xác định rhodamine b trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao hplc sử dụng detector uv - vis

ĐạI HọC QuốC GIA Hà NộI
Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên







Trần thị thanh nga

Xác định rhodamine trong thực phẩm
bằng Kỹ THUậT sắc ký lỏng
Hiệu năng cao hplc Sử DụNG DETETOR UV

Luận văn thạc sĩ khoa học

Giảng viên h-ớng dẫn: pgs.ts phạm luận




H Ni - 2011
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
88
Môc lôc

MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Một vài nét về rhodamine B 3
1.1.1. Công thức cấu tạo 3
1.1.2. Tính chất lý học 3
1.1.3. Tính chất sinh học………………………………………………… 4
1.1.3. Ứng dụng 4
1.2. Các phƣơng pháp xác định rhodamine B 5
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển - phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc
ký bản mỏng- TLC 7
1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8
1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp
HPLC………………… …………………………………………………… …8
1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng…………10
1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về rhodamine B bằng phƣơng pháp
HPLC 11
1.2.3. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B 13
Chƣơng 2: 14
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 14
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu 14
2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu 14
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Detector UV-Vis 16
2.2.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC 17
2.3. Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu 18
2.3.1. Hoá chất 18
2.3.2. Máy móc và thiết bị 19
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
89
3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký 21
3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) 21
3.1.2. Chọn bƣớc sóng của detector 22
3.1.2.1. Phƣơng pháp 1 24
3.1.2.2. Phƣơng pháp 2 26
3.2. Chọn pha tĩnh 28
3.3. Tối ƣu hóa pha động 30
3.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký
30
3.3.1.1. Pha động thứ nhất 31
3.3.1.2. Pha động thứ hai 36
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình tách sắc
ký……………………………………………………………………….………40
3.3.2.1. Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm 40
3.3.2.2.Pha động gồm 85% ACN- 15% đệm 43
3.3.3. Ảnh hƣởng của các chất phụ 45
3.3.3.1. Ảnh hƣởng của trietylamin đối với hệ pha động gồm MeOH và
đệm 45
3.3.3.2. Ảnh hƣởng của natri 1- heptansunfonat tới dung môi ACN
và đệm fomat có pH=3 48
3.3.4. Khảo sát tốc độ pha động 51
3.3.4.1. Hệ pha động MeOH – đệm 51
3.3.4.2. Hệ pha động ACN – đệm 53
3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 57
3.4.1. Tổng kết các điều kiện đã chọn 57
3.4.2. Khảo sát lập đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm
với pha động ACN- Đệm 57

3.4.3. Giới hạn phát hiện (limit of detection- LOD) 61
3.4.3.1. Phƣơng pháp tính toán theo đƣờng chuẩn 61
3.4.3.2. Phƣơng pháp trực tiếp 63
3.4.4. Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ) 64
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
90
3.4.5. Độ đúng của phép đo 64
3.4.6. Độ lặp lại của phép đo 68
3.5. Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý và kết quả phân tích 69
3.5.1. Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B 69
3.5.1.1. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích 69
3.5.1.2. Chọn dung môi chiết 70
3.5.2. Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết 74
3.5.2.1. Mẫu hạt dƣa 74
3.5.2.2. Mẫu bánh xu xê 77
3.5.2.4. Mẫu siro dâu 79
3.5.2.5. Mẫu nƣớc ngọt hƣơng dâu 80
KẾT LUẬN 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO 85

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
1
HPLC
High performance
liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
2
UV

Vùng tử ngoại
3
Vis

Vùng khả kiến
4
ADN
Acid dedonucleoic

5
LC- MS

Sắc ký lỏng khối phổ

6
SPE

Cột chiết pha rắn
7
TLC

Sắc ký bản mỏng
8
MSD

Detectơ khối phổ
9
DAD
Diod array
Điốt array
10
NP- HPLC

Sắc ký hấp phụ pha
thường
11
RP- HPLC

Sắc ký hấp phụ pha đảo
12
Ex- HPLC

Sắc ký trao đổi ion
13

Gel- HPLC

Sắc ký rây phân tử
14
TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam
15
SD

Độ lệch chuẩn
16
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
17
LOQ
Limit of quanlity
Giới hạn định lượng





Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
91
Danh môc b¶ng

Bảng 3.1. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector
đối với hệ dung môi 75% metanol-25% nước. 25
Bảng 3.2. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector
đối với hệ dung môi 85% axetonitril- 15% nước (0,005M natri 1-
heptansunfonat). 27
Bảng 3.3. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 31
Bảng 3.4. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động 37
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc k
’
vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 40
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc k
’
vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 43
Bảng 3.7. Hệ số dung lượng k
i
’
phụ thuộc vào nồng độ trietylamin 45
Bảng 3.8. Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri heptansunfonat 48
Bảng 3.9. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động 51
Bảng 3.10. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động 54
Bảng 3.11. Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ Rhodamine B 58
Bảng 3.12. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,1ppm 65
Bảng 3.13. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,5ppm 66
Bảng 3.14. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 1,0ppm 67
Bảng 3.15. Độ lặp lại của các phép đo tại các nồng độ 69
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới hàm lượng Rhodamine B 70
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới diện tích píc Rhodamine B 72
Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu hạt dưa 75
Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu bánh xu xê 77
Bảng 3.20. Kết quả phân tích mẫu siro dâu 79

Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu nước ngọt hương dâu 81

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 15
Hình 3.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B 23
Hình 3.2. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của
detectơ 26
Hình 3.3. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B 28
Hình 3.4. Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau 29
Hình 3.5. Sự phụ thuộc k
’
vào tỷ lệ % MeOH trong pha động 32
Hình 3.6. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau 34
Hình 3.7. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần ACN khác nhau 35
Hình 3.8. Sự phụ thuộc k
’
vào tỷ lệ % ACN trong pha động 37
Hình 3.9. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau 39
Hình 3.10. Sự phụ thuộc k
i
’
vào giá trị pH của dung dịch đệm 41
Hình 3.11. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhauđối với pha động MeOH-đệm42
Hình 3.12. Sự phụ thuộc k
i
’
vào giá trị pH của dung dịch đệm 43
Hình 3.13. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau 44
Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hệ số dung lượng vào nồng độ TEA 46
Hình 3.15. Sắc đồ píc sắc ký của các Rhodamine B với các nồng độ TEA 47

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ natri heptansunfonat 49
Hình 3.17. Sắc đồ píc sắc ký của Rhodamine B với các nồng độ 50
Hình 3.18. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 52
Hình 3.19. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động 53
Hình 3.20. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động 54
Hình 3.21. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động 56
Hình 3.22. Đường chuẩn theo diện tích pic trong khoảng nồng độ 59
Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký tại các nồng độ khác nhau của Rhodamine B 61
Hình 3.24. Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn Rhodamine B tại các nồng độ 63
Hình 3.25. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,1ppm 66
Hình 3.26. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,5ppm 67
Hình 3.27. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 1,0ppm 68
Hình 3.28. Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với các dung môi chiết 71
Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine với các tỷ lệ dung môi chiết 73
Hình 3.30. Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn đối với mẫu hạt dưa75
Hình 3.31. Đường chuẩn và sắc đồ khi thêm chuẩn đối với mẫu bánh xu xê 78
Hình 3.32. Đường chuẩn(a) và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu siro 80
Hình 3.33. Đường chuẩn (a)và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu nước ngọt82


Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
1
MỞ ĐẦU

Khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khoẻ của con người ngày
càng được chú trọng, trong đó vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường
được đặt lên hàng đầu vì nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của con người.
Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo ngại

đối với người tiêu dùng. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,
nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất độc trong thực phẩm.
Trong quá trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp,
bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp. Phẩm màu công nghiệp nói
chung, rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì
khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơ
thể con người, đặc biệt có thể gây ung thư. Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có
độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp. Do vậy nhiều người đã lạm
dụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử dụng trong thực
phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của các rhodamine B là vấn
đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Tuy nhiên, ngoài sự có mặt của rhodamine B còn có các thành phần hoá
học khác có trong phẩm nhuộm như Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu
nhất để xác định rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đây là một
phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những năm gần đây. Nó được áp
dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phương
pháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp
chất có tính chất hoá học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
2
điểm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều
chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,…
Trong phân tích bằng phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử
dụng là cột trao đổi ion và cột tách pha đảo. Trong luận văn này, chúng tôi sẽ
tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàm
lượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis. Phương pháp này có độ

chọn lọc cao, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta,
có tính khả thi và tính ứng dụng thực tế cao. Phân tích một số mẫu thực phẩm
như hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và các mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm
lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm này. Dựa trên các kết quả nghiên
cứu về phân tích hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm mà có thể
đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm của các cơ sở sản xuất.














Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1. Một vài nét về rhodamine B
1.1.1. Công thức cấu tạo
Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu
công nghiệp.

Công thức phân tử là C
28
H
31
ClN
2
O
3

Phân tử khối là 479,02g/mol.
Công thức cấu tạo của rhodamine B



[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride

1.1.2. Tính chất vật lý
Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở dạng bột màu nâu đỏ.
Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 210
0
C đến 211
0
C
Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trong
methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l). Dung dịch nước và rượu etylic có màu
đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung
dịch loãng. Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có  = 526 và 517 nm.


Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
4
1.1.3. Tính chất sinh học

Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính. Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc
làm mẩn ngứa da, mắt, Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau
ngực. Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận. Nếu tích tụ
dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh
cũng như có thể gây ung thư [17,21]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy
rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm
vào tĩnh mạch [21], khi rhodamine B đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành amin
thơm tương ứng có phần độc hại hơn loại rhodamine B thường, gây ung thư và
phát triển khối u dạ dầy. Tại đây rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác động
mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơ
quan tạng đầu tiên lọc chất rhodamine B [29]. Một số thực nghiệm khác cho thấy
rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi
cấy tế bào [24,19].

1.1.4. Ứng dụng

Rhodamine B thường được sử dụng trong nước để xác định tốc độ và
hướng của dòng chảy vận chuyển [22].
Được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh học như kính
hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [22].
Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng trong vắcxin bệnh dại
cho động vật hoang dã [22].
Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ. Ngoài ra Rhodamine B còn được sử
dụng để tạo mầu và nhuộm mầu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng
thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào do tính bền mầu [23].

Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộm
huỳnh quang. Tận dụng đặc tính phát quang của rhodamine B, người ta dùng
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
5
chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấy
dầu [23].
Tại Indonesia, phẩm mầu được đưa vào thực phẩm làm cho món hàng hấp
dẫn hơn, đánh lừa cảm quan của người dân Indonesia. Việc tổng hợp màu ngày
càng tăng trong một số loại thực phẩm do chi phí rất rẻ [21].
Kết quả phân tích Hóa Lý cho thấy việc sử dụng phẩm màu tổng hợp trong
đồ ăn nhẹ và thức uống chứng minh rhodamine B là phẩm màu được sử dụng
rộng rãi tại Jakarta. Thông tin này dựa trên những nghiên cứu chứng minh rằng
trong 20 đồ ăn nhẹ, 10 loại thức uống và 8 thương hiệu của chất màu đều có
chứa rhodamine B [21]. Một số loại phẩm mầu sử dụng tại Indonesia được cho
vào các loại thực phẩm như: thức ăn snack, tôm, kẹo bông, siro,…Nghiên cứu
cũng chỉ ra trong đồ uống được bán tại các trường tiểu học tiểu bang Bangdung
có chứa phẩm mầu công nghiệp với hàm lượng từ 7,841- 3226,55 ppm [21].
Theo Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc
nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban châu Âu đã quy định rất
rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ
phẩm [11,17] nên không có giới hạn chấp nhận đối với nhóm chất nhuộm này.
Do tính độc hại của rhodamine B nên ở các nước thuộc khối EU và hầu hết các
nước trên thế giới đều cấm sử dụng rhodamine B cho sản xuất và chế biến thực
phẩm [24, 19].

1.2. Các phƣơng pháp xác định rhodamine B
Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích rhodamine B đã
được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp vi

sinh và hóa học. Phương pháp vi sinh phân tích rhodamine B cho độ nhạy và độ
chọn lọc kém [12]. Vì vậy, các phương pháp hóa học được áp dụng rất rộng rãi
trên thế giới như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng khối
phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang.
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
6
Nhưng phương pháp sắc ký bản mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời
gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại và tốn kém [21, 15, 10].
Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng
sử dụng detectơ huỳnh quang là các phương pháp được sử dụng hiện nay [19]…
Tuy các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện
10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại,
thường phải chiết bởi các dung môi độc hại, làm sạch qua cột chiết pha rắn
(SPE) [12] trước khi bơm vào cột sắc ký.
Năm 2006, Brian Stuart và M Walker [11] đã đưa ra một phương pháp xử
lý mẫu nhanh, đơn giản, ít phải sử dụng đến các dung môi độc. Rhodamine B có
khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng
với detectơ UV- Vis là rất phù hợp cho việc phân tích rhodamine B. Vì vậy
chúng tôi chọn phương pháp của Brian Stuat và M.Walker để áp dụng cho
nghiên cứu này. Hiện nay các phương pháp phân tích rhodamine B trong gia vị
vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ cho các
nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học.
Tại Việt Nam, do ý thức chủ quan của con người, môi trường và thực
phẩm ngày càng bị ô nhiễm, nhiều chất độc hại làm ảnh hưởng đến sức khỏe và
gia tăng số người mắc bệnh ung thư. Đặc biệt là việc lạm dụng các chất phụ gia
trong chế biến thực phẩm như sử dụng rhodamine B để làm tăng màu đỏ của gia
vị: bột điều xay, ớt đỏ, bột sa tế, các loại gia vị nấu bò kho, nấu thịt hầm ragu và
hạt dưa đỏ làm cho món hàng hấp dẫn hơn. Ngày 02 tháng 02 năm 2010, sở y tế

Thành phố Hồ Chí Minh đã lấy mẫu ớt bột và mẫu gia vị có mầu đỏ tại cơ sở
Kim Nga- quận Bình Tân để kiểm tra kết quả đã phát hiện mẫu ớt bột sản xuất
ngày 20 tháng 01 năm 2010 có chứa 51 mg/kg rhodamine B và các mẫu bột gia
vị nhuộm màu đỏ lấy cùng ngày có chứa 33,4 mg/kg. Cơ sở này buộc phải tiêu
hủy 77,5kg ớt bột và 258kg gia vị có mầu đỏ vì không đảm bảo vệ sinh an toàn
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
7
thực phẩm [13]… Điều này hết sức nguy hại đối với sức khỏe người tiêu dùng và
góp phần làm gia tăng trực tiếp số người mắc bệnh ung thư trong cộng đồng.
Hiện ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về phẩm mầu công
nghiệp nhóm azo [7, 8], nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về rhodamine B trong
lĩnh vực thực phẩm. Do đó việc xây dựng một quy trình chuẩn áp dụng cho
phòng thí nghiệm địa phương là rất cần thiết. Tiêu chuẩn giới hạn hàm lượng
phẩm màu rhodamine B trong thực phẩm, hàng tiêu dùng…, và những quy định
tiêu chuẩn sức khỏe liên quan tới sức khỏe cộng đồng của Việt Nam hiện nay
vẫn chưa có.
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển- phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản
mỏng (TLC)

Phương pháp này khá đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để
kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích. Phương pháp này có tính ưu việt, tiến
hành nhiều mẫu song song trong một lúc rất tiện lợi. TLC được trang bị phần
phát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng [25,26].
Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn trong
ethanol tuyệt đối để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10g/ml. Rồi tiến
hành xác định định tính trong điều kiện sắc ký sử dụng bản mỏng silicagel
60F254, hoạt hóa ở 110
0

C trong 30 phút. Pha động được sử dụng gồm hai hệ:
Hệ 1: CHCl
3
- MeOH- H
2
O (65: 35: 10)
Hệ 2: EA- MeOH- H
2
O (100: 17: 13)
Phát hiện vết bằng cách quan sát vết ở ánh sáng thường hoặc soi dưới đèn
tử ngoại, bước sóng 366nm. So sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ
của dung dịch thử với vết mẫu của rhodamine B trên sắc ký đồ của dung dịch
chuẩn để đánh giá kết quả [26].


Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
8

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau,
nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu,
hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi
trường,…đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định rhodamine B trong
thực phẩm với các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác
vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao…
Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau rửa giải.

Ngày nay có rất nhiều loại detectơ được sử dụng đã mở rộng khả năng phát hiện
nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng thì người
ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD), nhất là tách và phân tích chất trong các
đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơ
huỳnh quang. Dùng detectơ UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất, nhưng
detectơ huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do
các hợp chất có trong nền mẫu. Ngoài ra còn dùng một số detectơ khác như
detectơ điot array (DAD), detectơ điện hoá [16],… các detectơ này cũng thường
được ứng dụng để phân tích các chất có trong phẩm nhuộm.


1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC
Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá
trình. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha
động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu
phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột
tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong
khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định,
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
9
hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó
luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký.
Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác
nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở
trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên
pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một
khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian này
phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc

của mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành
phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn
đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký [6].
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
 Tương tác hấp thụ
 Tương tác trao đổi ion
 Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau.
 Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC và hấp phụ pha ngược
RP- HPLC)
 Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)
 Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC)

Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách
chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa
các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ
thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp
ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được
lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
10
tới detectơ để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại
detectơ khác nhau [6].

1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng
Mẫu phân tích trong kỹ thuật HPLC thường ở trạng thái lỏng, đa số các
trường hợp không thể chuyển mẫu trong trạng thái nguyên thủy lên cột tách
được. Phương pháp xử lý mẫu hay được áp dụng trong phân tích là chuyển mẫu

về trạng thái lỏng. Phương pháp chiết lỏng- lỏng được áp dụng để xử lý mẫu cho
sắc ký lỏng. Cơ sở chính của phương pháp này dựa vào cân bằng phân bố của
chất tan trong hai hệ dung môi, hệ dung môi chiết và nền của chất mẫu. Yêu cầu
chủ yếu là chọn được một dung môi chiết thích hợp để chiết chất phân tích cho
hiệu suất thu hồi tốt và không ảnh hưởng cho quá trình chạy sắc ký sau này.
Ví dụ theo thạc sĩ Nguyễn Đắc Kiên- Trường Đại học Nha Trang- Khoa
nuôi trồng thủy sản, để phân tích độc tố aflatoxin B
1
trong thức ăn nuôi trồng
thủy sản, mẫu phân tích được cân từ 10- 20 gam cho vào bình nón dung tích
250ml. Chiết mẫu bằng 100ml clorofom (CHCl
3
), lắc 30 phút, tốc độ 140
vòng/phút. Sau đó tiến hành lọc vào bình 250ml và cô quay cạn ở 40
0
C. Hòa cặn
bằng 10ml diclometan (CH
2
Cl
2
), sau đó mẫu phân tích mới được bơm vào cột tách.[5]
Theo tiêu chuẩn xác định hàm lượng Histamin trong sản phẩm thủy sản
bằng phương pháp HPLC dựa theo tiêu chuẩn NMKL số 99-1981(Nordic
committee on food analysis No 99- 1981), mẫu được nghiền bằng máy nghiền
đồng thể, cho vào bình tam giác 150ml, thêm 50ml etanol, lắc đều trong hai
phút. Đặt bình chứa dung dịch mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 60
0
C trong 15
phút, sau đó chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình tam giác bằng
metanol. Để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng rồi định mức tới vạch bằng

metanol. Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc. Mẫu đã chiết được bơm vào cột
tách [28].
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
11
1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về Rhodamine B bằng phƣơng pháp HPLC
Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu để xác định rhodamine B.
Tháng 2 năm 1989, Carcinogen và Pesticide Branch [13], phòng thí nghiệm
hóa phân tích OSHA, thành phố Salt Lake, Utah, đã xác định rhodamine B bằng
phương pháp HPLC, sử dụng detectơ huỳnh quang với các điều kiện như sau:
Cột tách: hypersil ODS, 100mm x 2,1mm, 5m.
Nhiệt độ: 40
0
C
Pha động: 85% axetonitrile, 15% nước với 0,005M axit 1- heptansunfonic, được
điều chỉnh pH tới 3,5 bằng axit H
3
PO
4
.
Tốc độ dòng: 0,2ml/phút
Bước sóng: 556nm
Vòng mẫu: 1,0l.
Với các điều kiện như trên rhodamine B có trong mẫu đã được phát hiện ở
4,5 phút.
Cũng trong năm 1989, R.W. Mason và L.R.Edwards [20] cũng đã tiến
hành thí nghiệm phân tích rhodamine B ở trong huyết tương thỏ và người, sử
dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu DR-3 sử dụng detector huỳnh
quang với các điều kiện:

Cột tách: Bondapak CN (25mm x 4,6mm)
Pha động: axetonitril và nước (35: 65 hoặc 40: 60) chứa 0,1% axit octo-
photphoric.
Tốc độ dòng: 1,8ml/phút.
Nhiệt độ cột: 18  2
0
C
Mẫu huyết tương: 0,5ml huyết tương được pha loãng trong 0,5ml dung dịch
0,05M kali đihidro photphat, pH= 5,5, được chiết trong 5ml etylaxetat.
Kết quả phân tích: Rhodamine B được phát hiện ở 9,7 phút. Mẫu huyết tương
đem phân tích có chứa từ 25 đến 50 ng/ml [25].
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
12
Tháng 6 năm 1996, L. Gagliardi, D. De Orsi, G. Multari, D. Tonelli [16] đã
phân tích rhodamine B trong mỹ phẩm với các điều kiện phân tích được thực hiện
như sau:
Cột tách: C- 18
Pha động: Axetonitril và nước chứa 0,1M natri peclorat với tỷ lệ thành phần thay
đổi từ 50: 50 đến 70: 30.
Mẫu phân tích được pha trong metanol và nước với tỷ lệ 8: 2
Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch phân tích có chứa
0,3g/ml rhodamine B, píc xuất hiện ở 9,15 phút [16].
Ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector
huỳnh quang tác giả J.W.Hofstraat và cộng sự đã xác định rhodamine B trong
nước bề mặt. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 pg/l [17].
Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương [1] đã tiến hành phân
tích Rhodamine B trên các mẫu dược liệu. Các điều kiện sắc ký đã được thực
hiện như sau:

Cột tách: RP- C18 (5m, 4,6mm x 250mm)
Pha động: 50% Axetonitril- 50% đệm kaliđihidrophotphat 20mM- trietylamin
(100: 0,3), điều chỉnh pH tới 3,0 bằng axit photphoric.
Tốc độ dòng: 1,4ml/phút
Detector: UV-Vis
Bước sóng: 525nm.
Lượng tiêm: 20l.
Kết quả phân tích cho thấy trong dược liệu có chứa Rhodamine B[1].
Tháng 4 năm 2011, Việt Nam đã có TCVN 8670-2011, xác định
Rhodamine B bằng HPLC [10] trên cơ sở của viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia đã xây dựng và thực nghiệm cho một số loại thực phẩm có
nhuộm màu.
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
13

1.2.2. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B
Để xác định rhodamine B, người ta còn sử dụng phương pháp UV- Vis.
Lấy mẫu chất đem hoà tan trong dung môi thích hợp, lắc, rung siêu âm và chiết
lấy dung dịch. Đem dung dịch chiết được đo bằng máy UV- Vis, dựa vào cực đại
hấp thụ ta có thể định tính và định lượng rhodamine B [11, 15].

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
14
Chƣơng 2:
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Trong luận văn này, hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích rhodamine
B có trong thực phẩm, cụ thể là các mẫu thực phẩm: siro dâu, bánh xu xê, hạt
dưa, nước ngọt hương dâu.
Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector hấp thụ phân tử UV-
Vis được lựa chọn. Từ đó xây dựng một quy trình phân tích để áp dụng xác định
rhodamine B trong thực phẩm.

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Với mục tiêu nghiên cứu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu

tách và xác định rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis.
Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với độ nhạy và độ chính xác cao.Vì vậy, cần
nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:
1- Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng Rhodamine B bằng HPLC,
cụ thể là:
 Chọn bước sóng của detector.
 Chọn pha tĩnh.
 Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động.
 Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
 Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo.
2- Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
15
 Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu và xác định độ thu hồi.
 Chọn dung môi chiết Rhodamine B ra khỏi nền mẫu.
3- Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác
định hàm lượng rhodamine B trong một số loại thực phẩm để đánh giá mức độ
an toàn của thực phẩm.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu thực phẩm và chất
phân tích là phẩm mầu. Thông thường, trong các mẫu thực phẩm có rất nhiều
thành phần, nền rất phức tạp. Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High
Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sát
điều kiện tách và định lượng Rhodamine B.
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt

như trong hình 2.1.



Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
16
2.2.1. Detector UV-Vis
Loại detector này thực chất là các máy đo hấp thụ phân tử vùng tử ngoại
(UV) và vùng khả kiến (Vis). Nhưng ở đây buồng đặt cuvet đo được thay thế
bằng các cuvet đo dòng chảy (flowcell). Việc đo để phát hiện các chất phân tích
hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất
ở trong dung dịch tại một độ dài sóng nào đó, nhưng dung dịch ở đây là pha
động của quá trình sắc ký, nó chứa chất phân tích và chảy liên tục qua buồng đo
(flowcell). Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực
tiếp của chính nó. Như vậy nói chung tất cả các chât phân tích hay hợp chất của
nó đối với một thuốc thử mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng
nào đó trong vùng phổ UV-Vis đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại
detector này. Nguyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định
luật hấp thụ ánh sáng
0
lg . .
I
A l C
I





Trong đó:
A

là độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất phức của nó với thuốc
thử phân tích ở bước sóng .
 là hệ số độ hấp thụ quang phân tử (độ tắt phân tử)
l là bề dầy của lớp hấp thụ (chiều dài của flowcell).
Về nguyên tắc cấu tạo, loại detector này bao gồm các phần chính như sau:
 Nguồn sáng điểm S: là đèn D
2
(cho vùng phổ UV), hay đèn W- Halid (cho
vùng phổ Vis).
 Buồng mẫu và môi trường hấp thụ (flowcell).
 Bộ đơn sắc để thu chùm sáng, phân ly và chọn tia sáng cần đo. Trong các
detector đơn giản thì đây là một kính lọc cho các vùng phổ nhất định.
 Bộ phận điện tử thu nhận và khuếch đại tín hiện đo.
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
17
 Bộ phận chỉ thị kết quả.
Trong thực tế, rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại với
một thuốc thử phân tích đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detectơ
này. Detectơ UV- Vis đang được dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC vì nó
có độ nhạy tương đối cao, đơn giản, dễ dùng và không quá đắt.

2.2.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC
Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là

thời gian lưu t
Ri
của chất đó trên cột tách. Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu
này để định tính (thông qua mẫu chuẩn). Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích
thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất.
Để biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào mỗi pha là bao nhiêu, ta
dựa vào hệ số lưu k
’
i


'
0
0
()
()
Ri R
i
R
tt
m SP
k
m MP t



Trong đó:
k
’
I

là hệ số lưu
m(SP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh.
m(MP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha động.
t
Ri
là thời gian lưu của chất thứ i
t
R0
là thời gian chết của cột tách.
Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng
độ chất phụ thuộc vào chiều cao píc hoặc diện tích.
H= k.C
b

S= k. C
b

Trong đó:
Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
18
H là chiều cao pic sắc ký của chất
S là diện tích pic sắc ký của chất
k là hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký
b- là hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b  1
Ở vùng nồng độ nhỏ thì b= 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:
H= k
1
.C = f(C)

S= k
2
.C =f(C)
Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo
phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn. Dùng phương pháp
đường chuẩn nhanh, đơn giản. Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần
xác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn.

Đối với các píc tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của
diện tích píc vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn.
Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích.
Nên trong phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic.
Tuy nhiên đối với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc
đo diện tích pic lại chính xác hơn.
Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào
nông độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định
nồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn.

2.3. Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu
2.3.1. Hoá chất
Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích và HPLC
Dung dịch chuẩn: