Xác định hàm lượng vitamin b2 bằng phương pháp trắc quang

Chuyên ngành Hoá phân tích
Bộ giáo dục và đào tạo

Trờng đại học vinh

khoa ho¸ häc





Xác định hàm lợng vitamin B2
bằng phơng pháp trắc quang

luận văn tốt nghiệp đại học s phạm ngành hoá học
kho¸ 39, 1998 - 2002

Giáo viên híng dÉn: Th¹c sÜ Ngun Quang T
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Thọ - 39A Ho¸

Vinh, 5-2002

LuËn văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với:

Thầy giáo hớng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ đà giao đề tài và
híng dÉn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong

qu¸ trình thực hiện đề tài.

Để hoàn thành đợc đề tài này em còn đợc sự giúp đỡ và góp ý của
các thầy cô giáo : TS Nguyễn Khắc Nghĩa; Ths Võ Thị Hoà; cô
Phạm Thị Đức - cán bộ phụ tá phòng thí nghiệm, cùng nhiỊu thÇy
cô giáo khác trong khoa.

Vinh, tháng 5 năm 2002
Nguyễn Văn Thọ

Sinh viên lớp 39 A - Hoá



Mở đầu

Có thể định nghĩa về vitamin một cách tóm tắt nh sau: vitamin là một
nhóm các hợp chất hữu cơ có khối lợng phân tử bé, có cấu tạo hoá học rất khác
nhau và có các tính chất lí học cũng nh hoá học rất khác nhau. Chúng đều giống
nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống bình thờng của bất kì một cơ thể
nào. Trong các cơ thể sinh vật, vitamin hoàn thành các chức năng xúc tác.

1
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

Nhờ sự cố gắng của nhiều nhà hoá sinh học và nhiều nhà sinh lí học mà
gần 100 năm này trong nhành vitamin học ngời ta đà chiết xuất và phân lập đợc
trên 30 loại vitamin khác nhau. Ngời ta cũng đà tổng hợp đợc một số lớn các

vitamin bằng con đờng tổng hợp hoá học trong phòng thí nghiệm.

Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay ngời ta chia vitamin ra
làm các nhãm sau:

+ C¸c vitamin hoµ tan trong níc (B1, B2, B5, B6, B12, C, B3, H...)
+ C¸c vitamin hoµ tan trong chÊt bÐo (A, D, E, K, Q, ...)
ViƯc cung cÊp kh«ng đầy đủ các vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hởng xấu
không những đối với sự làm việc của hệ thần kinh mà còn đối với một số loại cơ
quan khác ở bên trong cơ thể. Vì thế, trong khẩu phần ăn của con ngời phải có
giá trị hoàn chỉnh không những về phơng diện calo, về phơng diện chất đạm, mà
còn về phơng diện vitamin nữa.
Đối với vitamin B1, B2 nói riêng cũng có vai trò rất quan trọng. Để cung
cấp đầy đủ và hợp lí đối với cơ thể thì vấn đề đặt ra là cần phải biết đợc hàm l-
ợng của nó trong các mẫu thuốc, các loại thức ăn. Do đó, cần phải tìm ra các
phơng pháp xác định hàm lỵng cđa chóng.
Vitamin B1, B2 có thể đợc định lợng bằng nhiều phơng pháp nh: phơng
pháp sinh vật học, phơng pháp hoá học, phơng pháp lí học, ... Phơng pháp định
lợng vitamin B1, B2 hầu hết chỉ tiến hành bằng phơng pháp hoá học.
Trong ®iỊu kiƯn thùc tÕ của phòng thí nghiệm hiện nay, chúng tôi định l-
ợng vitamin B2 bằng phơng pháp trắc quang. Phơng pháp này khá phổ biến vì có
tính chính xác cao nếu nh tìm đợc các thuốc thử thích hợp và xác định đọc các
điều kiện tối u cho phép phân tích.
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi định lợng vitamin B2 theo 2 phơng
pháp:
+ Phơng pháp dựa trên thiết bị quang phổ tử ngoại của TT Kiểm nghiệm
Dợc phẩm.
+ Phơng pháp cổ điển: xây dựng quy trình để định lợng hàm lợng vitamin
B2 ở phòng thí nghiệm khoa Hoá học.
Từ kết quả của 2 phơng pháp có thể rút ra so sánh nên sử dụng phơng pháp

nào để định lợng vitamin, từ đó ứng dụng để định lợng vitamin B2 trong một số
thực phẩm và dợc phẩm trên thị trờng hiện nay.

2
LuËn văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

PhÇn I

Tỉng quan tài liệu

1. Phân loại vitamin B - Nguồn gốc và vai trò của chóng.
Vitamin B cã nhiỊu loại, mỗi loại có vai trò riêng, có ý nghĩa rÊt quan
träng ®èi víi sù sèng.

1.1. Vitamin B1 (Tiamin).
C«ng thøc cÊu t¹o:

NH2

C H2C + CH3
NC NC

C CH HC C 3
Luận văn tốt nghiệp cHử nChân s phNạm ngành Ho¸ häc S H2C CH2OH
3

Chuyên ngành Hoá ph©n tÝch

(dạng có vòng thiazon)
+ Vai trß, chøc năng sinh học:
Khi kết hợp với hai gốc photphat, vitamin B1 sẽ tạo thành tiamin
pyrophotphat (TPP). Đó là coenzym của enzym đecacboxylaza và transxetolaza
(các enzym này tham gia vào quá trình trao đổi gluxit).
ThiÕu vitamin B1 sÏ ¶nh hởng đến sự trao đổi gluxit, viêm dây thần kinh, bị
bệnh tê phù (beri - beri). Khi mắc bệnh, hàm lợng axit piruvic và -xetoglutaric
trong máu cao hơn mức bình thêng.
+ Nguån cung cÊp, nhu cÇu:
Vitamin B1 cã nhiều trong thực vật nh men bia, cám gạo, gạo cha xát, ngô,
đặc biệt nhiều hơn trong đỗ tơng, lạc, ngoài ra còn có trong các loại rau nh bắp
cải, rau dền, xà lách. Trong động vật, vitamin B1 có nhiều trong gan, sữa, lòng
trắng trứng.
Nhu cầu vitamin B1 của ngời lớn là 1,5 - 3mg, đối với trẻ em là 0,5 - 2mg.
1.2. Vitamin B2 (riboflavin, lactoflavin).
+ Công thức cấu tạo: (trang sau)
+ Vai trß, chøc năng sinh học:
Vitamin B2 là thành phần cấu tạo nên các coenzym sau:

Flavin mono nucleotit (FMN)
Flavin a®enin ®inucleotit (FAD)
Đó là các coenzym tham gia vào quá trình oxy hoá - khử. Vì vậy, thiếu
vitamin B2, sự sinh trởng của cơ thể diễn ra không bình thờng. Ngoài ra nó còn
ảnh hởng đến sự phát triển của nhiều mô khác trong cơ thể nh da, màng nhầy,
bào thai, máu.

CH2 -(CHOH)3-CH2OH
N NO
H3C

HC NH

3N O

4
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá häc

Chuyên ngành Hoá ph©n tÝch

+ Nguån cung cÊp, nhu cÇu: Vitamin B2 cã nhiỊu trong nÊm men, trong rau
quả nh rau dền, da hấu, hành tây, súplơ, đậu, thịt, sữa, gan, lòng đỏ trứng.

Nhu cầu vitamin B2 hàng ngày của ngời là 2 - 2,5mg. Đối với động vật
nhai lại, nhờ các vi sinh vật đờng ruột có thể tổng hợp đợc vitamin B2 cung cấp
cho cơ thể nên chúng không có nhu cầu hấp thụ B2 từ ngoài.

1.3. Vitamin B3 (axit pantoteric):
+ Công thức cấu tạo:

O H H CH3

C CH2 CH2 N C C C CH2OH
O- N

O OH CH3

+ Vai trò, chức năng sinh học:
Vitamin B3 là một thành phần cấu tạo của coenzym A tham gia vào sự
chuyển hoá lipit trong cơ thể. Thiếu vitamin B3 sẽ bị bệnh viêm da.
+ Nguån cung cÊp: Trong thùc vËt, vitamin nµy cã nhiỊu trong nÊm men,

trong líp alơron của hạt lúa, trong chồi cây linh lăng, hạt lạc, đỗ tơng, cà chua,
gấc, ...
1.4. Vitamin PP (vitamin B5)
+ Công thức cấu tạo:

COOH

axit nicotinic (niaxin, vitamin B5, PP)

N

+ Vai trß, chức năng sinh học:
Vitamin PP ngăn ngừa đợc bệnh da sần sùi. Thiếu vitamin này da sẽ bị
viêm loét, sẫn sùi, nhất là những nơi tiếp xúc nhiều với ánh sáng. Vitamin PP là
thành phần cấu tạo nên các coenzym:

Nicotinait a®enin ®inucleotit (NAD+).
Nicotinamit a®enin ®inucleotit photphat (NADP+)

5
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

Đó là những coenzym tham gia vào quá trình oxy hoá - khử, vì vậy thiếu
vitamin này thì quá trình oxy hoá - khử trong cơ thể bị vi phạm.

+ Nguồn cung cÊp, nhu cÇu:
Vitamin PP có nhiều trong gan, thịt, trứng, hạt đậu đỗ, gạo, bánh mì, nấm
men. Nhu cầucủa ngời đối với vitamin PP trong một ngày khá cao: 15 - 25mg.

Tuy nhiên, một số loài vi sinh vật có thể tổng hợp đợc vitamin PP từ axit amin
không thay thế là triptophan.
1.5. Vitamin B6 (piri®oxin)
+ Công thức cấu tạo:

CH2OH CHO CH2NH2
CH2OH CH2OH CH2OH
OH
oxy ho¸ OH OH
CH3 NH3
CH3 CH3
N N N

piri®oxin piri®oxal piriđoxemin

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Khi piriđoxal đợc hoạt hoá bởi ATP để tạo thành photphopiriđoxal, nó sẽ

tham gia vào nhóm ngoại của enzym aminotransferaza, xúc tác cho sự chuyển

hoá nhóm NH2 từ axit amin đến axetoaxit. Nhờ đó các xetoaxit mới và axit

amin mới đợc tạo thành.

Thiếu vitamin B6 sẽ biểu hiện các triệu chứng nh viêm thần kinh, các bệnh

ngoài da, nôn mửa, đau cơ, suy nhợc.

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin B6 có nhiều trong thịt, sữa, lòng đỏ trứng, cá, men bia và các hạt

ngũ cốc. Nhu cầu vitamin B6 hàng ngày của ngời lớn là 1,5 - 2,8mg, trẻ em là

0,5 - 2mg.

1.6 Vitamin B12 (cobalamin)

CÊu t¹o cđa vitamin B12 rÊt phøc tạp.

+ Vai trò, chức năng sinh học:

6
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Ho¸ häc

Chuyên ngành Hoá phân tích

Vitamin B12 có tác dụng chữa bệnh thiếu máu ác tính, nó giúp cho sự hình
thành huyết cầu tố và hồng cầu, nó tham gia vào các quá trình sinh tổng hợp các
nucleotit, giúp cho các phản ứng metyl hoá.

+ Nguån cung cÊp, nhu cÇu:
Có trong thịt, cá, trứng, sữa, ...
ë ngêi, vitamin B12 đợc dự trữ ở gan (vài mg), đợc tổng hợp nhờ hệ vi
khuẩn đờng ruột, vi khuẩn này cũng thấy ở ao, hồ, trong nguồn nớc thải nhà
máy.
Nhu cầu 10 - 20 /ngày.ngày.
2. TÝnh chÊt ho¸ häc của thiamin - Khái quát về phơng
pháp định lợng.

2.1. TÝnh chÊt
+ Điểm nóng chảy: 246 - 2500C cho đến khi phá huỷ.
+ Độ hoµ tan:: 100g/ngµy.100ml níc.

1g/ngµy.100ml etanol 960.
kh«ng tan trong hexan, ete, axeton.
+ Trong m«i trêng kiỊm, thiamin rất dễ bị phá huỷ. Phần thiazol trong
phân tử rất dễ dàng bị phá huỷ. Thiamin trong môi trờng trung tính và đặc biệt
là trong môi trờng axit tơng đối vững bền.
Ngoài không khí bình thờng, thiamin trong dung dịch rất dễ bị oxy hoá. Sự
oxy hoá dần dần phát sinh ra dạng đisunfua, có tác dụng về phơng diện sinh vật
học. Bằng cách dùng các thuốc thử oxy hoá mạnh nhất phát sinh ra thiocrom là
một chất có huỳnh quang xanh lơ rất rõ. Phản ứng này coi nh đợc dùng cơ bản
cho phơng pháp định lợng thiamin rất nhạy và tơng đối đơn giản.
2.2. Khái quát về phơng pháp định lợng
Phơng pháp định lợng thiamin có thể phân chia thành 3 nhóm:
+ Phơng pháp định lợng sinh vật học và vi trùng học.
+ Phơng pháp hoá học.
+ Phơng pháp lý học.
Phơng pháp định lợng thiamin trên súc vật, trên cơ sở làm chứng (test) về
sự trởng thành nhanh chãng. ViƯc thiÕu vitamin B1 ë cht èm g©y nên một sự
bại liệt phần dới mà sau đó đợc điều trị bằng cách cho mẫu chuẩn đồng thời với
mẫu thử. Độ nhạy của phơng pháp vi sinh vật giảm đi đáng kể, điều đó đợc xác

7
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Ho¸ häc

Chuyên ngành Hoá phân tích

định rằng đôi khi do ảnh hởng của vi sinh vật tạo nên thiamin ở bộ máy tiêu ho¸

cđa cht.

Thùc tÕ khi định lợng thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên hay trong
các chế phẩm dợc, hầu hết ngời ta dùng phơng pháp định lợng hoá học. Phơng
pháp hoá học để định lợng thiamin dựa trên sự đo huỳnh quang của sản phẩm
oxy hoá của thiamin (thiocrom). Sau đó ngời ta dùng phơng pháp so màu để
định lợng. Phơng pháp này cho sản phẩm ngng kết của thiamin với những amin
thơm. D.Melnik và H. Field nghiên cứu phơng pháp này dùng sản phẩm ngng
kết với p-aminoaxetophenon. Màu phát sinh đem lắc với butanol, xylen hay
axeton. Nồng độ màu tăng lên khi có mặt etanol hay phenol. Phơng pháp này đ-
ợc cải tiến bằng cách dùng axit sunfanilic điazo hoá và kaliferixianua. Công
trình này làm tăng độ nhạy của phản ứng bởi vì sự có mặt của kaliferixianua tác
dụng với axit sunfanilic điazo hoá trong nguyên liệu có amin giao thoa với
thiamin. Từ nồng độ màu trớc và sau khi cho ferixianua, có thể định lợng một
cách tơng đối chính xác lợng thiamin.

Về các phản ứng màu khác đối với thiamin có thể cho biết một cách đơn
sơ. Vitamin B1 với p- đimetylamino benzaldehyd tạo nên một kết tủa đỏ gạch
khi cho bốc hơi trong môi trờng axit. Với 2,6- đibromquinon clorimit trong môi
trờng dung dịch đệm borat pH 9,6 thiamin cho mµu da cam.

Định lợng vitamin B1 bằng phơng pháp cân có thể tiến hành theo B.
Naiman bằng cách tủa dung dịch thiamin với iodo bitmuto kali. Tủa màu da
cam tạo thành thực tế không tan trong nớc. Sau khi lấy đợc, đem sấy khô và cân.
Phơng pháp này tuy vậy đôi khi dùng để định lợng thiamin trong các chế phẩm
dợc.

Định lợng thiamin tự do bên cạnh dạng este hoá dựa trên độ hoà tan khác
nhau của sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza với thiamin. Từ môi trờng kiềm
thiocrom có thể lấy đợc hẳn để định lợng bằng cách lắc với izobutanol, trong

khi đó, sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza vẫn ở trong pha nớc. Định lợng
thiamin đà đợc cân sẵn đáp ứng từ một lợng lớn cocacboxylaza đợc tiến hành
trên cơ sở định lợng thiamin trớc và sau sự thuỷ phân enzym.

2.2.1. Phơng pháp lý học để định lợng thiamin
2.2.1.1. Phơng pháp quang phæ

8
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

Phơng pháp quang phổ có thể dùng để định tính hay định lợng thiamin
trong các chế phẩm dợc, đặc biệt trong thuốc tiêm. Quang phổ hấp thụ vùng tử
ngoại của thiamin rất đặc hiệu và chịu sự thay đổi đáng kể trong môi trờng nớc
ỏ các pH khác nhau. Sự thay đổi sâu xa về quang phổ theo pH rất điển hình với
nhân pyrimidin. Trong môi trờng HCl 0,1N thiamin cho một quang phổ hấp thụ
đơn giản với độ cực đại ở bớc sóng 253nm. Trong môi trờng đệm axetat pH 3,5
có 2 cực đại ở các bớc sóng 245 nm và 261nm. Trong môi trờng đệm photphat
pH 6,6 có 2 cực đại ở cách xa nhau mà ở đó độ tắt của cực đại ở khoảng 265nm
thấp xuống đáng kể.

2.2.1.2. Phơng pháp cực phổ
K. Wiesner là ngời đầu tiên nghiên cứu định lợng thiamin bằng phơng
pháp cực phổ đà nhận thấy trong dung dịch thiamin có 2 loại sóng cực phổ:
sóng xúc tác trong dung dịch đệm, và sóng anot trong môi trờng kiềm. Dung
dịch đệm photphat pH 7,3 thích hợp cho việc định lợng. Còn về độ nhạy, thì pH
này rất thích hợp bởi vì có thể dùng nồng độ thiamin ở mg/ngày.ml. Tuy vậy, việc lựa
chọn phơng pháp này cũng rất ít vì tất cả chất gây tác nhân phát hiện hiđro trên
điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt đều cho làn sóng giống nhau. Vì thế chỉ dùng ph-

ơng pháp này cho việc định lợng các chế phẩm dợc, trong khi khả năng định l-
ợng trong các nguyên liệu thiên nhiên bị hạn chế.
2.2.1.3 Phơng pháp sắc kí định lợng thiamin
Phơng pháp sắc kí là phơng pháp rất căn bản để đạt tới việc định lợng
thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên. Và nh vậy kể cả phơng pháp sắc kí
hấp phụ trên cột đến phơng pháp sắc kí mới nhất trên giấy.
Trong sự chọn lọc các phơng pháp định lợng thiamin trong nguyên liệu
thiên nhiên, phơng pháp trao đổi ion từ nhóm zeolit do L.R. Cevecedo và D.J.
Henessy đà dùng chất này để chiết thiamin từ chất dợc liệu.
Trong thời gian gần đây, việc dùng phơng pháp sắc kí trên giấy rất thích
hợp và có giá trị đối với việc định lợng thiamin trong nguyên liệu thiên nhiên.
Phơng pháp sắc kí giấy có khả năng dễ tách thiamin khỏi các cocacboxylaza.
Vấn đề này đợc đặt ra do A. Baldantoni, M. Spaoloni. Dung môi đợc dùng là
hỗn hợp izo- butanol, pyridin với nớc, với tỷ lƯ 1 : 1 : 1 vµ 1,1% axit axetic kết
tinh đợc, ngời ta tiến hành phát hiện phản ứng thiocrom sau khi oxy hoá thiamin
và cocacboxylaza bằng ferixianua kali. Vị trí của vết thiocrom đợc phát hiện do

9
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

huỳnh quang phát triển dới ánh sáng tia tử ngoại. Việc chuyển dạng thiocrom
thờng hay đợc dùng để phát hiện thiamin trong sắc kí giấy. Nghiên cứu khả
năng mới định lợng các vitamin bằng cách phối hợp các phơng pháp lí học với
sắc kí trên giấy thì cần sử dụng đến khả năng phân chia lớn của phơng pháp sắc
kí trên giấy, và độ nhạy đáng kể của một vài phơng pháp lí học để định lợng
một lợng nhỏ vitamin.

2.2.1.4. Định lợng thiamin pyrophotphat bằng phơng pháp manomet.

Năm 1937 - 1938, A. S. Shultle, L. Atkin và các đồng nghiệp đà công bố
phơng pháp định lợng thiamin rất nhạy và đặc hiệu dựa trên việc đo thể tích CO2
phát sinh khi có sự lên men của glucoza trong giai đoạn đecacboxyl hoá axit
pyrotactrric. Nếu ta cho vào men cocacboxylaza (pyrophotphat thiamin) chất
này sẽ kết hợp với thành phần anbumin của cacboxylaza (men ngoại lai) dựa
trên chức năng hoạt động của cacboxylaza gây xúc tác cho sự khử cacboxyaxit
pyrotactrric. Đo bằng áp kế lợng CO2 phát sinh, và từ lợng đó xác định đợc lợng
cocacboxylaza trong mẫu nguyên liệu đem thử. G.K. Westenbrink và các đồng
nghiệp nghiên cứu phơng pháp này để định lợng thiamin pyrophotphat trong
máu, trong các mô và các men. Đó là một trong những phơng pháp rất nhậy để
định lợng vitamin.
2.2.2. Phơng pháp hoá học định lợng thiamin.
2.2.2.1. Kh¸i qu¸t chung
Trong các phơng pháp hoá học định lợng thiamin, phơng pháp thiocrom đ-
ợc xếp lên hàng đầu. Phơng pháp này dựa trên sự đo cờng độ huỳnh quang xanh
lơ của sản phẩm oxy hoá của thiamin là thiocrom:

N N C CH3
N CH2CH2OH
CH3 N
S

Thiocrom đợc phát sinh do thiamin bị oxy hoá trong môi trờng kiềm. Đạt
đợc những điều kiện tốt nhất để đo huỳnh quang khi ta dùng tia tím - tử ngoại ở
bớc sóng vào khoảng 365nm. B.C.P. Jansen là ngời đầu tiên dùng phơng pháp
huỳnh quang để định lợng thiamin. Jansen đà oxy hoá nớc chiết có chứa
thiamin bằng dung dịch muối màu đỏ máu. Sau đó sản phẩm oxy hoá vừa đợc

10
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

tạo ra đem lắc với izobutanol. Nguyên tắc này nói chung là dùng cho phơng
pháp huỳnh quang. Độ nhạy của phơng pháp đợc nâng lên với thời gian.

D.J. Henessyt và các cộng tác viên đà dùng zeolit tổng hợp (pecmutit) để
tách thiamin từ các nguyên liệu thiên nhiên, đà nghiên cứu nâng cao chủ yếu độ
nhạy của phơng pháp, và loại trừ ¶nh hëng cđa hnh quang cđa c¸c chÊt phơ
kh¸c.

Sù hÊp phơ thiamin trªn nguyªn liệu này đợc tiến hành trong môi trờng
axit. Henessy và cộng sự tiến hành giải phóng thiamin từ chất trao đổi ion bằng
dung dịch amoni nitrat. Tiếp theo là sự cải tiến phơng pháp ban đầu của Jansen
khi xác định rằng bên cạnh thiamin tự do còn có cả este của axit
pyrophotphoric, ví dụ trong men bánh mì và trong một vài mô tế bào động vật.
Tác dụng vi sinh vật của thiamin pyrophotphat tơng đơng với tác dụng của
thiamin tự do. Khi định lợng bằng phơng pháp thiocrom, cần phải lắc sản phẩm
oxy hoá của cocacboxylaza từ môi trờng kiềm với izo - butanol, do lí do trên
nên cần phải tiến hành giải phóng thiamin khỏi liên kết của este. Muốn vậy,
phải dùng một loại enzym khác để thuỷ phân nh: photphataza, takadiastaza và
amylaza cũng cho hiệu quả nh nhau.

2.2.2.2. Định lợng vitamin B1 bằng phơng pháp thiocrom theo "Hội
những nhà hoá học về vitamin".

Phơng pháp này tiến hành theo các bớc sau:
+ Chiết: cân một mẫu có chứa khoảng 10 - 40mg thiamin, cho vào bình
cầu 100ml, thêm 75ml dung dịch HCl 0,1N và đun sôi cách thuỷ 30 phút. Một
mặt trong môi trờng axit thì ít nhất thiamin cũng bị oxy hoá, mặc khác có thể

dùng phơng pháp này để chiết toàn bộ thiamin vào dung dịch. Đối với những
mẫu thử không chứa thiamin liên kết thì có thể không cần thuỷ phân bằng
enzym, mà tiến hành ngay sắc kí ph©n chia.
+ Thủ ph©n bằng enzym: nhằm giải phóng thiamin khỏi dây nối este bằng
axit pyrophotphoric. Tiến hành thuỷ phân bằng cách dùng sản phẩm
takadiastaza. Sau khi thuỷ phân xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, pha loÃng cho
vừa đủ 100ml nớc cất, lắng và lọc li tâm để có đợc dung dịch trong.
+ Sắc kí: để đẩy nớc trong có lơ lửng chất pecmutit đà chuẩn bị sắc vào cột
sắc kí ở dới đáy có lót bông thủ tinh. Dïng èng hót nhá 25 ml dung dÞch lọc
axit hay nớc chiết để cho chảy từ từ . Nớc lọc chảy ra bỏ đi. Rửa cột 3 lần, mỗi

11
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

lần bằng 10ml nớc nóng. Trong điều kiện này thiamin đợc giữ trong cột trao đổi
ion. Thiamin giải phóng sau đó đợc tiến hành lấy bằng dung dịch KCl.

TiÕn hµnh chiÕt thiamin bằng cách rửa cột hai lần với 10ml dung dịch axit
kaliclorua cho dung dịch chiết vào bình câù 25ml và đổ đầy dung dịch axit kali
clorua đến ngấn.

Hút 5ml dịch chiết axit vào 2 èng nghiƯm cã kÝch thíc thÝch hỵp. Trong
èng nghiƯm thø nhÊt, hót 3 ml dung dÞch kiỊm kali ferixianua, trén thêm 15ml
izobutanol và lắc mạnh trong 90 giây. Bằng phơng pháp oxy hoá này, có thể cho
oxy hoá toàn bộ thiamin thành thiocrom và đem lắc vào trong lớp izobutanol.
Trong èng nghiƯm thø hai, hót 3 ml dung dÞch NaOH vào mẫu trắng và sau đó
15ml izobutanol. Lắc mạnh trong 90 giây; tiến hành những bớc nh vậy với dung
dịch thiamin mÉu chuÈn.

+ T¸ch dung dịch thiocrom: tiến hành phân chia izobutanol với lớp nớc; có
thể dễ dàng phân tách 2 lớp ấy bằng ly tâm. Rút lớp nớc, thêm vào lớp chiết
izobutanol 23g natri sunfat khan và lắc trong 30 giây.

+ Đo huỳnh quang: để tiến hành định lợng, thờng tiến hành xác định kết
quả theo đờng cong đồ thị. Để tính đợc nồng độ thiamin trong mẫu cần phải biết
kết quả của 4 lần đo.

2.2.3. Định lợng thiamin bằng phơng pháp so màu
Nguyên tắc của phơng pháp này là dựa trên việc đo màu sắc của dẫn xuất
azo của thiamin phát sinh trong quá trình ngng tụ thiamin với các thuốc thử
điazo hoá khác nhau. Năm 1934 H. Kinersley và R. Pekers dùng axit
điazobenzen sunfonic làm các chất điazo hoá. Chất azo đợc tạo nên màu đỏ và
đợc đem lắc với butanol và đem so màu. Phơng pháp này tiếp tục đợc M.
Itvenberg và cộng sự cải tiến tốt hơn, và thực tế họ đà dùng phơng pháp so màu
này rất tốt để định lợng thiamin.
2.2.4. Định lợng thiamin bằng phơng pháp cân
Thiamin cho những hỗn hợp rất khó tan với axit silicovonframic.
D.Adamson và J. Handisyde đà dùng phản ứng này để định lợng thiamin bằng
phơng pháp cân trong các chế phẩm dợc. Thiamin tạo nên một tủa rất khó tan
với reineckat amoni nh một vài chất amin dự phòng và các muối bậc 4. Phản
ứng này do B. J. Bandelin đầu tiên dùng để tách thiamin ra khỏi các chế phẩm
dợc. Ngời ta cân trọng lợng các kết tủa này để định lợng thiamin.

12
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

3. Tính chất và phơng pháp định lợng riboflavin

(vitamin B2)

3.1. Tính chất

+ Độ hoµ tan: trong níc ë 250C: 0,012g trong 100ml.

trong cån etylic tut ®èi: 0,0045g trong 100ml.

trong ete: kh«ng tan.

trong benzen: kh«ng tan.

trong hexan: kh«ng tan.

+ §é quay cùc: []D25 = -1140 (trong NaOH 0,1N).

+ Riboflavin tơng đối vững bền trong môi trờng axit, trong môi trờng kiềm

nó rất dễ bị phá huỷ nhanh. Thuốc thử oxy hoá mạnh nh KMnO4, lại càng làm

phá huỷ nhanh. Các chất khử nh H hoạt động, NaHSO3, TiCl2 khử nó một cách

thuận nghịch thành hợp chất leuco(II) theo công thức dới. Riboflavin dới ảnh h-

ởng của ánh sáng bị phân huỷ

R RH
CH3 N N O

CH3 N N O +
+2e + 2H
NH
CH3 NH CH3
N
N
O H O II

Trong môi trờng kiềm, phần lớn tạo ra lumiflavin (III) là 6,7,9-
trimetylizoalloxazin trong môi trờng axit tạo ra lumicrom (IV) 6,7-
đimetylizoalloxazin. Huỳnh quang màu vàng xanh là tính chất đặc biệt của
riboflavin, là đợc dùng làm phơng pháp định lợng trong các nguyên liệu thiên
nhiên. R. Kuhn và G. Moruzzi xác định bằn huỳnh quang của riboflavin phụ
thuộc rất đáng kể vào việc dùng dung môi và pH của dung dịch. Mức tối đa của
huỳnh quang nằm trong giới h¹n pH tõ 6 - 7.

13
LuËn văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

CH3 H
CH3 N N O CH3 N N O

CH3 NH CH3 NH

N N

III O O
IV

3.2. Các phơng pháp định lợng riboflavin
Phơng pháp định lợng riboflavin hầu hết chỉ tiến hành bằng phơng pháp

hoá học, vì phơng pháp sinh vật học phụ thuộc một cách đáng kể vào tính chất

của động vật và tơng đối ít chính xác.

+ Phơng pháp sinh vật: ngời ta hay dùng nhất là thí nghiệm sự lớn trên

chuột ốm. Phơng pháp vi sinh vật học trong những năm gần đây thờng đợc dùng

dể định lợng riboflavin trong những nguyên liệu hiếm về yếu tố đó. E. E. Snell

và F.M. Strong và các đồng nghiệp đà viết về phơng pháp dựa trên việc theo dõi

sự phát triển của việc nuôi cấy lactobacillus casei. M. F. Clark và đồng nghiệp

đà nghiên cứu một trong những cải tiến sau này của phơng pháp đó.

+ Về phơng pháp lí học, dùng quang phổ tử ngoại và cực phổ để định lợng

riboflavin. ý nghĩa của phơng pháp này đến nay cũng cha đợc đánh giá đầy đủ.

+ Phơng pháp so màu dựa trên sự đo màu của dung dịch riboflavin cũng là

phơng pháp phổ biến, tuy nhiên độ nhạy thực tế rất ít.

+ Phơng pháp định lợng riboflavin bằng huỳnh quang dựa trên sự đo huỳnh

quang màu của chất đó. Nh vậy, cần phải loại trừ ảnh hởng do các chất huỳnh

quang mang lại, có thể tiến hành bằng phân tách và sắc kí hoặc định lợng riêng

biệt từng phần huỳnh quang trớc và sau khi khử riboflavin. Phơng pháp huỳnh

quang rất nhạy và tơng đối đặc biệt rõ rệt. Vì vậy, ngời ta dùng để định lợng

riboflavin trong một nguyên liệu thiên nhiên. Phơng pháp định lợng lumiflavin

dựa trên sự chuyển riboflavin trong môi trờng kiềm bằng những nguồn chiếu

sáng mạnh thành những sản phÈm quang häc cã hnh quang mµu vµng rÊt dƠ

tan trong clorofoc, khác với riboflavin không tan trong dung môi này. Phơng

pháp này rất đặc hiệu, nhng cũng có phần thiếu sót rất cơ bản là sự phân tích

bằng ánh sáng không xảy ra hoàn toàn đợc và hơn thế nữa sản phẩm phân tích

do ánh sáng lumichrom và lumiflavin sẽ bị phân huỷ tiếp ở ánh sáng nh phơng

pháp sắc kí giấy đà chứng minh.

14
LuËn văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

Sau đây là các phơng pháp lí học và hoá học để định lợng riboflavin.

3.2.1. Phơng pháp lí học để định lợng riboflavin
Trong các phơng pháp lí học có thể dùng chủ yếu là các phơng pháp quang
phổ trong vùng tia tím tử ngoại và phơng pháp cực phổ để định lợng riboflavin.
3.2.1.1. Phơng pháp quang phỉ
R. Kuhn vµ đồng nghiệp là những ngời đầu tiên đà đo quang phổ hấp thụ
của riboflavin và tìm thấy trong dung dịch nớc riboflavin 4 cực đại hấp thụ, cực
đại chính trong vùng 265nm đến 267nm. C. Daglish, M. Baxter xác định r»ng
quang phỉ hÊp thơ tia tÝm tư ngo¹i cđa riboflavin phụ thuộc một cách đáng kể
vào pH, và khi xác định kết quả về định lợng cần phải đo quang phỉ cđa mÉu
chn vµ mÉu thư trong cïng mét chÊt ®Ưm nh nhau.
§Ĩ chn bị cho dung dịch riboflavin đo quang phổ, cần phải đảm bảo
điều kiện mẫu phải sấy thật khô (sấy khô trên P2O5 hay ở 1000C trong tối), đem
cân và đem hoà tan trong 1ml axit axetic kết tinh, thêm 100ml nớc nóng, thêm
nớc vừa đủ 1000ml. Pha loÃng dung dịch ®Ĩ ®o quang phỉ b»ng HCl 0,01N lµm
sao ®Ĩ cã pH khoảng 3,0. Nồng độ thích hợp để ghi quang phổ là khoảng 4mg
%. Để xác định trị số về định lợng, tốt nhất là đo ở bớc sóng cực đại 267nm.
Quang phổ hấp thụ vùng tím tử ngoại là tiêu chuẩn cần thiết của dung dịch
riboflavin tinh khiết, đợc dùng khi định lợng bằng phơng pháp sinh vật học và
phơng pháp hoá học. Sau này phơng pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại đợc
dùng coi nh một phơng pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệu
riboflavin cũng nh các dợc phẩm.
3.2.1.2. Cùc phỉ
ViƯc nghiªn cøu định lợng vitamin B2 bằng cực phổ đà bổ sung rất tốt tính
chất đặc hiệu về hoá học của nó. R.Brolica và E. Knobloch là ngời đầu tiên
nghiên cứu phơng pháp cực phổ để định lợng riboflavin và đà nghiên cøu sù phơ
thc cđa viƯc khư riboflavin vµo pH. Trong phơng pháp cực phổ các tác giả đÃ
nghiên cứu theo dõi sự khử của riboflavin thành dạng leuco trong môi trêng
kiỊm cã dïng NaHSO3. Trong m«i trêng axit dïng chÊt TiCl2.
Công tác nghiên cứu cực phổ xác nhận rằng riboflavin là một chất khử oxy
hoá thuận nghịch. Khi khử riboflavin thành một chất leucolactoflavin cũng

không làm thay đổi thế oxy hoá khử cực, do vậy nên các đờng cong cực phổ đều
là những đờng cong điện thế tơng đối hoàn chỉnh.

15
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá häc

Chuyên ngành Hoá phân tích

Trên đờng cong cùc phỉ cđa riboflavin, ngêi ta theo dâi nh÷ng bớc đầu đặc
biệt mà không thấy có ở phơng pháp điện thế. Phơng pháp cực phổ đợc coi nh
để nghiên cứu sự phân tích do ánh sáng của riboflavin. Lumiflavin ®ỵc khư ë
®iƯn thÕ gièng nh riboflavin, do vËy, hai chất này không thể định lợng cạnh
nhau đợc bằng phơng pháp cực phổ. Lumicrom bị khử trên điện cực thuỷ ngân
nhỏ giọt ở thế âm hơn riboflavin và cũng vì vậy có thể định lợng nó bằng phơng
pháp cực phổ cạnh riboflavin.

Phơng pháp cực phổ đợc dùng có hiệu quả để định lợng riboflavin trong
các dợc phẩm. Phơng pháp này không phù hợp để định lợng riboflavin trong các
nguyên liệu sinh vật học, một mặt là vì riboflavin có trong các nguyên liệu thiên
nhiên với nồng độ rất nhỏ, một mặt khác riboflavin ở đó dới dạng kết hợp, nên
phơng pháp cực phổ không cã t¸c dơng.

Khi dïng phơng pháp cực phổ để định lợng các chế phẩm dợc, vì
riboflavin ít hoà tan trong nớc, nên cần cho thêm một chất làm tăng sự hoà tan
của nó. Chẳng hạn dung dịch natri salixilat 10% làm tăng sự hoà tan của
riboflavin, sự có mặt của chất này không làm ảnh hởng đến việc định lợng
riboflavin bằng phơng pháp cực phổ.

Việc dùng phơng pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lợng
riboflavin cã trong chÕ phÈm polivitamin, trong ®ã cã thĨ tiÕn hành định lợng

thẳng hỗn hợp vitamin nhóm B còn lại. Để dịnh lợng riboflavin bằng phơng
pháp cực phổ, việc chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh là rất cần thiết. Trong thí
nghiệm dùng phơng pháp cực phổ để định lợng riboflavin một cách chính xác
và đặc hiệu nhất trong công nghiệp dợc thì dùng 100% mẫu chuẩn.

3.2.1.3. Sắc ký
Phơng pháp sắc ký có một giá trị để định lợng riboflavin trong các nguyên
liệu thiên nhiên, gồm cả phơng pháp pháp sắc ký hấp phụ, và sắc ký phân chia.
Trong đó phơng pháp sắc ký trên giấy có giá trị đặc biƯt nhÊt. F. Weygemel vµ
K. Wacker dïng frankonit lµm chÊt hấp phụ để định lợng riboflavin trong nớc
tiểu. W. Neuweiler dùng đất sét nung để định lợng trong sữa. Trong những chất
hấp phụ khác nhau còn dùng sunfua chì, floridin và một vài loại đất sét hấp phụ
khác dùng trong kü nghƯ (®Êt sÐt dïng trong kÜ nghƯ chÊt bÐo). Để định lợng
riboflavin cạnh thiamin R.T. Conner và G.J. Straub dùng sự phân chia thành 2
hệ hấp phụ, pecmutit (thiamin) vµ floridin (riboflavin). Huúnh quang mµu vµng

16
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá häc

Chuyên ngành Hoá phân tích

xanh đậm của riboflavin đợc coi nh chất phát hiện trong phơng pháp sắc kí. Để
nghiên cứu việc tìm chất flavin-ađenin nucleotit trong các tế bào động vật, J. L.
Clamen lần đầu tiên dùng kĩ thuật sắc kí giấy để làm phơng pháp phân tích
riboflavin. Sau đó phơng pháp này đợc tiếp tục để định lợng riboflavin trong các
nguyên liệu thiên nhiên dạng kết hợp khác nhau và trong các môi trờng nuôi
cấy vi trùng. Vấn đề thuận lợi là có thể theo dõi bằng phơng pháp sắc kí trên
giấy sản phẩm phân huỷ bằng ánh sáng của riboflavin, bởi vì một trong những
sản phẩm phân huỷ chính có một huỳnh quang (xanh lơ) khác riboflavin.

3.2.2. Phơng pháp định lợng riboflavin bằng huúnh quang vµ so mµu
3.2.2.1. Phơng pháp huỳnh quang
Đo huỳnh quàng màu vàng xanh của riboflavin đợc coi nh là một phơng
pháp cơ bản hay dùng nhất để định lợng chất này trong các nguyên liệu thiên
nhiên. Nồng độ của huỳnh quang phụ thuộc vào pH của dung dịch, ®é cùc ®¹i
n»m trong vïng pH 6 - 7. Huúnh quang giảm mạnh nhất ở pH dới 3,8 và pH
>7,7. Nồng độ huỳnh quang giảm khi có mặt của các halogen, xianua, rodanua,
sunfua và muối sắt. Leucolactoflavin không có huỳnh quang. Độ chính xác của
phơng pháp đo huỳnh quang dựa trên cơ sở điều kiện chiết và loại trừ các huỳnh
quang phụ có ảnh hởng khi đo.
Riboflavin có trong thiên nhiên phần lớn kết hợp với anbumin dới dạng
este của axit photphoric, và dạng này khi chiết cần phải tách ra. Phần lớn các
tác giả chiết bằng axit vô cơ loÃng (H2SO4 0,2N). Có ngời lại xác định bằng đun
nóng nguyên liệu chiết với axit photphoric hay đun nóng dới áp suất trong môi
trờng HCl 0,1N. M. L. Wagner và A.R. Kemmerer lại tiến hành thuỷ phân bằng
men enzym tatradiastaza hay bằng các photphataza khác. Thông thờng để khỏi
làm ngăn cản huỳnh quang, ngời ta thờng tiến hành oxy hoá bằng dung dịch
KMnO4 loÃng trong môi trờng axit. Lợng KMnO4 thừa đợc loại một cách nhanh
chóng bằng cách cho thêm nớc oxy già. W. Koschara là ngời đầu tiên dùng ph-
ơng pháp này. Các tác giả tiến hành chiết bằng hyđrounfit, nh vậy sẽ loại tất cả
các thành phần, và trong phơng pháp coi nh chỉ có mình lactoflavin là có tính
chất oxy hoá thuận nghịch bởi oxy không khí.
A. Emmerie trong khi hoàn thiện phơng pháp đà tiến hành bằng metanol,
hấp phụ lactoflavin kết hợp và tự do với sunfua chì và tiến hành chiết bằng dung
dịch níc pyridin trong axit axetic (níc - pyridin - axit axetic = 7,8 : 2 : 0,2).

17
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá häc

Chuyên ngành Hoá phân tích

Dịch chiết lấy đợc loại trừ các huỳnh quang phơ b»ng c¸ch oxy ho¸ víi KMnO4.
G. Luade, H. Kringstael và A. Olsen hấp phụ riboflavin từ dịch chiết với
frankomit, ngăn cản các màu phụ đi theo bằng KMnO4 và sau đó tiến hành khử
bằng hyđrosunfit. Từ huỳnh quang trớc và sau khi khử có thể tính đợc hàm lợng
riboflavin.Lactoflavin ở trong các mô động vật phần lớndới dạng kết hợp với
anbumin; chất đợc tạo nên này không phát quang, vì thế khi định lợng hàm lợng
toàn phần cần phải giải phóng riboflavin ra khỏi dạng kết hợp. Thông thờng tiến
hành chiết bằng axit, hay bằng cách đun chế phÈm trong nåi hÊp.

Khi tiÕn hµnh theo A.Z. Hudson vµ L. C. Norvise vµ tốt hơn là theo V.A.
Najjar, riboflavin đợc chuyển sang dạng khử và dạng này có thể bị oxy hoá ng-
ợc lại bằng oxy không khí trên riboflavin. Các tác giả đều xác nhận rằng các
chất màu và huỳnh quang đi theo đều không bị oxy hoá bởi oxy. Để sắp xếp
theo V. Najjar cần phải đo sự khác nhau về huỳnh quang trớc và sau khi khử.
Đồng thời chú ý ảnh hởng cuả môi trờng đối với nồng độ của huỳnh quang đo
đợc, cần phải tiến hành mẫu chuẩn.

Huỳnh quang đợc đo bằng các loại máy huỳnh quang so màu khác nhau.
3.2.2.2. Phơng pháp so màu riboflavin
Định lợng riboflavin bằng so màu là phơng pháp cũ nhất để định lợng chất
này trong các nguyên liệu thiên nhiên và dựa trên cơ sở đo cờng độ màu vàng
của dung dịch riboflavin. Phơng pháp này chỉ dùng cho một vài nguyên liệu, khi
biết là các chÊt mµu phơ rÊt Ýt, ë møc tèi thiĨu.
Việc cải tiến của các tác giả bao gồm việc chiết nguyên liệu để thử với
axeton 75% loại các chất màu phụ bằng nớc oxy gìa 30% và đo sự hấp thụ của
ánh sáng màu vàng của dung dịch trớc và sau khi khử riboflavin bằng NaHSO3.
Sau đó từ những sự hấp thụ khác nhau, ngời ta xác định đợc nồng độ của
riboflavin. F. Weygand và K. Wacker đà cải tiến để định lợng riboflavin bằng
phơng pháp so màu trong nớc tiểu. Bên cạnh sự oxy hoá, tác giả còn đề cập đến

phơng pháp sắc kí với frankomit thành dạng leuco để có thể chiết ra định lợng
đợc. Sau khi chiết lại oxy hoá một lần nữa bằng oxy không khí dạng leuco
chuyển sang riboflavin. Các chất màu phụ kèm theo đợc oxy hoá bằng KMnO4.
Tiến hành đo bằng máy quang sắc kế Pulfric với kính lọc S.45. J. Effern đÃ
nghiên cứu phơng pháp định lợng so màu đơn giản trong sữa bò và W.

18
Luận văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học

Chuyên ngành Hoá phân tích

Neuweiler đà nghiên cứu một cải tiến rất thông dụng trong lâm sàng để định l-
ợng sữa mẹ.

4. Phân tích trắc quang

4.1. Cơ sở của phơng pháp phân tích trắc quang

Phơng pháp này dựa trên sự hấp thụ năng lợng ánh sáng của một chất xác

định ở một vùng phổ nhất định. Chất phân tích đợc chuyển thành một chất màu

có khả năng hấp thụ năng lợng và hàm lợng chất phân tích đợc xác định bằng

cách đo sự hấp thụ ánh sáng của chất màu. Nh vậy, phản ứng hoá học chiếm vị

trí chủ chốt trong phân tích trắc quang. Thời gian tiến hành phân tích, độ nhạy,

độ chính xác và tính chọn lọc của phơng pháp phụ thuộc chủ yếu vào việc lựa

chọn phản ứng hoá học và các điều kiện tối u để tạo thành chất màu.

Phơng pháp phân tích trắc quang gắn liền với các hợp chất màu, dùng màu

sắc để phân tích đối tợng nghiên cứu. Nó đợc tiến hành theo c¸c bíc sau:

+ Đa đối tợng nghiên cứu vào dung dịch.

+ Tạo hợp chất màu với thuốc thử thích hợp (nếu chất nghiên cứu không

phải là chất màu).

+ Chọn các điều kiện tối u để phép đo đợc chính xác.

+ Mật độ quang (xác định cờng độ chất màu nghiên cứu).

+ Đánh giá kết quả phân tích (tính nồng độ và nhận xét).

Cơ sở của phơng pháp này là dựa vào định luật hÊp thơ ¸nh s¸ng cđa

Bughe - Lambe - Bia.

Biểu thức định lợng: D = .l.C

Trong ®ã: D - mËt ®é quang của dung dịch nghiên cứu tìm đợc trên máy so

mµu.

D = lg(I0/ngµy.I)

I0 - cờng độ dòng sáng tới; I - cờng độ dòng sáng sau khi bị hấp thụ.

- hệ số hấp thụ phân tử gam (phụ thuộc bản chất của chất màu.

C - Nồng độ của dung dịch nghiên cứu.

l - bề dày của dung dịch màu.

Nh vậy, để xác định C ta phải đo mật độ quang trên máy. Tuy nhiên, khi

phân tích trắc quang phải chú ý đến các yếu tố làm sai định luật Bughe - Lambe

- Bia và khoảng nồng độ cđa nã phơ thc tun tÝnh.

19
LuËn văn tốt nghiệp cử nhân s phạm ngành Hoá học