phổi và thận của lợn bị nhiễm bệnh


2.1.3. Tác hại của bệnh
Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan
nhanh và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Đặc điểm bệnh là gây sảy thai
ở lợn nái và rối loạn đường hô hấp trên lợn sơ sinh và lợn nhỡ. Trong cơ thể, virus
tấn công vào đại thực bào (đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở phổi), gia tăng và
phá hủy đại thực bào dẫn đến suy giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể, vì
thế, các lợn nhỏ khi bị nhiễm PRRSV sẽ dễ dàng bị chết bởi virus và các tác nhân
gây bệnh khác (Drew, 2000).
 Tác hại của bệnh đối với từng đối tượng
 Lợn nái giai đoạn cạn sữa: Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm virus, lợn
biếng ăn từ 7 – 14 ngày (10% – 15% đàn), sốt 39 – 40oC, sảy thai thường vào giai

đoạn cuối (1% – 6%), tai chuyển màu xanh trong khoảng thời gian ngắn (2%), đẻ
non (10% – 15%), động đực giả (3 – 5 tuần sau khi thụ tinh), đình dục hoặc chậm
động dục trở lại sau khi đẻ, ho và có dấu hiệu của viêm phổi.
 Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn, mất sữa và viêm vú (triệu
chứng điển hình), đẻ sớm khoảng 2 – 3 ngày, da biến màu, thai gỗ (10% – 15% thai
chết trong 3 – 4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con chết ngay sau khi sinh (30%), lợn
con yếu, tai chuyển màu xanh (khoảng dưới 5%) và duy trì trong vài giờ. Pha cấp
tính này kéo dài trong đàn tới 6 tuần, điển hình là đẻ non, tăng tỷ lệ thai chết hoặc
yếu, tăng số thai gỗ, chết lưu trong giai đoạn 3 tuần cuối trước khi sinh.
 Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc
mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ.
 Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt
đường huyết do không bú được, mắt có dử màu nâu, tiêu chảy nhiều, tăng nguy cơ
mắc các bệnh về hơ hấp, chân chỗi ra, đi run rẩy.
 Lợn con cai sữa và lợn nhỡ: Chán ăn, ho nhẹ, lơng xác xơ. Ngồi ra, trong
trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, thể trạng gầy
yếu, da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới
15%.


2.1.4. Đường truyền lây
 Sự lây truyền dọc
Lợn mẹ mang virus có thể lây nhiễm cho bào thai từ giai đoạn giữa thai kỳ
trở đi và virus cũng được nhiễm qua nước bọt và sữa. Cho đến ngày nay, đã có
những chứng cứ chắc chắn rằng virus xuất hiện ở tháng thứ ba trong quá trình
mang thai.
 Sự lây truyền ngang
 Sự truyền lây trực tiếp
Sự truyền lây PRRSV thường xuyên xảy ra thông qua con đường truyền lây
trực tiếp như sự truyền lây thông qua sự tương tác gần giữa các con thú hay thông

qua các dịch bị lây nhiễm. Việc chăn ni theo bầy và tập tính hay tấn công nhau là
một nguyên nhân rất quan trọng dẫn đến sự truyền lây trực tiếp.
 Sự truyền lây gián tiếp
Sự truyền lây gián tiếp là sự truyền lây thông qua một vật mang tác nhân lây
nhiễm. Các vật mang ở đây có thể là kiến, lồi chân đốt và dụng cụ lao động. Sự lây
nhiễm máu trên các công cụ y tế cũng là tác nhân truyền bệnh. Ngoài ra, côn trùng
cũng là một tác nhân lây truyền bệnh rất nguy hiểm.
2.2.

Đặc điểm và cấu trúc của PRRSV

2.2.1. Đặc điểm của virus
Tác nhân gây bệnh là PRRSV thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae và
bộ Nidovirales (Cavanagh, 1997; Conzelmann et al., 1993) có đặc tính thích ứng
cao với đại thực bào, đặc biệt là các đại thực bào phế nang. Bình thường, đại thực
bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với PRRSV,
virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào
(tới 40%). Việc đại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ
thể và làm tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát (Meulenberg et al., 1993).


Đại thực bào bị bệnh

Đại thực bào bình thường

Hình 2.2 Đại thực bào của tế bào bị nhiễm PRRSV và tế bào bình thường
2.2.2. Cấu trúc virus
Virus có vỏ bao với bộ gen là ARN sợi đơn, dương, kích thước hệ gen
khoảng 15 kb chứa đầu 5’, đầu 3’ và 9 khung đọc mở (Meulenberg et al., 1997).

Hình 2.3 Cấu trúc genome PRRSV
Cấu trúc virus bao gồm hai gen mã hóa cho các protein khơng cấu trúc (Nsp –
non-structure protein) và bảy gen mã hóa cho các protein cấu trúc và chức năng.
ORF1a và ORF1b là các gen mã hóa protein khơng cấu trúc, kích thước phân tử
nhỏ, có hoạt tính sao chép và polymerase. Bảy ORF cịn lại có kích thước phân tử
nhỏ hơn, định vị ở đi 3’ của hệ gen, mã hóa các protein cấu trúc bao gồm GP1,
GP2, GP3, GP4, GP5, M và N (Anonymous, 1992; Meulenberg et al., 1993).


Khi phân tích hệ gen PRRSV người ta thấy rằng các khung đọc mở lồng vào
nhau từ 1 – 253 bp. Ví dụ: Khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi
1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp. Như vậy, virus sử dụng một phần
gen chung để mã hóa cho các protein khác nhau (hình 2.3) (Han et al., 2006).
Chức năng của các ORF là: ORF1a và 1b mã hoá protein enzym ARN polymerase
có chức năng xúc tác sao chép và tổng hợp như các ARN polymerase của các virus
ARN khác, ORF2 đến ORF6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus.
Trong đó đã xác định:
 Envelope glycoprotein (E, ORF5) có trọng lượng phân tử từ 24 – 25 kDa
là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen. Các kháng thể trung hoà chủ yếu liên
kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị
trung hồ. Những epitope trung hồ này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hố.
Người ta cũng thấy rằng phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hoà
và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hồ. Mặc dù vậy, những protein này
có tác dụng kích thích miễn dịch và sinh học nhỏ hơn đáng kể so với protein GP5.
 Membrane protein (M, ORF6) có khối lượng phân tử khoảng 18 – 19 kDa,
khơng được glycosyl hố, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng ngun và có
tính bảo tồn cao nhất. Protein M có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein M của
các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối disunfit với
glycoprotein 5 (GP5) cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễm
nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus.

 Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14 – 15
kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao. Protein N chiếm
khoảng 20 – 40% protein của hạt virus.
2.2.3. Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng
Hiện nay, dựa trên việc phân tích cấu trúc gen, người ta đã xác định được 2
nhóm virus:
+ Nhóm 1: Gồm các virus thuộc dịng châu Âu mà đại diện cho nhóm này là
virus ngun thủy dịng châu Âu Lelystad (Wensvoort et al., 1991).


+ Nhóm 2: Gồm những nhóm virus thuộc dịng Bắc Mỹ mà tiêu biểu cho
nhóm này là chủng virus nguyên thủy dòng Bắc Mỹ VR2332 gồm 9 dòng đã được
xác định (Mang Shi et al., 2010).
Dạng PRRSV nguyên thủy được chia làm hai chủng gốc là chủng gốc châu
Âu (virus Lelystad) và Bắc Mỹ (Virus VR2332) (Mardassi et al., 1994; Meulenberg
et al., 1997; Murtaugh et al., 1995; Nelsen et al., 1999). Mặc dù hai kiểu gen này có
sự khác biệt tương đối lớn (khoảng 20% đến 50% ở mức độ nucleotit) (Suarez et al.,
1996) nhưng hội chứng lâm sàng do hai chủng này gây ra tương tự nhau.
Khi so sánh trình tự axít amin của khung đọc mở ORF7, ORF5 ở hai chủng
này cho thấy sự tương đồng lần lượt chỉ vào khoảng 57% – 59% và 51% – 59%.
Khung đọc mở ORF2, 3, 4 và giữa các dòng Bắc Mỹ và châu Âu tương ứng chỉ ở từ
63%, 58% và 68%. Riêng ORF6 mức độ tương đồng cao hơn, khoảng 70% – 81%.
2.2.4. Protein kháng nguyên ORF5
ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thước từ 24,5 đến 26
kDa (Meulenberg et al., 1993). GP5 nằm trên bề mặt màng virus và chính là vị trí
tiếp xúc của PRRSV khi nó nhiễm vào vật chủ. GP5 là một trong những
glycoprotein vỏ phong phú và đa dạng nhất và là một tác nhân gây cảm ứng chính
của kháng thể trung hịa trong cơ thể. Nó bao gồm ba vị trí glycosylation được cho
là N-linked N34, N44, N51 nơi mà vị trí trung hịa virus được đặt tại đó. Plagemann
và cộng sự (2002) đã sử dụng bản đồ peptit để chỉ ra rằng các vị trí trung hịa virus

chính của PRRSV được đặt tại vị trí giữa của GP5 từ axít amin 36 đến 52 GP5 đóng
vai trị quan trọng trong việc bảo vệ chống lại PRRSV.
Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà,
tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do
ngăn cản hiện tượng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế
bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian
tế bào. Ngồi ra, GP5 cịn tham gia hiện tượng “chết theo chương trình” của các tế
bào trong cơ thể bị nhiễm PRRSV (Miller et al., 2009; Suarez et al., 1996). Sự biến
đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm
và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm


giảm hiệu quả phòng bệnh của các vắc xin phòng bệnh đang lưu hành (Ostrowski
et al., 2002).
Với những đặc tính nêu ở trên, GP5 rất được quan tâm nghiên cứu trong việc
phân tích dịch tễ học và tiến hóa phân tử cũng như biến đổi vật liệu di truyền của
chủng virus này. Điển hình là các peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng
xuyên màng và vùng nội bào virus, các điểm trung hòa virus và những đột biến
quan trọng như: 13 (R  Q), 151 (R  G). Đây là những mơ hình có vai trị quan
trọng làm thay đổi yếu tố ảnh hưởng đến độc lực virus. Hai đột biến trên OFR5
được xem là chỉ thị cho độc lực của chủng vắc xin, đó là đột biến R13 thành Q13 và
R151 thành G151. Đột biến Q13 nằm trên trình tự peptide tín hiệu giả định là trình
tự sẽ bị loại bỏ sau dịch mã. Đột biến này có thể ảnh hưởng đến sự vận chuyển GP5
đến màng của mạng lưới nội chất (Allende et al., 2000). Sự thay đổi G151 nằm trên
phần hiếu nước của glycoprotein, đây là một trong những dấu hiệu đột biến liên
quan đến sự suy yếu của PRRSV (Allende et al., 2000).
2.3.

Một số kỹ thuật dùng cho phân tích di truyền

2.3.1. Kỹ thuật tách chiết ARN
Quá trình chiết tách ARN gồm các bước cơ bản tương tự như chiết tách
ADN (bao gồm phá vỡ màng tế bào, loại protein, tủa ARN) sau đó dùng enzym
deoxyribonuclease để phân huỷ ADN. Do ARN kém bền và dể bị phân huỷ bởi
enzym ribonuclease có ở khắp nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt (trên 90ºC), vì vậy,
điều kiện thao tác để chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm
ngặt. Phương pháp chung để tách ARN tổng số được tiến hành như sau: Phân hủy
bằng Trizol (Invitrogen), tách pha được tiến hành bằng việc sử dụng choloroform
lạnh, sau đó sử dụng isopropanol và ethanol 70% để lần lượt tủa và rửa tủa ARN.
Cuối cùng, ARN được hịa tan vào nước khơng chứa enzym deoxyribonuclease và
ribonuclease. Đánh giá chất lượng và ARN bằng điện di trên gel agarose.
2.3.2. Kỹ thuật RT – PCR hai bước tạo cDNA sao chép ngược
RT – PCR (phản ứng chuỗi đồng phân hóa sao chép ngược) là một kỹ thuật
để tổng hợp cDNA sử dụng mRNA làm khuôn mẫu.


ARN được cấu tạo từ bốn loại nucleotit (adenine, guanine, cytosine và
uracil) liên kết với nhau tạo thành một chuỗi đơn. Khi chuỗi nucleotit này được biến
đổi thành ADN thì uracil (U) được thay thế bằng thymine (T). Phản ứng biến đổi
ARN hệ gen thành sợi ADN thứ nhất phải nhờ đến một enzym phiên mã ngược do
vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược, sau đó quá trình tổng hợp sợi ADN
thứ hai lại nhờ một enzym khác là ADN polymerase I (thường dùng đoạn Klenow).
Khi đã có ADN sợi đơi từ khn mẫu ARN thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại
gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ.
Toàn bộ phản ứng khuếch đại một đoạn ADN từ khuôn mẫu ARN trải qua hai giai
đoạn nói trên được gọi là RT – PCR.
Do trong tự nhiên một số virus có hệ gen là ARN nên muốn khuếch đại một
đoạn gen của nó thì người ta phải dùng kỹ thuật RT – PCR. Một số nghiên cứu khác
về mARN cũng cần đến RT – PCR để biến đổi sợi ARN thành ADN cho quá trình
tạo dịng để phân tích trình tự gen hay tái tổ hợp trong nghiên cứu biểu hiện gen.

Trong đó hai bước của kỹ thuật này bao gồm:
 Bước một: Tổng hợp cDNA từ khuôn ARN
Phiên mã ngược khuôn mẫu ARN thành sợi ADN thứ nhất, sau đó dùng sợi
này làm khn mẫu để tổng hợp sợi ADN thứ hai.
 Bước hai: PCR sản phẩm cDNA vừa tổng hợp
Dùng ADN sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR.
Các thành phần cần thiết cho phản ứng nhân PCR:
 ADN mẫu (template) chứa mảnh ADN cần khuếch đại có thể dài từ 100
đến ~35.000 bp.
 Cặp mồi (primer) tổng hợp (~20 nucleotit mỗi mồi) bổ sung với các vùng
trên các sợi đối nhau, các vùng này nằm ở hai đầu của trình tự ADN đích để xác
định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
 Enzym ADN polymerase bền nhiệt, có thể chịu được nhiêt độ từ 95 oC trở
lên, xúc tác cho việc nhân lên của ADN.
 4 deoxyribonucleotide làm nguyên liệu cho phản ứng PCR.