Lã hải long xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 chất bảo quản trong một số mẫu quả có cùi bằng phương pháp hplc với detector uv

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÃ HẢI LONG
Mã sinh viên: 1801422

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI 5 CHẤT BẢO
QUẢN TRONG MỘT SỐ MẪU QUẢ CÓ
CÙI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI
DETECTOR UV
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Thị Thuận
Nơi thực hiện:
Bộ mơn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2023


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày những nội dung thuộc đề tài nghiên cứu của mình, tơi xin
được gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã luôn đồng hành, giúp đỡ tơi trong
suốt q trình nghiên cứu khoa học tại trường Đại học Dược Hà Nội.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giảng viên hướng dẫn của tôi là
PGS.TS Nguyễn Thị Thuận – giảng viên Bộ mơn Hóa Dược trường Đại học Dược
Hà Nội đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn, động viên tơi trong q trình nghiên cứu, giúp
tơi hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa
Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội đã ln giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành
khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ.

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn chân thành nhất cho gia đình, bạn bè đã ln
ủng hộ và động viên tôi trong suốt những năm tháng học tập và nghiên cứu ở mái
trường này. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn anh Dương Tiến Anh, chị Phạm Thị Thu
Trang, chị Nguyễn Bình Minh, anh Bùi Văn Sơn, bạn Phạm Thúy Hà, em Hoàng
Thị Loan, em Bùi Văn Quân, em Chu Thị Trang đã luôn đồng hành, chia sẻ buồn
vui và giúp đỡ tơi trong suốt q trình nghiên cứu ở bộ môn.
Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2023
Sinh viên

Lã Hải Long


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .................................................................................
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...............................................................................................
DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ ..................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1.
Giới thiệu chung về các chất bảo quản: ..........................................................2
1.1.1.
Định nghĩa: ..............................................................................................2
1.1.2.
1.1.3.

Cơ sở để cho phép 1 chất là chất bảo quản thực phẩm: ...........................2
Phân loại: .................................................................................................2

1.1.4.

Acid sorbic: ..............................................................................................2

1.1.5.
Các parabens: Methylparaben, ethylparaben, propylparaben,
butylparaben:...........................................................................................................4
1.2.
Tình hình sử dụng các chất bảo quản trong các sản phẩm thực phẩm: ..........7
1.3.
Giới hạn tồn dư tối đa hàm lượng các chất trong thực phẩm: ........................8
1.4.
Tổng quan về các phương pháp phân tích acid sorbic và các parabens:
methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben: .................................8
1.4.1.
Các phương pháp phân tích trên thế giới: ................................................8
1.4.2.
Các phương pháp phân tích ở Việt Nam: ..............................................11
1.5.
Vài nét về phương pháp HPLC: ...................................................................12
1.5.1.
Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao: ...........................................12
1.5.3.
Ứng dụng của HPLC: ............................................................................13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................15
2.1.
Đối tượng nghiên cứu: ..................................................................................15
2.2.
Thiết bị, dụng cụ và hóa chất: ......................................................................15
2.2.1.
Thiết bị và dụng cụ: ...............................................................................15

2.2.2.
Hóa chất: ................................................................................................15
2.3.
Nội dung nghiên cứu: ...................................................................................16
2.3.1.
Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 chất bảo quản AS, MeP,
EtP, PrP và BuP trong thực phẩm: ........................................................................16
2.3.2.
Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng: ..................................16
2.3.3.
Áp dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng 5 chất bảo quản:
AS, MeP, EtP, PrP và BuP trong 1 số loại thực phẩm đang lưu hành trên thị
trường ...............................................................................................................16
2.4.
Phương pháp nghiên cứu: .............................................................................16
2.4.1.
Xử lý mẫu: .............................................................................................16


2.4.2.

Lựa chọn phương pháp phân tích: .........................................................17

2.4.3.

Thẩm định quy trình phân tích: .............................................................18

2.4.4.

Phương pháp xử lý số liệu: ....................................................................19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................20
3.1.2.
3.2.1.
3.2.2.

Khảo sát lại hệ pha động ........................................................................21
Độ phù hợp hệ thống: ............................................................................23
Độ đặc hiệu: ...........................................................................................25

3.2.3.
3.2.4.

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn: ......................................................27
Độ đúng: ................................................................................................32

3.2.5.
Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian) ............................36
3.3. Áp dụng kiểm tra các mẫu trên thị trường: ........................................................43
3.4. Bàn luận: ............................................................................................................45
3.4.1. Về phương pháp xử lý mẫu: .......................................................................45
3.4.2.
Về lựa chọn và xác định phương pháp ..................................................47
3.4.3.
Về thẩm định phương pháp phân tích ....................................................48
3.4.4.
Về ứng dụng thực tế...............................................................................48
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................................49
4.1.
Kết luận........................................................................................................49

4.2.
Đề xuất ..........................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................


DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Ký hiệu
ACN

Acetonitril

AB

Acid benzoic

AcOH

Acid acetic

ADI

Lượng ăn hàng ngày chấp nhận

AOAC

Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thức

AS

Acid sorbic

BeP

Octadecylsilan

BuP

Điện di mao quản

C18

Detector UV-Vis mảng diod Octadecylsilan

CE

Điện di mao quản

DAD

Detector UV-Vis mảng diod

HeP

Nồng độ ảnh hưởng bất lợi thấp nhất quan sát được

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

iHMGEC

Tế bào biểu mô tuyến meibomian ở người

IsoBuP

Detector khối phổ

IsoPrP

Octadecylsilan

LOAEL

Nồng độ ảnh hưởng bất lợi thấp nhất quan sát được

MeOH

Methanol

MeP

Methylparaben

MS

Sắc ký khối phổ

ODS

Octadecylsilan

PDA

Detector UV-Vis mảng diod

PeP

Pentylparaben

PheP

Phenylparaben

PrP

Propylparaben

RP-HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

UPLC-DAD

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao, detector DAD


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng

Số
trang

Bảng 1.1: Các thông tin chung về các parabens

4

Bảng 1.2: Độc tính của MeP, EtP, PrP, BuP [18]

6

Bảng 1.3: Các phương pháp phân tích đồng thời acid sorbic và các parabens

9

trên thế giới
Bảng 1.4: Các phương pháp phân tích đồng thời acid sorbic và các parabens
tại Việt Nam

11

Bảng 3.1: Chương trình gradient pha động

23

Bảng 3.2: Kết quả độ phù hợp hệ thống AS

23

Bảng 3.3: Kết quả độ phù hợp hệ thống MeP

23

Bảng 3.4: Kết quả độ phù hợp hệ thống PrP
Bảng 3.5: Kết quả độ phù hợp hệ thống EtP:

24

Bảng 3.6: Kết quả độ phù hợp hệ thống BuP:

24

Bảng 3.7: Thời gian lưu của các chất phân tích trong các mẫu độ đặc hiệu

27

Bảng 3.8: Độ phân giải Rs của các chất phân tích trong các mẫu độ đặc hiệu

27

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của AS

27

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của MeP

28

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của EtP

28

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của PrP

28

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của BuP

29

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với AS:

32

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với MeP:

33

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với EtP

34

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với PrP

35

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp đối với BuP

36

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với AS

37

Bảng 3.20: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với MeP:

37

Bảng 3.21: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với EtP:

38

Bảng 3.22: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với PrP:

38

24

39
Bảng 3.23: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với BuP:
Bảng 3.24: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối
với AS, MeP, EtP trên nền mẫu nguyên cả quả

40


Bảng 3.25: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối

41

với PrP và BuP trên nền mẫu nhãn nguyên cả quả
Bảng 3.26: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối
với AS, MeP, EtP trên nền mẫu cùi nhãn

42

Bảng 3.27: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối
với PrP và BuP trên nền mẫu cùi nhãn

43

Bảng 3.28: Kết quả phân tích của 1 số mẫu thực phẩm trên thị trường

43

Bảng 3.29: So sánh thời gian lưu của pic nghi ngờ và pic chuẩn

44

Bảng 3.30: So sánh hệ gradient khảo sát và hệ gradient tài liệu [22]

47


DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐỒ THỊ
Hình, đồ thị

Số

trang

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của acid sorbic

2

Hình 3.1: Phổ UV của 5 chất bảo quản AS, MeP, EtP, PrP và BuP

20

Hình 3.2: Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp 2 chuẩn khảo sát theo pha động 1

21

(a) và pha động 2 (b)
Hình 3.3: Sắc ký đồ hỗn hợp 5 chất khảo sát theo pha động

22

Hình 3.4 : Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu đối với nền dịch chiết nhãn cả

25

quả
Hình 3.5: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu với nền dịch chiết nhãn cùi

26

Hình 3.6: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu với nền dịch chiết long nhãn

26

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và

29

nồng độ của AS
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và
nồng độ của MeP

30

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và

30

nồng độ của EtP
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và
nồng độ của PrP

31

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và
nồng độ của BuP

31

Hình 3.12: (a) Sắc ký đồ mẫu long nhãn (chợ Đồng Xuân); (b) Sắc ký đồ
chuẩn hỗn hợp 6 chất bảo quản, (c) Chồng phổ UV của pic nghi ngờ và pic
chuẩn EtP

45

Hình 3.13: Sắc ký đồ mẫu long nhãn (chợ Đồng Xuân) thêm chuẩn hỗn hợp
6 chất bảo quản

45


ĐẶT VẤN ĐỀ
Do sự kỳ vọng về thời gian sử dụng lâu dài của thực phẩm nên đòi hỏi việc cần
sử dụng các chất bảo quản. Trong các chất bảo quản, acid sorbic và các parabens được
biết đến và sử dụng từ rất lâu trong thực phẩm và từng được coi là chất bảo quản an
toàn và dung nạp tốt nhất. Tuy nhiên, trong các báo cáo gần đây cho thấy, việc sử
dụng quá liều lượng cho phép của các chất bảo quản như parabens có khả năng tiềm ẩn
gây rối loạn nội tiết, bệnh ung thư vú, ảnh hưởng đến chức năng sinh sản ở nam giới
… Mặt khác, các chất bảo quản này cịn được bà con nơng dân sử dụng như những hóa
chất bảo vệ thực vật, thậm chí là phun lên bề mặt hoa quả ngay trước khi bán để giữ
được lâu hơn. Vì vậy việc xây dựng pp định lượng hàm lượng các chất bảo quản như
acid sorbic và các paraben trong thực phẩm là hồn tồn cần thiết.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để định lượng chất bảo quản
trong thực phẩm như: Phương pháp quang phổ hấp thụ (UV-Vis), sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE) ... Tuy nhiên để xây dựng phương pháp định
lượng đồng thời các chất bảo quản trong thực phẩm thì phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao vẫn là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất. Các tài liệu tham khảo trên
thế giới [15, 17, 18, 20] đã tiến hành các phương pháp định lượng đồng thời nhiều chất
bảo quản bằng phương pháp HPLC trên đa dạng các mẫu thực phẩm khác nhau, bao
gồm nước ép hoa quả, hoa quả tươi, khô.... Mặc dù vậy, tại Việt Nam, chúng tôi vẫn
chưa tìm được các tài liệu liên quan đến việc định lương đồng thời các chất bảo quản
như: acid sorbic, methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben trong các

mẫu hoa quả.
Đáp ứng nhu cầu trên và dựa trên một số nghiên cứu khả quan của một số tác
giả, đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 chất bảo quản trong một
số quả có cùi bằng phương pháp HPLC với detector UV” được xây dựng với 2 mục
tiêu như sau:
1, Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 chất bảo quản: Acid sorbic,
methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben trong các mẫu hoa quả
có cùi bằng phương pháp HPLC với detector UV.
2, Áp dụng phương pháp để xác định và định lượng các chất bảo quản: Acid
sorbic, methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben trong 1 số mẫu hoa
quả tươi và khô trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về các chất bảo quản:
1.1.1. Định nghĩa:
Chất bảo quản là các hóa chất tự nhiên hoặc tổng hợp được thêm vào sản phẩm
như thực phẩm, sơn, dược phẩm, các mẫu phẩm sinh học v.v... để ngăn ngừa hoặc làm
chậm sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật hay do các thay
đổi không mong muốn về mặt hóa học. Chúng có thể được sử dụng như 1 loại hóa chất
duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác [7]
1.1.2. Cơ sở để cho phép 1 chất là chất bảo quản thực phẩm:
-

Có đầy đủ tài liệu nghiên cứu về kỹ thuật và công nghệ sử dụng chất bảo
quản

-

Có đầy đủ tài liệu nghiên cứu về độc tố học

- Có đầy đủ tài liệu nghiên cứu về các phương pháp phân tích [7]
1.1.3. Phân loại:
Nhóm chất bảo quản trong thực phẩm bao gồm:
 Chất bảo quản có nguồn gốc vô cơ:
- Các muối clorid (NaCl); muối nitrat, nitrit của Natri, Kali
-

Acid carbonic (H2CO3); acid sulfurơ (H2SO3)...

 Chất bảo quản có nguồn gốc hữu cơ:
-

Acid sorbic và các sorbat
Acid benzoic, các benzoat và dẫn chất
Chất bảo quản nguồn gốc benzen
Acid hữu cơ: Acid formic, acid acetic...
Chất kháng sinh: Nisin, tylosin, pymarixin, biomycin (clotetracyclin)...
Các parabens: Methylparaben. Propylparaben ...
Chất chống oxy hóa: Acid ascorbic, tocopherol, BHA, BHT... [7]

1.1.4. Acid sorbic:
a, Các thơng tin chung:

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của acid sorbic
 Danh pháp IUPAC: Acid hexa-2,4-dienoic
 Kí hiệu trong ngành thực phẩm: E200
 Công thức phân tử: C6H8O2

 Khối lượng phân tử: 112.13 đvC

2


 Cảm quan: Bột hoặc tinh thể màu trắng, vị chua nhẹ và mùi nhẹ
 Nhiệt độ sôi: 228oC
 Nhiệt độ nóng chảy: 134.5oC
 Độ tan: Ít tan trong nước (0,25% ở 30oC), dễ tan trong Ethanol và Methanol
b, Vai trị, tính độc hại khi sử dụng trong bảo quản thực phẩm:
+ Vai trị: Acid sorbic có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men, nấm mốc,
các vi sinh vật này là nguyên nhân chủ yếu gây hư hỏng các sản phẩm rau quả. Tuy
nhiên chất này lại có tác dụng rất yếu đối với vi khuẩn. Vì vậy khi sử dụng acid sorbic,
người ta vẫn có thể giữ được khả năng hoạt động của các vi khuẩn có lợi như acid
lactic... Sử dụng acid sorbic đem lại hiệu quả tốt trong công nghiệp chế biến rau quả,
công nghiệp rượu nho, sản phẩm đồ hộp, sữa chua,...[7, 10]
Cơ chế được chấp nhận cho hoạt tính kháng khuẩn của acid sorbic là sự bất
hoạt các enzym cần thiết cho hoạt động sống cịn của vi sinh vật bằng cách hình thành
liên kết cộng hóa trị giữa các nối đơi của acid sorbic với nhóm thiol (-SH) của enzym
dẫn đến ngừng trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật [10]
Tuy nhiên 1 số loại nấm mốc như Aspergillus niger có khả năng decarboxylat
acid sorbic thành 1,3-pentadien dễ bay hơi và ít độc hơn. Khả năng kháng acid sorbic
của A.niger cũng cho phép sự phát triển của các vi khuẩn nhạy cảm với acid sorbic
khác. [10]
+ Tính độc hại khi sử dụng trong bảo quản thực phẩm: Trong nghiên cứu của R
Walker [23] đã làm hàng loạt các thử nghiệm về độc tính/ khả năng gây ung thư cấp
tính, ngắn hạn hoặc dài hạn. Kết quả cho thấy acid sorbic và các sorbat có mức độ độc
tính rất thấp ngay cả trong các nghiên cứu mãn tính lên đến 10% chế độ ăn uống và
khơng có hoạt tính gây ung thư. Acid sorbic và các sorbat không gây ra đột biến gen,
đột biến nhiễm sắc thể.

1 số trường hợp không dung nạp với acid sorbic (nổi mề đay do tiếp xúc không
miễn dịch và giả dị ứng). Tần suất xuất hiện tình trạng này thấp. Chưa có dữ liệu báo
cáo đầy đủ để đánh giá chính xác tỷ lệ mắc bệnh thực sự.
Trong điều kiện khắc nghiệt (nồng độ cao và nhiệt độ cao), acid sorbic có thể
phản ứng với nitrit để tạo thành các sản phẩm gây đột biến, những chất này thì khơng
thể phát hiện được trong điều kiện bình thường.
Trong một nghiên cứu khác của Shad.A.M và các cộng sự [21] đã cho thấy hoạt
động của enzym cholinesterase trong huyết thanh người giảm theo cấp số nhân khi
tăng nồng độ acid sorbic. Do acid sorbic đã có phản ứng cộng với nhóm thiol của
cystein có mặt trong trung tâm hoạt động của enzym, gây ra sự biến đổi cấu trúc
enzym dẫn đến sự ức chế không thuận nghịch của enzym.

3


1.1.5. Các parabens: Methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben:
a, Các thông tin chung:
Bảng 1.1: Các thông tin chung về các parabens
Methylparaben

Ethylparaben

Propylparaben

Butylparaben

Methyl 4hydroxy

Ethyl 4hydroxy

Propyl 4-

Butyl 4-hydroxy

benzoat

benzoat

hydroxy benzoat

benzoat

E218

E214

E216

C8H8O3

C9H10O3

C10H12O3

Cấu
trúc
hóa học

Danh
pháp

IUPAC
Kí hiệu
trong
ngành
thực
phẩm
Cơng
thức
phân tử
Độ tan

C11H14O3

Ít tan trong nước, dễ tan trong Methanol, Ethanol và Propylen glycol, Ether

Nhiệt
độ nóng
chảy
(oC)
Cảm
quan
Khối
lượng
phân tử
(đvC)

125-128

115-118

96-97

68-69

Bột kết tinh màu trắng hoặc tinh thể nhỏ khơng màu, hầu như khơng mùi

152.15

166.18

180.20

b,Vai trị, tính độc hại khi sử dụng trong bảo quản thực phẩm:
+Vai trò:

4

194.23


Các parabens có tác dụng sát khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau) và
diệt nhiều loại vi nấm. Parabens có hoạt tính kháng khuẩn là do chúng làm thay đổi
đặc tính của màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng tế bào bị thay đổi làm cho các
chất tan trong tế bào bị rị rỉ ra ngồi [9, 14]
Theo Steinburg Doron và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn của 4
parabens: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben trên các vi khuẩn
Streptococcus sobrinus gây bệnh sâu răng. Kết quả thu được cho thấy, theo chiều tăng
của chuỗi alkyl, khả năng kháng khuẩn của các parabens tăng dần [9, 14]
+ Tính độc hại:
a, Độc tính của các paraben nói chung:

Các parabens được ghi nhận là có độc tính cấp và trường diễn thuộc loại rất
thấp, gần như khơng có tác hại nào đáng kể và thuộc loại chất bảo quản có lịch sử sử
dụng lâu dài
Mối liên quan giữa parabens và bệnh ung thư vú:
Các parabens được biết đến là có hoạt tính estrogen. Estrogen được biết là có
liên quan đến sự phát triển của ung thư vú. Tuy nhiên theo FDA, các nghiên cứu đã chỉ
ra rằng, hoạt tính của các parabens ít hơn đáng kể so với hoạt tính tự nhiên của
estrogen trong cơ thể. Parabens chưa được chứng minh là có hại như được sử dụng
với hàm lượng rất thấp.[9, 25]
1 số nghiên cứu về mối liên quan giữa các parabens và bệnh ung thư vú:
Theo Routledge E.J và cộng sự, tất cả các parabens bao gồm: methylparaben,
ethylparaben, n-propylparaben, butylparaben đều có hoạt tính tương tự estrogen.
Trong đó methyl paraben là chất có hoạt tính estrogen yếu nhất với cường độ thấp hơn
khoảng 2500000 lần so với 17-estradiol (một loại estrogen có trong tự nhiên). Hoạt
tính estrogen mạnh lên theo chiều tăng của chuỗi alkyl, cụ thể ethylparaben, npropylparaben và butylparaben lần lượt có cường độ thấp hơn 150000, 30000 và
10000 lần so với 17-estradiol. Nghiên cứu này cũng nêu lên rằng cường độ hoạt tính
estrogen của parabens trên các cá thể chuột còn thấp hơn 2-3 lần so với cường độ thử
nghiệm trong ống nghiệm. Lý do là bởi các parabens nhanh chóng được đào thải ra
ngoài theo hệ thống bài tiết của cơ thể. [9, 19]
Theo Võ TB Thủy và cộng sự, nghiên cứu thử nghiệm được tiến hành trên chuột
cái ở độ tuổi dậy thì và trưởng thành (21-40 ngày sau khi sinh) về tác động của
parabens bao gồm: methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyl- và isobutylparaben. Kết
quả thu được hoạt tính estrogen mạnh lên theo thứ tự: methyl- < ethyl- < propyl- <
isopropyl- < butyl- Nghiên cứu về mối liên quan giữa các parabens và rối loạn nội tiết:

5


Nghiên cứu của Dorota B. và các cộng sự năm 2014 liên quan đến quần thể con

người đã chỉ ra mối liên hệ yếu giữa nồng độ paraben trong nước tiểu và gen chỉ thị
stress oxy hóa, suy giảm ADN tinh trùng hay suy giảm các hormon tuyến giáp trong
huyết thanh. Mặc dù tương quan có thể là ngẫu nhiên nhưng không thể loại trừ được
giả thuyết rằng các paraben, dù ở nồng độ thấp, ảnh hưởng đến cân bằng nội mơi của
cơ thể [1,12]
b, Độc tính riêng của các paraben:
Bảng 1.2: Độc tính của MeP, EtP, PrP, BuP [18]
Giới hạn
độc tính

MeP

EtP

PrP

Kích
ứng/ ăn

BuP

(+)

mịn/
nhạy
cảm

(-)

(-)

(-)

(kích ứng da, ăn mịn
mắt)

Độc tính
với gen

(+) (in vitro)
(-) (in vivo)

(-) (in vitro)
(-) (in vivo)

(-) (in vitro)
(-) (in vivo)

(-) (in vitro)
(-) (in vivo)

Độc tính
phát
triển

Độc tính
sinh sản

hiệu ứng độc tinh hoàn
(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

ảnh
hưởng
đến tinh trùng
(LOAEL 12,4
mg/kg
cân/
ngày)

và ảnh hưởng đến tinh
trùng (LO(A)EL 10 mg/
kg cân/ ngày)
ảnh hưởng đến số lượng
tinh trùng và nồng độ
testosteron và khối
lượng mào tinh (LOAEL
14,4 mg/kg cân/ ngày)

Nghiên cứu của Jingyi Wang và các cộng sự đã chỉ ra rằng methylparaben,
ethylparaben là các chất độc đối với iHMGECs (Human meibomian gland epithelial
cells – các tế bào biểu mô tuyến meibomian ở người – tuyến meibomian là tuyến ở mí
mắt với chức năng tiết dầu trên bề mặt của mắt; giúp cho nước mắt không bay hơi quá

nhanh): khi cho tế bào iHMGEC tiếp xúc với các chất bảo quản trên 30 phút sẽ làm
giảm đáng kể hoạt động của con đường Akt xảy ra ở liều lượng nhỏ hơn liều cho phép
sử dụng ở người. Mặt khác nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nuôi cấy tế bào iHMGEC
trong 24h ở điều kiện nồng độ methylparaben, ethylparaben được phê duyệt cho người
gây ra teo tế bào và tử vong [24]

6


1.2.

Tình hình sử dụng các chất bảo quản trong các sản phẩm thực phẩm:
Hiện nay việc sử dụng các hóa chất bảo quản trong chế biến thực phẩm trở nên

phổ biến tại mọi quốc gia. Một mặt việc sử dụng chất bảo quản giúp tăng thời lượng sử
dụng thực phẩm, mặt khác việc đưa các chất lạ vào cơ thể tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây
hại cho sức khỏe.
Tại Việt Nam, các cơ sở kinh doanh, chế biến thực phẩm hầu hết là sản xuất các
sản phẩm truyền thống ở quy mơ nhỏ lẻ, cá thể hoặc hộ gia đình nên việc sử dụng chất
bảo quản trong thực phẩm rất khó kiểm sốt. Tình trạng vi phạm các quy định về sử
dụng chất bảo quản trong chế biến thực phẩm, kể cả những chất ngoài danh mục Bộ Y
Tế cho phép diễn ra khá phổ biến và đã được cảnh báo trong nhiều năm ở nhiều địa
phương. Trên thị trường hiện nay vẫn cịn nhiều mặt hàng khơng rõ nguồn gốc xuất
xứ, sử dụng những chất bảo quản ngoài danh mục cho phép như: hàn the trong giị chả,
mì, bánh đa,... hay formol trong bánh phở, bún tươi.[6]
Acid sorbic và các muối của chúng lần đầu được sử dụng như 1 chất bảo quản
thực phẩm là vào đầu những năm 1980, dùng để ức chế Clostridium botulinum để thay
thế cho việc sử dụng các nitrit, có thể tạo ra các nitrosamin gây ung thư. Cho đến nay
acid sorbic là 1 chất được ưa thích bởi ngành cơng nghiệp thực phẩm hơn các chất bảo
quản khác như acid propionic hay acid benzoic do chúng ức chế sự phát triển của vi

sinh vật ở pH cao (6,0-6,5); lượng hấp thụ có thể chấp nhận được cao: 25mg/kg thể
trọng và ít ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do những ưu điểm thuận lợi như trên
nên acid sorbic thường hay bị lạm dụng trong bảo quản các loại thực phẩm như các
loại chả, nem, thịt nướng, tương ớt....[10]
Theo Hội đồng khoa học về phụ gia thực phẩm, hương liệu, chất hỗ trợ chế biến
và nguyên liệu tiếp xúc với thực phẩm (AFC); lượng ăn hàng ngày chấp nhận được
(ADI) của methylparaben và ethylparaben là từ 0-10mg/kg trọng lượng cơ thể. Đối với
propylparaben, hội đồng cho rằng khơng thể cho chất này vào nhóm ADI do nghiên
cứu gần đây chứng minh tác dụng của nó đối với các thơng số sinh sản ở chuột, mặc
dù sự xuất hiện của propylparaben trong chế độ ăn uống là hạn chế và không gây rủi ro
cho người tiêu dùng. [25]
Methylparaben, ethylparaben, propylparaben được phép sử dụng ở Liên minh
Châu Âu dưới dạng phụ gia thực phẩm trong 4 loại thực phẩm chế biến theo chỉ thị
95/2/EC: xử lý bề mặt đối với các sản phẩm thịt sấy khô, trong lớp phủ thạch của các
sản phẩm thịt như pate với mức tối đa cho phép là 1g/kg, trong bánh kẹo (trừ socola)
với mức tối đa cho phép 0.3g/kg, trong thực phẩm bổ sung dạng lỏng (2g/kg) [25]
Butylparaben không được phép sử dụng làm chất bảo quản trong thực phẩm ở
EU theo như chỉ thị EC số 1333/2008. Ngoài ra, butylparaben cũng không được phép

7


sử dụng trong sản xuất các vật liệu nhựa và các sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với thực
phẩm theo quy định số 10/2011 của ủy ban Food Contact Material (FCM), (EU). [16]
1.3.

Giới hạn tồn dư tối đa hàm lượng các chất trong thực phẩm:
Để đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng và thực hiện chức năng nhà nước về vệ

sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y Tế đã ban hành thông tư 27/2012/TT-BYT ngày 30

tháng 11 năm 2012 hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm (thay thế cho Quy định
danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm ban hành kèm theo
quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 8 năm 2001 và Quy định về điều
kiện bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất, kinh doanh, sử dụng phụ gia
thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 928/2002/QĐ-BYT ngày 21 tháng 3 năm
2002 của Bộ trưởng Bộ Y tế). Thông tư này quy định hàm lượng tối đa của từng chất
phụ gia trong từng sản phẩm cụ thể, trong đó có quy định rõ :
 Đối với acid sorbic trong 27 loại thực phẩm khác nhau (sữa, bơ, phomat,
quả đông lạnh,...) với hàm lượng tối đa được quy định dao động từ 3003000mg/kg sản phẩm. [3, 4]
 Đối với methylparaben, ethylparaben, propylparaben trong 22 loại thực
phẩm khác nhau với hàm lượng tối đa được quy định dao động từ 1002000mg/kg sản phẩm. [3, 4]
Trong tài liệu Codex Alimentarius được cập nhật năm 2021, ban hành bởi tổ
chức Y tế Thế Giới (WHO) và tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc
(FAO) cũng quy định giới hạn hàm lượng tối đa của acid sorbic và các parabens trong
từng sản phẩm. Tuy nhiên có sự mở rộng và đa dạng số lượng sản phẩm hơn so với
quy định của Bộ Y Tế. [13]
Theo EU, butylparaben khơng được phép có mặt trong thực phẩm cũng như
nguyên liệu bao gói thực phẩm, vì vậy sẽ khơng có giới hạn hàm lượng cho
butylparaben. Tuy nhiên, việc xác định hàm lượng chất này trong thực phẩm là hoàn
toàn cần thiết để đánh giá mức độ nguy cơ ảnh hưởng đến sinh sản và phát triển của
con người, thông qua việc so sánh với các LOAEL (nồng độ ảnh hưởng thấp nhất quan
sát được) trong các nghiên cứu trước đó.
Tổng quan về các phương pháp phân tích acid sorbic và các parabens:
methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben:
1.4.1. Các phương pháp phân tích trên thế giới:
Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích đã được triển khai và
chuẩn hóa tại nhiều phịng thí nghiệm bao gồm các phương pháp định lượng đồng thời
1.4.

acid sorbic và các parabens như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc

ký khí (GC), sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LCMS), điện di mao quản (CE)... Qua tìm hiểu nhóm nghiên cứu nhận thấy phương pháp

8


sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC là phương pháp thường được sử dụng nhờ hiệu lực
tách tốt, cũng như tính phổ biến tại nhiều phịng thí nghiệm:
Bảng 1.3: Các phương pháp phân tích đồng thời acid sorbic và các parabens trên thế
giới
Tài
liệu

[17]

Chất phân Mẫu nghiên
tích
cứu
AB, AS,
MeP, PrP

Điều kiện sắc ký

Nước ép trái + Cột sắc ký : cột C18
cây
+ Pha động: MeOH: đệm acetat (pH 4,4) = 50:50
+ Tốc độ dịng: 0,7mL/ph
+ Bước sóng phát hiện: 254nm

Natri

Nước ngọt,

benzoat,
kali sorbat,

đồ hộp,
+ Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng
nước sốt, sốt + Cột sắc ký: Supelcosil LC-18 (25cm x 4.6mm, 5µm)

MeP, PrP

cà chua, bột
cà chua,
nước ép trái
cây, nước

+ Bước sóng phát hiện: 225nm đối với natri benzoat
và 254nm đối với kali sorbat, methylparaben và
propylparaben.
+ Tốc độ dòng: 1ml/ph

chanh

+ Pha động : Chương trình dung mơi:
Dung mơi A: MeOH: đệm acetat pH 4,4 =
70:30 (v/v)
Dung môi B: MeOH: đệm acetat pH 4,4 =
35:65 (v/v)

[15]

[18]

+ Thể tích tiêm: 20µl

20 chất bao Nước ép trái
gồm: chất
cây, cola,
tạo ngọt,
nước có ga
chất bảo
quản và
caffein

Thời gian
(phút)

Dung mơi A
(%)

Dung môi B
(%)

0

0

100

8

0

100

18

100

0

20

100

0

21

0

100

25

0

100

+ Cột sắc ký: cột ODS-SP (250mm x 4,6mm, 5 µm)

được sử dụng cùng với cột bảo vệ C18 (25mm x
4,6mm, 5 µm)
+ Pha động: Chương trình dung mơi:
Dung môi A: dung dịch amoni acetat 0,1 mol/l
pH 7,2
Dung môi B: hỗn hợp MeOH:ACN = 90:10

9


(v/v)
Dung môi A

Dung môi B

(phút)

(%)

(%)

0-5

8

92

5-20

8-25

92-67

20-35

25-70

67-30

35-44

70-90

30-10

44-49

90-100

10-0

AB, AS,

Nước ngọt,

+ Cột sắc ký: C18 (15cm x 4,6mm, 5 µm)

MeP, PrP

trái cây/ rau

+ Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phịng

đóng hộp,
mứt/ thạch

+ Bước sóng phát hiện: 254 nm
+ Thể tích tiêm: 20 µL

trái cây, trái
cây khơ,
nước sốt,…

+ Dung mơi pha động: Chương trình gradient:

[20]

[26]

Thời gian

Thời gian

Đệm
MeOH (%)

amoiacetat pH
4,4 (%)

0-9

35

65

9-21

50

50

(phút)

10 chất:
AB, AS,

Nước giải
khát cola,

Phương pháp UPLC-DAD:
+ Cột sắc ký: Acquity BEH C18 column (50 x 2.1

acid
dehydroace
tic, MeP,
EtP, PrP,
IsoPrP,

nước giải
khát có ga

hương trái
cây, nước ép
hoa quả,

mm, 1.7 µm)
+ Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút
+ Nhiệt độ cột: 45oC
+ Dung mơi pha động: Chương trình gradient:

BuP,
IsoBuP,
HeP

Đệm kali
Thời gian
(phút)

Acetonitri
l (%)

dihydrophotphat
20 mM (pH 4,29)
(%)

0-0,1

10

90

0,1-8

10-38

90-62

8-10

38-90

62-10

10-10,1

90-10

10-90

10


1.4.2. Các phương pháp phân tích ở Việt Nam:
Bảng 1.4: Các phương pháp phân tích đồng thời acid sorbic và các parabens tại Việt
Nam
Tài

Chất phân

liệu

tích
IsoPrP,
PheP,

[1]

Mẫu
nghiên
cứu
Mỹ phẩm

Điều kiện sắc ký
+ Cột Luna C18, (250 x 4,6 mm), 5 µm có sử dụng tiền
cột thép không gỉ (3cm x 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh

IsoBuP,

C18 (5 µm)

BeP, PeP

+ Nhiệt độ cột: 40oC
+ Pha động: ACN: H2O = 40:60
+ Tốc độ dòng: 1ml /phút
+ Bước sóng phát hiện: 254 nm
+ Thể tích tiêm: 10 µl

MeP, PrP,
IsoPrP,
IsoBuP,

[9]

Mỹ phẩm,
thực phẩm
chức năng

Phương pháp UPLC-MS/MS:
+ Pha tĩnh: cột Waters XBridge TM C18 (150mm x
2,1mm x 1,8µm) .

PheP,

+ Pha động: Kênh A: dung dịch CH3COONH4 5mM có

BeP,PeP

chứa HCOOH 0,1%; Kênh B: ACN
+ Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: 50oC
Thời gian
(phút)

Pha động A
(%)

Pha động B
(%)

0-11,5

70

30

11,5-12,0

70-40

30-60

12,0-14,0

40-30

60-70

14,0-15,0

30-20

70-80

15,0-15,5

20-40

80-60

15,5-16,5

40-70

60-30

16,5-19,0

70

30

Sau khi tham khảo các tài liệu tại Việt Nam và trên thế giới, nhóm nhận thấy
điều kiện sắc ký có điểm chung như sau:
- Cột sắc ký: C18
-

Bước sóng phát hiện: 254 nm
Pha động thuờng gồm: MeOH hoặc ACN kết hợp với đệm amoni acetat hoặc
đệm acetat

11


Cùng với điều kiện có sẵn máy và hóa chất tại phịng thí nghiệm, trên cơ sở các
quy trình phân tích thu thập được, chúng tơi lựa chọn HPLC sắc ký pha đảo với cột
pha tĩnh C18 và detector DAD để phân tích, sử dụng pha động MeOH : đệm acetat pH
4,4 và khảo sát ở các tỷ lệ khác nhau, đồng thời lựa chọn phương pháp thích hợp và
thẩm định lại phương pháp đã chọn.
1.5. Vài nét về phương pháp HPLC:
1.5.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao:

HPLC là một kĩ thuật sắc kí được sử dụng để tách các hợp chất trong hỗn hợp
với mục đích định tính, định lượng và tinh chế các thành phần của hỗn hợp. Trong đó,
các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động
lỏng. Các chất phân tích có thể tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu trúc
khác nhau, tính chất khác nhau do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của pha
động khác nhau. Với các chất cùng nhóm có cấu trúc khá tương đồng hoặc đồng phân
đối quang cần tác động vào hệ tách gồm pha tĩnh và pha động để có thể thu được kết
quả tách đáp ứng yêu cầu.[2]
1.5.2. Các thơng số đặc trưng q trình sắc ký:
1.5.2.1. Thời gian lưu
Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi là
thời gian lưu tR. Đối với những chất khơng lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng
tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động. Thời gian tM của chất không lưu
được gọi là thời gian chết.
1.5.2.2. Độ phân giải
Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách 2 chất trong hỗn hợp trên cột sắc
ký:

RS =

2(t R 2 - t R1 )
W1 + W2

=

1,177(t R 2 - t R1 )
W1 + W1
2

trong đó:

1

2

2

RS: Độ phân giải
tR1, tR2: Thời gian lưu chất 1 và chất 2
W1, W2: lần lượt là độ rộng của các pic 1, 2 ở đáy các pic
W1/2 1, W1/2 2: lần lượt là độ rộng của các pic 1, 2 đo ở nửa chiều cao của

pic
RS ≥ 1,5 thì coi như 2 pic tách khỏi nhau hồn tồn.
1.5.2.3. Tính đối xứng của pic sắc ký
Hệ số bất đối xứng:

AF =

b
a

b: nửa chiều rộng phía sau pic
a: nửa chiều rộng phía trước pic

12


Hệ số kéo đuôi: AS =
1.5.2.4.

ab
2a

Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai
pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý
thuyết.
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc
ký nhất định. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ dãn pic nhỏ
1.5.3. Ứng dụng của HPLC:
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: định tính, định
lượng và điều chế
1.5.3.1. Định tính:
Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:
+ So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lưu
của chất chuẩn chạy trong cùng điều kiện sắc ký.
+ So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn
đối chiếu.
+ So sánh phổ UV-Vis (chồng phổ) giữa phổ của mẫu thử với phổ chất đối chiếu bằng
DAD thơng qua hệ số Match.
Ngồi ra cịn có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS để định tính dựa
vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).
1.5.3.2. Định lượng:
Nguyên tắc của phương pháp định lượng bằng sắc ký dựa trên nồng độ của chất
tỷ lệ với chiều cao và diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:
+ Phương pháp chuẩn ngoại
+ Phương pháp chuẩn nội

+ Phương pháp thêm chuẩn
+ Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp sử dụng chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến
hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện
tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu
thử.
Có thể sử dụng chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm
* Chuẩn hóa 1 điểm:

13


Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử
theo cơng thức:
Cx Sx

Cs Ss

Trong đó:

Cx: nồng độ chất thử
Cs: nồng độ chất chuẩn
Sx: diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử
Ss: diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn
* Chuẩn hóa nhiều điểm:
- Áp dữ kiện diện tích (chiều cao) của pic chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được
nồng độ của nó.
- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mơ tả mối quan hệ giữa diện tích (chiều cao) của
pic với nồng độ chất cần phân tích.

S  aC  b

Trong đó:

S: diện tích pic
C: Nồng độ chất phân tích
a: Độ dốc của đường chuẩn
b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

- Dựa vào phương trình hồi quy này ta sẽ tính được nồng độ chất thử:
C

S b
a

Chú ý: Độ lớn của diện tích (chiều cao) của pic phải nằm trong khoảng nồng độ tuyến
tính của đường chuẩn.

14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng nghiên cứu:
5 chất bảo quản dùng trong thực phẩm bao gồm: Acid Sorbic (AS),

Methylparaben (MeP), Ethylparaben (EtP), Propylparaben (PrP) và Butylparaben
(BuP).
Mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích:

+ Mẫu dịch chiết cả quả nhãn thái (khơng có 5 chất bảo quản phân tích)
+ Mẫu dịch chiết cùi tươi nhãn thái (khơng có 5 chất bảo quản phân tích)
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất:
2.2.1. Thiết bị và dụng cụ (Bộ mơn Hóa Dược, Đại học Dược Hà Nội):
+ Thiết bị:


Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hãng Shimadzu, model: L20155518195



Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6mm; 5µm).
Bộ lọc dung mơi (màng lọc 0,45 µm).







Máy lọc hút chân khơng Gast Manufacturing, INC, Mỹ
Cân phân tích Mettler Toledo 21 XPE 105, Mỹ.
Máy đo pH Eutech, Singapore
Tủ lạnh Sanyon MDF U333, Nhật Bản.

Tủ sấy Memmert ULM 500, Đức.

Máy siêu âm Sonirex Bandelin, Đức

Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh.

+ Dụng cụ: Bình định mức, pipet chính xác, bình nón 100ml, quả bóp cao su và các
dụng cụ thủy tinh khác.
2.2.2. Hóa chất:
 Chất đối chiếu AS (Trung Quốc): số lơ: 2020050325 có độ tinh khiết 99,0%
 Chất đối chiếu MeP do Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia cung cấp: số lơ:




20220404 có độ tinh khiết 99,18 %
Chất đối chiếu EtP (Sigma) : BCBL7531V có độ tinh khiết 99,0%
Chất đối chiếu PrP do Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia cung cấp: số lơ:
20170110 có độ tinh khiết 99,14 %
Chất đối chiếu BuP (Sigma): BCBM9217V
Amoniacetat: nhà sản xuất Xilong Scientific Co., Ltd
Methanol (HPLC), hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức
Acetonitril (HPLC), hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức



Nước cất 2 lần








15

2.3. Nội dung nghiên cứu:
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 5 chất bảo quản AS, MeP, EtP,
PrP và BuP trong thực phẩm:
Trên cơ sở tổng quan tài liệu, nhóm nghiên cứu tiến hành lựa chọn điều kiện
phân tích và tiến hành khảo sát một số tiêu chí như tỷ lệ dung mơi pha động và bước
sóng phát hiện.
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng:
Thẩm định phương pháp phân tích theo: “ Hướng dẫn của ASEAN về thẩm
định quy trình phân tích [5] và AOAC [11] với các tiêu chí sau:


Độ phù hợp hệ thống
Độ đặc hiệu



Khoảng tuyến tính và đường chuẩn



Độ đúng
Độ chính xác (Độ lặp lại và độ chính xác trung gian)





2.3.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng 5 chất bảo quản: AS, MeP,

EtP, PrP và BuP trong 1 số loại thực phẩm đang lưu hành trên thị trường
2.4. Phương pháp nghiên cứu:
2.4.1. Xử lý mẫu:
2.4.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn:
+ Dung môi pha mẫu: MeOH
+ Dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng 25,0 mg từng chất
chuẩn AS, MeP, EtP, PrP và BuP vào bình định mức 25,0 ml. Thêm khoảng 20 ml
MeOH, siêu âm 10 phút. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. dung dịch chuẩn gốc
được bảo quản ở điều kiện 0-8oC.
+ Dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng 10 lần bằng
MeOH để được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 100 µg/ml tương ứng .
+ Từ dung dịch chuẩn làm việc pha lỗng bằng dung mơi pha mẫu thành các
dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi
tiêm sắc ký.
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp (10 µg/ml AS; 8 µg/ml các paraben: MeP, EtP,
PrP, BuP): Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn làm việc AS và 4,0 ml dung dịch
chuẩn làm việc các paraben: MeP, EtP, PrP và BuP vào bình định mức 50,0 ml. Thêm
MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm sắc kí.
2.4.1.2. Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu nghiên cứu là các mẫu nhãn trên thị trường, nhóm nghiên cứu tiến hành
chuẩn bị 2 mẫu thử như sau:

16


+ Mẫu thử nguyên cả quả: Cân khoảng 25,0 g nhãn cả quả vào cốc có mỏ 250
ml, đong khoảng 15ml MeOH vào cốc có mỏ, siêu âm 10 phút, làm lặp lại 3 lần như
vậy, sau đó gộp dịch chiết vào bình định mức 50,0 ml. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch,
lắc đều. Lọc dịch qua màng 0,45 µm trước khi tiêm sắc ký.
+ Mẫu thử cùi tươi: Cùi nhãn tươi được xay nhỏ, sau đó cân chính xác khoảng

15,0 g cùi vào cốc có mỏ 100 ml, đong khoảng 15 ml MeOH vào cốc có mỏ, siêu âm
10 phút, làm lặp lại 3 lần như vậy, sau đó rót dịch chiết vào bình định mức 50,0 ml.
Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc dịch qua màng 0,45 µm trước khi tiêm sắc
ký.
Chuẩn bị dung dịch mẫu tự tạo:
+ Dung dịch nền mẫu nguyên cả quả và mẫu cùi tươi được chuẩn bị tương tự
như chuẩn bị dung dịch mẫu thử.
+ Thêm chính xác khoảng lượng dung dịch chuẩn của từng chất AS, MeP, EtP,
PrP và BuP vào mẫu nền sao cho tổng nồng độ sau khi thêm chuẩn tương ứng là 8
ppm (80 %), 10 ppm (100 %), 12 ppm (120 %) đối với AS và 6,4 ppm (80 %), 8 ppm
(100 %), 9,6 ppm (120 %) đối với các parabens.
2.4.2. Lựa chọn phương pháp phân tích:
Qua tổng quan tài liệu, nhóm nghiên cứu tiến hành lựa chọn cột sắc ký, nhiệt độ
cột, pha động, tốc độ dịng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu
và tiến hành khảo sát thêm:
+ Khảo sát lại pha động: Khảo sát tỷ lệ pha động đã lựa chọn ở trên để thu được
sắc ký đồ phù hợp nhất.
+ Bước sóng phát hiện: lấy phổ tử ngoại của các pic chuẩn AS, MeP, EtP, PrP
và BuP để lựa chọn bước sóng phát hiện.
Định tính bằng cách so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic và chồng phổ UVVis, so sánh hệ số tương đương của pic nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được
từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao của pic thu được
từ mẫu thử với mẫu chuẩn.
Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch thử, dung dịch chuẩn vào hệ thống
sắc ký lỏng sử dụng các điều kiện ở trên. Tiến hành sắc ký và ghi lại sắc ký đồ.
Cách đánh giá kết quả:
Dựa vào thời gian lưu: Thời gian lưu của pic thu được từ dung dịch thử phải trùng với
thời gian lưu của pic thu được từ dung dịch chuẩn
So sánh phổ UV-Vis của pic thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu tương ứng với
pic thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các pic này phải đạt từ 0,999
trở lên.

17