10 Tcn 719-2006.Doc

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
__________________

10TCN

TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 719-2006
QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH NEWCASTLE


10 TCN 719 – 2006

Hà Nội - 2006

TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 719 – 2006

QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH NEWCASTLE
ngày

(Ban hành kèm theo Quyết định số
QĐ/BNN-KHCN
tháng 5 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)

1. Phạm vi áp dụng
Quy trình này được áp dụng để chẩn đoán bệnh Newcastle của gia cầm tại các phòng
xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật.
2. Khái niệm
Bệnh Newcastle là một bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh ở gà mọi lứa t̉i. Gà có

những triệu chứng về hơ hấp, tiêu hố và thần kinh, tỷ lệ ốm và chết cao. Bệnh gây thiệt hại
lớn về kinh tế .
Virus Newcastle thuộc họ Paramyxoviridae phân nhóm PMV–1.
3. Lấy mẫu, bảo quản và gửi bệnh phẩm
3.1. Lấy mẫu
- Lấy mẫu vào thời kỳ đầu của ổ dịch. Lấy ngay sau khi con vật chết hoặc mổ khám.
- Mẫu bệnh phẩm là não (đầu gà), phủ tạng (gan, lách, thận, phởi) hoặc dùng tăm bơng
ngốy các giếng tự nhiên như: Hầu họng, khí quản, hậu môn.
- Các mẫu bệnh phẩm được lấy vô trùng và đựng trong lọ hoặc túi nilon sạch.

1


10 TCN 719 – 2006
- Nếu là gà bệnh hoặc xác gà mới chết phải gửi từ 3 con đến 5 con. Đàn gà bị bệnh nên
gửi thêm một số mẫu huyết thanh (từ 10 mẫu đến 20 mẫu) để kiểm tra kháng thể Newcastle
trong đàn.
3.2 Bảo quản và gửi bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm phải được bao gói cẩn thận tránh ô nhiễm ra môi trường xung quanh.
- Bảo quản và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 20C đến 80C.
- Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt, kèm theo phiếu gửi
bệnh phẩm.
4. Thiết bị - dụng cụ - nguyên liệu
4.1. Thiết bị
- Tủ lạnh thường
- Tủ ấm 370C
- Tủ sấy từ 1000C đến 2000C
- Tủ ấp trứng
- Nồi hấp ướt .
- Máy ly tâm từ 2000 vòng/phút đến 6000 vòng/phút

4.2. Dụng cụ
- Pipet khắc độ 1ml, 5 ml, 10 ml.
- ống hút Pasteur
- Micropipet từ 1 l đến 200 l
- Micropipet 8 kênh (dùng pha loãng) từ 1l đến 50 l
- Đầu típ 200 l
- ống lấy máu 10 ml
- Lọ chắt huyết thanh 2 ml
- Bơm tiêm thuỷ tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml
- Bộ cối chày sứ có đường kính 6 cm
- Dụng cụ dao, kéo, panh, kẹp
4.3. Nguyên liệu
- Bông, cồn
- Muối NaCl
- Kháng sinh: Peniciline, Streptomicyne, Kanamicyne
- Tri-Natrium citrate- C6H5Na3O7.2H2O (Chất chống đông)
- Nước cất
- Kháng nguyên chuẩn Newcastle
- Kháng huyết thanh chuẩn Newcastle
5. Phương pháp chẩn đoán.
Sơ ụ chõn oan bờnh Newcastle
Kiểm tra lâm sàng

Đặc điểm dịch tễ
học

Lấy mẫu bệnh phẩm
Phát hiện kháng
thể (HI)

Phân lập virus
(-)
(+)

2


10 TCN 719 2006

Giám định (HI)

Kết luận bệnh

5.1. c điểm dịch tễ học
- Bệnh Newcastle là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan cho gà mọi lứa tuổi.
- Có tỷ lệ ốm và chết cao.
5.2. Kiểm tra triệu chứng – bệnh tích
5.2.1. Triệu chứng
KLuËn:
- ủ rũ, ít vận động, nhắm mắt, uống nhiều nước, mào tím tái.
- Khó thở, ho, ngáp, lắc đầu, dịch nhớt chảy ra từ mũi, miệng, diều căng đầy hơi.
- Giảm đẻ, trứng biến dạng, vỏ xù xì hoặc thiếu canxi.
- Phân lỏng, màu trắng xanh, dính bết vào lông quanh giếng huyệt.
- Gà bị bệnh sau 5 ngày đến 6 ngày xuất hiện triệu chứng thần kinh: Vẹo cổ, bước vòng
tròn, liệt chân cánh.
5.2.2. Bệnh tích
Tuỳ theo thể bệnh có thể thấy nhiều hoặc một trong những bệnh tích đặc trưng sau:
- Thanh khí quản đọng dịch nhầy xuất huyết.
- Phổi xuất huyết lấm tấm.
- Niêm mạc miệng, thực quản có điểm xuất huyết.

- Niêm mạc giữa dạ dày tuyến và dạ dày cơ (cuống mề) có điểm xuất huyết.
- Niêm mạc ruột viêm, xuất huyết, có nốt loét hình cúc áo. Manh tràng xuất huyết. Trực
tràng, hậu môn viêm loét, xuất huyết.
- Buồng trứng xuất huyết, trứng non vỡ trong xoang bụng gây viêm phúc mạc.
5.3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm:
5.3.1. Phát hiện kháng nguyên: Virus gây bệnh
Xử lý bệnh phẩm
3


10 TCN 719 – 2006
Não hoặc các phủ tạng được nghiền trong cối chày sứ vô trùng, pha thành huyễn dịch
1:10 với nước sinh lý (hoặc PBS pH 7,2) có kháng sinh (Penicillin 2000UI/ml, Streptomycin
2mg/ml).
Nếu bệnh phẩm là tăm bông ngốy lỡ huyệt hoặc phân thì dùng kháng sinh đặc gấp 5
lần. Để ở tủ lạnh 40C trong 2 giờ.
Ly tâm từ 1500 vòng/phút đến 2000 vòng/phút trong 15 phút, lấy nước trong ở trên để
tiêm phôi trứng.
5.3.1.1 Phân lập virus:
5.3.1.1.1.Tiêm trứng gà có phôi
Dùng trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 11 ngày tuổi, lấy từ trại gà sạch bệnh.
- Soi trứng, chọn phôi khoẻ.
- Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ 3 phôi đến 5 phôi.
- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70%.
- Dùi vị trí tiêm ở phía trên buồng hơi.
- Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm rồi tiêm 0,2ml vào xoang niệu mô.
- Gắn kín giếng tiêm bằng keo dán.
- ấp tiếp ở tủ ấm từ 37 0C đến 380C. Ngày soi trứng 2 lần, loại bỏ phôi chết trước 24 giờ.
Theo dõi từ 5 ngày đến 7 ngày.
- Các trứng có phôi chết hoặc gần chết để vào tủ lạnh 4 0C. Phôi nhiễm virus Newcastle

cường độc thường chết từ 24 giờ đến 60 giờ.
- Sau 5 ngày đến 7 ngày các trứng không chết được để tủ lạnh 40C giết phôi.
5.3.1.1.2.Thu hoạch nước trứng
Trứng chết và trứng sống sau khi để tủ lạnh 4 0C được mổ khám, kiểm tra bệnh tích và
thu hoạch nước trứng.
- Mổ trứng trong điều kiện vô trùng, sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70%
- Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô.
- Hút nước trứng vào lọ vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 40C để kiểm tra.
- Kiểm tra bệnh tích: phôi có xuất huyết lấm tấm ở da đầu, thân, chân, cánh.
5.3.1.1.3. Kiểm tra virus
Kiểm tra nước trứng thu hoạch bằng phản ứng HA.
Tiến hành: Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà - HA (Xem phụ lục 2):
Đánh giá kết quả:
- Nếu phản ứng HA dương tính, xác định có virus gây bệnh.
- Nếu phản ứng HA âm tính, phôi chết, có xuất huyết cần tiêm truyền lần 2 để xác định
tiếp nguyên nhân gây bệnh.
5.3.1.2. Giám định virus
Giám định virus phân lập được bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn
Newcastle.
Tiến hành: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà - HI (Xem phụ lục 3).
Đánh giá kết quả:
- Nếu phản ứng HI dương tính, kết luận virus phân lập là virus Newcastle.
- Nếu phản ứng HI âm tính, cần kiểm tra tiếp với kháng huyết thanh của một số virus
có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu gà (ví dụ: kháng huyết thanh Cúm, EDS…).
5.3.1.3. Xác định tính độc lực của virus Newcastle (tuỳ theo yêu cầu chẩn đoán).
Virus Newcastle có 3 nhóm độc lực:
- Nhóm độc lực cao (Velogenic): Gây xuất huyết đường tiêu hoá, có tỷ lệ chết cao.
- Nhóm độc lực vừa (Mesogenic): Có triệu chứng hô hấp, đôi khi có triệu chứng thần
kinh, tỷ lệ chết thấp.
4

10 TCN 719 – 2006
- Nhóm độc lực yếu (Lentogenic): Gây nhiễm đường hô hấp ở thể nhẹ
Xác định tính độc lực của chúng bằng các chỉ số: MDT - ICPI – IVPI
(Xem phụ lục 4 - 5 - 6).
5.3.2. Phát hiện kháng thể:
Phản ứng HI phát hiện kháng thể Newcastle có trong mẫu huyết thanh kiểm tra do
mắc bệnh tự nhiên hoặc được tiêm vacxin.
- Mẫu bệnh phẩm: Là huyết thanh kiểm tra.
- Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên Newcastle chuẩn
+ Mẫu huyết thanh kiểm tra
+ Nước sinh lý 0,85%
+ Hồng cầu gà 1%
- Tiến hành:
+ Phản ứng HA: Xác định hiệu giá kháng nguyên Newcastle (xem phụ lục 2).
+ Pha 4 đơn vị HA: dùng cho phản ứng HI (Xem phụ lục 3.1)
+ Phản ứng HI: Xem phụ lục 3.
- Đánh giá kết quả: Nếu gà chưa được tiêm phòng có hiệu giá kháng thể lớn hơn hoặc
bằng 1/8 kết luận gà bị nhiễm virus Newcastle.
6. Kết luận
Dựa vào: Dịch tễ học
Triệu chứng lâm sàng
Kết quả xét nghiệm
Các đàn gia cầm có diễn biến dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng như đã nêu ở các mục
5.1; 5.2 và 5.3 phân lập có kết quả dương tính virus Newcastle hoặc có kháng thể Newcastle
quá cao so với hiệu giá kháng thể của vacxin thì kết luận gà mắc bệnh Newcastle.

KT. BỘ TRƯỞNG

THỨ TRƯỞNG

Bùi Bá Bổng

5


10 TCN 719 – 2006

Phụ lục 1
Chuẩn bị huyễn dịch hồng cầu gà 1%
1.1. Gà lấy máu là gà trống đã trưởng thành, khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng Newcastle.
1.2. Nuôi gà ở ch̀ng an tồn, dùng để lấy máu thường xuyên.
1.3. Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoặc tim) bằng bông cồn 70%.
1.4. Dùng bơm tiêm từ 5ml đến 10ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đông
(Natri xitrat 4%, Alserver…) rồi hút lấy máu gà. Cho máu vào ống nghiệm.
1.5. Rửa hồng cầu: Cho nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống lấy máu, một lượng gấp đôi
lượng máu trong ống, lắc đều. Ly tâm từ 1.500 vòng/phút đến 2.000 vòng/phút, trong 10
phút, đổ bỏ huyết tương ở trên.
Rửa như trên từ 2 lần đến 3 lần. Sau lần ly tâm cuối, bỏ nước ở trên, lấy hồng cầu để pha.
1.6. Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1%. Ví dụ: 1 ml hồng cầu và 99 ml nước sinh lý.
1.7. Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ từ 4 0 C đến 80 C. Hồng cầu sau khi pha có thể
dùng trong một tuần (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ).
Hồng cầu không dùng hết, cần cho nước sinh lý vào bảo quản. Khi cần, ly tâm lại để dùng.

Phụ lục 2
Kỹ thuật làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà
(HA – Haemagglutination test)
2.1. Nguyên liệu
- Hồng cầu gà 1%

- Nước trứng thu hoạch ( hoặc kháng nguyên Newcastle): đối chứng dương
6


10 TCN 719 – 2006
- Nước sinh lý
- Mẫu cần xét nghiệm
Các Giếng
bước N.liệu
Nước
sinh lý
Pha
(l)
loãng
Kháng
KN
nguyên
(l)
Hồng cầu
(l)
Cho
hồng
Độ pha
cầu
loãng KN

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 đối
chứng
hồng
cầu

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

0

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

2
4
8 16 32 64 128 256 512 1024 2048

2.2. Phản ứng HA: Dùng đĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ U
2.3. Trình tự tiến hành phản ứng HA
- Cho nước sinh lý vào mỗi giếng 25 l từ giếng 1 đến giếng 12.
- Cho kháng nguyên cần kiểm tra vào giếng 1 (25 l).
- Pha loãng kháng nguyên: trộn đều kháng nguyên với nước sinh lý ở giếng 1, hút 25 l
chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 l chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy
đến giếng 11, đổ bỏ 25 l đi.
- Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 l, lắc nhẹ 1 phút. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng.
Sau 15 – 30 phút đọc kết quả.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm.
+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn.
Hiệu giá ngưng kết được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện
ngưng kết hoàn toàn. Ví dụ: 1/256 là giếng cuối cùng còn có ngưng kết.
2.4. Nhận định kết quả
- Nếu HA dương tính: Kết luận có virus gây bệnh. Để xác định là virus Newcastle cần
phải làm phản ứng HI với kháng huyết thanh dương tính chuẩn Newcastle.
- Nếu phản ứng HA âm tính: Có thể trong bệnh phẩm không có mặt virus Newcastle
hoặc lượng virus quá ít. Vì vậy, cần tiêm phôi trứng 1 lần nữa.

Phụ lục 3
Kỹ thuật làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà.
(HI – Heamagglutination Inhibition test)
3.1. Nguyên liệu
- Nước muối sinh lý 0,85%
- Hồng cầu gà 1%
- Huyết thanh kiểm tra (hoặc kháng huyết thanh chuẩn Newcastle)
- Kháng nguyên chuẩn Newcastle (hoặc nước trứng thu hoạch):
7

10 TCN 719 – 2006
Kháng nguyên dùng cho phản ứng HI được pha 4 đơn vị HA.
Ví dụ: HA bằng 1/256, 4HA bằng 1/64
Kháng nguyên pha 4 đơn vị HA cần phải chuẩn để phản ứng HI có kết quả chính xác.
Cách pha: Ví dụ: 4HA bằng 1/64.
Pha 4HA gồm 1 phần KN và 63 phần nước sinh lý.
Kiểm tra kháng nguyên 4 HA đã pha: Tiến hành phản ứng HA nếu kết quả ngưng kết
đến giếng thứ 2, như vậy kháng nguyên pha đạt. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 (hoặc hơn)
là kháng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở giếng đầu tiên là kháng nguyên pha loãng.
Dựa vào kết quả đó để bổ xung thêm kháng nguyên hoặc nước sinh lý để có kháng nguyên
4HA chuẩn.
(Pha vào lọ vaccine 2ml nước muối sinh lý 2-8 độ C. Thì 1 HAU khoảng giếng 9-8
vì 1/128 hay 1/64 là lấy từ lọ vaccine đã pha 2 ml nước muối sinh lý. nếu pha tỉ lệ khác
kết quả sẽ khác
3.2. Phản ứng HI: Dùng đĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ U
3.3. Trình tự tiến hành phản ứng:
- Cho nước sinh lý vào mỗi giếng 25 l từ giếng 1 đến giếng 12
- Cho huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1 ( 25 l )
- Pha loãng huyết thanh: Trộn đều huyết thanh với nước sinh lý ở giếng 1, rồi hút 25 l
chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 l chuyển sang giếng 3 tiếp tục làm như vậy đến giếng
11, đổ bỏ 25 l đi.
- Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ 1 đến 11, mỗi giếng 25 l.
- Lắc nhẹ, để 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 l, lắc nhẹ 1 phút. Để đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng.
Sau 15-30 phút đọc kết quả.
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng
thể tương ứng.
+ Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa

kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng.
Giếng
Các
bước

Pha
loãng
HT
Cho
KN

6

7

8

9

10

11

12
đối
chứng
hồng
cầu

25 25 25 25 25 25

25

25

25

25

25

25

25 25 25 25 25 25

25

25

25

25

25

0

25 25 25 25 25 25

25

25

25

25

25

0

25

25

25

1

2

3

4

5

N.liệu
Nước sinh
lý (l)

Huyết
thanh
NCX
4 HA
Newcastle
(l)

Lắc nhẹ, để 30 phút ở nhiệt độ phòng
Cho
H.cầu

Hồng cầu
(l)

25 25 25 25 25 25

25

25

25

8


10 TCN 719 – 2006
Độ pha
loãng HT

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

2

4

8

16 32 64 128 256 512 1024 2048

3.4. Nhận định kết quả:

* Mẫu là huyết thanh kiểm tra kháng thể:
- Hiệu giá kháng thể của mẫu huyết thanh kiểm tra được tính ở độ pha loãng cao nhất
còn có hiện tượng ức chế ngưng kết.
- Những gà chưa được chủng vacxin có kháng thể lớn hơn hoặc bằng1/8 (3log2) thì
mẫu đó được coi là nhiễm virus Newcastle.
* Mẫu là kháng nguyên (nước trứng giám định virus phân lập)
Nếu có hiện tượng ức chế ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn Newcastle chứng
tỏ viru-s phân lập là virus Newcastle.

Phụ lục 4
Phương pháp xác định thời gian gây chết phôi trung bình
( MDT – Mean Dead Time )
Chủng virus phân lập (nước trứng) được pha loãng từ 10-1 – 10-9
- Tiêm mỗi nồng độ cho 5 phôi gà từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi với liều 0,1 ml/ phôi
- Đối chứng: 5 phôi không tiêm. Trứng được đem ấp tiếp ở 370C
- Soi trứng ngày 2 lần trong 7 ngày, ghi giờ và số phôi chết.
Ví dụ bảng sau:
Độ pha
loãng

Số trứng tiêm

-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8

-9
Đ.chứng

5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Tổng số
phôi chết

Thời gian phôi chết (giờ)
24

36
2
1
2
1

48
3
2
1

2

60
1
1
2

72
1
1

84 96

100
5
5
5
5

0

9


10 TCN 719 – 2006
- MDT: là thời gian trung bình được tính bằng giờ cho liều tối thiểu gây chết 100% số
phôi. Ví dụ ở bảng trên ta có:
(1 x 36) + (2 x 48) + (2 x 60)
MDT =

= 50,4 giờ
5
- Liều gây chết phôi tối thiểu là độ pha loãng cao nhất của virus gây chết 100% số phôi.
- Nhận định kết quả: Dựa vào kết quả của MDT để phân loại virus Newcastle:
Nhóm Velogenic: MDT nhỏ hơn 60 giờ.
Nhóm Mesogenic: MDT lớn hơn 61 giờ và nhỏ hơn 90 giờ.
Nhóm Lentogenic: MDT lớn hơn 90 giờ.

Phụ lục 5
Phương pháp xác định chỉ số độc lực trên não gà con
(ICPI – Intracerebral Pathogenicity Index)
Chủng Virus phân lập (nước trứng) được pha nồng độ 10-1(1/10) tiêm vào não 10 gà
con 1 ngày tuổi, với liều 0,05 ml/con.
Gà được theo dõi trong 8 ngày liền, ghi lại những biểu hiện sức khoẻ: ốm, chết, bình
thường. Biểu hiện bệnh được tính bằng điểm:
+ Chết:
2 điểm
+ ốm:
1 điểm
+ Bình thường:
0 điểm
Ví dụ:
Ngày

1

Số chết
Số ốm
Số bình thường

1
1
8

7
3

B
Cách tính: =

2

4

5

6

10

10

10

10

7

8

10 10

68
4
8
A
80

Điểm
2
1
0

Tổng
số
điểm
136
4
0
B
140

140
=

A

3

Cộng

dồn

= 1,75
80
10


10 TCN 719 – 2006
Chỉ số ICPI chỉ số độc lực của virus được đánh giá như sau:
Nhóm Velogenic từ 1 đến 2
Nhóm Mesogenic lớn hơn hoặc bằng 0,5
Nhóm Lentogenic bằng 0

Phụ lục 6
Phương pháp xác định chỉ số độc lực khi tiêm tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi
(IVPI – Intravenous Pathogenicity Index)
Chủng virus phân lập (nước trứng) được pha với nước sinh lý vô trùng thành huyễn
dịch 10-1 (1:10), tiêm 0,1 ml vào tĩnh mạch cho 10 gà 6 tuần tuổi lấy từ đàn gà sạch bệnh.
Gà được theo dõi trong 10 ngày liền, ghi lại tình trạng sức khoẻ và đánh giá theo qui
định:
+ Bình thường:
0 điểm
+ ốm:
1 điểm
+ Liệt:
2 điểm
+ Chết:
3 điểm
Ví dụ:
Ngày

Số chết
Số liệt
Số ốm
Số bình thường

1

2

3

4

5

6

2
2
3
3

6
2
2

80
2

10

10

10 10 10

B

7

8

Cộng
dồn
86
6
5
3
A
100

Điểm
3
2
1
0

Tổng số
điểm
258
12

5
0
B
275

275
11


10 TCN 719 – 2006
Cách tính: =

=
= 1,75
A
100
Chỉ số ICPI chỉ số độc lực của virus được đánh giá như sau:
Nhóm Velogenic từ 1,5 đến 3,0
Nhóm Mesogenic bằng 0
Nhóm Lentogenic bằng 0

11. Serology
Introduction
The presence of antibodies to Newcastle disease virus in chickens is detected by serological
testing. The results of these tests are used for three purposes.
1. To assess the efficacy of Newcastle disease vaccine in laboratory and field trials.
2. To assess the level of Newcastle disease virus antibodies in the field.
3. Serum known to contain antibodies to Newcastle disease virus is used to confirm the presence
of Newcastle disease virus in a test sample of allantoic fluid. Such a sample would be obtained
during the isolation of virulent Newcastle disease virus. See Section 15.

There are two assays commonly used to carry out serological testing for Newcastle disease virus
antibodies.
1. Haemagglutination inhibition (HI) test. The HI test is a convenient and commonly used assay that
requires cheap reagents and is read by eye.
2. ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay). This is a colourimetric assay and requires the use
of a sophisticated instrument to read the optical density of the reactions. ELISA kits for Newcastle
disease virus antibody detection are prepared and sold commercially. Detailed instructions are
supplied with the kits. They are usually quite expensive.
In this manual a protocol for the HI test based on the test described by Allan and Gough will be
used for serological testing. (Allan and Gough, 1974 a.)
Preparation of serum
Serum samples are collected for testing for the presence of antibodies to Newcastle disease virus.
Blood is collected as described in Section 7. The blood forms a clot in the syringe in a few minutes.
Once the blood clots, the syringes of blood can be kept with the needle upright to prevent serum
filling the needle cap. The serum will separate from the clot within a few hours at room temperature
or in approximately 2 hours at 37°C. Storage at 37°C will help the serum separate from the clot.
Materials



Syringes with blood samples.
Sterile glass Pasteur pipettes.

12


10 TCN 719 – 2006




Microfuge tubes.
Storage tubes. (1.8 mL Nunc cryotubes are ideal but microfuge tubes are a cheaper
alternative.)
Sharps container and discard bag for biological waste.

Method
1. Remove the plunger from the syringe. Transfer the serum to a microfuge tube by pouring or
using a glass Pasteur pipette.
2. Dispose of needles, syringes, clots and pipettes in appropriate containers.
3. Often the serum will contain red blood cells. Centrifuge for 30 seconds in a microfuge centrifuge
or allow to settle under gravity overnight at 4°C to pellet the cells. Do not freeze the samples at this
step. Freezing will lyse the red blood cells.
4. Transfer clear serum to a second tube.
5. Remember to label each tube after the transfer of the serum. This ensures the serology results
can be applied to individual birds and groups.
Storage of Serum
Store ampoules of serum at -20°C.
Storage at 4°C is acceptable for a short period, up to 2 weeks.
Notes on serum samples
Samples collected in the field may end up at room temperature overnight and often do not
separate well.
It has been noted at the John Francis Virology Laboratory that in some samples the serum does
not separate from the clot. In these cases, the whole clot is centrifuged. This usually results in a
small amount of serum separating.
It is important that the serum samples are clear. Pink samples contain lysed red blood cells.
When pink samples are tested observe both test and control samples carefully to determine effect
of the colour on the results of the test.
Pink coloured samples can affect results of an ELISA, which is a colourimetric assay.
An overview of the Haemagglutination Inhibition (HI) test

Antibody response to the haemagglutinin protein in the Newcastle disease virus envelope can
be measured by the HI test.
When serum containing these antibodies is mixed with Newcastle disease virus, the antibodies
bind to the haemagglutinin protein in the envelope of the virus. This blocks the haemagglutinin
protein from binding with the receptor site on chicken red blood cells.

13


10 TCN 719 – 2006
Thus the haemagglutination reaction between the virus and the red blood cells is inhibited.
By performing two-fold serial dilutions on the serum prior to testing, the concentration of the
serum antibodies can be expressed as an HI titre to the log base 2.
Standardization of the HI test
It is important that there is correlation between the results of tests carried out by different
technicians and in different laboratories. For this reason HI tests should be standardized both within
a laboratory and between laboratories.
Standardization is achieved by following a standard protocol. This will include:
Using a standard 4 HA units of Newcastle disease virus antigen.
Using standard positive anti-serum and negative serum.
Including a serum control for each test serum to detect the presence of non-specific agglutinins.
Using a standard 1 percent dilution of red blood cells.
The use of control serum in the HI test
Positive and negative control sera are tested to avoid errors in the interpretation of the results of
the HI test. Inconsistencies in the results of the HI test may be caused by variations in reagents and
procedures.
Examples of possible variations include:
The source and exact percentage by volume of the red blood cells.
The exact amount of antigen used in the HI test.
Accuracy of dilutions.

Temperature.
Time allowed for the antibody/antigen reactions to occur.
Quality of test serum samples (haemolysed serum samples may be responsible for non-specific
reactions)
Two standard sera are used.
1. A standard negative control serum known to contain no antibodies to the Newcastle disease
virus. It has no HI titre and does not agglutinate chicken red blood cells.

14


10 TCN 719 – 2006
2. A standard positive control serum also known as a standard anti-serum. The HI titre of the antiserum will have been established by repeated titration.
Variability in HI titres of standard positive serum
It is sometimes observed that the standard HI titre of the standard anti-serum tested on the same
day with the same antigen preparation and protocol may vary. A difference in HI titre of one dilution
that is one log base 2 (21) can be regarded as due to random errors and an inherent variability in
biological responses. However if the titre of the standard positive serum differs by more than one
dilution or log base 2, then the test is invalidated. In this case, fresh antigen must be prepared and
tested and the HI test repeated.
Three categories of standard sera
1. International standard reference serum. Certain laboratories prepare reference serum to a
very high standard. Standard reference Anti-Newcastle disease serum is available for purchase. It
is used as a reference serum in the preparation of national and laboratory standard sera.
The National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) in the United Kingdom can
supply an international standard reference serum. The potency of the international reference serum
has been determined by the supplier and is expressed in International Units (IU) per ampoule of
freeze-dried serum.
Contact
Email

Tel 44 (0) 1707 654753
Fax 44 (0) 1707 646730
Website
2. National standard serum is prepared by a national laboratory and distributed to collaborating
laboratories as required. This serum is prepared by mixing sera with known HI titres. A series of HI
tests are carried out to establish the HI titre of the national standard. This is compared with the HI
titre of the international standard reference serum if available. The national standard serum is then
stored in multiple aliquots and distributed to collaborating laboratories within a country.
3. Laboratory standard serum is prepared by some laboratories in order to conserve supplies of
national standard serum. The laboratory standard is prepared by mixing serum samples with known
HI titres. Comparative HI testing of the laboratory standard and the national standard is used to
establish the HI titre of the laboratory standard.
Preparation of national and laboratory standard sera
Each laboratory will require a supply of negative and positive control serum in order to carry out HI
tests on serum samples.
Collection of HI negative serum
Collect serum from chickens that have had no exposure to Newcastle disease virus. The serum
should show no inhibition of viral haemagglutination activity when tested by the HI test. It is often
difficult to find serum without any HI activity. In this case use serum with low HI titres of 21.
Collection of HI positive serum

15


10 TCN 719 – 2006
There may be stored serum that is suitable for this purpose. If not, vaccinate several chickens with
I-2 Newcastle disease vaccine. Two weeks after the primary vaccination, give a booster
vaccination. Two weeks later, take a serum sample from each chicken and test the HI titre. Collect
extra serum from chickens with a titre of 25 or above. The volume of blood collected from each
chicken depends on the size of the chicken. Pool all the serum samples with HI titres of 25 or above

and test the HI titre of the pooled serum.
Comparative HI testing of international reference and national standard sera
Information supplied by NIBSC in 2001 indicated their international standard reference contained
320 IU per ampoule.
The serum can be reconstituted in PBS. A suitable volume of PBS would be 2 mL, which would
give 4 IU in the 25 µL test sample. Refer to instructions provided by the manufacturer.
Use the standard HI test described in this section to determine the titre of the international
reference standard and the national standard.
Test both samples in triplicate on the same microwell plate.
Carry out a series of at least three tests on different days.
Once the HI titre of the international standard serum and the national standard serum have been
established, prepare a series of two-fold dilutions of the serum that are spread around the endpoint
used to establish the HI titres. Titrate the dilutions that range from complete inhibition to no
inhibition as an additional check on the HI titres. The results of testing these dilutions will confirm
the HI titre of the undiluted serum.
Example of confirming HI titre of standard samples by testing a series of dilutions of the sample.
Repeated testing of the pooled serum established the HI titre at 25.
Prepare 1/8, 1/16, 1/32 and 1/64 dilutions of the pooled serum.
Test each dilution for HI titre.
Confirmatory results: The results tabled confirm that the HI titre of the serum used to prepare
the dilutions had a titre of 25.
Table 3: Results confirming HI titre of serum = 25

Serum dilution HI titre
1/8

22

1/16

21

1/32

- ve

1/64

- ve

16


10 TCN 719 – 2006
The test results will give a HI titre for both the International reference serum and the national
laboratory serum being tested. The HI titre for 4 IU of the International reference serum can be
used to determine the number of IU in the national reference serum.
Example
The standard HI test of 25 µL of the international reference serum containing 4 IU and has a HI titre
of 8 (23). The national serum tested HI titre of 64 (26).
How many IU does the national serum contain?
4 IU in a sample with a HI titre of 8.
How many (?) IU in a sample with a HI titre of 64.

Note:
Not all laboratories use the same protocol for testing HI titre and IU are independent of the test
system used.
Serological results of samples expressed in IU should give equivalent results when tested by
different systems.
By comparing the HI titre of the standard national serum with the HI titre of the international

reference serum enables you to express the results of HI tests in IU. However it is not very often
that you will be required to express the results of HI testing in IU.
Most publications of Newcastle disease serology results describe the assay used and express
HI titres to log base 2.
Preparing a laboratory standard serum
Each laboratory should receive a national standard serum from a central laboratory. The HI titre
and activity in International units of the serum will have been determined by rigorous testing as
described above. To conserve the supply of national standard serum some laboratories will decide
to prepare a secondary laboratory standard serum.
Collect positive serum as described above. Do comparative testing of the laboratory and national
standards. Test each sample in triplicate on the same microwell plate. Repeat several times and
analyze HI titres for both samples. Record the HI titre for the laboratory standard.
Store 1 mL aliquots of the laboratory standard at -20°C. This standard is used every time the HI test
is carried out and should always show the same HI titre when tested with the 4 HA units of antigen.
Preparing a national standard serum without an international reference serum
Many laboratories will not be able to obtain an international reference serum with which to compare
their national standard serum. In this case, more rigorous HI testing of the pooled HI positive serum
samples will be required to establish the HI titre of the standard serum. It is suggested that the

17


10 TCN 719 – 2006
serum is tested up to ten times. Use freshly prepared 4 HA units of antigen for each test and carry
out the test on different days if possible. The results will be a range of HI titres. The most frequently
occurring titre can be considered the HI titre of the standard serum. All future HI tests carried out on
the standard serum should give this titre.
Storage of standard serum
Once the positive and negative standard sera have been tested, aliquots can be prepared, labeled
and stored frozen. Storage at -70°C is optimal (but -20°C is adequate). Do not thaw and refreeze

the samples frequently. Representative samples should be thawed and tested to confirm that there
is no loss of titre in the storage process.
Preparation of Newcastle disease virus antigen for use in HI tests
Antigen is prepared by inoculating embryonated eggs with a sample of Newcastle disease virus
and harvesting the allantoic fluid four days later. Part of the first batch of I-2 Newcastle disease
vaccine prepared from the I-2 working seed can be set aside for storage as antigen. A volume of 50
mL to 100 mL is adequate for a large number of tests. Centrifuge the sample at 1 200 g to clarify
and remove any contaminating red blood cells. Store the antigen in one mL aliquots at -20°C.
See Sections 6 and 9.
Preparation of 4HA units of Newcastle disease virus antigen
The standard amount of Newcastle disease virus used in the haemagglutination inhibition (HI) test
is 4HA units. It is necessary to prepare and test a suspension of Newcastle disease virus
containing 4HA units in order to carry out the HI test. This involves a series of following steps.
1. Titrate the stored suspension of virus to be used as the antigen in the HI test. See Section
10 Calculate the HA titre.
2. Calculate the dilution factor required to produce 4 HA units. A simple way is to divide the HA titre
by 4.
3. Apply the dilution factor and dilute the original suspension of antigen in PBS to produce an
adequate volume of 4HA antigen to carry out the HI test. Allow 2.5 mL for each microwell plate.
4. Titrate the diluted (4HA) suspension of virus. This is a back titration to check the diluted antigen
contains 4 HA units.
5. Read HA titre. It should equal 4HA units. If not adjust the dilution and titrate again.
6. Use the 4HA unit dilution of antigen in an HI test to test the standard positive and negative
serum. The HI titre of the laboratory standard positive serum should equal the predetermined titre.
Interpretation
The results of the back titration of the diluted antigen and the HI titre of the standard positive are
both used to confirm the antigen has been diluted to a concentration equivalent to the standard 4
HA units.
If the HI titre of the positive control serum is less than the standard titre, the antigen is too
concentrated. Prepare a new dilution and test again.

18


10 TCN 719 – 2006
Conversely if the HI titre of the positive control serum is too high the antigen is too dilute.
Prepare a new dilution and test again.
Worked example

Preparation of 4HA units of antigen for HI test in
10 microwell plates:
The HA titre of the antigen was tested according to the protocol described above. The HA titre =
128
Calculation of dilution factor to prepare 4 HA units: 128/4 = 32
Calculation of volume of 4HA unit dilution of antigen required:
Allow 2.5 mL per plate; total volume required = 10 × 2.5 mL = 25 mL
Apply dilution factor = 25 mL/32 = 0.781 mL = 781 µL
Preparation of the diluted antigen: mix 781 µL of original virus suspension with 24.219 mL of
diluent. PBS is a suitable diluent.
Note: In this case it would be easiest to prepare 32 mL of the 4HA antigen. This would use 1 mL of
the original suspension diluted in 31 mL of PBS.
Haemagglutination inhibition
Materials











Thawed serum samples in racks
V-bottom microwell plates and covers
PBS
1 percent washed red blood cells
V-bottom reagent trough
25 µL single and multichannel pipettes and tips
Microwell plate recording sheet.
Newcastle disease virus antigen diluted to 4 HA units per 25 µL
Standard positive and negative serum

Method
1. Fill in recording sheets to record how samples will be dispensed into microwell plates.
2. Calculate the number of plates required and number each plate.
3. Dispense 25 µL of PBS into each well of the plates.
4. Shake each serum sample and dispense 25 µL into the first well and the last (control) well of a
row of a microwell plate.

19