Nghiên cứu sự biến đổi hình thái mạch máu tân tạo trong sarcom 180 trước và sau liệu pháp quang động

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lý do lựa chọn đề tài:
Ung thư là một bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao. Theo
thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2008 thế giới có
khoảng 12,7 triệu ca mắc mới với 7,6 triệu người chết do ung thư.
Hiện nay, trên thế giới đang có xu hướng tìm kiếm các phương pháp
chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ung thư hiệu quả, trong đó hướng
nghiên cứu tạo mạch trong khối u tỏ ra có nhiều triển vọng.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy trong khối u có hệ mạch
rất phong phú, quá trình tạo mạch diễn ra liên tục, tân tạo mạch có
vai trò quan trọng trong quá trình chuyển dạng, tiến triển và di căn
ung thư. Bicknell R. và Giampietro Gasparini (1997) đã tổng kết 18
công trình nghiên cứu định lượng mạch u đối chiếu lâm sàng tiến
hành trên 2700 bệnh nhân ung thư đặc ở vú, buồng trứng, đầu cổ,
melanoma cho thấy mối liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính tạo mạch
u tiên phát với phát triển u tại chỗ và di căn xa.
Liệu pháp quang động (Photodynamic Therapy - PDT) là
phương pháp mới trong trị liệu ung thư. Được Dougherty T.J. và
cộng sự ứng dụng điều trị ung thư lâm sàng tại Hoa Kỳ lần đầu tiên
năm 1978, đến nay trị liệu này đã trải qua nhiều giai đoạn thử
nghiệm lâm sàng và bắt đầu ứng dụng trong điều trị nhiều loại ung
thư trên người với kết quả khả quan. Tiến hành điều trị quang động
trải qua hai giai đoạn chính: trước tiên đưa một lượng thuốc nhạy
quang vào cơ thể, sau một thời gian nhất định thuốc sẽ tập trung vào
khối u nhiều hơn mô lành, làm cho tế bào trong u nhạy cảm với ánh
sáng, sau đó chiếu ánh sáng đơn sắc có bước sóng thích hợp lên vùng
u để phá hủy mô ung thư một cách chọn lọc mà không làm tổn hại
đến mô lành xung quanh. Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu hệ mạch
1
máu tân tạo trong khối u, đặc biệt là tác dụng ức chế tạo mạch tại u
của liệu pháp quang động chưa được nghiên cứu nhiều và hệ thống.

Để bổ sung thêm các cơ sở khoa học cho việc triển khai và đánh giá
khả năng ứng dụng của PDT trong điều trị các bệnh nhân ung thư ở
Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài nhằm các mục tiêu:
1. Đánh giá mật độ mạch máu tân tạo trong sarcom 180
thực nghiệm ở đùi chuột.
2. Xác định mối liên quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với
tiến triển của sarcom 180.
3. Đánh giá hiệu quả ức chế tạo mạch của liệu pháp quang
động trong điều trị ung thư thực nghiệm.
Ý nghĩa của luận án:
- Đây là công trình đầu tiên trong nước nghiên cứu xác định
mật độ mạch máu tân tạo tại khối u bằng các dấu ấn đặc hiệu với tế
bào nội mô là kháng thể CD31 và CD34 trên tiêu bản nhuộm hóa mô
miễn dịch. Kết quả nghiên cứu cho thấy đồng thời với sự phát triển
của u sarcom 180, hệ thống mạch máu trong u phát triển mạnh, quá
trình tạo mạch diễn ra liên tục.
- Mật độ mạch máu tân tạo có mối liên quan chặt chẽ với
phát triển khối u và di căn các cơ quan gan, lách, phổi. Chính vì vậy,
có thể xem định lượng tạo mạch là yếu tố có giá trị trong chẩn đoán
giai đoạn và tiên lượng ung thư. Đây cũng là cơ sở khoa học cho việc
thử nghiệm các thuốc ức chế tạo mạch điều trị ung thư.
- Xác định tác dụng ức chế tạo mạch của PDT và bổ sung cở
sở khoa học về cơ chế tổn thương mạch máu khối u sau điều trị quang
động, đó là PDT giai đoạn sớm có tác dụng ức chế tạo mạch u theo cơ
chế làm tế bào nội mô chết theo chương trình.
2
Cấu trúc luận án: Gồm 4 chương, phần đặt vấn đề (3 trang), tổng
quan tài liệu (37 trang), đối tượng và phương pháp nghiên cứu (15
trang), kết quả (36 trang), bàn luận (27 trang) và kết luận (2 trang),
tài liệu tham khảo (với 186 tài liệu: 9 tài liệu tiếng Việt, 177 tài liệu

tiếng Anh).
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Quá trình tạo mạch bình thường và sự hình thành mạch
máu tân tạo trong khối u
1.1.1. Quá trình tạo mạch bình thường
Hệ thống mạch máu trong thời kỳ bào thai được hình thành từ
mạng lưới mạch máu có nguồn gốc từ tiền tế bào nội mô gọi là
angioblasts. Quá trình tạo mạch ở người trưởng thành (angiogenesis),
trước đây cho rằng được hình thành bằng cách phân nhánh của các
mạch máu liền kề, tuy nhiên các công trình nghiên cứu gần đây đã
chứng minh quá trình tân tạo mạch cũng có thể xảy ra do sự biệt hóa của
các tế bào nội mô tiền sinh từ tủy xương. Quá trình tạo mạch đóng vai
trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý, đặc biệt là sự
phát triển của tế bào ung thư, đồng thời còn góp phần vào việc cung
cấp thông tin cho tuần hoàn liền kề. Chính vì vậy, gần đây nhiều tác
giả đang tích cực nghiên cứu nhằm tìm hiểu rõ cơ chế kiểm soát việc
hình thành các mạch máu tân tạo. Có hai giả thiết chính về cơ chế tạo
mạch là các chất kích thích tạo mạch (gia tăng trong lòng mạch khi
cần thiết) và các chất ức chế tạo mạch.
Với cơ chế tạo mạch bằng việc huy động từ các tế bào nội mô
tiền sinh từ tủy xương, các tế bào nội mô tiền sinh (EPCs) được di
chuyển đến khu vực tổn thương hoặc khối u tăng sinh. Cơ chế của quá
3
trình di chuyển chưa được xác định đầy đủ. Tại khu vực này, các EPCs
biệt hóa và trưởng thành tạo nên một mạng mao mạch mới bằng cách
liên kết với nhau và liên kết với mạch máu liền kề. Trường hợp tân tạo
mạch từ mạch máu liền kề, các tế bào nội mô tăng sinh và phát triển và
tạo ra các nhú mạch. Với cả 2 cơ chế, lớp vỏ ngoài của mạch máu
được hình thành bằng cách huy động từ các tế bào cơ trơn liền kề.

1.1.2. Quá trình tạo mạch trong khối u
Theo nghiên cứu của Gasparini và một số tác giả khác, quá
trình tạo mạch trong u (tumor angiogenneis) diễn ra về cơ bản giống
như sự tân tạo mạch trong các tổ chức khác. Các u đang phát triển đã
hình thành nguồn cấp máu ra sao? Một số nghiên cứu đã nhận thấy
tạo mạch trong u bị tác động bởi các yếu tố chế tiết. Có nhiều tế bào
và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tân tạo mạch trong khối u như
tế bào nội mô, tế bào lympho, đại thực bào, dưỡng bào. Các yếu tố
tạo mạch khối u do tế bào ung thư tự tiết ra hoặc do các tế bào viêm
như đại thực bào, thâm nhiễm vào u. Trong số các yếu tố kích thích
tạo mạch u, có 2 yếu tố quan trọng nhất là yếu tố tăng trưởng nguyên
bào sợi (bFGF) và yếu tố phát triển tế bào nội mô mạch (VEGF). Cả
hai chất này đều gắn với proteoglycan ở màng đáy và dễ dàng phóng
thích khi màng đáy bị tổn thương. Dù trực tiếp hay gián tiếp những
chất này cũng kích thích các tế bào nội mô chế tiết các men
proteinases để phân huỷ màng đáy, thúc đẩy các tế bào nội mô tăng
sinh và di cư. Các yếu tố tạo mạch còn trực tiếp liên kết với phân tử
lamidin của thành mạch để tạo ra các ống mạch mới nhờ sự di cư của
các quần thể tế bào nội mô. Các yếu tố khác như yếu tố hoại tử u
(TNF-
α
) do đại thực bào chế tiết, cũng góp phần nhất định vào quá
trình tạo mạch. Quá trình tạo mạch có tính hai chiều đối với sự phát
triển u: một mặt đưa chất dinh dưỡng và oxy đến cung cấp cho u, mặt
4
khác các tế bào nội mô mới sinh sẽ kích thích u phát triển do tiết ra các
yếu tố phát triển. Hình thái mạch máu trong khối u có nhiều đặc điểm
khác biệt so với hình thái mạch máu bình thường. Các mạch máu này
không tuân theo quy luật, chia nhánh không đều, tạo nên các nhánh
nối động mạch- tĩnh mạch bất thường, không phân chia tuần tự và

hầu hết chúng đều có nhiều khe hở. Kết quả là có rất nhiều protein,
hồng cầu thoát mạch vào tổ chức, và ngược lại các tế bào u di chuyển
vào trong lòng mạch, chúng là cơ sở cho việc hình thành di căn.
1.2. Các liệu pháp ức chế tạo mạch trong khối u
Các tế bào ung thư có tốc độ phân chia nhanh chóng, vì vậy
các thuốc điều trị ung thư chủ yếu hoạt động theo cơ chế gây độc tế
bào kháng lại tăng trưởng của các tế bào u. Tuy nhiên, hóa trị liệu
ung thư cũng tiêu diệt các tế bào bình thường, do đó gây ra các tác
dụng phụ nặng nề như suy tủy. Hơn nữa, các tế bào u thường có gen
không ổn định, dễ đột biến, mặt khác hiệu quả điều trị của thuốc còn
phụ thuộc vào loại u và giai đoạn phát triển của u. Chính vì vậy,
ngày nay rất khó nghiên cứu tìm kiếm các thuốc gây độc tế bào điều
trị ung thư. Sau khi Folkman J. (1970) phát hiện vai trò quan trọng
của tân tạo mạch trong quá trình phát triển khối u, nhiều nghiên cứu
đã tập trung làm sáng tỏ mối quan hệ chặt chẽ giữa tân tạo mạch với
phát triển u và di căn xa. Khi xác định được mối liên hệ chặt chẽ
giữa tân tạo mạch với sự phát triển khối u, đặc biệt sau khi cơ chế tạo
mạch được làm sáng tỏ, rất nhiều chất ức chế tạo mạch được dùng
trong trị liệu ung thư được nghiên cứu và phát triển. Hiện nay có 2
liệu pháp trị liệu ức chế tạo mạch thường sử dụng trong lâm sàng:
nhóm trị liệu điều trị ức chế tân tạo mạch và nhóm trị liệu ức chế hệ
mạch trong khối u. Phương thức ức chế tạo mạch hiệu quả là ngăn
chặn đường dẫn truyền tín hiệu kích thích tạo mạch (như là cạnh
5
tranh thụ cảm thể của yếu tố kích thích tạo mạch). Một số hướng
nghiên cứu lại tập trung vào công nghệ kháng thể hoặc công nghệ tế
bào đích. Các hướng nghiên cứu này tỏ ra có nhiều triển vọng trong
điều trị ung thư, thực tế đã có một số thuốc ức chế tạo mạch đưa vào
thực tế điều trị lâm sàng. Với các trị liệu ức chế tạo mạch truyền
thống vẫn còn nhiều nghi vấn như: Liệu pháp này có thực sự hiệu

quả cho tất cả các loại và giai đoạn phát triển khối u? Trị liệu này có
ức chế hoàn toàn phát triển u? Để trả lời những câu hỏi này, hiện nay
đang phát triển cách tiếp cận mới trong các liệu pháp ức chế tạo
mạch u bằng cách dùng các thuốc tiêu diệt các tế bào nội mô tăng
sinh, qua đó ức chế tạo mạch trong u. Các thuốc mới này có triển
vọng ức chế hiệu quả khối u phát triển, mặc dù vẫn còn một số tác
dụng phụ. Hướng nghiên cứu ức chế hệ mạch tân tạo trong khối u
bằng cách tiêu diệt các tế bào nội mô của mạch máu tăng sinh đang
được đánh giá là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng trong điều trị
ung thư. Trong đó liệu pháp quang động (PDT) với tác dụng ức chế
hệ mạch tân tạo trong khối u được xem là một trong những phương
pháp hữu hiệu nhất để điều trị các khối u tại chỗ mà ít có tác dụng
phụ. Liệu pháp giải quyết được những hạn chế của hóa trị liệu thông
thường, và là hy vọng trong lâm sàng điều trị ung thư hiện nay.
1.3. Phương pháp quang động sử dụng thuốc nhạy quang Radachlorin
trong điều trị ung thư
Liệu pháp quang động (PDT) được Dougherty và cộng sự
ứng dụng đầu tiên trong lâm sàng điều trị ung thư năm 1978 tại Mỹ.
Phương pháp điều trị này đã được thử nghiệm lâm sàng qua các giai
đoạn I, II và III trên khoảng 60.000 bệnh nhân với kết quả rất khả
quan. Cơ chế tác dụng của liệu pháp quang động dựa trên phản ứng
quang hoá giữa chất nhạy quang và ánh sáng với sự có mặt của oxy
6
tại mô và tạo ra các oxy singlet (
1
O
2
) và một số gốc tự nhiên như
superoxyd, hydroxyl gây peroxyt hoá phospholipid của màng cơ bản
và phá huỷ cấu trúc tế bào u nơi tập trung thuốc nhạy quang nhiều

hơn mô lành liền kề, kết hợp tổn thương thành mạch và tắc mạch do
huyết khối gây thiếu máu dẫn đến hoại tử u sau điều trị. Quá trình
phá huỷ mạch máu khối u do PDT là nguyên nhân quan trọng thứ hai
làm khối u bị phá huỷ. Henderson BW (1985) cắt khối u động vật
ngay sau PDT để nuôi cấy và thử nghiệm clon hoá trong ống nghiệm,
đã thấy nhiều tế bào u phát triển và clon hoá nhanh. Ngược lại, sau
PDT vẫn để nguyên các khối u tại chỗ thì chúng sẽ bị phá huỷ hoàn
toàn. Như vậy, sự khác biệt giữa hai kết quả trên là do PDT đã phá huỷ
mạch máu gây thiếu máu, thiếu oxy và chất dinh dưỡng dẫn đến hàng
loạt tế bào ung thư bị hoại tử.
Radachlorin, được Công ty TNHH “RADA-PHARMA”,
Cộng hòa Liên bang Nga đăng ký và sản xuất là một trong những
chất nhạy quang thế hệ thứ hai, thuộc nhóm chlorin-e
6
tan trong
nước, có đặc tính thời gian hấp thu và thải trừ ngắn, hấp thụ ánh sáng
ở bước sóng dài 662nm nên làm tăng độ xuyên sâu của PDT. Thuốc
hiện được sử dụng nhiều trong lâm sàng PDT hiện nay.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành trên 250 chuột nhắt trắng thuần
chủng dòng BALB/c, 6 đến 8 tuần tuổi, trọng lượng từ 20 đến 25
gram. Động vật được chia thành nhóm chứng, các nhóm gây u đơn
thuần và các nhóm được PDT sau gây u 7 và 14 ngày.
7
2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị nghiên cứu PDT
- Thiết bị laser Diode ML 662
- Thuốc nhạy quang Radachlorin (biệt dược của Chlorin e

6
)
2.2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu mô bệnh
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo mô hình ung thư thực nghiệm sarcom 180
Phương pháp gây ung thư thực nghiệm của Lapis K., Trần
Văn Hanh (1979) và Nguyễn Đình Tảo (1982). Tiêm vào điểm giữa
mặt ngoài khối cơ đùi mỗi chuột nhắt 5 x 10
6

tế bào sarcom 180.
2.3.2. Phương pháp điều trị quang động khối u sarcom 180
Tiến hành PDT một lần duy nhất trên động vật mang u. Tiêm
vào tĩnh mạch đuôi chuột thuốc nhạy quang Radachlorin liều 20
mg/kg thể trọng chuột. Sau 6 giờ tiến hành chiếu laser diode 662 nm
toàn bộ u đùi và ra ngoài ranh giới u với mật độ năng lượng trung bình
200 J/cm
2
và mật độ công suất 0,22W/cm
2
. Xác định thời gian chiếu
và liều chiếu sáng theo phương pháp của Fingar và CS (1991).
2.3.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu mô bệnh
2.3.3.1. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm HE: theo kỹ thuật thông thường
2.3.3.2. Phương pháp và kỹ thuật làm mẫu mô động vật cho kính
hiển vi điện tử truyền qua.
- Sử dụng phương pháp của Hayat MA (1989)
- Quan sát sự biến đổi của tế bào nội mô trên các tiêu bản
sau PDT 24 giờ đến 48 giờ và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử
truyền qua JEM 1010 của hãng JEOL (Nhật Bản).

2.3.3.3. Phương pháp và kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch
- Sử dụng kỹ thuật nhuộm miễn dịch men gián tiếp phức hợp
Avidin-Biotin-pero-peroxidase (ABC) với kháng thể thứ nhất là kháng
8
thể đơn dòng đặc hiệu với tế bào nội mô CD31 và CD34 (Hãng BP
Pharmigen, Hoa Kỳ).
- Phương pháp định lượng mạch máu tân tạo tại khối u: áp
dụng phương pháp của Weidner và cộng sự. Theo đó, các tiêu bản
đầu tiên được soi ở độ phóng đại thấp (x40) để xác định các điểm
nóng tạo mạch (hot spot), sau đưa lên độ phóng đại cao hơn (x400)
để đếm mạch. Định lượng mật độ mao mạch trung bình (MVD: meal
microvessel profile density) trên tiêu bản trong khối u và vùng cơ
lành cạnh u trên 1 đơn vi 0,74 mm
2
bằng cách đếm số lượng mạch
máu tại ba điểm nóng tạo mạch và lấy giá trị trung bình.
2.3.4. Quy trình nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu theo các bước quy chuẩn.
2.3.4.1. Nghiên cứu định lượng tạo mạch tại u đùi chuột.
- Định lượng mạch máu tân tạo tại khối u trong các nhóm
trên tiêu bản u đùi nhuộm hóa mô miễn dịch, sử dụng kháng thể
CD31 và CD34.
2.3.4.2. Xác định mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với sự
phát triển khối u
- Đánh giá sự phát triển khối u đại thể: trọng lượng, thể tích
u, các nốt di căn. Đánh giá sự phát triển khối u trên vi thể: mật độ tế
bào u.
- Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa định lượng tạo
mạch với trọng lượng, thể tích khối u và với mật độ tế bào trong u.
- Nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa định lượng tạo

mạch với số lượng nốt di căn gan, lách, thận chuột.
2.3.4.3. Nghiên cứu hiệu quả ức chế tạo mạch của liệu pháp quang
động trong điều trị ung thư
- Đánh giá hiệu quả điều trị của PDT trên đại thể, vi thể.
9
- Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điều
trị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 7 ngày.
- Nghiên cứu sự thay đổi mật độ mạch máu trước và sau điều
trị bằng liệu pháp trên nhóm chuột PDT 14 ngày.
- Đánh giá sự biến đổi của tế bào nội mô và hệ thống mạch
máu tân tạo trên tiêu bản siêu cấu trúc ở các thời điểm sau PDT 24
giờ và 48 giờ.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả tạo mô hình u đùi thực nghiệm Sarcom 180
Toàn bộ chuột nhắt trắng BALB/c sau khi được tiêm 5x10
6
tế
bào sarcom 180 vào cơ đùi đều thấy xuất hiện khối ung thư phát triển
trong cơ đùi. Động vật mang u vào giai đoạn muộn có biểu hiện bỏ
ăn, suy kiệt, xù lông, ỉa chảy, liệt chân mang u và một số chết vào
khoảng ngày thứ 26 đến 28 sau khi tiêm tế bào ung thư.
3.2. Định lượng mạch máu tân tạo tại khối u đùi chuột
Bảng 3.1. Mật độ mạch máu trên một đơn vị diện tích u đùi
Stt Giai đoạn
Phương pháp nhuộm hóa
mô miễn dịch
P
Kháng thể
CD 31 (a)

Kháng thể
CD 34 (b)
1
7 ngày
sau gây u
17,9 ± 6,2 16,8 ± 7,7
p
1-2
<0,001 p
2-3
<0,01
2
14 ngày
sau gây u
34,5 ± 13,2 30,7 ± 14,2
p
1-3
<0,001 p
2-4
<0,01
3
21 ngày
sau gây u
58,2 ± 31,1 53,9 ± 32,5
p
1-4
<0,001 p
3-4
<0,05
4

28 ngày
sau gây u
49,6 ± 27,6 46,4 ± 28,5
p
a-b
>0,05
10
Kết quả cho thấy, mật độ mạch máu trên một đơn vị diện
tích tại u đùi tăng ở giai đoạn sớm của u, mức độ tăng cao nhất vào
ngày thứ 14 và 21 sau gây u. Số lượng mạch máu có phần giảm
xuống ở ngày thứ 28 sau gây u. Không có sự khác biệt giữa mật độ
mạch máu tân tạo tại khối u cùng một thời điểm giữa phương pháp
nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể CD31 và CD34.
3.2. Mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với sự phát triển u
3.2.1. Mối tương quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với thể tích
u
Bảng 3.2. Mối liên quan giữa tạo mạch với thể tích khối u
Nhóm NC
(n = 20)
MDV với
CD31 (1)
MDV với
CD34 (2)
Thể tích khối
u (mm
3
)(3)
Hệ số TQ
r
1-3

r
2-3
Ngày 7 sau
gây u
17,9 ± 6,2 16,8 ± 7,7 288±98
0,45 0,48
Ngày 14 sau
gây u
34,5 ± 13,2 30,7 ± 14,2 682±139
0,51 0,53
Ngày 21 sau
gây u
58,2 ± 31,1 53,9 ± 32,5 1678±412
0,37 0,39
Ngày 28 sau
gây u
49,6 ± 27,6 46,4 ± 28,5 2361±689
0,28 0,25
Qua bảng 3.2 cho thấy mối tương quan thuận, chặt chẽ giữa
mật độ mạch máu trên một đơn vị diện tích tại khối u trên tiêu bản
nhuộm hóa mô miễn dịch với thể tích khối u đùi ở các giai đoạn sau
gây u ngày thứ 7, 14, 21 (r>0,33). Tuy nhiên không nhận thấy mối
tương quan giữa hai đại lượng này ở ngày thứ 28 (r<0,33).
3.2.2. Mối liên quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với mật độ tế
bào u
Bảng 3.3. Mối liên quan giữa tạo mạch với mật độ tế bào u
Nhóm NC MDV với MDV với Mật độ tế bào Hệ số TQ
11
(n = 20) CD31 (1) CD34 (2) u (3) r
1-3

r
2-3
Ngày 7 sau
gây u
17,9 ± 6,2 16,8 ± 7,7 156,3 ± 58,4
0,47 0,51
Ngày 14 sau
gây u
34,5 ± 13,2 30,7 ± 14,2 545,7 ± 141,5
0,50 0,53
Ngày 21 sau
gây u
58,2 ± 31,1 53,9 ± 32,5 1454,8 ± 390,9
0,45 0,49
Ngày 28 sau
gây u
49,6 ± 27,6 46,4 ± 28,5 1203,4± 301,3
0,39 0,41
Qua bảng 3.3 cho thấy có mối tương quan chặt chẽ giữa mật
độ mạch máu trên một đơn vị diện tích trên các tiêu bản nhuộm hóa
mô miễn dịch với các kháng thể CD31 và CD34 với mật độ tế bào
ung thư trên một đơn vị diện tích khối u đùi (r>0,33).
3.2.3. Mối tương quan giữa mật độ mạch máu tân tạo với di căn
Bảng 3.4. Mối tương quan giữa mật độ mạch máu tân tạo trong u
với số lượng nốt di căn gan, phổi, lách
Nhóm nghiên cứu
(n = 20)
Tương quan
MDV với SL
nốt di căn phổi

Tương quan
MDV với SL
nốt di căn gan
Tương quan
MDV với SL
nốt di căn lách
Ngày 7
sau gây u
CD31 0,18 0,25 0,19
CD34 0,23 0,31 0,23
Ngày 14
sau gây u
CD31 0,41 0,56 0,51
CD34 0,46 0,51 0,53
Ngày 21
sau gây u
CD31 0,62 0,51 0,52
CD34 0,59 0,57 0,49
Ngày 28
sau gây u
CD31 0,51 0,62 0,58
CD34 0,50 0,63 0,61
12
Kết quả bảng trên cho thấy có mối tương quan giữa định
lượng tạo mạch với số lượng nốt di căn gan, phổi và lách vào các
ngày 14, 21 và 28 sau gây u. Đây là tương quan thuận và mức độ
tương quan chặt chẽ giữa mật độ mạch máu trên một đơn vị diện tích
với số lượng nốt di căn gan, phổi, lách (r>0,33). Tuy nhiên, không
thấy tương quan ở ngày 7 sau gây u (r
1-3

<0,33, r
2-3
<0,33).
3.4. Hiệu quả ức chế tạo mạch của phương pháp quang động
trong điều trị u đùi sarcom 180
Sau gây u 7 và 14 ngày, tiến hành PDT một lần duy nhất.
Kết quả định lượng mật độ mạch mạch máu tân tạo trên một đơn vị
diện tích khối u đùi (0,74mm
2
) của các nhóm động vật nghiên cứu
được thể hiện trong các bảng dưới đây.
Bảng 3.5. Mật độ mạch máu tân tạo trung bình u đùi trước và sau
PDT
Nhóm nghiên cứu (n=20)
Nhuộm HMMD
với CD31
Nhuộm HMMD
với CD34
Ngày 14
sau gây u
Gây u không điều trị
34,5 ± 13,2 30,7± 14,2
PDT 7 ngày sau gây u
22,1 ± 6,8 23,6± 8,4
Ngày 21
sau gây u
Gây u không điều trị
58,2 ± 31,1 53,9 ± 32,5
PDT 7 ngày sau gây u
24,9 ± 8,2 23,7 ± 9,3

PDT 14 ngày sau gây u
32,5 ± 16,4 30,3 ± 15,4
Ngày 28
sau gây u
Gây u không điều trị
49,6 ± 27,6 46,4 ± 28,5
PDT 7 ngày sau gây u
23,6 ± 11,3 21,9 ± 10,6
PDT 14 ngày sau gây u
47,9 ± 23,7 46,2 ± 28,8
Kết quả nghiên cứu cho thấy u đùi các nhóm được PDT đều
bị giảm mạnh số lượng mạch máu. Đặc biệt nhóm chuột PDT sau
gây u 7 ngày đạt hiệu quả ức chế tạo mạch trong u mạnh và ổn định
13
trong các giai đoạn sau gây u 14 ngày (22,1 ± 6,8 trên CD31 và
23,6± 8,4 trên CD34), sau gây u 21 ngày (24,9 ± 8,2 trên CD31 và
23,7 ± 9,3 trên CD34) và sau gây u 28 ngày (23,6 ± 11,3 trên CD31
và 21,9 ± 10,6 trên CD34). Tuy nhiên kết quả định lượng tân tạo
mạch với nhóm PDT 14 ngày cho thấy kết quả ức chế tạo mạch
không ổn định, giai đoạn 21 ngày sau gây u, mật độ mạch máu tân
tạo có giảm so với nhóm chứng không điều trị (32,5 ± 16,4 trên
CD31 và 30,3 ± 15,4 trên CD34), nhưng lại có xu hướng tăng lên
giai đoạn muộn là 28 ngày sau gây u (47,9 ± 23,7 trên CD31 và 46,2
± 28,8 trên CD34).
3.5. Biến đổi siêu cấu trúc tế bào nội mô sau PDT
Sau PDT, chúng tôi tiến hành làm tiêu bản cho kính hiển vi
điện tử truyền qua vào các giai đoạn 24 giờ và 48 giờ sau PDT để tìm
hiểu những biến đổi siêu cấu trúc các tế bào nội mô và mạch máu tân
tạo tại khối u. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vào giai đoạn 24 giờ sau
PDT, các tế bào nội mô bị tổn thương không hồi phục, biểu hiện

nhân tế bào teo nhỏ, chất nhiễm sắc tụ đặc sát màng nhân, bào tương
có nhiều không bào. Khe nối giữa hai tế bào giãn rộng, xuất hiện các
hồng cầu thoát mạch. Đồng thời vùng dưới nội bào (subendothelial)
có nhiều protein bị đông vón dạng hạt. Vào giai đoạn 48 giờ sau
PDT, quan sát thấy nhân tế bào nội mô bị tổn thương không hồi
phục, chủ yếu theo cơ chế chết theo chương trình (apoptosis) điển
hình, biểu hiện màng nhân có nhiều nếp gấp, chất nhiễm sắc bị tụ đặc
sát màng nhân, bào tương của tế bào nội mô có các không bào.
Chương 4
14
BÀN LUẬN
4.1. Về định lượng mạch máu tại u đùi sarcom 180
Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, u đùi các
nhóm động vật nghiên cứu có hệ thống mạch máu rất phong phú và
quá trình tạo mạch diễn ra liên tục. Mật độ mạch máu trên vi thể trên
một đơn vị diện tích 0,74 mm
2
ngày thứ 7 là (17,9 ± 6,2) trên tiêu bản
nhuộm CD31 và (16,8 ± 7,7) trên tiêu bản nhuộm CD34. Mật độ này
tăng nhanh ở các giai đoạn muộn. Định lượng mạch máu u đùi tăng
lên nhiều nhất ở vào ngày thứ 21 sau khi gây u (58,2 ± 31,1 trên CD31
và 53,9 ± 32,5 trên CD34), song đến ngày 28 mật độ mạch máu có
giảm xuống so với ngày 21 (49,6 ± 27,6 trên CD31 và 46,4 ± 28,5 trên
CD34). Sự khác biệt về mật độ mạch máu giữa các giai đoạn là có ý
nghĩa thống kê với (p<0,001 và p<0,01). Sở dĩ có sự thay đổi này, theo
chúng tôi là do trong u có hệ thống mạch phong phú và quá trình tạo
mạch diễn ra liên tục, tuy nhiên vào giai đoạn muộn (ngày 28), hiện
tượng hoại tử các tế bào diễn ra mạnh, phần trung tâm u đã hoại tử
dạng bã đậu làm cho quá trình tạo mạch cũng giảm đi. Điều này cũng
phù hợp với các nghiên cứu của Quản Hoàng Lâm (2001) khi nghiên

cứu u đùi trên chuột BALB/c.
4.2. Về mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với phát triển u
4.2.1. Về mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với thể tích u
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy thể tích u đùi
tăng nhanh theo thời gian. Ở ngày thứ 7 sau gây u, thể tích u đùi là
288 ± 98 (mm
3
) thì vào ngày thứ 14 đã tăng hơn gấp đôi 742 ± 149
(mm
3
). Đặc biệt cả trong giai đoạn muộn, thể tích u đùi tăng nhanh,
ngày 21 sau gây u kích thước u đùi là 1628±412 (mm
3
), còn đến
ngày 28 là 2661 ± 689 (mm
3
). Sự khác biệt về thể tích khối u đùi
giữa các thời điểm là có ý nghĩa thống kê với (p<0,001 và p<0,01).
15
Kết quả này thể hiện sự phát triển nhanh chóng của khối u ác tính.
Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của Quản Hoàng
Lâm (2000), Nguyễn Đình Tảo (1994).
Khi tìm mối liên quan giữa thể tích khối u và định lượng tạo
mạch với cùng các cặp số liệu quan sát, chúng tôi thấy có mối liên
quan giữa hai đại lượng này. Chúng tôi cũng nhận thấy có mối tương
quan thuận, rất chặt chẽ giữa mật độ mạch máu trên một đơn vị diện
tích với với thể tích khối u đùi ở các giai đoạn sau gây u ngày thứ 7,
14, 21 (r>0,33), Điều này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu và thực tế
lâm sàng vì có thể lập được phương trình hồi quy giữa hai đại lượng
này ở các giai đoạn khác nhau. Tuy nhiên không nhận thấy mối

tương quan giữa hai đại lượng ở ngày thứ 28 (r<0,33). Theo chúng
tôi, ở ngày thứ 28, không có mối tương quan có thể là do vào giai
đoạn muộn, thể tích khối u vẫn tiếp tục tăng lên, song hoại tử tế bào
ung thư xuất hiện rất mạnh ở toàn bộ trung tâm khối u, kéo theo sự
tạo mạch giảm đi rõ rệt. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù
hợp với nghiên cứu của Arakawa A., Soh S. và CS (1997), Imamura
M. (2007), Sonmezer M. (2004)
4.2.2. Về mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với mật độ tế
bào u
Kết quả định lượng tế bào ung thư trên một đơn vị diện tích
của tiêu bản u đùi thuộc các nhóm động vật nghiên cứu cho thấy, số
lượng tế bào ung thư tăng nhanh theo thời gian ở giai đoạn đầu. Ở
nhóm ngày thứ 14 tăng gấp đôi so với ngày thứ 7, và tiếp tục tăng
mạnh trong nhóm ngày thứ 21, tuy nhiên số lượng này giảm xuống ở
nhóm ngày thứ 28. Sự khác biệt giữa các nhóm là có ý nghĩa thống
kê với (p<0,01 và p<0,001).
16
Tiến hành thống kê với các số liệu quan sát từng cặp là mật
độ tế bào khối u trên một đơn vị diện tích và định lượng tạo mạch,
kết quả cho thấy có mối liên quan giữa hai đại lượng này. Chúng tôi
nhận thấy có mối tương quan rất chặt chẽ giữa mật độ mạch máu trên
một đơn vị diện tích trên các tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch với
các kháng thể CD31 và CD34 với mật độ tế bào ung thư trên một
đơn vị diện tích khối u đùi (r>0,33). Mối tương quan này của chúng
tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác như Ames
B.M. (1990), Medelsohn J. (1995), Hasan J. (2002) và Michell R.N.
(2000). Theo các tác giả này thì ngoài yếu tố động học tế bào ung
thư, sự cấp máu cho u cũng có vai trò hết sức quan trọng trong quá
trình phát triển của mô ung thư, bởi vì tất cả các khối u không thể lớn
hơn 2 mm chiều dày và rất khó di căn, lan tràn nếu không có sự tạo

mạch nuôi dưỡng nó. Mật độ tạo mạch trong u khác nhau tuỳ loại u,
vùng u và giai đoạn phát triển của nó. Sự tạo mạch đưa chất dinh
dưỡng và oxy đến cung cấp cho u, mặt khác các tế bào nội mô mới
sinh này sẽ kích thích u phát triển do tiết ra các yếu tố tăng trưởng.
4.2.3. Về mối liên quan giữa định lượng tạo mạch với số lượng nốt
di căn tại một số cơ quan ở chuột
Nghiên cứu tìm mối liên hệ giữa định lượng tạo mạch với di
căn các cơ quan đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Ngay từ năm
1971, Folkman J. đã tìm thấy mối liên quan giữa định lượng tạo
mạch với di căn ở động vật. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu trên các khối
u như ung thư buồng trứng, u vú, ung thư tiền liệt tuyến cho thấy mối
liên quan chặt chẽ này. Theo Michell N. và CS (2000) , trong các con
đường di căn thì di căn theo đường máu có vị trí hết sức quan trọng.
Các tế bào ung thư đi vào máu theo đường ống ngực hoặc bằng cách
17
xâm lấn vào mạch máu. Các tạng co bóp liên tục như dạ dày và phổi
có xu hướng đẩy các tế bào u vào trong các mao mạch.
Nhiều nghiên cứu thực nghiệm chứng minh mối liên quan
giữa định lượng tạo mạch tại khối u tiên phát với việc xuất hiện và
hình thành di căn. Quá trình hình thành di căn xuất hiện khi các tế
bào u đi qua lớp nội mô vào thành mạch, sống sót trong lòng mạch,
ra khỏi lòng mạch ở các mô cơ quan đích và tiến triển thành di căn ở
các cơ quan này. Nhóm nghiên cứu của Folkman J. (2002) đã chứng
minh cơ chế của việc cắt bỏ u tiên phát có thể làm kích thích tăng di
căn xa. Theo các tác giả này, khi chuyển ghép Lewis Lung Carcinoma
cơ thể chuột có thể sản xuất 1 chất ức chế tạo mạch tự nhiên là
angiostatin. Chất này tồn tại lâu trong máu và tác động như một
hormon hệ thống ức chế tăng gánh tế bào nội mô. Khi cắt bỏ khối u
nguyên phát làm giảm angiostatin và kích thích di căn tăng nhanh.
Trong một nghiên cứu khác, các tác giả này còn nhận thấy, vi di căn

(micrometastaes) không tăng khi các tế bào ung thư nguyên phát
được cân bằng giữa apoptosis với yếu tố tạo mạch. Ngược lại, vi di
căn tăng mạnh khi giảm apoptosis và giảm yếu tố ức chế tạo mạch.
Biểu đồ 4.1. Số lượng các nốt di căn gan, phổi, lách
18
Số lượng
nốt di căn
Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả của
Gasparini (1996) khi tổng kết trên 16 công trình nghiên cứu lâm sàng
về vấn đề này và nhận thấy mật độ tạo mạch tại khối u có liên quan
chặt chẽ với di căn hạch vùng (lympho nodal) và di căn xa (distant
metastases).
4.3. Về hiệu quả ức chế tạo mạch của PDT sử dụng thuốc nhạy
quang Radachlorin trên u đùi sarcom 180
Sau khi tiến hành PDT một lần duy nhất trên các nhóm động
vật mang u sau 7 và 14 ngày, chúng tôi tiến hành định lượng mạch
máu tân tạo tại khối u. Kết quả cho thấy PDT giai đoạn sớm (7 ngày
sau gây u) có hiệu quả ức chế tạo mạch tại u mạnh và ổn định hơn so
với giai đoạn muộn hơn (14 ngày sau gây u). Theo chúng tôi, các
khối u vào giai đoạn muộn thường lớn, nằm ở sâu, xâm lấn xung
quanh rộng, vùng trung tâm hoại tử nhuyễn hóa rất khó cho thuốc
nhạy quang ngấm vào, đồng thời PDT có hiệu quả chủ yếu trên các
khối u nông nên hiệu quả ức chế tạo mạch chỉ có hiệu quả tốt ở giai
đoạn sớm. Như vậy PDT giai đoạn sớm có hiệu quả ức chế tạo mạch
rõ rệt. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nhiều tác
giả khác khi xác định hiệu quả ức chế tạo mạch của PDT. Cơ chế tổn
thương mạch máu sau PDT cũng đã được Robertson C.A. (2009) và
Osaki T. (2009) chứng minh là do thuốc nhạy quang phân bố chọn
lọc vào hệ mạch mới tân tạo và từ đó thuốc này di chuyển dễ dàng
sang các tế bào u bên cạnh, điều này chỉ rõ vai trò của hệ mạch máu

trong tiến trình PDT là đưa thuốc nhạy quang vào tế bào u để trực
tiếp phá huỷ chúng khi chiếu sáng và tổn thương tế bào nội mô gây
tắc mạch sau điều trị.
Các kết quả nghiên cứu gần đây còn cho thấy cơ chế tác
dụng của PDT không chỉ làm tổn thương hệ mạch, mà còn tác động
19
đến các đường dẫn truyền tín hiệu của các yếu tố kích thích tạo mạch
như VEGF, MMP và các cytokinese khác, do đó nó có tác dụng làm
cân bằng tạo mạch nghiêng về phía ức chế tạo mạch. Ferrario A.
(2000) PDT sử dụng thuốc nhạy quang Photofrin có tác dụng làm
giảm yếu tố gây thiếu oxy tổ chức -1alpha (HIF-1alpha), do đó làm
tăng nồng độ gen HIF-1 trong bào tương trong khi đây là yếu tố tác
động đến VEGF, vì vậy gián tiếp làm giảm mạch trong khối u
carcinoma trên chuột. Ferrario A. và cộng sự (2004) cũng nhận thấy
PDT sử dụng thuốc nhạy quang Photofrin và Hypercin có tác dụng
ức chế MMP vì vậy sẽ ngăn chặn tế bào u hoặc tế bào nội mô di cư
và xâm lấn, kết quả là ức chế quá trình tạo mạch trong u.
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua với độ
phóng đại 1.500 – 6000 lần của chúng tôi cho thấy đa phần các tế
bào nội mô sau PDT 24 đến 48 giờ đã bị tổn thương không hồi phục
kiểu chết theo chương trình (apoptosis) với biểu hiện nhân tế bào teo
nhỏ, chất nhiễm sắc tụ đặc sát màng nhân, bào tương có nhiều không
bào. Đồng thời vùng dưới nội bào (subendothelial) có nhiều protein
bị đông vón dạng hạt. Theo Stranadko E.F. (1997) và Radakovic F.S.
thì nghiên cứu siêu cấu trúc các tế bào trong ung thư sau PDT nhằm
xác định được các tổn thương ở mức siêu vi của những hệ thống nội
bào đặc biệt mẫn cảm với điều trị là màng tế bào, bộ máy hô hấp tế
bào trong ty thể, hệ thống sinh tổng hợp protein, màng nhân tế bào
và bộ gen nhân tế bào. Mặt khác, cơ chế chết của các tế bào trong
khối u theo kiểu hoại tử (necrosis) hay chết theo chương trình

(apoptosis) cũng có thể khẳng định chắc chắn khi quan sát bằng kính
hiển vi điện tử truyền qua hoặc kính hiển vi điện tử quét.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, các mạch máu bị tổn
thương và tăng tính thấm trong khối u thường rất nhạy cảm với PDT.
20
Điều này thể hiện ở việc sau PDT, cấu trúc của các tiểu động mạch,
tiểu tĩnh mạch và mao mạch trong khối u bất thường (giãn rộng, co
nhỏ hoặc kết cụm lại), làm ứ trệ tuần hoàn trong lòng mạch, kết quả
này dẫn đến hiện tượng thiếu oxy tổ chức và làm chết các tế bào
trong khối u. Do đó, có thể xem tác dụng tổn thương hệ mạch của
PDT là một trong những lý do chính phá hủy tổ chức u. Nghiên cứu
của Peng Q (1995) trên chuột mang u sarcom CaD2 cho thấy, PDT
sử dụng thuốc nhạy quang A1PcS2 làm giảm tái phát u có ý nghĩa
thống kê thông qua việc tác động đến cấu trúc cơ bản của khối u.
Dưới tác dụng của PDT, các tế bào nội mô tổn thương chủ yếu theo
cơ chế chết theo chương trình. Ngoài ra, PDT còn làm tổn thương
các tổ chức liên kết (như là các sợi collagen và các thành phần liên
kết khác) dưới nội mạc trong thành mao mạch mới. Có được điều
này là do các chất nhạy quang rất dễ gắn với các thành mạch bất
thường trong khối u.
KẾT LUẬN
1. Đồng thời với sự phát triển của u sarcom 180, hệ thống
mạch máu trong u đùi sarcom 180 của các nhóm động vật nghiên
cứu phát triển mạnh, quá trình tạo mạch bắt đầu từ ngày 7 đến ngày
28 sau gây u. Trên tiêu bản u đùi nhuộm hóa mô miễn dịch với các
kháng thể CD31 và CD34, mật độ mạch máu tân tạo trên đơn vị diện
tích 0,74 mm
2
tăng mạnh từ ngày thứ 7 (17,9 ± 6,2 ở tiêu bản CD31
và 16,8 ± 7,7 trên CD34) đến ngày 21 (58,2 ± 31,1 trên CD31 và

53,9 ± 32,5 trên CD34) và giảm xuống ngày thứ 28 sau gây u (49,6 ±
27,6 trên CD31 và 46,4 ± 28,5 trên CD34). Sự khác biệt giữa các
thời điểm có ý nghĩa thống kê (p<0,01 và p<0,001).
21
2. Khối ung thư sarcom 180 trên đùi chuột phát triển liên tục,
xâm lấn vào vùng mô lành liền kề và di căn vào gan, lách, phổi từ
ngày thứ 7 đến ngày 28 sau gây u. Mật độ mạch máu tân tạo tại khối u
tương quan thuận, chặt chẽ với thể tích, trọng lượng khối u đùi ở các
thời điểm sau gây u 7, 14, 21 ngày (r: 0,37- 0,53), nhưng không thấy
tương quan ở ngày thứ 28 (r: 0,22 - 0,28); tương quan thuận, chặt chẽ
với mật độ tế bào ung thư ở tất cả các thời điểm (r: 0,39 - 0,53), với số
lượng các nốt di căn phổi, gan, lách ở ngày thứ 14, 21, 28 sau gây u
(r: 0,46 - 0,63).
3. Liệu pháp quang động (PDT) sử dụng thuốc nhạy quang
Radachlorin và nguồn sáng laser diode 662 nm có tác dụng ức chế
tân tạo mạch tại u. Thực hiện PDT ở giai đoạn sớm của khối u (sau
gây u 7 ngày) có tác dụng ức chế tạo mạch trong u mạnh và ổn định,
từ thời điểm sau gây u 14 ngày (22,1 ± 6,8 trên CD31 và 23,6± 8,4
trên CD34), cho đến sau gây u 28 ngày (23,6 ± 11,3 trên CD31 và
21,9 ± 10,6 trên CD34). Thực hiện PDT ở giai đoạn muộn (sau gây u
14 ngày) ức chế tạo mạch không nhiều và không ổn định. Thời điểm
21 ngày sau gây u, mật độ mạch máu tân tạo có giảm so với nhóm
chứng không điều trị (32,5 ± 16,4 trên CD31 và 30,3 ± 15,4 trên
CD34), nhưng lại có xu hướng tăng lên vào thời điểm 28 ngày sau
gây u (47,9 ± 23,7 trên CD31 và 46,2 ± 28,8 trên CD34). Nghiên cứu
siêu cấu trúc sau PDT cho thấy tác dụng ức chế tạo mạch bằng cách
làm các tế bào nội mô trong u chết theo chương trình (apoptosis).
22