xác định tình trạng bội nhiễm streptococcus suis trên heo nhiễm virus gây hội chứng hô hấp và sinh sản

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ





BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

XÁC ĐỊNH TÌNH TRẠNG BỘI NHIỄM
STREPTOCOCCUS SUIS TRÊN HEO NHIỄM VI-RÚT
GÂY HỘI CHỨNG HÔ HẤP VÀ SINH SẢN


CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI




TS. NGÔ THỊ HOA ThS. PHẠM PHONG VŨ


CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG _3_/ 2013

1
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Streptococcus suis serotype 2 (Streptococcus suis serotype 2 – SS2) là tác nhân gây
bệnh phổ biến trên ngƣời bệnh viêm màng não mủ (VMNM) tại Việt Nam. Heo là
ký chủ tự nhiên của vi khuẩn này và là nguồn lây nhiễm trực tiếp cho ngƣời thông
qua tiếp xúc và tiêu thụ sản phẩm thịt heo nhiễm khuẩn. Kể từ năm 2007, Việt
Nam trở thành nƣớc trong vùng dịch của bệnh tai xanh do vi-rút gây hội chứng rối
loạn rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS). Đồng nhiễm của vi-rút này và S. suis là
nguyên nhân gây bệnh nặng cho heo trong mùa dịch PRRS. Do vậy khảo sát bội
nhiễm S. suis trên heo nhiễm PRRS là cần thiết, để hiểu hơn nguy cơ nhiễm S. suis
cho ngƣời và lây lan cho heo trong đàn trong các đợt dịch tai xanh. Chúng tôi đã
khảo sát sự hiện diện của S. suis trong máu của heo bệnh tai xanh và heo không có
biểu hiện lâm sàng của bệnh.
Chúng tôi đã thu nhận 563 mẫu máu và 14 bộ mẫu mô của 573 heo thuộc 107 hộ
chăn nuôi. Mẫu máu đại diện của từng hộ chăn nuôi đƣợc ly trích RNA và tiến
hành phản ứng reverse transcriptase real time PCR (RT-rtPCR) khuếch đại gen
nsp2 nhằm khẳng định heo nhiễm vi-rút PRRS. Các mẫu máu không đông và mẫu
mô đƣợc tiến hành nuôi cấy tìm tác nhân vi khuẩn. Các mẫu vi sinh đã phân lập
đƣợc tiến hành định danh và thực hiện kháng sinh đồ. Phản ứng real time PCR
khuếch đại gen cps2J và PCR khuếch đại 16SrDNA đƣợc tiến hành nhằm xác định
heo nhiễm S. suis serotype 2 hay S. suis. Đồng thời, độ nhạy của các phản ứng
đƣợc sử dụng ở trên cũng đƣợc xác định nhằm tìm ngƣỡng phát hiện.
Tổng cộng 493 heo bệnh có biểu hiện lâm sàng điển hình của PRRS thuộc 91 hộ
đƣợc xác định nhiễm vi-rút PRRS. Kết quả nuôi cấy vi sinh xác định 17 (3,9 %)
heo bệnh tai xanh bị nhiễm vi khuẩn với 9 (2,1%) heo bị nhiễm với SS2 trong máu

và/ hoặc các cơ quan khác nhau. Phản ứng khuếch đại cps2J của SS2 từ mẫu máu
của 487 heo xác định đƣợc 26 (5,3%) heo thuộc 21 (23%) hộ nhiễm SS2. Kết quả

2
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
khuếch đại 16SrDNA của S. suis giúp xác định thêm 34 (7%) heo thuộc 24 (26,4%)
hộ nhiễm S. suis khác serotype 2. Tổng cộng có 60 (12.3%) heo nhiễm S. suis đƣợc
xác định. Kết quả kiểm tra mẫu máu của từng heo của 52 heo đối chứng (heo
không biểu hiện bệnh) cho thấy tất cả heo không nhiễm vi-rút PRRS. Chỉ một heo
cho kết quả cấy máu dƣơng tính với S. suis khác SS2 và không có heo nhiễm SS2.
Độ nhạy với độ lập lại 100% của phản ứng nsp2/RT-rtPCR (PRRS) đƣợc xác định
là 25 bản sao của gen ; của phản ứng cps2J/rtPCR là 5 tế bào SS2 và của
16SrDNA/PCR là 25 tế bào S. suis.
Kết quả nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng cụ thể về sự đồng nhiễm của SS2
trong heo nhiễm PRRSV, với sự khác biệt thống kê (p<0.05), so với heo không có
triệu chứng lâm sàng. Điều này cho thấy nguy cơ nhiễm SS2 cho ngƣời tiếp xúc
trực tiếp với heo bệnh tai xanh (nhƣ ngƣời nuôi, chăm sóc heo bệnh, ngƣời tham
gia tiêu hủy hay ngƣời giết mổ) và tiêu thụ sản phẩm chƣa chín của heo bệnh tai
xanh nhiễm SS2. Ngoài ra kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, tỉ lệ nhiễm S. suis
trong đàn heo bệnh cũng cao hơn đàn heo khỏe. Nhƣ vậy S. suis có thể lây lan
nhanh trong đàn heo bệnh dẫn đến tình trạng bệnh nặng và diễn biến phức tạp của
dịch bệnh tai xanh. Vì vậy, việc trang bị và nhất thiết sử dụng các biện pháp và
dụng cụ bảo hộ lao động trong công việc chăm sóc, giết mổ, tiêu hủy heo bệnh tai
xanh là rất cần thiết và cần đƣợc thực hiện nghiêm ngặt để giảm thiểu tối đa nguy
cơ nhiễm S. suis cho ngƣời.


3
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Streptococcus suis serotype 2 (SS2) is one of the main cause of bacterial
mennigitis in adult patients in Vietnam. Pig is the natural host of this pathogen
and/or the source of transmission to human via direct contact and consumption of
contaminated pork product. Since 2007, Vietnam has become an endemic country
for blue ear disease with causative agent is Porcine Reproductive and Respiratory
Syndromes virus (PRRSV) (co called blue ear disease). Co- infection of PRRSV
and Streptococcus suis was shown to cause complication and increase of severity
in blue ear outbreak. Therefore investigating the co-infection of S. suis in PRRS
pigs should be carried out to understand risk of S. suis infection in human and
transmission among sick and healthy pigs in pens/ herds during PRRS ourbreaks.
We investigated the presence of S. suis in clinical sick pigs infected with PRRSV
and in clinical healthy pigs.
We collected 563 blood samples và 14 sets of tissue samples of 573 pigs reared in
107 backyard farms or farms. RNA of representative blood samples of 107 farms
were extracted to use in RT-rtPCR, which amplify nsp2 gene of PRRSV, to
confirm the infection of PRRSV in those farms. The unclotted blood samples and
tissue samples were cultured to isolate bacteria pathogen. Susceptibility tests of all
isolates were identified using disk diffusion tests. PCR to amplify cps2J and/
16SrDNA gen were performed to confirm the infection of S. suis serotype 2 or S.
suis in these blood samples. The threshold of detection of these above reactions
were also identified.
In total, 493 sick pigs with typical PRRS from the 91 family holders, which were
confirmed to infect with PRRSV, were included in this study. The samples of these
493 sick pigs were 487 unclotted blood samples and 13 tissue samples. The latter
included tissue samples of 6 sudden dead pigs (with no blood samples collected).

4
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Bacterial culture results showed that 17 (3.9%) pigs were bacterial coinfected,
amongst those 9 (2.1%) pigs were coinfected with SS2 in blood or/ and tissue.

samples Specific DNA amplification methods for SS2 using 487 unclotted blood
samples of sick pigs confirmed that 26 (5.3%) pigs from 21 (23%) family holders
were coinfected with SS2. Amplication of 16SrDNA from blood samples of sick
pigs confirmed another 34 (7%) PRRS sick pigs originated from 24 (26.4%) farms
were co infected with non- serotype 2 S.suis. Oveall, 60 (12.3%) PRRS sick pigs
co-infected with S. suis were confirmed. RT-rtPCR reactions with individual 52
blood samples collected from clinical healthy pigs were all negativ with PRRS.
Only one pig was positive with S. suis non serotype 2 by culture. The threshold of
detections of the above test were 100% reproducible at 25 bản sao for nsp2/ RT-
rtPCR and 5 S. suis serotype 2 cells for cps2J/rtPCR and 25 S. suis cells for
16SrDNA PCR.
The result of this research provided the evidence of the co-infection of S. suis in
PRRS pigs, with significant difference (p<0.05) in comparison to asymptomatic
pigs. This indicated a potential risk of SS2 infection for direct contact or exposure
personnels, who take care, treat, directly involve in culling, slaughter sick pigs and
consume undercook pork dishes. Therefore encouraging a habit of frequent usage
of personal protective equipment should be enforced to prevent or minimize the
risk of human infection.


5
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013

BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài:
Xác định tình trạng bội nhiễm Streptococcus suis trên heo nhiễm vi-rút gây hội
chứng hô hấp và sinh sản

Chủ nhiệm đề tài: TS. Ngô Thị Hoa

ThS. BSTY. Phạm Phong Vũ
Cơ quan chủ trì: Văn phòng đại diện Tổ chức Centre for Tropical Medicine -
Oxford University Clinical Research Unit – Vietnam
Thời gian thực hiện đề tài: 12/2010- 12/2012
Kinh phí được duyệt: 550.000.000 Đồng
Kinh phí đã cấp: 500.000.000 Đồng, theo TB số: 226/HĐ-SKHCN
ngày 2/12/2010
Mục tiêu:
Xác định tỉ lệ bội nhiễm Streptococcus suis serotype 2 (Streptococcus suis serotype
2 – SS2) trong mẫu bệnh phẩm của heo nhiễm vi-rút PRRS nhằm đƣa ra khuyến
cáo về nguy cơ nhiễm bệnh cho ngƣời
Nội dung:
1. Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu bệnh phẩm được thu nhận
từ heo bằng qui trình revervse transcriptase real time PCR (RT-rtPCR )
đang được sử dụng tại Cơ quan thú y vùng 6. Đồng thời xác định ngưỡng
phát hiện của phương pháp.
2. Xác định vi khuẩn bội nhiễm bằng phương pháp cấy phân lập, thực hiện
kháng sinh đồ cho các chủng S. suis.
3. Khảo sát sự hiện diện của SS2 trong máu heo bệnh tai xanh bằng qui trình

6
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
real time PCR (rtPCR).
4. Ứng dụng qui trình PCR phát hiện sự hiện diện của liên cầu khuẩn heo
trong máu heo bệnh hay không bệnh tai xanh.

Những nội dung thực hiện ở giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký):
Công việc dự kiến

Công việc
đã thực hiện
ST
T
Các nội dung, công việc
chủ yếu cần được thực hiện
(các mốc đánh giá chủ yếu)
Kết quả phải
đạt
Kết quả trên mẫu heo bệnh (bốn nội dung đăng ký)
1. Nội dung 1:
Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ heo
bằng qui trình revervse transcriptase real time PCR (RT-rtPCR ) đang được sử dụng
tại Cơ quan thú y vùng 6. Đồng thời xác định ngưỡng phát hiện của phương pháp.
1.1
Nhận mẫu máu và mẫu mô của
heo bệnh tai xanh xác định dựa
trên lâm sàng tại cơ sở chăn
nuôi.

- Thu nhận mẫu
máu: trung bình
5 mẫu/ hộ chăn
nuôi và thu
nhận mẫu trên
100 hộ.
Hoàn tất:
- Đã thu nhận mẫu từ 573 heo
bệnh thuộc 107 hộ chăn nuôi.
Bao gồm 563 mẫu máu và 14 bộ

mẫu mô.
1.2
Từ qui trình thƣờng đƣợc dùng
với mẫu huyết thanh và không
có hiện diện của mẫu chứng
nội, tiến hành ứng dụng phản
ứng RT-rtPCR khuếch đại
RNA của vi-rút gây PRRS
trong mẫu huyết tƣơng.
Qui trình phản
ứng RT-rtPCR ,
có hiện diện của
chứng nội, trong
mẫu huyết
tƣơng
Hoàn tất:
qui trình đính kèm.

7
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
1.3
Tách chiết RNA (một mẫu
chọn ngẫu nhiên/ hộ chăn nuôi)
và thực hiện qui trình RT-
rtPCR trên các mẫu máu heo
thu nhận để xác định cơ sở
chăn nuôi heo có nhiễm
PRRSV.
Xác định heo
bệnh của cơ sở

chăn nuôi đã lấy
mẫu có nhiễm
PRRSV.
Hoàn tất:
Tiến hành phản ứng với 107 mẫu
máu thu nhận ngẫu nhiên từ 107
hộ đã thu nhận mẫu.
91 hộ chăn nuôi, với 493 heo
đƣợc thu mẫu, đƣợc xác định
nhiễm PRRSV. Mẫu bao gồm
487 mẫu máu và 13 bộ mẫu mô
1.4
Nuôi cấy phân lập vi-rút gây
bệnh tai xanh nhằm sử dụng
chủng vi-rút trong phản ứng
tạo plaque.
Chủng vi-rút
Hoàn tất:
Chủng vi-rút đƣợc lƣu giữ tại Cơ
quan thú y Vùng 6
1.5
Thực hiện tạo dòng và tiến
hành Real Time PCR
Xác định
ngƣỡng phát
hiện của phƣơng
pháp -rtPCR
khuếch đại gen
nsp2 của
PRRSV

Hoàn tất:
Ngƣỡng phát hiện là 25 bản sao
của gen nsp2/ phản ứng
2. Nội dung 2:
Xác định vi khuẩn bội nhiễm bằng phương pháp cấy phân lập, thực hiện kháng sinh
đồ cho các chủng S. suis.
2.1
Cấy phân lập vi sinh, định
danh vi sinh,
Thực hiện với các mẫu máu
hoàn toàn không đông.
Danh sách các
chủng vi sinh
phân lập đƣợc từ
mẫu máu và mô.

Hoàn tất:
- Đã thực hiện nuôi cấy với 435
mẫu máu không đông thu nhận từ
heo bệnh thuộc 91 hộ chăn nuôi
đã đƣợc xác định nhiễm PRRSV.
-phân lập đƣợc 17 chủng vi sinh.

8
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
2.2
Tiến hành thực hiện kháng sinh
đồ của các chủng vi sinh phân
lập đƣợc.
Kháng sinh đồ

của các chủng vi
sinh đó
Danh sách 17 chủng vi sinh với
kháng sinh đồ của từng chủng.
3. Nội dung 3:
Khảo sát sự hiện diện của SS2 trong máu heo bệnh tai xanh bằng qui trình real time
PCR (rtPCR).
3.1
Từ qui trình đã đƣợc dùng với
mẫu dịch não tủy của ngƣời,
ứng dụng qui trình phản ứng
rtPCR khuếch đại DNA của
SS2 hiện diện trong mẫu máu
heo.
Qui trình rtPCR
có chứng nội sử
dụng với mẫu
máu
Hoàn tất:
qui trình đính kèm.
Với ngƣỡng phát hiện là 5 tế bào
SS2/ phản ứng.
3.2
Tách chiết DNA và thực hiện
phản ứng rtPCR khuếch đại
DNA của SS2 trong tất cả 487
mẫu máu của heo nhiễm
PRRSV.
Tỉ lệ heo bệnh
tai xanh nhiễm

SS2
Hoàn tất:
- Thực hiện xong 487 mẫu máu
- Tỉ lệ dƣơng tính đƣợc xác định
là: 26 heo (5,3%)
4. Nội dung 4:
Ứng dụng qui trình PCR phát hiện sự hiện diện của liên cầu khuẩn heo trong máu
heo bệnh tai xanh.
4.1
Khảo sát độ đặc hiệu và độ
nhạy của phản ứng
Xác định tính
đặc hiệu của
mồi.
Xác định
ngƣỡng phát
hiện của phản
ứng

Hoàn tất:
qui trình đính kèm.
- Primers đặc hiệu với S. suis
- Ngƣỡng phát hiện của phản ứng
là 25 tế bào S. suis.

9
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
4.2
Ứng dụng phản ứng PCR
khuếch đại 16SrDNA của SS

trong mẫu máu.
Tỉ lệ nhiễm SS
của heo bệnh tai
xanh
Hoàn tất:
Tỉ lệ heo bệnh tai xanh nhiễm S.
suis là 60 (12,3%)
Kết quả trên mẫu heo không biễu hiện bệnh tai xanh
5. Mẫu đối chứng:
Khảo sát trên mẫu máu thu nhận từ heo không có triệu chứng lâm sàng của bệnh tai
xanh:
5.1
Thu nhận mẫu máu heo không
có biểu hiện lâm sàng của bệnh
tai xanh.
Mẫu máu heo có
biểu hiện lâm
sàng khỏe,
Cấy phân lập vi
sinh
Hoàn tất:
Thu nhận mẫu máu của 52 heo
không có biểu hiện của bệnh tai
xanh.
1/52 (1,9%) heo khỏe dƣơng tính
với SS không phải serotype 2
5.2
Thực hiện
a. RT-rtPCR khuếch đại
RNA của PRRSV trên tất cả

các mẫu huyết tƣơng của 52
heo
b. rtPCR khuếch đại DNA của
SS2.
c. PCR khuếch đại 16SrDNA
của SS

Xác định heo
không nhiễm
PRRSV

Tỉ lệ heo khoẻ
nhiễm SS2
Tỉ lệ heo khoẻ
nhiễm SS
Hoàn tất:
- Tất cả mẫu máu không nhiễm
PRRS (0%)
-0% heo khỏe nhiễm SS2
-0% heo khỏe nhiễm SS (PCR)

6. Kết quả khác
6.1
Đào tạo
1 Thạc sĩ Sinh
học

Đã tốt nghiệp
1 Thạc sĩ Sinh học
3 Cử nhân (Đại học quốc tế, Đại

học khoa học tự nhiên, Đại học
Văn Lang)

10
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
6.2
Viết bài báo khoa học
- 2 bài báo khoa
học


1. Đã xuất bản: 2 bài
1 Tạp chí CNSH (ISSN1811-
4989), volume 9, 4B, 2011
1 bài trên tạp chí Emerging
Infectious Diseases, CDC USA
(ISSN1080-6059)
2. Đã nộp lại sau khi chình sửa
theo nhận xét của phản biện:1 bài
nộp cho tạp chí CNSH
7. Nghiệm thu đề tài
7.1
Báo cáo nghiệm thu cấp cơ sở.
Đạt chất lƣợng
12/2012
7.2
Báo cáo nghiệm thu cấp Thành
phố.
Đạt chất lƣợng
1/2013

11
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Mục lục


TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1
SUMMARY OF RESEARCH CONTENT 3
I. Tổng quan 20
I.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo 20
I.2 Khác biệt di truyền giữa các chủng vi-rút PRRS 20
I.3 Nhiễm trùng Streptocccus suis trên heo 23
I.4 Nhiễm trùng SS2 trên ngƣời, tác nhân gây bệnh lây nhiễm từ heo 24
I.5 Bội nhiễm của Streptococcus suis trên heo nhiễm vi-rút gây hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trong nghiên cứu 25
I.6 Điều trị heo nhiễm PRRSV bị bội nhiễm S. suis 27
I.7 Các gen mục tiêu đặc hiệu của S. suis dùng trong phản ứng khuếch
đại 27
I.8 Nghiên cứu trong nƣớc 28
II. Thiết kế và nội dung nghiên cứu 32
II.1 Thiết kế nghiên cứu 32
II.2 Nội dung nghiên cứu 34
II.2.1 Nội dung 1: Xác định heo bệnh nhiễm vi-rút gây hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp (heo bệnh PRRS) và ngƣỡng phát hiện
của phản ứng RT-rtPCR 34
II.2.2 Nội dung 2: Xác định tác nhân bội nhiễm vi khuẩn trên heo
nhiễm vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 46
II.2.3 Nội dung 3: Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn liên

cầu khuẩn heo tuýp huyết thanh 2 49

12
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
II.2.4 Nội dung 4: Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn liên
cầu khuẩn heo 50
III. Kết quả và thảo luận 53
III.1 Nội dung 1: Xác định sự hiện diện của vi-rút PRRS trong mẫu máu
heo bệnh và nguỡng phát hiện của phƣơng pháp 53
III.1.1 Thu nhận mẫu máu heo tại hai tỉnh Tiền Giang và Sóc Trăng 53
III.1.2 Xác định heo nhiễm hay không nhiễm vi-rút gây hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp 55
III.1.3 Phân lập vi-rút 58
III.1.4 Xác định ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp phát hiện PRRSV 59
III.2 Nội dung 2: Xác định tác nhân bội nhiễm vi khuẩn trên heo nhiễm
vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 68
III.3 Nội dung 3: Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn SS2 74
III.4 Xác định tỉ lệ heo bệnh PRRS nhiễm vi khuẩn S. suis 78
III.4.1 Tính đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen 16SrDNA của S. suis 78
III.4.2 Ngƣỡng phát hiện của phản ứng khuếch đại 16SrDNA phát hiện
S. suis 80
III.4.3 Tỉ lệ nhiễm S. suis trong máu heo nhiễm vi-rút gây hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp 81
III.5 Nhiễm S. suis trong heo khỏe 82
III.6 Thảo luận chung 83
IV. Kết luận và đề nghị 89
V. Tài liệu tham khảo 93
VI. Phụ lục 99
VI.1 Phụ lục 1A: Tổng hợp cDNA 100

13
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
VI.2 Phụ lục 1B: Qui trình rtPCR phát hiện PRRSV trong mẫu huyết
tƣơng của heo 103
VI.3 Phụ lục 2: Qui trình rtPCR phát hiện SS2 trong mẫu máu toàn phần
của heo 107
VI.4 Phụ lục 3: Qui trình PCR phát hiện S. suis trong mẫu máu toàn phần
của heo 111
VI.5 Phụ lục 4: thông tin của 117 hộ nuôi heo thu nhận mẫu (bao gồm 107
hộ heo bệnh và 10 hộ heo khỏe) 114



14
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013

Danh sách hình

Hình I-1: So sánh trình tự ORF5 của chủng PRRSV phân lập 22
Hình I-2: Mất đoạn trên protein nsp2 22
Hình II-1: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 34
Hình II-2: Sơ đồ thực hiện plaque assay 40
Hình II-3: Sơ đồ cấy phân lập và định danh vi khuẩn bội nhiễm trên heo bệnh tai
xanh 47
Hình II-4: Hình minh họa thực hiện kháng sinh đồ của S. suis sử dụng E test hay
đĩa khuếch tán. 48
Hình III-1: Sơ đồ tóm tắt thu nhận và phân tích mẫu máu heo bệnh 54
Hình III-2. Tế bào MARC 145 trên đĩa đối chứng (A) và đĩa có ủ với dịch mô của
heo bệnh đƣợc xác định nhiễm PRRSV (B) . 58
Hình III-3: Tế bào Marc-145 đƣợc chụp từ kính hiển vi ngƣợc. 59

Hình III-4: Khả năng tạo plaque của vi-rút PRRS gần nhƣ không thể quan sát
đƣợc. 60
Hình III-5: Kết quả khuếch đại đoạn gen nsp2 (hình trái) và EAV (hình phải) từ
genome của vi-rút PRRS và EAV. 61
Hình III-6: Kết quả biến nạp vào tế bào DH5 α. 62
Hình III-7: Sản phẩm khuếch đại của các đoạn chèn nsp2 và gen của EAV. 63
Hình III-8: Trình tự đoạn chèn gen nsp2 trong plasmid tái tổ hợp với gen nsp2 của
PRRSV kiểu gen Trung Quốc. 64
Hình III-9: Sản phẩm khuếch đại của các gen nsp2 và của EAV với các primer đặc
hiệu. 65
Hình III-10: Đƣờng cong khuếch đại của phản ứng real time với plasmid mang gen
EAV với các nồng độ khác nhau. 66

15
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Hình III-11: Sản phẩm khuếch đại gen 16SrDNA của các chủng S. suis thuộc các
serotype khác nhau. 79
Hình III-12: Sản phẩm khuếch đại gen 16SrNDA đặc hiệu cho Streptococcus suis
từ các mẫu DNA của vi khuẩn Gram dƣơng và âm không có chứa (A) và có chứa
DNA của S. suis (B). 79
Hình III-13. Sản phẩm khuếch đại PCR (318 bp) cuả gen 16S rDNA của S. suis với
DNA ly trích từ dịch nuôi cấy (A) hoặc từ mẫu máu (B). 81


16
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Danh sách bảng

Bảng I-1: So sánh độ tƣơng đồng amino axit giữa chủng Bắc Mỹ (VR-2332) và
chủng Châu Âu (Lelystad) [8] 21

Bảng II-1: Các môi truờng sử dụng cho thí nghiệm tạo plaque của vi-rút PRRS 41
Bảng II-2: Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng phiên mã ngƣợc khuếch đại
RNA của vi-rút PRRS 44
Bảng II-3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của vi-rút PRRS trong
qui trình tạo dòng 45
Bảng III-1: Phân bố của các mẫu lâm sàng thu nhận từ heo bệnh 54
Bảng III-2: Kiểm tra ảnh hƣởng của RNA của vi-rút Equine arteritis đến phản ứng
khuếch đại cDNA của PRRSV 55
Bảng III-3: Tổng số hộ và mẫu thuộc hộ đƣợc xác định nhiễm vi-rút gây hội chứng
rối loạn sinh sản và hô hấp, và phân bố của chúng 57
Bảng III-4: Giá trị ngƣỡng trung bình của phản ứng với nồng độ khác nhau của
plasmid mang gen của EAV 65
Bảng III-5: Tỉ lệ dƣơng tính trong các phản ứng xác định giới hạn phát hiện của
phƣơng pháp rtPCR phát hiện PRRSV 67
Bảng III-6: Số liệu giá trị ngƣỡng của phản ứng RT-rtPCR phát hiện PRRSV nhằm
xác định giới hạn phát hiện của phản ứng. 67
Bảng III-7: Tổng số mẫu đƣợc thực hiện nuôi cấy và kết quả phân lập vi sinh và S.
suis 68
Bảng III-8: Vi khuẩn phân lập từ mẫu máu và mô của heo bệnh tai do nhiễm vi-rút
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 71
Bảng III-9: Kháng sinh đồ của các chủng SS2 72
Bảng III-10: Kháng sinh đồ của các chủng E. coli 72
Bảng III-11: Kháng sinh đồ của chủng Enterococcus faecalis 73

17
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Bảng III-12: So sánh kết quả giá trị Ct của phản ứng khuếch đại cps2J từ mẫu dịch
nuôi cấy và mẫu máu 75
Bảng III-13: Kết quả so sánh giá trị Ct của các cặp phản ứng rtPCR khuếch đại gen
cps2J của SS2, có và không có chứng nội 76

Bảng III-14: Ngƣỡng phát hiện của phản ứng rtPCR khuếch đại gen cps2J với
DNA phân lập từ mẫu máu 76
Bảng III-15: Kết quả khảo sát sự hiện diện của SS2 trong mẫu máu của heo nhiễm
vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 78
Bảng III-16: Kết quả khuếch đại đoạn DNA của gen 16S của Streptococcus suis
nhằm xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng 80
Bảng III-17: Tỉ lệ nhiễm Streptococcus suis trong heo nhiễm vi-rút gây hội chứng
rối loạn sinh sản và hô hấp theo kết quả khuếch đại DNA 82


18
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Danh mục chữ viết tắt

BVBNĐ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
cDNA copied deoxyribo nucelic acid
cps2 capsular polysaccharide serotype 2
Ct Chu trình ngƣỡng
EAV Equine arteritis vi-rút
Epf Extra cellular factor (gen)
HP-PRRS High pathogenic- PRRS
Gdh Glutamate dehydrogenase (gen)
Nsp2 Non-structure protein 2
PCR Polymerase Chain Reaction
PHFS Porcine High Fever Syndrome
phHV Phocine Herpes Vi-rút
PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Pocine reproductive
and respiratory syndrome)
PRRSV Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Pocine
reproductive and respiratory syndrome virus)

rt Real time
rtPCR Real time PCR
RNA Ribonucleic acid
RT-rtPCR Reverse transcriptase real time PCR
Streptococcus suis Liên cầu khuẩn heo
SS Streptococcus suis
SS2 Streptococcus suis serotype 2
SS7 Streptococcus suis serotype 7
VMNM Viêm màng não mủ

19



TỔNG QUAN


TỔNG QUAN
20
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
I. Tổng quan
I.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo, (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome, PRRS) còn đƣợc gọi là bệnh tai xanh, là bệnh truyền nhiễm
cấp tính nguy hiểm ở heo mọi lứa tuổi, bệnh lây lan nhanh. Bệnh do vi-rút PRRS
đƣợc chẩn đoán lần đầu tại Mỹ năm 1987 [1], sau đó đƣợc phát hiện tại Châu Âu
và nhanh chóng lan rộng ra nhiểu nƣớc trên thế giới bao gồm cả Việt nam [2].
Hiện nay, tác nhân gây bệnh này đã hiện diện trên heo của hầu hết các nƣớc trên
thế giới [3]. Dịch heo tai xanh do vi-rút PRRS đã và đang là nguyên nhân dẫn đến
thiệt hại kinh tế và ảnh hƣởng đến an sinh xã hội cho ngƣời chăn nuôi heo trên thế

giới [4]. Biểu hiện bệnh thƣờng thấy là suy hô hấp trên heo con mới sinh và sẩy
thai trên heo nái mang thai, cho nên tác nhân gây bệnh này đƣợc đặt tên theo triệu
chứng lâm sàng [1]. Nguyên nhân gây ra bệnh tai xanh là do vi-rút thuộc họ
Arteriviridae trong bộ Nidovirales có cấu tạo di truyền là RNA mạch đơn xoắn
thuận. Hiện nay, dựa trên việc phân tích cấu trúc gen, ngƣời ta đã xác định đƣợc 2
nhóm chủng, nhóm tuýp I là các chủng có nguồn gốc Châu Âu, nhóm tuýp II là các
chủng có nguồn gốc Bắc Mỹ, các chủng Trung Quốc cũng thuộc nhóm này.
Nghiên cứu di truyền cho thấy có sự khác biệt khá lớn về tính sinh miễn dịch, độc
lực và đa dạng về trình tự giữa 2 nhóm chủng [5]. Ngoài ra, những nghiên cứu gần
đây cho thấy, vi-rút PRRS tồn tại dƣới hai dạng, dạng cổ điển có độc lực thấp và
dạng biến thể có độc lực cao, dạng biến thể gây nhiễm và gây chết nhiều heo. Vi-
rút gây bệnh tai xanh ở Trung Quốc từ năm 2006 đến nay thuộc trong nhóm biến
thể này [6].
I.2 Khác biệt di truyền giữa các chủng vi-rút PRRS
Vi-rút PRRS có 2 chủng nguyên mẫu (Prototype), chủng Bắc Mỹ và chủng
châu Âu với sự khác biệt di truyền khoảng 40% [7].
TỔNG QUAN
21
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Bảng I-1: So sánh độ tƣơng đồng amino axit giữa chủng Bắc Mỹ (VR-2332) và
chủng Châu Âu (Lelystad) [8]


Mã đọc mở (open reading frame)
Tính đồng nhất (%)
1a
32-62
1b
66-75
2

62
3
60
4
66
5
58
6
79
7
60

Tại Trung Quốc, năm 2006, dịch PRRSV đã làm hàng triệu heo bị ốm, chết và
phải tiêu hủy. Bệnh có đặc điểm sốt cao 41
o
C, tỉ lệ heo ốm cao (50-100%), và tỉ lệ
tử vong cao (20-100%) cho heo ở mọi lứa tuổi. Kết quả nghiên cứu của Trung
Quốc đã cho thấy chủng vi-rút PRRS gây bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao
HP-PRRSV (highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome vi-
rút) [7]. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục thú y, dựa trên phân tích trình tự
nucleotide của ORF5, cho thấy mối tƣơng quan cao giữa những chủng vi-rút PRRS
kiểu gen Trung Quốc và của Việt Nam, phân lập từ các ổ dịch bệnh trong các tỉnh
vào các năm 2007-2010 [9, 10].
TỔNG QUAN
22
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013

Hình I-1: So sánh trình tự ORF5 của chủng PRRSV phân lập
Theo [9, 10]

Hình I-2: Mất đoạn trên protein nsp2
Theo [9, 10]
TỔNG QUAN
23
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
Chủng độc lực cao HP-PRRSV ở Trung Quốc là biến thể của dòng Bắc Mỹ với
đặc điểm là gen nsp2 bị mất một đoạn DNA có tổng chiều dài là 90 Nucleotide, cụ
thể là mất 1 axit amin tại vị trí 482 và 29 axit amin tại vị trí 533-561 trên protein
nsp2 [9, 10]. Thêm vào đó, độ tƣơng đồng của protein nsp2 giữa chủng Châu Âu
và Bắc Mỹ thấp (32%) [8]. Do vậy gen nsp2 mất đoạn trở thành gen đích đặc hiệu
trong phản ứng RT-rtPCR xác định chủng Trung Quốc [11]. Qui trình này đƣợc
ứng dụng trong chẩn đoán nhiễm vi-rút PRRS trong mẫu huyết thanh tại Cơ Quan
Thú Y vùng 6.

I.3 Nhiễm trùng Streptocccus suis trên heo
Liên cầu khuẩn heo, Streptococcus suis (SS), là vi khuẩn Gram (+) bao gồm 35
serotype đƣợc xác định dựa vào sự hiện diện của kháng nguyên polysaccharide vỏ
nang. Liên cầu khuẩn heo là tác nhân gây bệnh quan trọng cho heo và là một trong
những nguyên nhân dẫn đến những tổn thất lớn trong ngành công nghiệp chăn nuôi
heo do khả năng gây bệnh và có thể gây thành dịch. Các triệu chứng thƣờng gặp
trên heo do liên cầu khuẩn heo gây ra gồm viêm phổi, viêm nội tâm mạc, viêm
màng não, xảy thai và chết đột ngột Các serotype gây bệnh cho heo thƣờng gặp
là serotype 1, 1/2, 2, 7, 9, 14 [12, 13]. Heo đƣợc biết là ký chủ tự nhiên của vi
khuẩn này, chúng thƣờng sống trong các cơ quan hô hấp nhƣ hạch amidan và các
cơ quan sinh sản nhƣ tử cung của heo cái. Tỉ lệ mang trùng liên cầu khuẩn heo trên
amidan heo thay đổi tùy theo tuổi heo, theo đàn/bầy và có thể lên đến 100%. Nguy
cơ xảy ra bệnh trong đàn thay đổi, nhƣng thƣờng khoảng 1-5%; tuy nhiên nếu
không điều trị thích hợp, dịch có thể xảy ra với 20% heo trong đàn [13]. Heo trong
cùng đàn có thể lây truyền liên cầu khuẩn heo thông qua tiếp xúc trực tiếp, qua
không khí hoặc lây nhiễm từ mẹ sang con ngay sau sinh [14, 15]. Hiện nay chƣa có

TỔNG QUAN
24
NTH-PPV:SS-PRRS: BÁO CÁO NGHIỆM THU 1/2013
vắc xin hiệu quả cho việc ngăn ngừa nhiễm liên cầu khuẩn heo trên heo, điều trị
heo bệnh chủ yếu là dựa vào sử dụng kháng sinh.
I.4 Nhiễm trùng SS2 trên người, tác nhân gây bệnh lây nhiễm từ heo
SS2 là tác nhân gây bệnh trên ngƣời với trên 700 ca bệnh đã đƣợc báo cáo trên thế
giới [16]. Đa số các đối tƣợng nhiễm bệnh thƣờng là những ngƣời có tiếp xúc trực
tiếp với heo nhƣ ngƣời chăn nuôi heo, cán bộ công tác trong ngành thú y có tham
gia chăm sóc và điều trị heo bệnh, công nhân trong lò mổ heo, ngƣời vận chuyển
hay buôn bán thịt heo… Vì thế heo đƣợc xem là nguồn lây nhiễm liên cầu khuần
heo trực tiếp cho ngƣời, và liên cầu khuẩn heo đƣợc xem là tác nhân gây bệnh
nghề nghiệp [13]. Yếu tố nguy cơ dẫn đến việc nhiễm liên cầu khuẩn heo trên
ngƣời chủ yếu là do tiếp xúc trực tiếp với heo mang trùng thông qua những vùng
vết thƣơng hở trên tay chân [17], hoặc tiêu thụ thức ăn chƣa đƣợc nấu chín có
nguồn gốc từ heo bị nhiễm khuẩn [18]. Nghiên cứu hồi cứu trên 66 bệnh nhân tại
Thái Lan xác định yếu tố nguy cơ của nhiễm trùng liên cầu khuẩn heo trên 39
(59%) ngƣời bị bệnh là sử dụng thức ăn có nguồn gốc từ thịt heo chƣa đƣợc nấu
chín hoặc các cơ quan nội tạng [18]. Đa số bệnh nhân nhiễm SS có biểu hiện lâm
sàng của bệnh VMNM, nhiễm trùng huyết [17, 19] và trong 1 số ít ca bệnh, vi
khuẩn này đƣợc xác định là tác nhân gây viêm nội tâm mạc (endocarditis) trên
ngƣời [20].
Dù tỉ lệ tử vong của bệnh nhân bị VMNM do S. suis không cao (6%) đối với các ca
bệnh xảy ra riêng lẻ, nhƣng di chứng thƣờng gặp trong hơn 35% các bệnh nhân
phục hồi sau VMNM do S. suis là tình trạng giảm thính lực từ nhẹ nhƣ ù tai đến
điếc hoàn toàn cả 2 tai [20]. Di chứng này chắc chắn ảnh hƣởng đến chất lƣợng
cuộc sống của các bệnh nhân đã phục hồi, của gia đình và xã hội [21].
Các ca bệnh trên ngƣời do liên cầu khuẩn heo gây ra thƣờng xảy ra rải rác
(sporadic cases), Tuy nhiên, gần đây liên cầu khuẩn heo đƣợc biết đến nhƣ là một