0003 xây dựng và thẩm định qui trình định lượng curcumin
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (61.87 MB, 103 trang )
Í (re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Ả
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
XÂY DỰNG VÀ THÁM ĐỊNH
QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN
_ THU VIEN |
TRƯỞNG GAi HOC Y DUOC CAN THO
HAY TON TRONG BAN QUYEN
Chủ tịch Hội Đồng
ae mle
Chủ nhiệm đề tài
a
⁄
⁄
————
PGS. TS. Tran Ngoc Dung
Cần Tho — Nam 2013
|
A
fl~
ao
Ths. Lé Thi Minh Ngoc
(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tơi
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và
chưa từng được ai cơng bồ trong bắt kì cơng trình nghiên cứu khác.
Cần Thơ, tháng 06 năm 2013
¿ 14 ẹ
a
Lé Thi Minh Ngoc
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
iii
MUC LUC
090v
89). ........).).)............
\/00/9109 0...
ÔÔÔÔỐÔÔỐỐỐ
ii
ili
57.0819) 0vv 2) y1 .................... vii
PHAN 2. TOAN VAN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU.......................-..--.s-ss©sscssccsee xii
DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHỮ VIẾT TẮTT............................-5 -ss-s° xii
)/.9):0/10009/(e;:90 cm.
................ xiii
0. 9/:8./00/909.(e:i0.077.. .................. XỈv
¡37.0 ,(052701010577..................... 1
CHƯƠNG I — TONG QUAN TAI LIBU ..............................55-55 ses
1.1. TONG QUAN VE CURCUMIN........................... scsesuvesesssecsssetesssuseesssnsesssseessesass 3
1.1.1. Cấu trúc & tính chất lý hóa của curcumin........................- - sc+c+sevseserssrse- 3
ID Xe
3vì0y0)0iiììi(00 06-0351...
............. 4
1.1.3. Tác dụng được lý.................-ccset xxx eEEkCEEkeerkkerkrrrtrrrrreet _—
6
1.1.4. Định lượng CUrCUmlTn.........................
.<< G5940 1H
kg
nh 6
1.2. TÔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHÔ UV - VIS........................... 8
1.2.1. Dinh luat hap thu birc xa Lambert — Beer... cecceeceeseeennneeeeeeeeeeaaes 8
1.2.2. Ung dung trong dinh Irong.....sccesscsscssssssesesssesesssessseccsesecstestesssasssecseesees 8
1.3. TONG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC.........................---------- tre
9
1.3.1. Hé thong may HPLC. eccscscscssssesecsesesesscsesccssstsceserscecsneasavsseseseeasseeseaes 9
1.3.2. Các thông số kỹ thuật trong sắc ký lỏng hiệu năng cao........................- 10
1.3.3. Ứng dụng.........................----:se kc222132711321127121121111112111111111111 T111... 12
1.4. THAM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH...............................---22s +:z+c+seccxeerx 13
1.4.1. Khái niệm. . . . . . . . . . . . .¿
¿5< 2sct E921 11711011211011710111171117111121
1221. ecrrrrryd 13
1.4.2. Các yêu cầu cần thực hiện để thẩm định qui trình phân tích .................. 13
CHUONG 2 ~ ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.............................
2-2 ©©+++E++SESEt2EExevErxrrrrxersrrrerree 17
"5 0N9. 02.02 1... ................. 17
2.1.2. Chất chuẩn đối chiếu..........................-2 2cecceverrerverreeo "
2.2. HĨA CHÁT, DƯNG MƠI VÀ TRANG THIẾT BỊ............................- 5-5555
17
17
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
iv
2.2.1. Hóa chất, dung Mi e...eccsescscessssescsseecsessssseessesssesesssesssessseessseessssecasesseneces 17
"8N
8)
820...
...... A:Ư...ƠỎ
18
"c8 ?(019))168327.)30)16):1002)09900001............ 18
2.3.1. Xây dựng và thâm định qui trình định lượng HPTR curcumin trong méi
trường thử độ hòa tan bằng phương pháp UV — Vis.......................c.ccccrierierre 18
2.3.2. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng curcumin trong viên nén nỗi
b5011901011/i1-09:1809 04111777...
.............
21
2.3.3. Xây dựng và thẩm định qui trình định long curcumin trong viên nén nỗi
i11-80106,1-89)-18s)309211Đ7....................... 23
CHUONG 3 — KET QUA NGHIBN CỨU............................-----+-ecrretrerre 29
3.1. XAY
DUNG
VA
THAM
ĐỊNH
QUI
TRÌNH
ĐỊNH
LƯỢNG
HPTR
CURCUMIN TRONG MƠI TRƯỜNG THỬ ĐỘ HỊA TAN BẰNG PHƯƠNG
70654217775. .......................
3.1.1. Lura chon
2.00
29
.................
29
3.1.2. Xây dựng qui trình định lượng..............................----.---«+---<<+- L4 21tr
29
3.1.3. Thâm định qui trình định lượng ..................
. ------5-5+-55+csecerxervererkeeveee 30
ki -n ty nga
...................
30
3.1.3.2. Timh tuyén tinh .................
33
3.1.3.3. DO chinh XAC crssssssssseecsssseseeseeeeee essessussssesesssansannasesenscuneneneseseuveneees 34
cơ NT
na... ........................,Ơ 35
3.2. XÂY DỰNG VÀ THẢM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CURCUMIN
TRONG VIÊN NÉN NĨI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-—VIR............................... 36
3.2.1. Lựa chọn bước sóng định lượng .......................--...-5s SĂ Sen
re 36
KÝ 6b (00 :;ïsn 017.
3.2.3. Tinh tuyén
3.2.4. D6 si
3.2.5. DO
0
pc...
..................
.............
36
37
................
38
na... ........E...........
39
3.3. XAY DUNG VA THAM DINH QUI TRINH DINH LUGNG CURCUMIN
TRONG VIÊN NÉN NỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC..........................--.------ 40
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Vv
3.3.1. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu...........................----cssccccccccvrrxre 40
3.3.2. Tính tương thích hệ thống........................-22c cx€ExcEEEEECEkEEEEEEEEEeEkerkerrxre 42
3.3.3. Tính đặc hiỆu....................--s-tt22tS+2
9211221221 712112110217T1 21111111. crkerreee 44
3.3.4. Tính tuyến tính và miền giá trị....................----65s csctvktEEeEeEkererkerkerkervres 45
S0
vn
0c 1
............................... 47
3.3.6. Độ đúng.........................¿+ tt 11212 1111171321121. 11.1111.11111.11.11.1.
111... 48
3.3.7. Độ tỉnh khiết của piG........................----sse 2S Scs2 E2 2E EEkEEEEkrrkrrrkerrrrrrrrrk 49
3.3.8. So sánh kết quả định lượng curcumin trong viên nén nỗi của hai phương
pháp UV — Vis và HIPLC......................-¿2-5 s£+x+S++E£EE+2EEEEEEEvEErkezkrErrkrrxvrerretred 50
CHƯƠNG 4~— BAN LUẬN .............................o-s55< seo ch E*EeEsEESsEkrksEsrssreepsesetser 52
4.1. XÂY
DỰNG
VÀ THÁM
ĐỊNH
QUI TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG
HPTR
CURCUMIN TRONG MOI TRUONG THU DO HOA TAN BANG PHUONG
PHAP UV — VIS cocccssccseccssscscssecesssseccsssvecsssvecsessvesssusssssuvessseecsssvessseressanecsssusessssvessesseees 52
4.2. XÂY DỰNG VÀ THAM DINH QUI TRINH DINH LUONG CURCUMIN
TRONG VIEN NEN NỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV-—VIS............................... 54
4.3. XAY DUNG VA THAM ĐỊNH QUI TRINH DINH LUGNG CURCUMIN
TRONG VIÊN NÉN NÓI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC...............................---- 56
KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ,.................................
2- << se se EEeEsEsese ke ersesterersersree 62
4i). 1/6: .............),).)H),HD)D)H... 63
(V.000i19000:/ 9,097 0012... ................. 64
PHỤ LLỤC, ..........................22--C22
EEECE22EEEEEEEtE22E27Ed9tE22EEEedcv222222d2ecvvvvvrzed 68
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
VỊ
`
PHAN 1. TOM TAT DE TAI
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
sẻ
Ví
I. PHAN MO DAU
Curcumin là thành phần chiết xuất từ củ nghệ có rất nhiều trong dụng như giảm
đau, kháng viêm, làm lành vết thương đặc biệt là khả năng kháng ung thư của
curcumin đo đó việc nghiên cứu bào chế những sản phẩm có chứa curcumin đang
được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu hiện nay. Với những tác dụng có lợi
mà
curcumin
mang
lại, hiện
đang
có nhiều
cơng
trình nghiên
cứu về hoạt
chất
curcumin. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có chuyên luận curcumin trong Dược
Điển Việt Nam cũng như Dược Điển của các nước khác trên thế giới. Những cơng
trình nghiên cứu về việc phân tích kiểm tra chất lượng curcumin, trong đó phân tích
định lượng là một trong những chỉ tiêu quan trọng, vẫn còn hạn chế.
Nhằm phục vụ cho việc định lượng hệ phân tán rắn curcumin trong mơi trường thử
độ hịa tan và xác định hàm lượng curcumim trong viên nén nổi đã được bào chế
đồng thời với mong muốn có được một qui trình định lượng curcumin chuẩn để
kiểm tra chất lượng sản phẩm góp phan mang đến những sản phẩm vừa hiệu quả
vừa an toàn cho bệnh nhân, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng và thẩm định qui
trình định lượng curcwmin” với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng và thâm định qui trình định lượng hệ phân tán ran curcumin trong
môi trường thử độ hòa tan bằng phương pháp UV — Vis.
2. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng viên nén nổi chứa curcumin
bằng phương pháp UV — Vis.
3.
Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng viên nén nỗi chứa curcumin
bằng phương pháp HPLC.
II. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Xây dựng và thẳm định qui trình định lượng HPTR curcumin trong mơi
trường thử độ hịa tan bằng phương pháp UV — Vis
2.1.1. Lựa chọn dung môi
Tiến hành khảo sát mơi trường thử độ hịa tan cho HPTR curcumin (dung môi A).
Hai dung môi được khảo sát là đệm pH 1,2 va tween 80 0,2%.
Đánh giá khả năng hòa tan của curcumin trong hai dung mơi này. Từ đó, lựa chọn
dung mơi thích hợp cho thir d6 hoa tan HPTR curcumin.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
¬
Vill
2.1.2. Xây dựng qui trình định lượng
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch curcumnin chuẩn đối chiếu: cân chính xác khoảng 10 mg curcumin chuẩn
cho vào bình định mức 50 ml, thêm methanol, lắc kỹ đến tan hoàn toàn. Bồ sung
methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác I ml dung dịch cho vào bình định
mức 50 ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng dung môi A (được khảo sát ở mục
-_2.3.1.1.), lắc đều. Dung dich thu được có nồng độ chất chuẩn đối chiếu là 4 hg/ml.
Dung dich mẫu thử: cân một lượng bột của HPTR curcumin tương ứng với khoảng
10 mg
curcumin
cho vào bình định mức
50 ml, thêm methanol
vừa đủ đến vạch,
siêu âm trong 10 phút. Lọc dung dịch qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 ml dịch lọc đầu.
Hút chính xác 1 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50 m], bổ sung vừa đủ đến vạch
bằng dung môi A, lắc đều. Dung dịch thu được có nồng độ curcumin là 4 ug/ml.
Cách tiễn hành
Quét phổ các dung dịch thu được trong vùng từ 350 — 500 nm để lựa chọn bước
sóng thích hợp cho định lượng.
2.1.3. Thẩm
định qui trình định lượng: Tính đặc biệu, tính tuyến tính, độ chính
xác, độ đúng.
2.2. Xây dựng và thâm định qui trình định lượng curcumin trong viên nén nỗi
bằng phương pháp UV -— Vis
2.2.1. Chuẩn bị mẫu
Dung dịch chuẩn đối chiếu: cân chính xác khoảng 10 mg curcumin chuẩn cho vào
bình định mức 50 ml, thêm methanol, lắc kỹ đến tan hoàn toàn. Bổ sung methanol
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 1 ml dung dịch cho vào bình định mức 50
ml, bé sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được có nơng độ
chất chuẩn đối chiếu là 4 ug/mI.
Dung dịch mẫu thử: Cho 20 viên nén nỗi nghiền mịn đều trong cối. Cân chính xác
một lượng bột tương ứng với 10 mg curcumin cho vao bình định mức 50'ml, thêm
methanol vừa đủ đến vạch, siêu âm trong khoảng 10 phút. Lọc dung dịch qua giấy
lọc, bỏ khoảng 10 mÌ dịch lọc đầu. Hút chính xác I ml dung dịch cho vào bình định
mirc 50 ml, bé sung methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được có
nồng độ cureumin là 4 ug/ml.
l\Ø'ruMPLiB Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
.
IX
Cách tiễn hành
Quét phổ các dung dịch thu. được trong vùng từ 350 — 500 nm để lựa chọn bước
sóng thích hợp cho định lượng.
2.2.2. Thắm định qui trình định lượng: Tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính
xác, độ đúng.
2.3. Xây dựng và thắm
định qui trình định lượng curcumin trong viên nén nỗi
bằng phương pháp HPLC
2.3.1. Xử lý mẫu
Dung địch curcumin chuẩn đối chiếu: cân chính xác khoảng 10 mg cureumin chuẩn
hịa tan trong bình định mức 50 mÏl với ACN, siêu âm trong 10 phút. Hút chính xác
1 ml dung địch cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ACN,
lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 um thu được dung dịch curcumin chuẩn đối chiếu có
néng d6 20 ug/ml.
Dung dich mẫu thử viên nén nổi chứa cwrcumin:
cho 20 viên nén nỗi nghiền
mịn
đều trong cối. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 10 mg curcumin
cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch bằng ACN, siêu âm trong 10 phút.
Lọc dung địch qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dung
dịch cho vào bình định mức
10 ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ACN, lac déu,
lọc qua màng loc 0,45 um được dung địch có néng dé curcumin 1a 20 pg/ml.
2.3.2. Tham định qui trình định lượng: Thăm dị điều kiện sắc ký tối ưu, tính
tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng.
II. KẾT QUÁ NGHIÊN CUU
1. Đã xây dựng và thâm
định qui trình định lượng HPTR
curcumin trong mơi
trường thử độ hịa tan tween 80 0,2%. Kết quả thu được bước sóng định lượng là
427 nm. Phương trình hồi quy là
= 0,1661x với khoảng nồng độ tuyến tính là
[1 — 8] ug/ml. Ngoai ra, qui trình cịn đạt tính đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng.
2.
Đã xây dụng và thấm định qui trình định lượng curcumin trong viên nén nỗi
bằng phương pháp UV — Vis. Kết quả bước sóng định lượng là 424 nm. Phương
trình hồi quy là =0,1616x với khoảng nồng dé tun tinh [1 — 14] pg/ml.
Ngồi ra, qui trình cịn đạt tính đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
3.
Đã xây dựng và thâm định qui trình định lượng curcumin trong viên nén nỗi
bằng phương pháp HPLC, thu được điều kiện sắc ký tối ưu cho định lượng
curcumin trong viên nén nỗi:
Hệ thống máy HPLC Dionex UltiMate 3000.
Pha tinh: cét Phenomenex Lunar RP — C18 (250 x 4,60 mm, 5 ym, 100 A).
Thé tich tiém mau: 40 yl.
Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng.
Bước sóng phát hiện: 380 nm.
Pha động: ACN : acid formic 0,2 % = 90: 10.
.
Qui trình đạt tính tương thích hệ thống với giá trị RSD% của các thông số (tạ, S,
N, As, Rs) đều nhỏ hơn 2%. Phương trình hồi quy thu được là ÿ=3,2707x với
khoảng nồng độ tuyến tính [5 — 100] ug/ml. Qui trình định lượng đã xây dựng
đạt tính đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng.
IV. KÉT LUẬN
Sau thời gian thực hiện để tài đã thu được các kết quả theo mục tiêu đề ra, đã xây
dựng và thâm định thành công các qui trình định lượng curcumin hệ phân tán rắn,
trong viên nén nỗi bằng phương pháp quang phô UV — Vis và phương pháp HPLC.
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
bội
.
PHẢN 2. TỒN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
XI _
DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHU VIET TAT
Từ nguyên
Nghia Tiéng Viét
Gia tri trung binh
Khoảng tin cậy
Absorbance
Độ hấp thu
Acetonitril
Asymmetry factor
Dd
Dung dich
DĐVN IV
Dược Điền Việt Nam IV
Giới hạn tỉn cậy
e
HPLC
Hệ sô bất đôi
High performance liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
chromatography
HPTR
Hé phan tan ran
Mobile phase
Pha động
Theoretical plates
Số đĩa lý thuyết
PEG
Polyethylen glycol
Pic
Peak
PVP
Polyvinyl pyrolidon
Đỉnh trên sắc ký đồ
Coefficient of Correlation
Hệ số tương quan
RP
Reversed phase
Pha đảo
Rs
Resolution factor
Hệ số phân giải
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
Area
Diện tích đỉnh
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
Retention time
Thời gian lưu
Ultraviolet — Visible Spectroscopy
Quang phổ tử ngoại-khả kiến
SD
UV - Vis
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
XIH
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bang 1.1 Qui trình thâm định theo Q2(RI)-ICH (International Conference on
Harmonization, 11
920005011077. ........................
14
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất và dung môi sử dụng trong đề tài.........................--.- 16
Bảng 2.2. Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài........................... --¿------ 17
Bảng 3.1. Sự tuyến tính giữa độ hấp thu theo nồng độ định lượng.......................-- 32
Bang 3.2. Kiểm tra tính tương thích, ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi
50) 01 ..........................................
32
Bảng 3.3. Khảo sát độ chính xác định lượng HPTR curcumin/PEG.......................... 33
Bảng 3.4. Khảo sát độ chính xác định lượng HPTR curcumin/B-cyclodextrin....... 33
Bang 3.5. Khao sat d6 chính xác định lượng HPTR curcumin/PVP...........................- 33
Bảng 3.6. Kết quả thử độ đúng phương pháp định lượng HPTR curcumin ............ 34
Bang 3.7. Su tuyén tính giữa độ hấp thu theo nồng độ định lượng ........................... 36
Bảng 3.8. Kiếm tra tính tương thích, ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi
500...
.....................
37
Bảng 3.9. Khảo sát độ chính xác định lượng curcumin trong viên nén nổi............. 38
Bảng 3.10. Kết quả độ đúng phương pháp định lượng curcumin trong viên nén nổi.
Bảng 3.11. Tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn curcumin ........................... 4I
Bảng 3.12. Tính tương thích hệ thống trên mẫu thử viên nén nỗi chứa curcumin.. 42
Báng 3.13. Sự tuyến tính giữa diện tích đỉnh theo nồng độ định lượng.................. 44
Bảng 3.14. Kiểm tra tính tương thích, ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi
10122...
. . ........................
44
Bảng 3.15. Khảo sát độ chính xác định lượng curcumin trong viên nén nôi........... 46
Báng 3.16. Kết quả độ đúng phương pháp định lượng curcumin trong viên nén nổi .
Bảng 3.17. So sánh hai phương pháp về các chỉ tiêu đã khảo sát..........................-- 49
. Bảng 3.18. Bảng kết quả xác định hàm lượng của cureumin trong viên nén nỗi.... 50
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
‹
XIV
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học curcumin. .........................
----c- + <2 ++k+S+kk+kzE+EEEEEErxekrszksrsred 3
Hình 1.2. Dạng hỗ biến bis-ceto (A) trong mơi trường acid và trung tính và dạng
enol (B) ở pH trên 8..........................-.-.-ĂĂ tk vs
re 'tggNN.NL
4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học demethoxycurcumin. ............................-..--- --¿©55scs
Hình 3.1. Phổ UV — Vis của cureumin trong mơi trường tween 80 0,2%............... 28
Hình
3.2.
Overlay
phổ
UV
— Vis
của mẫu
chuẩn
curcumin,
mẫu
thử HPTR
curcumin/PEG và mẫu trắng PEG trong tween 80 0,2% ....................-.cccccvcvvervsrceree 29
Hinh
3.3.
Overlay
phé
UV
— Vis
của
mẫu
chuẩn
curcumin,
mau
thử HPTR
curcumin/B-cyclodextrin va m4u trang B-cyclodextrin trong tween 80 0,2% ......... 29
Hình
3.4. Overlay
phé
UV
— Vis
cia mau
chuẩn
curcumin,
mau
thi HPTR
curcumin/PVP va mau trang PVP trong tween 80 0,2% ....ccccssssscsessessesseseeseeseeesecenes 30
Hình 3.5. Overlay phổ UV — Vis của mau chuan curcumin có sử dụng methanol
trong giai đoạn đầu xử lí mẫu, mẫu khơng sử dụng methanol và mẫu trang methanol
¬
................Ố.Ố....
31
Hình 3.6. Đồ thị tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ dd cureumin chuẩn........ 32
Hình 3.7. Phổ UV — Vis của curcumin trong dung mơi methanol........................-..--- 35
`
A
x
+
%
ˆ
A
x
+
“A
As
z
Hình 3.8. Overlay phơ đơ của mẫu curcumin chuân, mâu thử viên nén nôi chứa
curcumin và mẫu tá dược viên nén nổi trong methanol .....................
.-.- +5: +ss5+>++5+2 36
Hình 3.9. Đồ thị trơng quan giữa độ hấp thu và nồng độ dd curcumin chuẩn........ 37
Hình 3.10. Kết quả khảo sát ở điều kiện sắc ký (1), (2), (3) và (4)....................... 39
Hình 3.11. Kết quả khảo sát ở điều kiện sắc ký (5), (6), (7) và (8)....................... 40
Hình 3.12. Kết quả khảo sát ở điều kiện sắc ký (9), (10), (11), (12), (13) và (14).. 40
Hình 3.13. Overlay sắc ký đồ tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn curcumin...
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
XV
Hình 3.15. Overlay sắc ký đồ mẫu thủ, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu trắng,
dung môi pha mẫu và dung mơi pha động ...............................----- 25+ sxererceerrrxee 43
Hình 3.16. Đồ thị tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ dd curcumin chuẩn 44
Hình 3.17. Overlay sắc ký đồ tính tuyến tính của curcumin chuẩn....................... 45
Hình 3.18. Overlay sắc ký đồ độ chính xác curcumin trong mẫu thử...................... 46
Hình 3.19. Overlay sắc ký đồ độ đúng curcumiin........................... ----c+s--+c+rescsrczrrrcee 41
Hình 3.20. Kiểm tra độ tình khiết pic curcumin trong mẫu thử ..........................
-: 48
Hình 3.21. Phổ 3D của curcumin trong mẫu thử........................-.
--- +: s+c<
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
PHAN MO DAU
Ngày nay, với sự phát triển của hóa dược và công nghệ, nhiều hoạt chất mới được
tổng hợp kèm theo đó là những tác dụng phụ khơng mong muốn. Do vậy, xu hướng
của những cơng trình nghiên cứu hiện tại và tương lai là hướng đến những hoạt chất
có nguồn gốc tự nhiên, chiết xuất từ được liệu mang lại hiệu quả điều trị tốt, đồng
thời giảm nhẹ được những tác dụng phụ không mong muốn.
Nghệ (Czrcưma longa) là một loại dược liệu đã được sử dụng từ rất lâu, thuộc họ
Gừng (Zingiberaceae), được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam A.
Nghệ được sử dụng làm gia vị, chất màu trong thực phẩm và điều trị nhiều loại
bệnh. Trong y học cỗ truyền
Án Độ, Nghệ
được dùng để chữa các bệnh rối loạn
đường mật, chán ăn, ho, làm lành vết thương do tiêu đường, chữa bệnh thấp khớp,
và viêm xoang. Trong y học hiện đại, Nghệ được nghiên cứu chiết xuất các thành
phần hoạt chất và bào chế thành những chế phẩm trên thị trường. Curcumin là một
hoạt chất chính trong Nghệ, có tác dụng kháng viêm, lành vết loét đã được sử dụng
phổ biến trong điều trị loét dạ dày tá tràng. Ngoài ra, curcumin cịn có tác dụng
chống oxy hóa, chống xơ vữa thành mạch, giảm cholesterol máu, chống kết tập tiểu
cầu, đặc biệt là hoạt tính chống ung thư đang rất được quan tâm. [9]
Với những tác dụng có lợi mà curcumin mang lại, hiện đang có nhiều cơng trình
nghiên cứu về hoạt chất curcumin. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có chuyên luận
Việt Nam cũng như Dược Điển của các nước khác trên
curcumin trong Dược Điển
cơng trình nghiên
thế giới. Những
tra chất lượng
tích kiểm
cứu về việc phân
curcumin, trong đó phân tích định lượng là một trong những chỉ tiêu quan trọng,
vẫn còn hạn chê.
Đề tài “Nghiên cứu bào chê và đánh giá sinh khả dụng của viên nén nỗi chứa phức
A
x?
an
,
`
A
“fF
.
a
7
tA
,
A
°
,
,
curcumin” là một hướng nghiên cứu mới cho hoạt chất curcumin. Bước đâu nghiên
cứu của đề tài là cải thiện sinh khả dụng bằng cách bào chế hệ phân tán rắn
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
cureumin có độ hịa tan cao với một số tá được như PEG, PVP hayf
- cyclodextrin
và đồng thời nghiên cứu đạng bào chế mới viên nén nổi chứa curcumin. Nhằm phục
vụ cho việc định lượng hệ phân tán rắn curcumin trong mơi trường thử độ hịa tan
và xác định hàm lượng curcumin trong viên nén nỗi đã được bào chế, chúng tôi tiến
hành đề tài “Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng curcumin”.
Với mục tiêu:
- _ Xây dựng và thâm định qui trình định lượng hệ phân tán rắn curcumin trong mơi
trường thử độ hịa tan bằng phương pháp UV — Vis.
- - Xây dựng và thẩm định qui trinh dinh luong vién nén néi chita curcumin bang
phuong phap UV - Vis.
-
XAy dung va tham định qui trình định lượng viên nén nổi chứa curcumin bang
phương pháp HPLC.
Ý nghĩa khoa học:
Đề tài góp phần bố sung phương pháp định lượng hệ phan tan ran curcumin va
curcumin trong chế phẩm bào chế viên nén nổi, đồng thời góp phần định hướng cho
những nghiên cứu sau này về phân tích định lượng các chế phẩm chứa curcumin.
Ý nghĩa thực tiễn:
Góp
phần
rất quan
trọng trong
công
tác kiểm
nghiệm
những
chế phẩm
chứa
curcumin trên thị trường nhằm phục vụ cho công tác đảm báo chất lượng thuốc lưu
thông trên thị trường.
(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Chương Í
TĨNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TONG QUAN VE CURCUMIN [9], [13], [14], [17], [27]
Curcuminoids
(Curcuma
là một
longa,
nhóm
các
Zingiberaceae).
chất
tạo nên
Trong
màu
đó, chiếm
vàng
đặc
trưng
tỷ lệ khoảng
cho
2%
Nghệ
— 5%
la
curcumin, đóng vai trị là curcuminoids chính quan trọng trong Nghệ, cịn được gọi
là
curcumin
I.
Ngồi
ra
cịn
có
demethoxycurcumin
(curcumin
II),
bisdemethoxycurcumin (curcumin III), cyclocurcumin.
Curcumin duge phan lap dau tién vao năm 1815, thu được dạng kết tỉnh vào năm
1870 với tên
1,6-heptadien-3,5-dion-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-(1E,6E)
hay diferuloylmethan.
Khung
feruloylmethan được xác nhận sau đó vào 1910 và
được tổng hợp bởi Lampe (1910), Lampe và Milobedka (1913). Trong nhiều thập
kỷ qua, với nhiều nghiên cứu khác nhau, curcumin dần được khám phá với nhiều
tác dụng trị liệu đáng được quan tâm như kháng viêm, chống oxy hóa, kháng ung
thư, hạ cholesterol máu và ức chế kết tập tiểu cầu.
1.1.1. Cấu trúc & tính chất lý hóa của eureumin [7], [25], [26], [29], [30]
Curcumin chiếm tỷ lệ khoảng 75%. Tên gọi khác là màu vàng nghệ, curcumagelb
hay diferuloylmethan.
Danh
pháp
là 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-
1,6-dien-3,5-dion. Công thức phân tử của curcumin là Cạ¡HạgO¿. Khối lượng phân
tử là 368,37 g/mol. Nhiệt độ nóng chảy là 183°C và nhiệt độ sôi là 591,4°C ở 760
mmHg.
Curcumin co ba gia trị pKa lần lượt là 7.8; 8,5 và 9,0. Curcumin có màu
vàng ở pH 2,5 - 7 và đỏ ở pH > 7. Cấu trúc hóa học curcumin như hình 1.1.
OCH;
Hình 1.1. Cấu trúc hóa hoc curcumin
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
4
Curcumin tôn tại ở dạng bột kết tỉnh màu vàng cam, thực tế không tan trong nước
và ether nhung tan trong ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethyl formamid
với độ tan khoảng l mg/ml và aceton là 20 mg/ml. Hệ số phân bố và độ tan trong
nước của curcumin tương ứng là 3,2 ug/ml va 0,6 ug/ml.
Curcumin có thể tồn tại ở những dạng hỗ biến bis-ceto và enol. Dạng bis-ceto chiếm
ưu thế trong mơi trường acid hay trung tính. Ngược
lại, ở pH trên 8, dạng enol
chiếm ưu thế và curcumin hoạt động như chất cho điện tử. Dạng hỗ biến bis-ceto và
dạng enol của curcumin được trình bày ở hình 1.2.
oO
MeO
HO
Sy
ZA
IL
eS
(A)
ư
McO
HO
O
N
:
H
oN
z
L
OH
Oo
⁄
(B)
OMe
OH
Hình 1.2. Dạng hỗ biến bis-ceto (A) và dạng enol (B) của curcumin
Curcumin kém bền trong môi trường kiềm và bị phân hủy trong vịng 30 phút thành
trans-6-(40-hydroxy-30-methoxypheny])-2,4-dioxo-5-hexanal,
acid ferulic, vanillin
và feruloylmethan. Trong mơi trường acid, sự phân hủy của curcumin chậm hơn rất
nhiều, nhỏ hơn 20% tổng lượng curcumin bị phân hủy trong vịng
l giờ. Những
nghiên cứu cũng cho thấy rằng curcumin ơn định ở nhiệt độ cao nhưng rất nhạy cảm
với anh sang. Do do, curcumin can duoc bao vé tranh anh sang.
1.1.2. Cac curcuminoids khac
1.1.2.1. Demethoxycurcumin
Demethoxycurcumin chiém ty 1é khoang 16%. Danh phap 1a 1-(4-hydroxyphenyl)7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-I,6-dien-3,5-dion
hay
p-hydroxycinnamoyl
feruloylmethan. Công thức phân tử là C›H¡sO;. Khối lượng phân tử là 338 g/mol.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Nhiệt độ nóng chảy là 168§°C và nhiệt độ sơi là 571,4°C ở 760 mmHg. Cấu trúc hóa
học của demethoxycurcumin được trình bay ở hình 1.3.
OCH3
Hình 1.3. C4u tric héa hoc demethoxycurcumin
1.1.2.2. Bisdemethoxycurcumin
Bisdemethoxycurcumin
chiém
ty
1é
hydroxyphenyl)-hepta-1,6-dien-3,5-dion
khodng
hay
8%.
Danh
p,p-dihydroxy
phdp
1a
dicinnamoyl
1,7-bis-(4methan.
Cơng thức phân tử là C¡sH¡sa. Khối lượng phân tử là 308 g/mol. Nhiệt độ nóng
chay tir 221 — 223°C va nhiệt độ sôi là 5Š1,3°C ở 760 mmHg. Cấu trúc hóa học của
bisdemethoxycurcumin được trình bày ở hình 1.4.
OH
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học bisdemethoxycurcumin
1.1.2.3. Cyclocureumin
Cyclocurcumin chiếm tỷ lệ rất nhỏ so với các curcuminoids khác. Cấu trúc hóa học
của cyclocurcumin được trình bày ở hình I.5.
HO
Hình I.5. Cầu trúc hóa học cyclocurcumin
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
1.1.3. Tác dụng dược lý [7], |9]. [29], [35]
1.1.3.1. Chống oxy hóa
Curcumin bảo vệ các màng sinh học thơng qua ức chế q trình peroxy hóa, làm
sạch các gốc tự do. Các hoạt động chống oxy hóa của curcumin cũng được thực
hiện thơng qua các enzym
chống oxy hóa như superoxid dismutase, catalase và
lutathion peroxidase. Trong thực tế, curcumin đã được minh chứng là hoạt tính
chống oxy hóa gấp ít nhất 10 lần so với vitamin E.
1.1.3.2. Kháng viêm
Curcumin đã được minh chứng về khả năng kháng viêm rất tốt. Hoạt tính kháng
viêm tự nhiên của curcumin
được xem
là ngang tầm với các thuốc kháng viêm
steroid và non-steroid nhu indomethacin va phenylbutazon. Kha nang khang viém
cla curcumin được thực hiện thông qua sự ức chế enzym cyclooxygenase-2 và sự
sản xuất các cytokine như interferon và yếu tố hoại tử mô.
1.1.3.3. Chống ung thư
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng curcumin là một tác nhân chống ung thư mạnh.
Curcumin có khả năng chống khối u ở da, tuyến vú, khoang miệng, thực quản, dạ
dày, ruột, phổi, và gan. Một số cơ chế được đề nghị để giải thích khả năng kháng
ung thư của curcumin bao gồm: gây độc tế bào và cảm ứng sự chết theo chương
trình (apoptos1s), tác động trên enzym chuyển hóa sinh học chất gây ung thư, ức chế
q trình tổn thương nhiễm sắc thể, ức chế sự oxy hóa các base purin.
1.1.3.4. Một số tác dụng dược lý khác
Ngoài những tác dụng được lý nêu trên, curcumin cịn có hoạt tính trên tim mạch,
chống xơ vữa thành mạch, ức chế tăng sinh cơ trơn mạch máu, giảm cholesterol
máu, chống kết tập tiểu cầu và hỗ trợ điều tri bénh Alzheimer.
1.1.4. Định lượng curcumin
1.1.4.1. Phương pháp UV - Vis
Năm
2010,
Kilambi
Pundarikakshudu
và
Hiral
N.
Dave
định
lượng
hỗn
hợp
curcumin và berberin trong methanol với hệ thống quang phổ Shimadzu 1800. [18]
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Năm
2011, Shishu Goindi, Kamalpreet Mann
curcumin trong methanol va đệm pH
và Nidhi Aggarwal
đã định lượng
1,2 cho kết quả phương trình hồi quy là y =
0,145x với khoảng tuyến tính I — 10 hg/ml tại 421 nm (methanol) va y = 0,0054x
tai 430 nm (đệm pH I,2), qui trình đạt độ đúng và chính xác. [33]
Năm 2012, Kiran Sharma, S. S. Agrawal va Monica Gupta st’ dung may quang phô
Doublebeam Shimadzu
1601 định lượng curcumin (10 ug/m]) trong methanol, thu
kết quả với À„a„ = 421 nm và khoảng tuyến tính I — 7 ug/ml. [20]
Năm 2012, D. Ridhima, P. Shweta và KJ. Upendra sử dụng HC] 0,I N trong định
lượng dịch thử độ hòa tan bằng phương pháp UV — Vis tại 430 nm. [10]
Năm 2012, Sav Ajay, Desai Harita, Meer Tarique, Purnima Amin đã bào chế HPTR.
curcumin với kollidon VAó64 và thử độ hịa tan trong mơi trường đệm pH 1,2, sau
đó định lượng bằng phương pháp UV — Vis tai 427 nm. [31]
1.1.4.2. Phuong phap HPLC
Năm 2010, Nguyễn Đức Hạnh đã chiết xuất và định lượng curcumin bằng hệ thống
HPLC với cột Sulfire RP-C18
(250 x 4 mm, 5 um) va MP 1a
ACN : acid acetic
0,05% (với chương trình rủa giải gradient). Kết quả thu được phương trình hồi quy
tuyến tính: y = 101098x — 451071 (œ = 0,05). [5]
Năm 2010, Đinh Nữ Hạnh Thục và Nguyễn Ngọc Khôi sử dụng hệ thống HPLC
Waters, cột Sulfire RP-CI8§ (250 x 4 mm;
5 um) và MP
là dung môi À: ACN
và
dung môi B: acid acetic 0,5% (với chương trình rửa giải gradient). [6]
Năm 2011, Trịnh Hồng Dương và Hà Diệu Ly đã xây dựng được qui trình định
luong curcumin bằng phương pháp HPLC voi cét RP — 18 (250 mm x 4,6 mm, 5
um) va MP la ACN : acid acetic 0,03 % (50 : 50). [3]
Nam
1983,
Hanna
Hjorth
Tonnesen
va Jan
Karlsen
nghién
ciru nhém
gồm
3
curcuminoids: curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin với pha tĩnh
là Nucleosil NH2 (Chrompack), kích thuéc hat Sum va MP 1a ethanol. [15]
Nam
2009,
Ji Li, Yunyun
Jiang,
Jun
Wen,
Guorong
Zhang str dung c6t Diamonsil C18 (4,6 x 100 mm,
Fan,
Yutian
5 um) va MP
Wu
va Chuan
Ia ACN :
acetic 5% (75 : 25) và chuẩn bị mẫu ở nồng độ 0,5 mg/ml trong ACN. [22]
acid
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Năm
2009,
Krishna Veni Nagappan,
Meyyanathan
S N, Rajinikanth B Raja va
Elango Kannan định lượng đồng thời curcumin và piperin với cột Princeton C18
(250 x 4,6 mm, 5 um) và MP là ACN
: potassium dihydrogen orthophosphate 50
mM (60 : 40). [34]
Năm 2011, Kumudhavalli MV, Saravanan, Thamizh, Jayakar B và Tamil Nadu sử
dụng hệ thống HPLC
Shimadzu 2010AHT với cột Lichrocart Lichrosphere (250 x
4,0 mm, 5 um) va MP là đệm và ACN
với chương trình rửa giải gradient cho kết
quả khoảng tuyến tính là 50 — 150 pg/ml. [21]
Nam
2011, Ying-Rui Han, Jin-Jin Zhu, Yu-Rong
Wang, Xing-Sheng Wang va
Yong-Hong Liao định lượng curcumin với cột Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm, 5
um) va MP là ACN, tetrahydrofuran va nudc (véi chương trình rửa giải gradient) và |
curcumin được chuẩn bị ở nồng độ 100 pg/ml trong ACN. [36]
1.2. TONG
QUAN
PHUONG
PHAP QUANG
PHO
UV - VIS
[Error!
Reference source not found.|, [18]
1.2.1. Định luật hấp thu bức xạ Lambert — Beer
A=D=
In(-2) =e.LC
A = D: dé hap thu
lạ: cường độ ánh sáng đơn sắc tới
I: cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch
e: hệ số hấp thu mol (còn gọi là hệ số tắt mol)
|: chiều dày của lớp chất hấp thu (cm)
C: nồng độ của chất hấp thu (mol/l)
1.2.2. Ung dung trong định lượng
- 1.2.2.1. Định lượng trực tiếp
(1.1)
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Phương pháp đo tuyệt đối (trường hợp này khơng có chuẩn): sử dụng
#}“lem (hệ số
hấp thu % = hệ số tắt riêng = độ tắt riêng là độ hấp thu của chất đó ở nồng độ 1% và
chiều đày của lớp chất hấp thu l = Iem).
Khi đó ta có:
Ce =—
0
,
A
Even
(1.2)
Phương pháp sử dụng hệ số hấp thu mới e: Ap dụng định luật Lambert-Beer:
A=elc=c,=4
(13)
„....
(Với A„ được đo từ máy, e từ tham khảo tài liệu hoặc đo trên mẫu chuẩn)
Phương pháp so sánh độ hấp thu: trường hợp này có chất chuẩn đối chiếu. Khi đó,
so sánh độ hấp thu của dung dịch thử nghiệm (nồng độ C¿) và dung dịch chuẩn
(nồng độ Cạ). Với C„ và Cạ không được chênh lệch quá.
44
C,
Co
0-4,
(1.4)
Ay
Phương pháp sử dụng đường hồi quy chuẩn: Xây dựng đường hồi quy chuẩn. Pha
các dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C¡, Cạ, C... Từ đó xác dinh Aj, Az, A3,...
Xây dựng đường đường hồi quy: y = ax + b với trục tung là A và trục hoành là C.
1.2.2.2. Định lượng gián tiếp
Chuẩn độ đo quang: dùng quang phô kế để phát hiện điểm kết thúc trong phương
pháp chuẩn độ.
Tạo dẫn chất: tạo dẫn chất có khả năng hấp thu mạnh và đo trong vùng UV — Vis.
1.3. TONG
QUAN
PHUONG
PHAP
HPLC
[Error! Reference source not
found.], [4], [22]
1.3.1. Hệ thống máy HPLC
Một hệ thống máy HPLC đầy đủ gồm 8 bộ phận, bao gồm: bình dung mơi pha động
(solvent reservoir), bộ phận khử khí (degasser) hệ thống bơm
cao áp (pump), bộ
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
10
phận tiêm mẫu (sample), lọc tiền cột (pre-column), cột sắc ký (HPLC
column), bộ
phận phát hiện (detector), bộ phận xử ký và ghi tín hiệu (data system).
1.3.2. Các thơng số kỹ thuật trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.2.1. Thời gian lưu tp (Retention time)
Thời gian lưu của một chất tan là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện
đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ.
Thời gian lưu là thơng tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan.
Thời gian lưu lý tưởng tạ (hoặc tụ): là thời gian lưu của một chất tan không bị giữ
lại bởi pha tĩnh. Trên thực tế, thời gian lưu lý tưởng là thời gian cần thiết để pha
động ổi ra khỏi hệ thống tính từ lúc tiêm mẫu.
Thời gian lưu hiéu chinh t’p: t’p= tr — ty
(1.5)
1.3.2.2. Hệ số phân bố K (Partition coeffieient)
Hệ số phân bố là tỉ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
ale
Cu
(1.6)
Cs: nồng độ chất tan trong pha tĩnh
Cụ: nồng độ chất tan trong pha động
1.3.2.3. Hệ số đung lượng k’ (Capacity factor)
Hệ số dung lượng là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để diễn tả tốc độ
di chuyển của một chất. Trị số téi uu: 1 < k’ <8.
palate
fu
tạ: thời gian lưu
(1.7)
tụ: thời gian lưu lý tưởng
1.3.2.4. Hiệu lực cột N (Column efficiency)
Hiệu lực cột là thông số về hiệu suất tách của cột, được biểu thị bởi 2 thông số:
SỐ đĩa lý thuyết N:
t
t
N= l6( 23 = 554)
1/2
(1.8)
