Báo Cáo Tốt Nghiệp - Công Nghệ Sinh Học - Phân Tích Trình Tự Nucleotit Gen Mã Hóa Protein Kháng Nguyên Orf5 Của Virus Gây Hội Chứng Hô Hấp Và Sinh Sản Ở Lợn Từ Mội Số Mẫu Thu Thập Ở Việt Nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NÔI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Báo cáo tốt nghiệp
“Phân tích trình tự nucleotit gen mã hóa protein kháng
ngun ORF5 của virus gây Hội chứng hơ hấp và sinh sản ở
lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus)
từ mội số mẫu thu thập ở Việt Nam”

1


NỘI DUNG
1

Phần
Phần I:I: Mở
Mở đầu
đầu

2
3

Phần
PhầnII:
II:Đối
Đối tượng
tượng và
vàphương
phương pháp
pháp nghiên

nghiên cứu
cứu

Phần
PhầnIII:
III: Kết
Kết quả
quảvà
vàthảo
thảoluận
luận

4

Phần
Phần IV:
IV: Kết
Kết luận
luận và
và đề
đềnghị
nghị

2


Phần 1: Mở đầu
1.1 Đặt vấn đề
Lợn là vật nuôi có giá trị kinh tế cao, được ni nhiều trên
tồn thế giới và đóng góp một phần khơng nhỏ vào nền

kinh tế của thế giới nói chung cũng như Việt Nam nói riêng
• Tuy nhiên, có rất nhiều bệnh đe dọa đến sự sinh sản và
phát triển của lợn như: Bệnh lở mồm long móng, bệnh tụ
huyết trùng, bệnh phó thương hàn v..v . Trong đó có PRRS
đang là mối nguy hại nghiêm trọng

3


Giggle Search
Your Tab Name

PRRS là gì?Triệu chứng và tác hại bệnh?

Search
Search

4


Giggle Search
Your Tab Name

PRRSV là gì?

PRRS (Porcine reproductive and
respiratory syndrome)
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản là bệnh
truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra trên lợn,
do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, bộ

Nidovirales gây ra

Virus gây hội chứng hô hấp và rối loạn
sinh sản ở lợn
(Nguồn www.pigprogress,net)

5


Triệu chứng của lợn mắc PRRSV
Phá hủy đại thực bào dẫn đến suy giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể

+

Lợn có chửa thường sảy thai hoặc thai chết lưu

+

Rối loạn đường hô hấp
Đại thực bào bị bệnh

Đại thực bào bình thường

+

Lợn ốm thường sốt cao đến 40 – 42oC

+

Lợn ốm viêm phổi nặng

Nguồn: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

Ngoài ra, ở lợn mắc bệnh còn một số triệu chứng khác
như: Run rẩy, co giật, triệu chứng khập khễnh và phát
ban đỏ ở tai, nổi mụn nhọt và xuất huyết da v..v

6


Q trình lây lan của PRRSV
•
•

•

•

Năm 1987, bệnh PRRS xuất hiện lần đầu
tiên ở Mỹ
Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên
xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng
sang các quốc gia khác ở châu Âu
Do chưa xác định được nguyên nhân gây
bênh nên được gọi bằng nhiều tên khác
nhau trong đó phổ biến nhất là tên “bệnh
tai xanh”
Năm 1992 được hiệp hội Thú y thế giới gọi
là PRRS

Lan nhanh ra toàn thế giới và trở
thành một mối lo ngại lớn

7


Một số diễn biến chính của dịch PRRS tại Việt Nam
Tiếp tục lây lan trên 11 tỉnh, thành phố 2012
Lây lan khắp 36 tỉnh, thành phố
Lây lan khắp 17 tỉnh, thành phố
03/2007

2010

7/2008

Trung tâm Thú y cơng bố có
PRRSV trong mẫu xét nghiệm

12/3/2007Lợn tại Hải Dương có triệu chứng lâm sàng
tương tự bệnh sốt cao ở Trung Quốc 2006

1987

PRRSV lần đầu tiên xuất hiện tại Mỹ

8


BOOM!

Tóm tắt sự bùng nổ dịch do virus PRRS gây ra ở Việt Nam năm 2007

9


/>Thiệt hại do PRRS từ năm 2008 đến 2012

Hình1.1 Lợn chết vì PRRS
Nguồn: />
Năm

Số lợn nhiềm
bệnh

Số lợn tiêu
hủy

7/2008

271.215

261.854

6/2009

4.018

3.739

6/2010

146.051

65.911

6/2011

14.759

14.158

6/2012

33.778

21.708
10


Vật chất di truyền của PRRSV là gì?

RNA mạch đơn có kích thước phân tử
khoảng 15 kb mã hóa cho protein cấu
trúc và protein khơng cấu trúc. Virus
PRRS có gồm 7 khung đọc mở gối lên
nhau, mã hóa cho 7 protein của virus
gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và
N.
Trong đó, GP5 đóng vai trị đặc biệt quan

Hình 1.2 Cấu trúc genome PRRSV
Nguồn www.porcilis-prrs.com

trọng vì……
11


Vai trị của GP5 - Protein vỏ chính của virus

1
• Vị trí tiếp
xúc
của
PRRSV khi
nhiễm vào
vật chủ

2
• Đích đến
chủ
yếu
của kháng
thể trung
hồ

3
• Tham gia
vào cơ chế
“lẩn tránh”

4
• Tham gia
hiện tượng
“chết theo
chương
trình”

Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm tăng khả năng
lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV do làm giảm hiệu quả phòng bệnh
12
của các vắc xin phòng bệnh đang lưu hành


1.1 Đặt vấn đề
Mục tiêu nghiên cứu

1

2

Giải trình tự gen ORF5 các mẫu đã
phân lập được

Phân tích, so sánh và đánh giá với các
chủng nguyên thủy và các chủng vắc xin
đang lưu hành trên thế giới và khu vực

13

1.1 Đặt vấn đề

Nội dung nghiên cứu

• Tách ARN tổng số của các mẫu phân lập

• Tổng hợp cDNA và khuếch đại đoạn gen chứa
ORF5
• Giải trình tự các gen ORF5 và phân tích trình
tự gen, axit amin tương ứng
• Xây dựng cây phả hệ và phân tích được mối
quan hệ di truyền

14


Phần II: Đối Tượng và Phương Pháp Nghiên Cứu
2.1 Địa điểm và thời gian thực tập
 Địa điểm nghiên cứu
 Phịng Cơng nghệ Gen động vật – Viện Cơng nghệ sinh học
Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam
18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
 Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công Nghệ Sinh Học
Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội
Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội
 Thời gian
 Khóa luận được tiến hành từ ngày 15/01/2012 đến ngày 30/07/2012

15

2.2 Đối tượng nghiên cứu
Bảng 2.1 Ký hiệu và địa điểm thu mẫu của các mẫu ORF5 được phân lập

Mẫu máuSTT
lợn do Viện
Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp
miền Nam,
Tên mẫu
Địa điểm
Năm
Đại học Cần Thơ và Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh cung
1
HG2012.RV1
Hậu Giang
2012
cấp
2
CT2012.HS1
Cần Thơ
2012
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

DT2012.DT8
BD2010.R1
HCM2010.CC3
HCM2010.D06
DN2010.1
DN2010.4
DN2010.5.2
DN2010.11
DN2009.42
DN2009.44
DN2009.59
DN2009.88
DN2009.292
DN2009.1107
DN2009.1155
Hình

2.1 Mẫu
DN2008.153
DN2008.444
DN2008.452
DN2008.460
DN2008.499
DN2008.694
JAX1-R Vaccine

máu

Đồng Tháp
Bình Dương
Tp HCM
Tp HCM
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồngcứu
Nai
nghiên
Đồng Nai
Đồng Nai

Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Đồng Nai
Vắc xin Trung Quốc

2012
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2010
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2012

16

2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Tách chiết ARN
THU DỊCH TRÊN
100 µl máu + 100 µl
nước + 600 µl Trizol
Ủ trong 5 phút ở nhiệt
độ phịng

Mẫu máu

Thêm 200 µl
chloroform

Ly tâm

Ủ 15 phút ở
nhiệt độ phịng

15 phút

lần 1

12000v/phút

Thêm 500 µl
Isopropanol
Tủa được để khơ
tự nhiên

Thêm 30 µl
H2O

Thêm 500 µl
Ly tâm lần 3
THU TỦA

ethanol 70o

Ly tâm lần 2
THU TỦA

Phương pháp của Chomcynski và Sacchi có cải tiến
(Chomczynski & Sacchi, 1987)

Ủ 15 phút ở
nhiệt độ phòng.

17


2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.2 Thiết kế cặp mồi
Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này được thiết kế nhằm
mục đích nhân đoạn 720 bp có chứa gen ORF5 bên trong
Bảng 2.2 Trình tự mồi để giải trình tự ORF5
603 bp
STT

Tên mồi

Trình tự nucleotit (5’ – 3’)

1

Mồi xi

TCCTACTGGCAATTTGAATG

2

Mồi ngược

TGATGATATATGCTCTAAAGG

720 bp

18


2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.3 RT – PCR hai bước
Sử dụng “First-strand dDNA synthesis System” cho RT-PCR của hãng Fermentas cung cấp
Bước 1: Tổng hợp cDNA
1. Thêm các thành phần phản ứng như sau vào các ống eppendorf vô
trùng và không chứa RNAse theo như sau
STT
Thành phần phản ứng
1

RNA tổng số
2
Mồi ngẫu nhiên
4
H2O
Thể tích tổng số

Thể tích (µl)
5,0
1,0
5,0
11,0

2. Thêm các chất theo thứ tự sau vào ống eppendorf thứ 2 như sau
STT

Thành phần phản ứng

Thể tích (µl)

1

Đệm phản ứng 5X

4,0

2

RibolookTM RNase inhibitor

1,0

3

Hồn hợp dNTP 10 mM

2,0

4

M - MuLV

2,0

Thể tích tổng số

9,0

19


2.3 Phương pháp nghiên cứu
3. Trộn đều hai hỗn hợp với nhau và tiến hành ly tâm nhanh. Thể tích
tổng số của hỗn hợp là 20 µl sau đó ủ ở nhiệt độ như bảng sau:
Bảng 2.3 Quy trình nhiệt phản ứng tạo cDNA
Bước

Giai đoạn

Nhiệt độ

(oC)

Thời gian
(phút)

1

Ủ

25

5

2

Tiến hành phản ứng

37

60

3

Kết thúc phản ứng

70

5

4

Bảo quản

4

∞
20