tóm tắt la tiếng việt: Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

ĐẶNG TRƯỜNG GIANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG,
ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA
PHYTOSOME SILYBIN
Ngành đào tạo: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
Mã số: 972 02 02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI-2023


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QN Y
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Nguyễn Hữu Mỹ
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Long

Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến

Phản biện 2: PGS.TS. Đoàn Cao Sơn

Phản biện 3: PGS.TS. Trịnh Nam Trung

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường

vào hồi:

giờ

ngày

tháng

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc Gia
2. Thư viện Học viện Quân y

năm


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây kế sữa (Silybum marianum (L.) Gaertn), thuộc họ Cúc
(Asteraceae) với thành phần hóa học chính là các flavonoid đã được
chứng minh có một số hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxi
hóa mạnh, ức chế sự hủy hoại tế bào gan do các tác nhân như rượu,
thuốc,... đồng thời kích thích tái tạo tế bào gan; cải thiện đáng kể
chức năng gan mật và ít tác dụng khơng mong muốn. Trong số các
hoạt chất thuộc nhóm flavonoid trong cây Kế sữa thì silybin là một
chất chiếm tỉ lệ lớn (từ 50-70%) và là hoạt chất chính tạo nên tác
dụng sinh học của nhóm này. Tuy nhiên, silybin có độ tan và tính
thấm kém nên sinh khả dụng theo đường uống thấp. Do đó, một số
nghiên cứu đã được thực hiện nhằm cải thiện độ tan, tính thấm và
sinh khả dụng của silybin như: tạo phức với β-cyclodextrin, tạo dẫn
xuất glycosid, bào chế liposome và phytosome.

Trong số các biện pháp trên, bào chế hoạt chất dưới dạng
phytosome được xem là hướng nghiên cứu mới, có hiệu quả trong
việc nâng cao sinh khả dụng đường uống của silybin. Trong
phytosome các hoạt chất (cao chiết hoặc chất tinh khiết) thường là
các flavonoid, polyphenol tự nhiên sẽ liên kết với phospholipid thông
thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành tiểu phân có cấu trúc
tương tự màng tế bào, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất trong
dịch ruột, vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép.
Mặt khác, phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào
M ở ruột non vào tuần hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm
chuyển hóa bước 1 qua gan và tăng sinh khả dụng của silybin.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cũng như các chế phẩm
phytosome của nhiều hoạt chất như phytosome quercetin, phytosome
curcumin, phytosome trà xanh, phytosome ginkgo biloba ...; trong đó
đã có một số nghiên cứu về phytosome silybin. Tuy nhiên, ở Việt
Nam đến nay chưa có nghiên cứu về bào chế phytosome silybin. Bên
cạnh đó, nguồn nguyên liệu phytosome nói chung và phytosome
silybin nói riêng chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngồi với giá thành
cao cũng sẽ ảnh hưởng phần nào đến việc ứng dụng rộng rãi dạng
phytosome vào các sản phẩm chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Do đó,


2
việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome silybin là cần thiết. Vì
vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc
tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin” được
thực hiện với hai mục tiêu sau:
1. Bào chế được phytosome silybin qui mô phịng thí nghiệm.
2. Đánh giá được sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn
và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin trên thực

nghiệm.
* Những đóng góp mới của luận án:
- Đã xây dựng được công thức và quy trình bào chế
phytosome silybin quy mơ 150g/mẻ bằng phương pháp bốc hơi dung
môi qua 3 giai đoạn (tạo phức hợp, hydrat hóa và phun sấy tạo bột
khơ). Sản phẩm thu được có hàm lượng silybin dạng phytosome đạt
khoảng 12%, hàm lượng silybin toàn phần đạt khoảng 13%.
Phytosome silybin bào chế đã cải thiện đáng kể về độ tan, độ hòa tan
của silybin so với silybin nguyên liệu. Bột phytosome có các đặc tính
(độ ẩm, CI và KLRbk) thích hợp có thể ứng dụng vào các dạng như
viên nang cứng, viên nén, cốm, bột. Đã đề xuất được tiêu chuẩn chất
lượng cho bột phytosome silybin và theo dõi ổn định ở điều kiện
phịng thí nghiệm và lão hóa cấp tốc trong thời gian là 06 tháng.
- Đã xây dựng được mơ hình đánh giá sinh khả dụng
phytosome silybin trên chó ta thực nghiệm. Mơ hình có tính khả thi
và có thể áp dụng cho các nghiên cứu tương tự. Phương pháp phân
tích đủ độ nhạy, đặc hiệu để xác định nồng độ các chất dạng
phytosome trong dịch sinh học với nồng độ thấp (cỡ ng/mL).
- Đã chứng minh được silybin ở dạng phytosome cải thiện về
sinh khả dụng và tác dụng bảo vệ tế gan trên động vật thực nghiệm.
Những kết quả của đề tài này sẽ làm cơ sở cho các nghiên
cứu bào chế dạng phytosome cho các hoạt chất khác (thuộc nhóm
flavonoid) có độ tan kém, tính thấm kém và sinh khả dụng thấp. Từ
đó góp phần vào sự phát triển dạng phytosome ứng dụng trong bào
chế các sản phẩm thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe ở tại Việt Nam.
* Nội dung và cấu trúc của luận án:
Luận án bao gồm 150 trang. Đặt vấn đề: 2 trang; chương 1


3

(tổng quan): 27 trang; chương 2 (nguyên vật liệu và phương pháp
nghiên cứu): 27 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu): 62 trang;
chương 4 (bàn luận): 29 trang; kết luận và kiến nghị: 3 trang
* Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 184 tài liệu, trong đó có
167 tài liệu tiếng Anh.
Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề:
- Về silybin: Nguồn gốc; cơng thức hóa học; tính chất lý hóa;
dược động học; tác dụng dược lý; công dụng, liều dùng, tác dụng
không mong muốn; một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường
uống của silybin theo các tài liệu đã được công bố.
- Về phytosome: Khái niệm; thành phần; ưu, nhược điểm;
phương pháp bào chế; các chỉ tiêu đánh giá; một số nghiên cứu về
bào chế phytosome silybin theo các tài liệu đã được công bố.
- Về nội dung đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tác dụng bảo
vệ tế bào gan của phytosome: tổng quan được các nội dung theo các
tài liệu đã được công bố.
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU và THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
Nguyên liệu bào chế đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất gồm: Silybin
95%, PC90%, Ethanoltđ, THF, maltodextrin, aerosil. Các chất chuẩn,
hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị gồm: Máy khuấy từ gia nhiệt IKA CMAG HS4HS10 (Malaysia), Máy siêu âm đồng nhất hóa 01D882 (Hàn Quốc),
Thiết bị cất quay chân không EYELA - N1200B (Nhật Bản), Thiết bị
phun sấy LPG5 (Trung Quốc), hệ thống HPLC, máy đo kích thước
tiểu phân, máy đo phổ DSC, NMR, IR, XRD, máy phân tích huyết
học, máy xét nghiệm sinh hóa …

2.1.3. Động vật thí nghiệm
Chuột cống trắng chủng Wistar, giống cái (khơng mang thai,
không đang nuôi con/cho con bú), 8-12 tuần, cân nặng 190±20g và


4
chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, cân nặng 1822g. Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai giống, khỏe mạnh, cân
nặng 180±20g. Chuột cống trắng, cả 2 giống, từ 3 tháng tuổi, cân
nặng 120±20g. Chó ta, giống đực khỏe mạnh, cân nặng 10-12kg.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế phytosome silybin
2.2.1.1. Nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid
a. Thẩm định phương pháp định lượng silybin A và silybin B
trong nguyên liệu và phức hợp Si-PC bằng HPLC
* Chuẩn bị: Mẫu chuẩn: dãy chuẩn Si-A có nồng độ từ 2,35
đến 94,12 µg/mL và dãy chuẩn Si-B có nồng độ từ 2,45 đến 97,96
µg/mL (trong MeOH). Mẫu trắng nguyên liệu: MeOH. Mẫu trắng
phức hợp: PC được thực hiện như quy trình bào chế mẫu thử phức
hợp Si-PC. Mẫu thử nguyên liệu: nguyên liệu silybin trong MeOH.
Mẫu thử phức hợp Si-PC: Hòa tan silybin và PC theo tỉ lệ trong hỗn
hợp dung môi THF và EtOHtđ. Hỗn hợp được duy trì ở nhiệt độ 50°C
và trong khoảng 4 giờ. Sau phản ứng, hỗn hợp được bốc hơi dưới áp
suất giảm để tạo màng film. Thêm cloroform vào hòa tan, ly tâm lấy
dịch, lọc qua màng 0,22 µm. Dung dịch này được pha lỗng tới nồng
độ cần thiết bằng MeOH, trước khi phân tích HPLC.
* Điều kiện sắc ký: cột C18 (250x4,6 mm, 5µm); detector
UV, ở 288 nm, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 40°C. Pha
động: MeOH: H3PO4: nước (20:0,5:80) (A) và MeOH: H 3PO4: nước
(80:0,5:20) (B) theo chương trình gradient (0-5 phút: 15 % B, 5-20
phút: 15-45 % B, 20-30 phút: 45 % B, 30-31 phút: 45-15 % B, 31-40

phút: 15% B).
* Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống; tính
chọn lọc, độ đặc hiệu; khoảng tuyến tính; độ lặp lại, độ đúng, giới
hạn phát hiện, giới hạn định lượng, theo yêu cầu chung của ICH.
b. Thẩm định phương pháp định lượng phosphatidyl cholin
trong nguyên liệu bằng HPLC
* Chuẩn bị: Mẫu chuẩn: chuẩn bị dãy chuẩn PC trong MeOH
từ 9,90 - 198,00 µg/mL. Mẫu trắng: MeOH. Mẫu thử: nguyên liệu
PC trong MeOH được pha loãng tới nồng độ cần thiết, lọc qua màng


5
lọc 0,22µm, trước khi phân tích HPLC.
* Điều kiện sắc ký: cột C18 (250x4,6mm, 5µm); detector UV,
ở 205 nm, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 40°C. Hệ dung mơi
ACN:MeOH:nước (30:65:5) chạy theo chương trình đẳng dịng.
* Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống, tính
chọn lọc, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới
hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo yêu cầu chung của ICH.
c. Xác định hàm lượng silybin trong ngun liệu
Hịa tan chính xác khoảng 0,1 g ngun liệu silybin trong
MeOH trong bình định mức 100 mL, pha lỗng bằng MeOH đến
nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi định lượng
bằng HPLC.
d. Xác định độ tan của silybin trong một số dung môi
Cân một lượng dư ngun liệu silybin vào bình nón nút mài,
thêm khoảng 10 mL dung môi khảo sát, lắc ở 250C, với tốc độ 200
vịng/phút trong 48 giờ. Sau đó đem ly tâm 4.000 vòng/phút trong 15
phút, lớp dịch trên đem lọc qua màng lọc 0,2 µm, pha lỗng bằng
MeOH (nếu cần), trước khi định lượng bằng HPLC. Các dung môi

khảo sát gồm: EtOHtđ, EtOH 96%, hỗn hợp EtOH tđ:THF với các tỷ lệ
khác nhau, nước cất, chloroform, n-octanol, THF.
e. Độ ổn định về hàm lượng của silybin và phosphatidyl cholin
ở khoảng nhiệt độ khác nhau
Cân chính xác khoảng 0,1g silybin; khoảng 0,15g
phosphatidyl cholin vào bình cầu, thêm 20ml hỗn hợp dung mơi
EtOHtđ:THF (97:3) vào hịa tan, gia nhiệt ở các nhiệt độ khảo sát
(nhiệt độ phòng, 40, 50, 60 và 700C) trong 24 giờ. Sau đó chuyển vào
bình định mức 100 mL, vừa đủ bằng MeOH. Lọc qua màng lọc 0,45
µm, pha loãng bằng MeOH, trước khi định lượng bằng HPLC. So
sánh hàm lượng hoạt chất trước và sau thời gian khảo sát. Phần dịch
MeOH cịn lại đem cơ dưới áp suất giảm ở 40 0C đến cắn. Cắn thu
được đem đo phổ FTIR. So sánh phổ FTIR của các mẫu ở các nhiệt
độ với mẫu ban đầu.
2.2.1.2. Nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ phịng thí
nghiệm


6
Tiến hành bào chế phytosome silybin theo 3 giai đoạn (tạo
phức hợp, hydrat hóa và phun sấy tạo bột khơ):
a. Giai đoạn tạo phức hợp Si-PC
* Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố về công thức bào chế: Loại
phospholipid: PC 90% và PC50%. Loại dung môi phản ứng: EtOH
và hỗn hợp EtOHtđ:THF. Lượng dung môi phản ứng (CR/DM):
0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%. Tỉ lệ mol Si:PC: 1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3, 1:4.
* Khảo sát ảnh hưởng các thông số kỹ thuật của quy trình
bào chế: Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phịng; 40°C; 50°C; 60°C;
70°C. Thời gian phản ứng: 2; 3; 4; 5; 6 giờ. Tốc độ khuấy trộn: 50;
100; 150 vòng/phút.

* Chỉ tiêu đánh giá: EE%, độ tan của silybin trong nước và độ
hòa tan của phức hợp so với nguyên liệu silybin ban đầu.
b. Giai đoạn hydrat hóa phức hợp
* Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hydrat hóa:
Loại dung mơi hydrat hóa: nước; đệm phosphat 6,8 và 7,4. Lượng
dung mơi hydrat hóa: tỉ lệ DM/CR (tt/kl) là 6:1; 8:1; 10:1; 12:1
* Khảo sát các yếu tố đến quá trình làm giảm và đồng nhất
KTTP: Mức năng lượng siêu âm: 600W, 720W, 840W và 1.080W.
Thời gian siêu âm: 3, 5, 10, 15 phút.
* Chỉ tiêu đánh giá: KTTP, PDI, thế Zeta, EE%, độ tan
silybin trong nước và độ hịa tan phytosome silybin trước và sau khi
hydrat hóa.
c. Giai đoạn phun sấy tạo bột phytosome silybin
* Khảo sát ảnh hưởng của loại tá dược hỗ trợ phun sấy: Các
tá dược là Maltodextrin (MD) và Aerosil (AE) ở các tỷ lệ: MD/AE
(100:0); MD/AE (0:100); MD/AE (80:20); MD/AE (60:40); MD/AE
(40:60) và mẫu không sử dụng tá dược.
* Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược hỗ trợ phun sấy:
Tiến hành phun sấy với các tỷ lệ tá dược so với lượng chất rắn trong
hỗn dịch là (TD/CR) = 1:1; 0,5:1; 0,4:1; 0,2:1.
* Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khí đầu vào và tốc độ
phun dịch: Khảo sát ở các nhiệt độ là 120, 140 và 160°C và tốc độ
phun dịch là 5, 10 và 15ml/phút.


7
* Chỉ tiêu đánh giá: độ ẩm, KLR, CI, Hps, Hth, hàm lượng Sitp,
hàm lượng Siphy, độ tan silybin trong nước, độ hòa tan của phytosome
silybin trước và sau khi phun sấy.
2.2.1.3. Phương pháp đánh giá đặc tính và một số chỉ tiêu chất

lượng phytosome silybin
a. Xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa: Tỷ lệ hoạt chất
phytosome hóa được tính theo cơng thức: EE% = HL silybin dạng
phytosome/HL silybin tồn phần. Trong đó: Hàm lượng silybin dạng
phytosome: Hịa tan một lượng phytosome tương ứng với khoảng
0,1g silybin trong chloroform, lắc trên máy lắc trong 10 phút. Lọc
dịch qua màng lọc 0,22 µm. Sau đó, hút chính xác 5,0 ml dịch lọc và
tiến hành pha loãng bằng MeOH đến nồng độ cần thiết. Lọc qua
màng lọc 0,45 µm, trước khi định lượng bằng HPLC. Hàm lượng
silybin tồn phần: Hịa tan lượng phytosome tương ứng với 0,1g
silybin trong MeOH, pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau đó lọc
qua màng 0,45 µm và tiến hành sắc ký với các điều kiện tương tự.
b. Hình thái cấu trúc tiểu phân: Chụp TEM: Bột phytosome
silybin phun sấy được phân tán trong nước cất với tỷ lệ nước/CR =
10:1, khuấy đều trong 5 phút. Sau đó ly tâm ở tốc độ 10.000
vịng/phút để thu lấy phần tủa. Phần tủa được rửa tiếp 3 lần bằng
nước cất, sau đó được hydrat hóa trở lại với nước cất (tỷ lệ nước/CR
= 20:1), khuấy đều trong 5 phút. Sau đó lọc qua giấy lọc có kích
thước lỗ lọc 3µm, thu lấy phần hỗn dịch, pha lỗng mẫu để chụp
TEM. Chụp SEM: Cân khoảng 0,05-0,1g mẫu (bột phytosome phun
sấy, MD, AE, Silybin nguyên liệu) gắn lên giá đo bằng băng dính
dẫn điện C, mẫu khơng dẫn điện sẽ cho vào máy phủ chất dẫn Pt
khoảng 30-50S. Sau đó cho mẫu vào buồng mẫu và đo.
c. KTTP, PDI: Tiến hành đo trên máy Horiba SZ-100, sử dụng
cuvet disposable cuvett cell. Ánh sáng tán xạ được đo ở góc 90°.
d. Thế Zeta: Tiến hành tương tự 2.2.1.3.c với cuvet zeta
electrode cell với chỉ số đếm nằm trong khoảng 300 - 400 kcps.
e. Mất khối lượng do làm khô: Thử theo Phụ lục 9.6, DĐVN V
(1 g, ở 1050C trong 4 giờ).
f. Độ tan của hoạt chất: Độ tan của silybin dạng phytosome

8
trong dung môi được tiến hành theo mô tả trong mục 2.2.1.1.d.
g. Hệ số phân bố dầu-nước: log D được tính theo cơng thức:
LogD = Log(([Silybin]/n-octanol)/([Silybin]/pha nước)). Trong đó:
[Silybin]/n-octanol: Nồng độ silybin dạng phân tử trong pha noctanol. [Silybin]/pha nước: Nồng độ silybin (dạng ion hóa và dạng
phân tử) trong pha nước ở các pH khác nhau.
h. Độ hòa tan của hoạt chất: Phương pháp cánh khuấy với
một lượng các mẫu (tương đương với 100mg silybin) trong cốc chứa
môi trường thử (Môi trường pH 1,2 + 0,5% Tween 80 và môi trường
pH 6,8 + 0,5% Tween 80). Sau các khoảng thời gian 10, 30, 60, 120,
180, 240 phút, lấy 10ml dung dịch thử, ly tâm 5 phút với tốc độ
10.000 vịng/phút. Phần dịch trong được lọc qua màng lọc 0,2µm và
để định lượng bằng HPLC.
i. Đánh giá tương tác phân tử giữa hoạt chất và phospholipid
- Phân tích phổ hồng ngoại FTIR: Lấy khoảng 5-10 mg mẫu
đã làm khô, trộn đều và nghiền mịn với kali bromid, khi được hỗn
hợp đồng nhất đem dập thành viên mỏng. Tiến hành quét phổ trong
vùng từ 400 - 4000 cm-1 với các mẫu: silybin, PC, phức hợp Si-PC và
hỗn hợp vật lý Silybin - PC.
- Phân tích nhiệt vi sai (DSC): Cân khoảng 2-6 mg đã làm
khơ, đặt trong đĩa nhơm có thể tích 40 µL, hàn nắp đĩa nhơm, đưa
vào buồng máy. Tiến hành quét nhiệt từ nhiệt độ phòng đến 725°C,
tốc độ gia nhiệt 5°C/phút, tốc độ thổi khí nitrogen 40 µl/phút với các
mẫu: silybin, PC, phức hợp Si-PC và hỗn hợp vật lý Silybin - PC.
- Phân tích phổ nhiễu xạ tia X (XRD): Tiến hành đo phổ
nhiễu xạ tia X của các mẫu silybin, PC, phức hợp Si-PC và hỗn hợp
vật lý Silybin - PC bằng nhiễu xạ kế tia X với bước sóng tia X lấy từ
bức xạ Kα của đồng kim loại là λCu = 1,5406Ǻ, cường độ dịng điện

40 mA, điện áp 40 kV, góc qt từ 5°-60° với tốc độ quay góc θ =
1°/phút, nhiệt độ 25°C.
- Phân tích phổ cộng hưởng từ 1H-NMR và 13C-NMR: Hòa
tan mẫu (silbyin, PC và phức hợp Si-PC) vào dung môi DMSO (sử
dụng dung môi deuterium); tiến hành đo phổ 1H-NMR (500 MHz) và
13
C-NMR (125 MHz).


9
j. Hiệu suất phun sấy (Hps): dựa trên khối lượng bột thu
được và khối lượng chất rắn trong dịch phun sấy.
k. Hiệu suất thu hồi hoạt chất (Hth): dựa trên hàm lượng
silybin trong bột phun sấy và hàm lượng silybin trong dịch phun.
l. Chỉ số nén của bột (CI) và khối lượng riêng biểu kiến
(KLRbk): Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 6.13.
m. Định tính: Định tính silybin A và B trong hoạt chất bằng
phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, phụ lục 5.3).
n. Định lượng: Định lượng hàm lượng silybin trong mẫu
bằng phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, phụ lục 5.3).
2.2.1.4. Nghiên cứu độ ổn định của phytosome silybin
Đối tượng thử: Ba (03) mẻ bào chế bột phytosome silybin
được đựng trong túi zip (màng PE ghép nhôm). Điều kiện bảo quản:
Điều kiện phịng thí nghiệm (T°C: 15-35°C, RH%: 60-90%). Điều
kiện lão hóa cấp tốc: T°C: 40±2°C, RH%: 75±5%). Thời gian
nghiên cứu: 06 tháng. Các chỉ tiêu khảo sát: Sau thời gian 3 tháng và
6 tháng, lấy mẫu đánh giá các chỉ tiêu gồm: Hàm lượng silybin toàn
phần và dạng phytosome; KTTP, PDI, thế Zeta, mất khối lượng do
làm khơ. Đối với chỉ tiêu độ hịa tan silybin trong dung dịch pH 6,8
và hình thái cấu trúc tiểu phân thực hiện ở tháng thứ 6.

2.2.2. Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng, độc tính cấp, bán
trường diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin
2.2.2.1. Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của phytosome silybin
a. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng silybin A và silybin
B trong huyết tương chó bằng HPLC
* Chuẩn bị mẫu: Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc silybin
trong MeOH (nồng độ 1mg/mL). Dung dịch nội chuẩn catechin: pha
chuẩn catechin trong MeOH để đạt nồng độ khoảng 200,0 µg/mL.
Chuẩn bị dãy chuẩn silybin trong MeOH: chuẩn bị dãy chuẩn nồng
độ là 10, 20, 50, 100, 150, 200, 400 µg/mL từ dung dịch chuẩn gốc
silybin.
* Tiến hành: Hút chính xác 50,0 µL (MeOH hoặc chuẩn
silybin ở các nồng độ trên) + 500 µL huyết tương, lắc đều trong 90
giây, rồi thêm 50,0 µL acid perchlorid 20%, lắc đều; thêm 350,0 µL


10
MeOH + 50,0 µL chuẩn catechin, lắc đều, ly tâm ở tốc độ 12000
vòng/phút trong 40 phút. Hút dịch trong (thu được dãy chuẩn silybin
trong huyết tương có nồng độ tương ứng là 0,2; 0,5; 1,0; 2,5; 5; 7,5;
10; 20 µg/mL) đem định lượng HPLC.
* Điều kiện sắc ký: Cột C18 (250x4,6 mm, 5µm); nhiệt độ
cột: 40ºC; Detector UV, ở 288 nm; pha động gồm
MeOH:H3PO4:nước = 20:0,5:80 (A) và MeOH:H3PO4:nước =
80:0,5:20 (B). Tốc độ dịng: 1,0 mL/phút; thể tích tiêm mẫu: 100,0
µL; chương trình gradient: từ 0-5 phút: 85% (A), từ 5-20 phút: 55%
(A), từ 20-30 phút: 55% (A), từ 30-31 phút: 85% (A), từ 31-40 phút
85% (A).
* Tiến hành thẩm định: tính tương thích hệ thống, đường
chuẩn khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện,

giới hạn định lượng, độ ổn định theo tiêu chuẩn của FDA.
b. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin trên chó
* Chuẩn bị mẫu: Phân tán đều một lượng silybin và bột
phytosome silybin trong 50ml nước để đảm bảo mức liều dùng trên
chó là 9,0mg/kg cân nặng.
* Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chó trưởng thành, khỏe
mạnh, cân nặng 10-12 kg, được cho thích nghi với điều kiện phịng
thí nghiệm ít nhất một tuần và cho nhịn đói 12 giờ, chỉ uống nước
trước khi thí nghiệm.
* Thiết kế thí nghiệm: 6 cá thể chó đực được chia ngẫu
nhiên thành 2 nhóm, mỗi nhóm 3 con. Thiết kế 2 giai đoạn thử chéo
đôi, mỗi giai đoạn cách nhau 7 ngày.
* Thời điểm lấy mẫu: Trước khi cho chó dùng thuốc lấy
mẫu máu chó. Sau đó lấy máu lần lượt từ 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h,
8h, 10h, 12h, 14h, 16h, 24h sau khi cho chó dùng thuốc.
* Xác định thông số dược động học: Dựa trên hàm lượng
silybin đã được định lượng bằng HPLC, xác định các thông số gồm:
Cmax, Tmax, AUC0-t và AUC0-∞, t1/2, MRT của thuốc theo phương pháp
dựa trên mơ hình khơng ngăn sử dụng phần mềm Kinetica 4.4.
2.2.2.2. Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường
diễn của phytosome silybin trên thực nghiệm


11
- Xác định độc tính cấp của phytosome silybin theo đường
uống trên chuột cống trắng: Chuột được uống phytosome silybin với
liều 5.000 mg/kg, uống một lần duy nhất trong 24 giờ. Đánh giá độc
tính cấp, xác định LD50 gần đúng và đánh giá cấp độ độc, mức độ
độc của phytosome silybin trên chuột cống trắng đường uống theo
hướng dẫn của OECD 423.

- Xác định độc tính cấp của phytosome silybin theo đường
uống trên chuột nhắt trắng: Cho chuột uống phytosome silybin (Cân
11,14 gam phytosome silybin với 16,5ml NaCMC 0,5% tạo thành
vừa đủ 29ml) với liều tăng dần trong cùng một thể tích để xác định
liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất không gây chết
chuột. Xác định LD50 của phytosome silybin trên chuột nhắt trắng
theo đường uống theo hướng dẫn của OECD 423.
- Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của phytosome silybin:
Chuột cống trắng cả 2 giống được uống phytosome silybin liều
28mg/kg/ngày và 84 mg/kg/ngày liên tục trong 4 tuần. Đánh giá độc
tính bán trường diễn theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới
và tham khảo một số tài liệu.
2.2.2.3. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome
silybin trên thực nghiệm
Chuột cống trắng, cả 2 giống, 60 con, từ 3 tháng tuổi, khối
lượng từ 120 ± 20 gram. Chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con:
Lô 1 (Chứng sinh lý): Uống nước cất liều 0,5ml/100g. Lô 2 (Chứng
bệnh lý): Uống nước cất liều 0,5ml/100g và PAR liều 200mg/kg. Lô
3 (Chứng dương): Uống silymarin liều 50mg/kg và PAR liều 200mg/
kg. Lô 4: Uống silybin nguyên liệu liều 30mg/kg và PAR liều
200mg/kg. Lô 5: Uống phytosome silybin liều 10mg/kg và PAR liều
200mg/kg. Lô 6: Uống phytosome silybin liều 30mg/kg và PAR liều
200mg/kg. Chuột ở các lô được cho uống thuốc thử hoặc nước cất
liên lục vào các buổi sáng trong 7 ngày liên tục. Đến ngày thứ 7, cho
chuột nhịn đói 16-18 giờ trước đó, sau khi uống thuốc thử 3 giờ, cân
lại khối lượng chuột rồi tiến hành gây tổn thương tế bào gan cho
chuột từ lô 2 đến lô 6 bằng cách cho uống PAR liều 1.000mg/kg. Sau
48 giờ, máu tĩnh mạch cảnh chuột được lấy để định lượng hoạt độ

12
enzyme AST, ALT và mổ chuột để quan sát vi, đại thể gan chuột.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN
3.1.1. Kết quả nghiên cứu một số tính chất của silybin và
phospholipid
3.1.1.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng silybin A và
silybin B bằng HPLC
- Tính tương thích hệ thống: Phương pháp định lượng có số
đĩa lý thuyết của Si-A và si-B lần lượt là >39000 và >44000; hệ số
đối xứng lần lượt là 1,38 và 1,34. RSD của thời gian lưu và diện tích
pic của cả Si-A và Si-B đều nhỏ hơn 2%. Phương pháp phân tích
đảm bảo ổn định và phù hợp để định lượng silybin trong các mẫu.
- Tính chọn lọc, đặc hiệu: Tại vị trí xuất hiện đáp ứng pic
của Si-A và Si-B trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện pic tương ứng
trên SKĐ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện pic tương ứng trên
các mẫu trắng. Pic của silybin A và silybin B trên mẫu thử là cân đối,
sắc nét, độ rộng chân pic nhỏ, tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Phương
pháp phân tích đảm bảo độ chọn lọc và đặc hiệu.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ khảo
sát, có mối liên hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân
tích. Đường hồi quy của Si-A và Si-B là đường thẳng (y = 22527x +
6475,9 và y = 22174x + 12322) với hệ số tương quan R 2 gần bằng 1
(0,9995 và 0,9992).
- Độ lặp lại: RSD ở các điểm khảo sát trong ngày và khác
ngày đều < 2 %. Phương pháp đã xây dựng đảm bảo độ lặp lại.
- Độ đúng: Độ thu hồi của phương pháp đều lớn hơn 95%
đối với cả 2 mẫu thử nguyên liệu và phức Si-PC. Phương pháp định
lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: LOD và LOQ

của Si-A lần lượt là 0,003 µg/mL và 0,009 µg/mL; của Si-B lần lượt
là 0,004 µg/mL và 0,012 µg/mL.
3.1.1.2 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng PC
- Tính chọn lọc, đặc hiệu: Tại vị trí xuất hiện đáp ứng pic của
chất cần phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất hiện pic tương ứng


13
trên SKĐ mẫu thử và đồng thời không xuất hiện pic tương ứng trên
các mẫu trắng. Pic của PC trên mẫu thử là cân đối, sắc nét, độ rộng
chân pic nhỏ. Phương pháp này đảm bảo tính chọn lọc và đặc hiệu.
- Tính tương thích hệ thống: RSD về thời gian lưu và diện
tích pic của phosphatidyl cholin đều nhỏ hơn 2%. Phương pháp
phân tích là tương thích với hệ thống sắc ký.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Đường hồi quy của PC là đường
thẳng y = 9001,3x - 3621,6 với hệ số tương quan R 2 là 0,9996.
Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về khoảng tuyến tính.
- Độ lặp lại: RSD ở các điểm khảo sát trong ngày và khác
ngày đều < 2%. Phương pháp của xây dựng đảm bảo độ lặp lại.
- Độ đúng: Độ thu hồi của phương pháp đều lớn hơn 95%.
Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: giá trị LOD và
LOQ của PC lần lượt là 0,40 µg/mL và 1,33 µg/mL.
3.1.1.3. Kết quả xác định hàm lượng silybin trong mẫu nguyên liệu
Kết quả cho thấy silybin nguyên liệu có hàm lượng silybin đạt
96,21 % (tỷ lệ si-A và si-B xấp xỉ lần lượt là 49% và 51%).
3.1.1.4. Kết quả đánh giá độ tan của silybin trong một số dung môi
Silybin thực tế khơng tan trong nước (9,29 µg/mL) và
chloroform (4,96 µg/mL). Độ tan silybin trong EtOH 96% giảm
khoảng 2 lần so với EtOH tuyệt đối. Khi thêm THF vào EtOH tđ, độ

tan của silybin trong hỗn hợp dung môi đã tăng từ 1,5 đến 2,5 lần so
với khi chỉ dùng cồn tuyệt đối.
3.1.1.5. Kết quả đánh giá độ ổn định về hàm lượng của silybin và
PC ở các nhiệt độ khác nhau
Mẫu silybin và PC ổn định về hàm lượng trong dung môi phản
ứng ở các khoảng nhiệt độ khảo sát trong 24 giờ.
3.1.2. Kết quả nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ
phịng thí nghiệm
3.1.2.1. Kết quả xây dựng phương pháp xác định EE%
Có thể sử dụng chloroform để tách riêng silybin dạng tự do và
phytosome trong mẫu bào chế, qua đó xác định được tỷ lệ hoạt chất
phytosome hóa. Phương pháp đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại.


14
3.1.2.2. Kết quả giai đoạn bào chế phức hợp Si-PC
Các thông số gồm: Dung môi phản ứng: hỗn hợp dung môi
EtOHtđ:THF = 97:3 (tt/tt); tỉ lệ chất tham gia phản ứng/dung môi là
2,0%; tỉ lệ mol Si:PC là 1:2; nhiệt độ phản ứng là 50 0C; thời gian
phản ứng là 4 giờ; tốc độ khuấy trộn: 50 vòng/phút.
3.1.2.3. Kết quả giai đoạn hydrat hóa phức hợp Si-PC
Các thơng số gồm: dung mơi hydrat hóa màng film là nước; tỉ
lệ nước/chất rắn là 8:1. Hỗn dịch thu được tiến hành siêu âm với mức
năng lượng siêu âm là 720 W trong thời gian là 10 phút.
3.1.2.4. Kết quả giai đoạn phun sấy tạo bột phytosome silybin
Các thông số gồm: Tá dược hỗ trợ phun sấy: MD/AE (80/20);
tỷ lệ tá dược/chất rắn: 0,5:1; nhiệt độ khí đầu vào: 140ºC; tốc độ cấp
dịch: 10mL/phút. Mẫu bột phytosome thu được có hàm lượng Si tp
khoảng 13%, Siphy khoảng 12% và độ tan của silybin trong nước tăng
khoảng 59 lần so với silybin dạng tự do.

3.1.3. Kết quả bào chế, đánh giá một số đặc tính và chỉ tiêu chất
lượng của phytosome silybin ở quy mô 150g/mẻ
3.1.3.1. Bào chế phytosome silybin quy mô 150g/mẻ
Tiến hành bào chế phytosome silybinn quy mô 150g/mẻ với
các thiết bị gồm: Bếp từ gia nhiệt C-MAG HS10, hệ thống cất quay
N1200B sử dụng bình cầu (SJ: 60/46) dung tích 6 lít, máy siêu âm
đầu dị 01D882 và máy phun sấy ly tâm LPG-5. Tiến hành điều
chỉnh một số nội dung sau: Tỷ lệ HC/DM từ 2,0% thành 2,5%.
Thời gian phản ứng từ 4,0 giờ lên 4,5 giờ. Tốc độ khuấy trộn từ 50
vòng/phút lên 100 vòng/phút. Tỷ lệ nước/CR từ 8:1 thành 8,5:1.
Thời gian siêu âm từ 10 phút lên 12 phút. Kết quả cho thấy, mẫu
thu được khơng có sự khác biệt về các chỉ tiêu về độ ẩm, KLR, CI,
hàm lượng Sitp, hàm lượng Si phy, Hth, độ hòa tan so với mẫu nghiên
cứu ở giai đoạn phun sấy. Từ kết quả trên thì quy trình bào chế
phytosome silybin 150g/mẻ như sau: Hòa tan silybin 95%, PC90%
(tỷ lệ mol 1:2) vào 4,0 lít hỗn hợp dung mơi EtOH td:THF (97:3). Sau
đó đưa vào bình cầu, tiến hành phản ứng (hồi lưu) trên bếp từ gia
nhiệt ở các điều kiện nhiệt độ 50°C, tốc độ khuấy 100 vòng/phút
trong thời gian 4,5 giờ. Kết thúc phản ứng, chuyển bình cầu sang


15
máy cô quay chân không, tiến hành cô bốc hơi dung môi ở 50°C đến
khi tạo màng film mỏng. Sau đó cho từ từ 850,0 ml nước cất vào
trong bình cầu, vừa cho vừa kết hợp khuấy trộn để tạo hỗn dịch
phytosome. Sau khi hydrat hóa hết thể tích nước chuyển bình cầu
vào đầu dị siêu âm, tiến hành siêu âm ở 720W trong 12 phút. Sau
khi siêu âm, tiến hành phối trộn đều hỗn hợp tá dược MD/AE (80/20)
vào trong hỗn dịch. Hỗn dịch này được phun sấy ở điều kiện khí đầu
vào 140°C, tốc độ cấp dịch 10ml/phút. Bột phytosome thu được

đóng gói bảo quản trong túi zip (PE pha nhơm).
3.1.3.2. Đánh giá một số đặc tính và một số chỉ tiêu chất lượng của
phytosome silybin bào chế quy mô 150g/mẻ và dự kiến tiêu chuẩn
chất lượng phytosome silybin
Tiến hành bào chế 03 mẻ phytosome silybin với công thức
bào chế thể hiện ở bảng 3.28.
Bảng 3.28. Thành phần công thức bào chế phytosome silybin 150g/mẻ
STT
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Thành phần
Silybin 95%
Phosphatidyl cholin 90%
Maltodextrin
Aerosil
EtOHtđ
THF
Nước cất

Đơn vị
gam
gam
gam
gam

ml
ml
ml

Số lượng
25,0
75,0
40,0
10,0
3880,0
120,0
850,0

Kết quả đánh giá sự hình thành liên kết giữa Si và PC: Trên
phổ DSC của phức hợp Si-PC, hai đỉnh thu nhiệt của silybin và PC
hoàn tồn biến mất. Thay vào đó là một đỉnh thu nhiệt mới thấp hơn
ở 72,6oC. Điều này gợi ý rằng có sự hình thành liên kết giữa silybin
và PC. Phổ IR của phức hợp cho thấy pic ở 3609,13 cm -1 của nhóm
hydroxyl (O-H) tự do trong phân tử silybin đã biến mất, đồng thời
các pic ở 3454,85 và 3131,83 cm-1 thì có sự dịch chuyển số sóng
thành 3398,96 và 3010,34 cm-1 . Bên cạnh đó, pic hấp thụ của nhóm
P=O trong PC cũng có sự dịch chuyển số sóng từ 1243,86 cm -1
thành 1238,08 cm-1. Như vậy, có sự liên kết giữa các nhóm –OH tự
do của Si và nhóm PO 4- của PC. Trên phổ XRD của phức hợp các
đỉnh nhiễu xạ của Si và PC đã biến mất. Chứng tỏ Si tồn tại ở dạng


16
vơ định hình trong phức hợp. Phổ 1H-NMR trong phức hợp cho thấy:
Tín hiệu 10,53 ppm của nhóm -OH bị mất, các tín hiệu -OH cịn lại

đều yếu, thấp và tù hơn khi so sánh với tín hiệu silybin tinh khiết.
Trên phổ 13C-NMR của phức hợp so với PC (độ sai khác) ở vùng
choline gồm: (δ) N(CH3) 53,096 - 53,078 (+0,018); C2 57,958 –
57,886 (+0,072); C3 62,270 và 62,220 - 62,176 và 62,130
(+0,094/+0,096). Độ dịch chuyển hóa học các nhóm khác có xu
hướng dịch về trường mạnh (bên phải) khi so sánh phức hợp với Si
và PC. Carbon 2,3 gần nhóm PO4- của PC bị ảnh hưởng nhiều nhất.
Tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của
phytosome bào chế và dự kiến tiêu chuẩn chất lượng (Bảng 3.35):
Bảng 3.35. Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của phytosome silybin
Tiêu chuẩn
Tính chất
KTTP (nm)
PDI
Độ ẩm (%)
CI (%)
KLRbk (g/ml)
Định
(HPLC)

tính

Định lượng
(HPLC) Siphy
(%) và Sitp
(%)
% Silybin hòa
tan sau 60
phút trong dd
pH 6,8

Mẻ 1
Mẻ 2
Mẻ 3
Đề xuất tiêu chuẩn
dạng bột khô tơi, màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vị
đắng.
189,5 ± 188,7 ± 187,9 ±
Không quá 300nm
6,4
7,9
8,0
0,430 ± 0,443 ± 0,437 ±
Không quá 0,5
0,011
0,024
0,021
3,47 ±
3,46 ±
3,45 ±
Không quá 5 %
0,16
0,16
0,14
19,20 ± 19,33 ± 19,13 ±
16 - 20
0,80
0,83
0,76
0,415 ± 0,418 ± 0,416 ±

Không nhỏ hơn 0,35
0,013
0,014
0,015
bột phytosome silybin thể hiện peak trùng với peak của
silybin chuẩn trên sắc ký đồ.
- Hàm lượng silybin dạng
12,68 ± 12,60 ± 12,69 ± phytosome trong mẫu
0,82
0,40
0,67
không dưới 10,0%.
- Hàm lượng silybin toàn
13,43 ± 13,48 ± 13,56 ± phần trong mẫu không
0,40
0,39
0,50
dưới 11,0%
91,71 ±
3,46

90,06 ±
4,07

93,70 ±
2,90

≥ 85%

3.1.4. Theo dõi độ ổn định của phytosome silybin

17
Kết quả sau 6 tháng bảo quản ở 2 điều kiện (Điều kiện phịng
thí nghiệm và điều kiện lão hóa cấp tốc): Hệ tiểu phân phytosome
silybin vẫn tồn tại ở dạng cấu trúc và hình thái như ban đầu. KTTP
và PDI thay đổi không đáng kể (p>0,05). Chỉ tiêu mất khối lượng do
làm khô, hàm lượng Siphy, hàm lượng Sitp và độ hòa tan của các mẫu
ở 3 mẻ bào chế vẫn nằm trong giới hạn cho phép.
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ
TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME
SILYBIN
3.2.1. Kết quả đánh giá sinh khả dụng của phytosome silybin
3.2.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng silybin A và
silybin B trong huyết tương chó bằng HPLC
- Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tại vị trí xuất hiện đáp ứng pic của
Si-A và Si-B trên sắc ký đồ mẫu silybin trong huyết tương không
xuất hiện pic tương ứng trên các mẫu trắng. Pic của catechin, silybin
A và silybin B trên mẫu thử cân đối, sắc nét, độ rộng chân pic nhỏ,
tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Phương pháp này đảm bảo độ chọn lọc
và đặc hiệu.
- Tính tương thích hệ thống: RSD về thời gian lưu và diện tích
pic của cả catechin, Si-A và Si-B đều nhỏ hơn 2%. Phương pháp
phân tích này là tương thích với hệ thống sắc ký.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ khảo sát,
có mối liên hệ tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic (S silybin /Scatechin) và
nồng độ chất phân tích. Đường hồi quy của Si-A và Si-B là đường
thẳng (y = 0,488x – 0,0194 và y = 0,4996x – 0,0177) với hệ số tương
quan R2 gần bằng 1 (0,9997 và 0,9997).
- Độ chính xác: Độ lặp lại: RSD ở các điểm khảo sát trong

ngày và khác ngày đều < 3% . Phương pháp xây dựng đảm bảo độ
lặp lại. Độ lặp lại trung gian: RSD ở các điểm khảo sát đều < 3%.
Phương pháp xây dựng đảm bảo độ lặp lại trung gian. Độ tái lặp:
RSD ở các điểm khảo sát đều < 3%. Phương pháp xây dựng đảm bảo
độ tái lặp.
- Độ đúng: Ở 3 điểm khảo sát, độ thu hồi của phương pháp đều
lớn hơn 85%. Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng.


18
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Giá trị LOD và
LOQ của Si-A lần lượt là 4,69 ng/mL và 14,20 ng/mL; của Si-B lần
lượt là 2,79 ng/mL và 8,46 ng/mL.
- Độ ổn định của mẫu: Độ ổn định trong ngày: Định lượng
silybin trong mẫu LQC, MQC và HQC sau thời gian để ổn định
trong 24 giờ, cho độ thu hồi lần lượt là 110,42 - 116,43%; 104,17 108,95%; 98,30 - 99,10%. Silybin ổn định trong huyết tương sau thời
gian 24 giờ. Độ ổn định sau các chu kỳ rã đông: Định lượng silybin
trong mẫu LQC, MQC và HQC sau 3 chu kỳ đông-rã, cho độ thu hồi
lần lượt là 99,64 - 111,65%; 85,34 - 105,44%; 89,67 - 103,21%.
Silybin ổn định trong huyết tương sau 3 chu kỳ đông- rã.
3.2.1.2. Kết quả đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin trên
chó thực nghiệm
Bảng 3.40. Các thơng số dược động học của silybin nguyên liệu và
phytosome silybin (n=6)
Thông số
Tmax
Cmax
t1/2
MRT
AUC0-14

(1)
AUC0- (2)

giờ
ng/ml
giờ
giờ

Silybin nguyên
liệu (a)
5,2 ± 0,8
945,2±26,0
3,6±0,6
8,11±0,6

Phytosome
silybin (b)
3,5 ± 0,5
1547,7±93,7
4,7±0,6
8,82±0,4

ng/ml.giờ

6683,8±748,1

11024,6±885,7

ng/ml.giờ

7693,1±637,2

Đơn vị

(1)/(2)
%
Ln[AUC0-14]
Ln[AUC0-∞]
Ln[MRT]
Ln[Cmax]

86,5±2,9
8,80 ± 0,11
8,95 ± 0,08
2,09 ± 0,07
6,85 ± 0,03

13471,2±1072,
6
81,9±1,8
9,31 ± 0,08
9,51 ± 0,08
2,18 ± 0,05
7,34 ± 0,06

Pa-b
0,008*
0,0156

pa-b < 0,0001

pa-b < 0,0001
pa-b: 0,042
pa-b < 0,0001

3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng độc tính cấp và độc tính bán
trường diễn của phytosome silybin trên thực nghiệm
Chưa xác định được LD50 của chế phẩm phytosome silybin
theo đường uống trên chuột nhắt trắng. Phytosome silybin khơng có
biểu hiện độc tính cấp ở liều 28,81g/kg trên chuột nhắt trắng theo
đường uống.
Dựa theo bảng phân loại hóa chất theo mức độ độc, dựa vào