0048 tổng hợp tạp chất liên quan d (ethyl 5 amino 1h pyrazol 4 carboxylat) và tạp ethyl (

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

BỘ Y TẾ

NGUYỄN NHẬT TOÀN

TỔNG HỢP TẠP CHẤT LIÊN QUAN D (ETHYL 5AMINO-1H-PYRAZOL-4-CARBOXYLAT) VÀ TẠP
ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2CYANOETHENYL)AMINO-1H-PYRAZOL-4CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN NHẬT TOÀN

TỔNG HỢP TẠP CHẤT LIÊN QUAN D (ETHYL 5AMINO-1H-PYRAZOL-4-CARBOXYLAT) VÀ TẠP
ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2CYANOETHENYL)AMINO-1H-PYRAZOL-4CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. LỮ THIỆN PHÚC
TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

Cần Thơ – 2018


LỜI CẢM ƠN
Sau chín tháng làm nghiên cứu tại Liên bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm
– Độc chất, trải qua nhiều niềm vui, nỗi buồn, thuận lợi, khó khăn, cuối cùng tơi đã
hồn thành quyển luận văn tốt nghiệp của mình và khơng qn gửi lời cảm ơn chân
thành nhất đến những người tôi yêu quý.
Cảm ơn Cha, Mẹ, người con kính trọng, yêu thương nhất. Cảm ơn Anh hai đã
tiếp sức cho em về vật chất lẫn tinh thần.
Cảm ơn thầy ThS. Lữ Thiện Phúc, người đã hỗ trợ và truyền đạt kiến thức cho
em trong quá trình làm nghiên cứu. Thầy ln là tấm gương sáng cho em học hỏi để
hồn thiện mình hơn.
Cảm ơn thầy TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người đã tạo điều kiện cho em rất
nhiều để hoàn thành nghiên cứu của mình. Thầy ln là nguồn động lực cho các thế
hệ sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học.
Cảm ơn thầy DS. Nguyễn Mạnh Quân, là người thầy cũng như người anh đã
quan tâm, giúp đỡ em rất nhiều, truyền cho em nhiều kinh nghiệm quý giá để làm
hành trang ra trường.
Cảm ơn cô Ngọc Vân, cô Trúc Ly, cô Đặng, anh Hiền đã hỗ trợ em trong khi
thực hiện đề tài nghiên cứu.
Cảm ơn chị Trang, chị Hường, chị Thảo, chị Thúy Ngọc, anh Hạnh, chị An,
chị Xương, chị Như Ngọc, chị Mộng Ngọc, anh Thi, anh Phú, anh Dương, anh Truyền
đã cho em nhiều lời khuyên bổ ích. Em rất biết ơn khi được quen biết các anh, chị những con người tài giỏi.
Đặc biệt cảm ơn hai bạn Cẩm Nhung và Duy Thái đã bên mình trong suốt quá
trình làm đề tài, mình tin đây sẽ là kỷ niệm rất quý thời sinh viên.
Và gửi lời cảm đến ơn các thầy, cơ bộ mơn Dược liệu, Hóa dược cũng như các
bạn làm đề tài khóa 39.
Cảm ơn mọi người rất nhiều!

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn khoa học của thầy ThS. Lữ Thiện Phúc và thầy TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ.
Các kết quả, số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Cần Thơ, ngày 14 tháng 6 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Nhật Toàn


i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC .................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ...................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. ALLOPURINOL ...............................................................................................3
1.1.1. Tính chất lý hóa ..........................................................................................3
1.1.2. Dược lực học ..............................................................................................3
1.1.3. Dược động học ...........................................................................................4
1.1.4. Tổng hợp allopurinol trong các nghiên cứu ...............................................4
1.1.5. Các tạp chất của allopurinol .......................................................................5
1.2. TẠP D CỦA ALLOPURINOL .........................................................................6

1.2.1. Tính chất vật lý ...........................................................................................7
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ...................................................................................7
1.2.3. Độc tính ......................................................................................................7
1.2.4. Các cơng trình nghiên cứu về tạp D ...........................................................7
1.2.5. Giới hạn tạp D của allopurinol ...................................................................9
1.3. TẠP ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2-CYANOETHENYL)AMINO-1HPYRAZOL-4-CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL ...................................................9
1.3.1. Tính chất vật lý .........................................................................................10
1.3.2. Nguồn gốc phát sinh .................................................................................10


ii

1.3.3. Độc tính ....................................................................................................10
1.3.4. Các cơng trình nghiên cứu về tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat ..................................................11
1.3.5. Kiểm nghiệm tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino1H-pyrazol-4-carboxylat của allopurinol ...........................................................11
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 12
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................12
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................12
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................12
2.1.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu .........................................................12
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................13
2.2.1. Tạp D của allopurinol ...............................................................................13
2.2.2. Tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4carboxylat của allopurinol ..................................................................................16
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 20
3.1. TẠP D CỦA ALLOPURINOL ......................................................................20
3.1.1 Kết quả tổng hợp tạp D của allopurinol ....................................................20
3.1.2. Kết quả tinh chế tạp D ..............................................................................21
3.1.3. Kết quả sơ bộ độ tinh khiết của tạp D .....................................................21
3.1.4. Kết quả quy trình xác định độ tinh khiết của tạp D bằng HPLC-PDA ....22

3.1.5. Kết quả xác định cấu trúc tạp D ...............................................................25
3.1.6. Kết quả xác định độ tinh khiết của tạp D bằng HPLC-PDA ....................29
3.2. TẠP ETHYL-(E/Z)-5-(2-CARBETHOXY-2-CYANOETHENYL)AMINO-1HPYRAZOL-4-CARBOXYLAT (TẠP F – USP 38) CỦA ALLOPURINOL .......................31


iii

3.2.1. Tổng hợp sản phẩm trung gian ethyl-2-cyano-3-hydrazinylacrylat .........31
3.2.2. Tổng hợp tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1Hpyrazol-4-carboxylat của allopurinol .................................................................34
Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 45
4.1. TỔNG HỢP TẠP D CỦA ALLOPURINOL .................................................45
4.1.1. Cơ chế phản ứng .......................................................................................45
4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng ........................................................45
4.1.3. Xác định tạp D bằng các phương pháp phổ nghiệm ................................48
4.1.4. Kiểm tra độ tinh khiết của tạp D bằng HPLC – PDA ..............................49
4.2. TỔNG HỢP TẠP ETHYL-(E/Z)-5-(2-CARBETHOXY-2CYANOETHENYL)AMINO-1H-PYRAZOL-4-CARBOXYLAT (TẠP F – USP
38) CỦA ALLOPURINOL...................................................................................52
4.2.1. Cơ chế phản ứng .......................................................................................52
4.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng ........................................................53
4.2.3. Xác định tạp F bằng các phương pháp phổ nghiệm .................................54
4.2.4. Kiểm tra độ tinh khiết của tạp F bằng HPLC – PDA ...............................55
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 57
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT
1
2
3
4
5

Chữ tắt
ACN
As
BP
CE
DĐVN

6

HLA-B

7

HPLC

8
9
10
11
12
13
15
16

17
18
19
20
21
22
23

IR
k’
MS
N
NMR
PDA
Rs
RSD%
S
SKLM
tR
TFA
USP
UV – Vis
WHO

Chữ nguyên
Acetonitril
Asymmetric factor
British Pharmacopoeia
Capillary Electrophoresis
Dược điển Việt Nam

The human leukocyte
antigen B
High performance liquid
chromatography
Infrared
Capacity factor
Mass spectrometry
Number of theoretical plate
Nuclear Magnetic Resonance
Photodiode arrays
Resolution
Relative standard deviation %
Peak area
Sắc ký lớp mỏng
Retention time
Acid trifluoroacetic
United States Pharmacopeia
Ultraviolet – Visible
World Health Organization

Ý nghĩa
Hệ số bất đối
Dược điển Anh
Điện di mao quản
Kháng nguyên bạch cầu B
ở người
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Hồng ngoại
Hệ số dung lượng
Khối phổ

Số đĩa lý thuyết
Cộng hưởng từ hạt nhân
Dãy diod quang
Độ phân giải
Độ lệch chuẩn tương đối
Diện tích đỉnh
Thời gian lưu
Dược điển Mỹ
Tử ngoại – khả kiến
Tổ chức Y tế thế giới


v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng
Trang
1.1 Các tạp chất liên quan của allopurinol theo USP 38
5
1.2 Giới hạn tạp D trong các dược điển
9
Giới hạn tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino1.3
11
1H-pyrazol-4-carboxylat trong dược điển Mỹ 41
2.1 Nguyên liệu dùng cho tổng hợp
12
2.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
12
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khảo sát đến phản ứng
3.1

20
dựa trên SKLM
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/hydrazin đến
3.2
20
phản ứng dựa trên khối phổ
3.3 Hiệu suất của cả quá trình tổng hợp – tinh chế tạp D
21
So sánh độ dịch chuyển hóa học của SPTH (tạp D) và chuẩn tạp D
3.4
22
của allopurinol
3.5 Tính tương thích hệ thống
27
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích hydrazin hydrat đến hiệu
3.6
31
suất tổng hợp.
3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất tổng hợp
31
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất
3.8
31
tổng hợp
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất
3.9
31
tổng hợp
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng SPTG đến hiệu suất tổng
3.10

35
hợp
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích ete đến hiệu suất tổng
3.11
35
hợp
3.12 Tính tương thích hệ thống
36


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình vẽ Tên hình
Trang
3.1
Tạp D
21
3.2
Độ tinh khiết của tạp D trên SKLM
21
Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp
3.3
23
D, nguyên liệu, hỗn hợp tạp D – nguyên liệu ở 250nm.
Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp
3.4
23
D, nguyên liệu, hỗn hợp tạp D – nguyên liệu ở chế độ max plot.
3.5

Hình ảnh 3D của pic tạp D
24
3.6
Kiểm tra độ tinh khiết pic của tạp D.
24
3.7
Phổ UV – Vis của tạp D
25
3.8
Phổ IR của tạp D
25
3.9
Phổ MS của tạp D ở chế độ ESI+
26
3.10
Phổ MS ở chế độ daughter product ion của tạp D
26
3.11
Phổ 13C – NMR của tạp D
28
Công thức cấu tạo của sản phẩm tổng hợp (tạp D của
3.12
28
allopurinol)
3.13
Sắc ký đồ của tạp D trước khi tinh chế ở chế độ Max plot
29
3.14
Hình ảnh 3D của tạp D trước khi tinh chế
29

3.15
Sắc ký đồ của tạp D sau khi tinh chế ở chế độ Max plot
30
3.16
Hình ảnh 3D của tạp D sau khi tinh chế
30
3.17
SPTG
32
3.18
Độ tinh khiết của SPTG trên SKLM
32
3.19
Phổ UV – Vis của SPTG
33
3.20
Phổ IR của SPTG
33
3.21
Phổ MS của SPTG
34
3.22
Tạp F
35
3.23
Độ tinh khiết của tạp F trên SKLM
35
Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp
3.24
F, nguyên liệu, SPTG, hỗn hợp tạp F – nguyên liệu – SPTG ở

37
250nm.
Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp
3.25
F, nguyên liệu, SPTG, hỗn hợp tạp F – nguyên liệu – SPTG ở
37
chế độ max plot


vii

3.26
3.27
3.28
3.29
3.30
3.31
3.32
3.33
3.34
3.35
3.36
3.37
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7

4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13

Hình ảnh 3D của pic tạp F
Kiểm tra độ tinh khiết pic của tạp F.
Phổ UV – Vis của tạp F
Phổ IR của tạp F
Phổ MS của tạp F
Phổ 13C – NMR của tạp F
Phổ 13C và DEPT – NMR của tạp F
Công thức cấu tạo của sản phẩm tổng hợp (tạp F của
allopurinol)
Sắc ký đồ của tạp F thu được khi lượng diethyl ete sử dụng là
10ml ở chế độ Max plot
Hình ảnh 3D của tạp F thu được khi lượng diethyl ete sử dụng
là 10ml
Sắc ký đồ của tạp F thu được từ quy trình tối ưu ở chế độ Max
plot
Hình ảnh 3D của tạp F thu được từ quy trình tối ưu
Phổ MS của chất được hình thành khi tỷ lệ nguyên liệu và
hydrazin là 1:1
Khảo sát phản ứng bằng SKLM khi thay đổi tỷ lệ nguyên
liệu/hydrazin
Khảo sát phản ứng bằng SKLM ở các thời điểm khác nhau.
So sánh phổ UV – Vis của nguyên liệu và tạp D
So sánh phổ IR của nguyên liệu và tạp D

Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu và tạp D khi thay đổi hệ
đệm acid
Kiểm tra tinh khiết pic của tạp D khi dùng hệ đệm H3PO4 pH
2,5
Kiểm tra tinh khiết pic của tạp D khi dùng hệ đệm acid acetic
pH 2,5
Hình dạng pic tạp D khi ở nhiệt độ khác nhau
So sánh phổ UV – Vis của nguyên liệu, SPTG và tạp F
So sánh phổ IR của nguyên liệu và tạp F
Sự tách các pic tạp F, nguyên liệu, SPTG khi dùng các acid
khác nhau
Sắc ký đồ của hỗn hợp mẫu thử khi sử dung acid formic ở các
pH khác nhau

38
38
39
40
40
41
42
42
43
43
44
44
46
46
47
48

49
50
51
51
52
54
54
55
56


viii

Sơ đồ
1.1

Tên sơ đồ
Qui trình tổng hợp allopurinol theo Roland.K Robins

Trang
4

1.2

Qui trình tổng hợp allopurinol theo Jean Druey và cộng sự

5

1.3

Quy trình tổng hợp tạp D theo Masahiko Takahashi và cộng sự

8

1.4

Quy trình tổng hợp tạp D theo Mangesh Narayan Rajadhyaksha
và cộng sự

8

1.5
1.6
2.1
2.2
2.3
4.1
4.2
4.3
4.4

Quy trình tổng hợp tạp D theo Sindhu Jose và cộng sự
Phản ứng tạo ra tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat (tạp F – USP 38)
Quy trình tổng hợp tạp D
Phản ứng tạo SPTG
Phản ứng tạo ra tạp ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat
Cơ chế phản ứng đóng vịng của ngun liệu trong dung mơi
ethanol.
Phản ứng của nguyên liệu và hydrazin trong môi trường nước
và ethanol

Cơ chế phản ứng tạo sản phẩm trung gian
Cơ chế tự phản ứng tạo ra tạp F

9
10
13
16
17
45
48
52
53


ix


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Gout là một trong những bệnh được ghi nhận đầu tiên bởi người Ai Cập vào
năm 2640 trước công nguyên, biểu hiện bệnh như một sự sưng viêm khớp ngón chân
cái, cho đến thế kỷ 13 sau cơng nguyên thì Ralph Bocking, một vị tu sĩ người
Dominica, mới sử dụng từ “gout” để đặt tên cho bệnh [14]. Gout liên quan chặt chẽ
đến lối sống nhàn nhã, chế độ ăn uống nhiều thức ăn, rượu cho nên được đặt tên là
“bệnh của vua”. Ngày nay, điều kiện cuộc sống con người ngày càng được nâng cao
nên bệnh gout cũng trở nên phổ biến hơn. Theo các nghiên cứu tại Anh tỷ lệ bệnh
gout đã tăng từ 0,14% năm 1975 lên 1,4% năm 2005. Nghiên cứu dịch tế do Tổ chức
Y tế thế giới và hội thấp khớp học châu Á - Thái Bình Dương tiến hành tại một số
tỉnh miền Bắc Việt Nam vào năm 2000 cho thấy tỷ lệ mắc gout là 0,14% ở người

trưởng thành [4].
Gout gây ra nhiều đau đớn cho bệnh nhân, nên nhu cầu điều trị cao và thuốc
để trị gout cũng rất đa dạng. Allopurinol là một trong những hoạt chất được sử dụng
rất phổ biến, hiệu quả trong điều trị bệnh gout, với giá thành phù hợp. Mặc khác,
allopurinol đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu lần VI năm 2013 [3]
và được chỉ định thường quy trong điều trị tăng uric huyết thứ phát do hóa trị bệnh
bạch cầu hay ung thư [1]. Allopurinol cũng là thuốc thiết yếu duy nhất nằm trong
danh mục thuốc thiết yếu năm 2017 của WHO khuyên dùng [24].
Do sự phổ biến của allopurinol trên thị trường nên việc kiểm nghiệm là vấn đề
cần được quan tâm đúng mức, đặc biệt việc kiểm tra tạp liên quan allopurinol gặp
nhiều khó khăn [22] do hệ thống kiểm nghiệm trong nước không cung cấp chuẩn tạp
của allopurinol [23]. Hiện nay, ngành công nghiệp dược nước ta vẫn còn phụ thuộc
nhiều vào nguồn nguyên liệu allopurinol được nhập khẩu từ các công ty nước ngồi.
Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng ngun liệu đầu vào cũng như thành phẩm trước và
trong quá trình lưu hành cần được đặt lên hàng đầu nhằm đảm bảo chất lượng các chế
phẩm nội địa cũng như kiểm soát chất lượng các chế phẩm ngoại nhập từ hoạt chất
allopurinol.


2

Trong quá trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản allopurinol vẫn còn tồn tại hoặc
phát sinh tạp chất liên quan D và tạp ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat của allopurinol có khả năng gây độc
tính ảnh hưởng khơng nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an tồn của
thuốc đối với bệnh nhân. Tạp D của allopurinol đã được chứng minh có khả năng gây
độc tính trên da và gây hội chứng Steven Johnson do tác dụng lên gen HLA-B*5801
[15].

Ngoài

ra,

trong

cấu

trúc

tạp

ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-

cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat của allopurinol

do có phản ứng

Michel ở nhóm hút điện tử nên được xếp vào nhóm 3 các chất có khả năng gây đột
biến gen [19].
Trong chuyên luận BP 2016, USP 41 và DĐVN IV, kiểm tra tạp liên quan của
allopurinol là một tiêu chuẩn bắt buộc trong kiểm nghiệm nguyên liệu và thành phẩm
allopurinol mà các tạp chuẩn của allopurinol lại có giá khá đắt và khơng có sẵn trong nước.
Xuất phát từ những lý do trên, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “tổng hợp
tạp chất liên quan D (ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat) và tạp ethyl-(E/Z)3-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat của allopurinol” với các mục
tiêu và ý nghĩa như sau:
Mục tiêu tổng quát: nghiên cứu tổng hợp, tinh chế tạp D của allopurinol, hướng đến
thiết lập tạp D của allopurinol thành chất chuẩn kiểm nghiệm.
Mục tiêu cụ thể:
1. Nghiên cứu các phương pháp tổng hợp tạp D từ nguyên liệu thích hợp bằng các
phản ứng quy mơ phịng thí nghiệm.
2. Tinh chế và xác định độ tinh khiết của tạp D.

3. Xác định cấu trúc tạp D bằng các phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR).
Ý nghĩa:
-

Góp phần xây dựng và củng cố cơ sở lý thuyết về tổng hợp, tinh chế tạp D của
allopurinol

-

Cung cấp hợp chất mới cho ngân hàng tạp chuẩn trong nước và tạo thuận lợi kinh
tế cho công tác kiểm nghiệm allopurinol của các cơ sở, xí nghiệp dược phẩm.


3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

ALLOPURINOL

Tên khoa học: 1,5-dihydro-4H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-on.
Tên quốc tế: allopurinol, allopurinolum.
Công thức phân tử: C5H4N4O
Công thức cấu tạo:

Khối lượng phân tử: 136,11g/mol [2].
1.1.1. Tính chất lý hóa
Bột trắng hay gần như trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 350oC.
Độ tan: rất khó tan trong nước và trong ethanol 96%, tan trong các dung dịch

hydroxyd kiềm loãng, dễ tan trong DMSO (4mg/ml), kém tan trong n-octanol,
cloroform [21].
Allopurinol có pKa = 10,2 [6].
1.1.2. Dược lực học
Allopurinol có cấu trúc tương tự hypoxanthin, tác dụng ức chế enzym xanthin
oxydase, là enzym có vai trị chuyển hóa các tiền chất hypoxanthin thành acid uric.
Vì thế, allopurinol làm giảm nồng độ acid uric trong máu. Acid uric huyết tăng cũng
có thể gây bệnh thận và sỏi thận. Do vậy, allopurinol được dùng để ngăn ngừa sỏi
thận do acid uric và ngăn ngừa cơn viêm khớp gout cấp.
Thuốc ức chế xanthin oxydase, bắt đầu làm giảm sản xuất acid uric trong 2-3
ngày, acid uric máu trở lại bình thường trong vịng 1-3 tuần [1].


4

1.1.3. Dược động học
Trong đường tiêu hóa, allopurinol hấp thu khoảng 90% và đào thải 20%.
Nồng độ cao nhất trong máu là 3µg/ml, đạt được sau 1,5 giờ và 6,5µg/ml
oxypurinol sau 4,5 giờ với liều sử dụng là 300mg allopurinol theo đường uống.
Dưới tác động của enzym xanthin oxydase, allopurinol chuyển hóa thành
oxypurinol. Allopurinol cũng được chuyển hóa bởi enzym hypoxanthin guanin
phosphoribosyl transferase và phosphoribosyl transferase orotat tạo ra sản phẩm ức chế
purin nucleosid phosphorylase, enzym tham gia quá trình chuyển hóa purin. Ngồi
oxypurinol, các sản phẩm chuyển hóa khác của allopurinol gồm allopurinol-1-ribosid và
oxypurinol-7-ribosid.
Allopurinol bị oxy hóa tạo thành sản phẩm oxypurinol rất nhanh. Tốc độ thanh
thải qua đường tiết niệu của allopurinol gần bằng độ lọc cầu thận. Vì thế, thời gian bán
thải của allopurinol chỉ khoảng 1-2 giờ. Tuy nhiên, oxypurinol có thời gian bán thải dài
hơn, khoảng 15 giờ. Do đó, tác dụng ức chế enzym xanthin oxydase được duy trì hiệu
quả trong khoảng 24 giờ [1].

1.1.4. Tổng hợp allopurinol trong các nghiên cứu
Allopurinol được tổng hợp lần đầu bởi Roland. K Robins năm 1955, từ phản ứng
malononitril với triethyl orthoformat [17].
Đun hồi lưu 6h

NH2NH2
Đun hồi lưu 1h

H2SO4 đậm đặc,
khuấy đều 1,5h

NH2CHO
180-190 oC, 45 phút

Sơ đồ 1.1. Qui trình tổng hợp allopurinol theo Roland.K Robins

Năm 1959, Jean Druey và cộng sự đã tổng hợp allopurinol từ ethoxymethylene-cyanacetic acid ethyl este và hydrazin, formamid với số bước phản ứng ít
so với Rolan. K Robins [8].


5

NH2NH2
Đun hồi lưu 6h

NH2CHO
190-200 oC, 8h

Sơ đồ 1.2. Qui trình tổng hợp allopurinol theo Jean Druey và cộng sự

1.1.5. Các tạp chất của allopurinol
Bảng 1.1. Các tạp chất liên quan của allopurinol theo USP 38
Tạp

Công thức

Danh pháp IUPAC

A

5-amino-1H-pyrazol-4-carboxamid; 3aminopyrazol-4-carboxamid

B

5-(Formylamino)-1H-pyrazol-4carboxamid

C

5-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)-1H-pyrazol-4carboxamid


6

D

Ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat

E

Ethyl 5- (formylamino)-1H-pyrazol-4carboxylat

Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2cyanoethyl)amino-1H-pyrazol-4carboxylat

1.2. TẠP D CỦA ALLOPURINOL
Tên hóa học: ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat.
Công thức phân tử: C6H9N3O2.
Khối lượng mol: 155,15g/mol.


7

Cơng thức cấu tạo:

1.2.1. Tính chất vật lý
Chất rắn, kết tinh, màu trắng, trắng ngà hoặc vàng nhạt, không mùi.
Nhiệt độ nóng chảy: 101 – 104oC.
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh
Tạp D là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui
trình của Jean Druey và cộng sự (1959) như được trình bài ở mục 1.1.4.
1.2.3. Độc tính
Có thể gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và gây tổn hại cho thai nhi.
Có hại cho sinh vật ở nước, gây ra các tác hại lâu dài trong môi trường nước.
Tạp D của allopurinol đã được chứng minh có khả năng gây độc tính trên da
và gây hội chứng Steven Johnson do tác dụng lên gen HLA-B*5801 [19].
1.2.4. Các cơng trình nghiên cứu về tạp D
Năm 1977, Masahiko Takahashi và cộng sự, khi nghiên cứu tổng hợp các dẫn
xuất vòng pyrazol, đã sử dụng dẫn xuất amidrazon với ethyl 2-cyano-3-ethoxyacrylat
trong ethanol tạo chất trung gian N-(2-cyano-2-ethoxycarbonylvinyl) amidrazon. Sản
phẩm trung gian được tiếp tục đóng vịng trong toluen tạo 3-amino-1H-pyrazol-4carboxylat (tạp D) [20].

8

C2H5OH
0 oC

Đun hồi lưu 4h-6h
toluen

Sơ đồ 1.3. Quy trình tổng hợp tạp D theo Masahiko Takahashi và cộng sự
Mangesh Narayan Rajadhyaksha và cộng sự cho ethyl cyano acetic phản ứng
với morpholine và triethylorthoformate để tạo ra sản phẩm trung gian, sản phẩm này
tiếp tục cho phản ứng với hydrazin để tạo ra tạp D [16].

15-45 oC, 6h
85-90 oC, 3-5h

NH2NH2

Sơ đồ 1.4. Quy trình tổng hợp tạp D theo Mangesh Narayan Rajadhyaksha và cộng
sự.
Năm 2017, Sindhu Jose và cộng sự, trong quá trình nghiên cứu các tác dụng
sinh học của các sản phẩm tạo ra từ sự ngưng tụ ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4carboxylat và methyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat với (7-chloro-4-oxochroman-3-yl)-oxo-acetic acid ethyl este, đã mô tả cách tổng hơp tạp D (ethyl 5amino-1H-pyrazol-4-carboxylat và methyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat) bằng
cách khuấy đều hỗn hợp dimethyl formamid dimethylacetal, ethylcyanoacetat và
dimethylformamid ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ cho phản ứng xảy ra, làm lạnh về


9

0oC và cho từng giọt hydrazin 80% vào, sau đó đun nóng hỗn hợp lên 50oC để tạo ra

tạp D [11].
NH2NH2
50 oC, 2h

Sơ đồ 1.5. Quy trình tổng hợp tạp D theo Sindhu Jose và cộng sự
Nhận xét: các công trình nghiên cứu trên cịn sử dụng nhiều ngun liệu, điều
kiện tương đối khắc nghiệt để tổng hợp tạp D. Qua tham khảo các cơng trình trên,
nhóm

nghiên

cứu

quyết

định

lựa

chọn

ngun

liệu

ethyl

(ethoxymethylen)cyanoacetat và hydrazin, thực hiện phản ứng đóng vịng trong mơi
trường ethanol để tạo ra tạp D, phản ứng một giai đoạn, điều kiện không khắc nghiệt
như các nghiên cứu trên.

1.2.5. Giới hạn tạp D của allopurinol
Bảng 1.2. Giới hạn tạp D trong các dược điển
Giới hạn tạp D trong nguyên
liệu không vượt quá (%)
0,1
0,1
0,2

Dược điển
DĐVN IV
BP 2016
USP 41

Giới hạn tạp D trong viên
nén khơng vượt q (%)
0,1
0,1
-

1.3. TẠP ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2-CYANOETHENYL)AMINO-1HPYRAZOL-4-CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL
Tên

hóa

học:

ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-

pyrazol-4-carboxylat.
Cơng thức phân tử: C12H14N4O4.

Khối lượng mol: 278,1 g/mol.
Công thức cấu tạo


10

1.3.1. Tính chất vật lý
Chất rắn, màu trắng [21].
1.3.2. Nguồn gốc phát sinh
Tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat được
hình hành từ sản phẩm trung gian là tạp D [12] trong quá trình tổng hợp allopurinol
theo qui trình của Jean Druey. Tạp D sao khi hình thành sẽ phản ứng tiếp với lượng
dư của triethyl orthoformat và ethyl cyanoaceton tạo thành tạp ethyl-(E/Z)-5-(2carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat.

Tạp D

Ethyl cyanoaceton

Triethyl orthoformat

Tạp F

Sơ đồ 1.6. Phản ứng tạo ra tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol4-carboxylat (tạp F – USP 38)
1.3.3. Độc tính
Makoto Osabe và cộng sự (2016) bằng mơ hình docking đã chứng minh khả
năng gắn kết của 6 tạp chất liên quan của allopurinol có ký hiệu lần lượt là A, B, C,
D, E, F (theo USP 38) với gen HLA-B*5801 gây ra hội chứng Steven-Johnson và
hoại tử tế bào biểu bì [15] tương tự như tác dụng phụ của allopurinol. Kết quả nghiên
cứu cho thấy các tạp liên quan allopurinol (ngoại trừ tạp A) có khả năng gắn kết cao
hơn hẳn hoạt chất chính, trong đó đặc biệt đáng lưu ý là tạp F (theo USP 38) với hai

dạng đồng phân quang học (Z) và (E) có khả năng gắn kết vượt trội.
Theo USP 38, hàm lượng các tạp không vượt quá 0,2%, tuy nhiên đối với tạp
F do có phản ứng Michel ở nhóm hút điện tử nên được xếp vào nhóm 3 các chất có
khả năng gây đột biến gen, cần có sự kiểm sốt nghiêm ngặt [19].


11

1.3.4. Các cơng trình nghiên cứu về tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat
Năm 2010, G. G. Danagulyan và cộng sự khi nghiên cứu tổng hợp các dẫn
xuất của pyraolo[1,5-α]pyrimidin cho thấy có thể tổng hợp ethyl-(E/Z)-5-(2carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat từ tạp D với ethoxy
methylen cyanoacetat. Tuy nhiên do là sản phẩm trung gian nên chưa đề cập hiệu suất
phản ứng cũng như độ tinh khiết [12].
1.3.5. Kiểm nghiệm tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1Hpyrazol-4-carboxylat của allopurinol
Bảng 1.3. Giới hạn tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1Hpyrazol-4-carboxylat trong dược điển Mỹ 41
Dược điển

Giới hạn tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-

Giới hạn tạp ethyl-(E/Z)-5-

carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino- (2-carbethoxy-21H-pyrazol-4-carboxylat trong

cyanoethenyl)amino-1H-

nguyên liệu không vượt quá (%)

pyrazol-4-carboxylat trong
viên nén không vượt quá
(%)

USP 41

0,2

-


12

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là tạp chất liên quan ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4carboxylat (tạp D) và tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1Hpyrazol-4-carboxylat của allopurinol.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Liên Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, khoa Dược,
trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
Thời gian: từ tháng 09/2017 đến tháng 06/2018.
2.1.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
Bảng 2.1. Nguyên liệu dùng cho tổng hợp
STT
1
2
3
4
5
6

Tên hóa chất
Nguồn gốc

Hàm lượng
Diethyl ete
Xylong
99,5%
Ethanol
Xylong
99,5%
Ethyl (ethoxymethylen)cyanoacetat
Acros
98%
Ethylacetat
Xylong
99,5%
Hydrazin Hydrat
Xylong
80%
Nước cất 1 lần
Các hóa chất dùng trong xác định cấu trúc, xác định độ tinh khiết và sắc ký

lớp mỏng là các hóa chất tinh khiết dùng cho phân tích của hãng Merck.
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Dụng cụ
Dùng trong tổng hợp và tinh chế
Erlen 100ml, 250ml, 500ml
Bộ dụng cụ đun hồi lưu
Nhiệt kế
Bercher 50ml, 100ml, 250ml

Trang thiết bị

Bếp điện
Bộ lọc áp suất giảm
Cân phân tích 4 số
Máy cơ quay Heidolph
Máy đo pH Consort
Máy khuấy từ gia nhiệt Heidolph