bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân tím (amomum longiligulare t.l.wu)

1

MỞ ðẦU

Cây thuốc Việt Nam rất phong phú và ña dạng. Việc sử dụng nguồn tài
nguyên quý giá này ñể phòng ngừa chữa bệnh và nâng cao sức khỏe cho con
người ñã có một quá trình lịch sử hàng ngàn năm và ngày càng ñược chú ý
quan tâm hơn trong xã hội hiện ñại.
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ñang phát triển rất mạnh và dần
trở thành một ngành sản xuất mang hiệu quả kinh tế cao. Công nghệ này ñã
giúp tạo ra ñược một số lượng lớn cây trồng ñồng nhất trong một thời gian
ngắn, duy trì các tính trạng tốt từ thế hệ này sang thế hệ khác. Thực chất, nuôi
cấy mô tế bào thực vật là một bước tiến bộ vượt bậc về chất của các phương
pháp nhân giống vô tính cổ ñiển như giâm cành, chiết, ghép, tách dòng… Nói
cách khác, nuôi cấy mô ñã biến những phương pháp cổ ñiển ñó thành những
phương thức hoàn toàn mới về chất mà phương pháp cổ ñiển không thể vượt
qua [10].
Trong những năm gần ñây, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
ñã áp dụng thành công cho nhiều loại cây. ðối với những loại cây trồng có giá
trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô ñã ñem lại những hiệu quả kinh tế
hết sức rõ rệt. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học có nhiều
triển vọng, ñược ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế.
Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc họ Gừng
(Zinggiberaceae) chi Amomum, là một loại dược liệu rất quý, chuyên trị các
bệnh ñường ruột, kém tiêu hóa và dung làm gia vị, hương liệu. Sa nhân ñược
dùng nhiều trong nước và ñược xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Sa nhân là loại thuốc quý ñược sử dụng nhiều trong y học phương
ðông, bao gồm cả Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Triều tiên và một số
quốc gia khác. Hạt sa nhân còn ñược dùng làm gia vị, tinh dầu hạt sa nhân
2

cũng ñược dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm ñể sản xuất nước hoa, dầu gội ñầu và
xà phòng thơm.
Sa nhân tím phân bố chủ yếu ở vùng Tây Nguyên và một số tỉnh thuộc
khu vực duyên hải Nam Trung Bộ, là một loại cây ưa bóng và mọc xen giữa
nhiều cây khác. Sa nhân trong tự nhiên phát triển rất mạnh. Mỗi năm cứ ñến
vụ người ta lại vào rừng hái quả sa nhân ñem di bán. Với giá 8.000 – 10.000
ñ/kg quả sa nhân tươi, sau khi phơi là 150.000 – 200.000 ñ/kg quả khô thì sau
trồng 2 năm ñã cho thu nhập 6 – 8 triệu ñồng/ha và những năm tiếp theo còn
cao hơn [15].
Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp do nạn phá
rừng, do triệt hạ rừng tự nhiên ñể mở rộng diện tích sản xuất nông nghiệp
như: trồng rừng cao su, trồng rừng keo, trồng sắn ñã làm thu hẹp phân bố
của cây sa nhân, làm giảm trầm trọng năng suất, sản lượng hằng năm, ảnh
hưởng nghiêm trọng ñến kinh tế và ñời sống của hộ gia ñình vùng núi.
Trước thực trạng ñó nếu chúng ta không kịp thời khoanh vùng, bảo vệ,
trồng mới và có những biện pháp tích cực thì nguồn gen quý giá này cũng dần
bị mất ñi.
Nhân giống sa nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra ñược một
sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục ñược
những khó khăn trong việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp cây giống, giúp cho
người dân chủ ñộng ñược mùa vụ không phải mất diện tích trồng cũng như
chi phí lưu trữ giống. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hàh dề tài
: " Bước ñầu nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân tím (Amomum
longiligulare T.L.Wu).





3

Phần 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. NHÂN GIỐNG INVITRO THỰC VẬT
1.1.1. Lược sử phát triển và tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.1.1. Lược sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi
và ñưa ra khái niệm "tế bào - Cell". Năm 1838, Matthias Schleiden và
Theodore Schwann ñề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học
thuyết tế bào:
+ Mọi cơ thể sống ñược cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là ñơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình
thức nhỏ
nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ ñược tạo ra từ tế bào tồn tại trước ñó [5].
Năm 1902, Haberlandt lần ñầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá
mầm nhưng không thành công. Năm 1934, Kogl lần ñầu tiên xác ñịnh ñược
vai trò của IAA, hoocmon thực vật ñầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng
kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học
Gautheret, Nobecourt và White ñã ñồng thời nuôi cấy callus thành công trong
thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, callus có
khả năng sinh trưởng liên tục. Năm 1941, Overbeek và cs ñã sử dụng nước
dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1955, Miller và cs ñã
phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin ñóng vai trò
quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. ðến năm 1957,
Skoog và Miller ñã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng ñộ các chất
auxin/cytokinin trong môi trường ñối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng ñộ IAA/ nồng ñộ kinetin) nhỏ hơn 1

và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi tỷ lệ IAA/kinetin lớn
4

hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng ñộ auxin và cytokinin
thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh [10], [18].
Năm 1949, Limmasets và Cornuet ñã phát hiện rằng virus phân bố
không ñồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng ñỉnh sinh
trưởng. Năm 1952, Morel và Martin ñã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6
giống khoai tây từ nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với
một số cải tiến ñã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus ñược dùng
rộng rãi ñối với nhiều loài cây trồng khác nhau. Năm 1952, Morel và Martin
lần ñầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Kỹ thuật vi ghép sau ñó ñã
ñược ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự
virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng
phương pháp vô tính khác nhau, ñặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh.
Năm 1960, Morel ñã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật
nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại ñịa lan Cymbidium, mở
ñầu công nghiệp vi nhân giống thực vật [18].
Năm 1960, Cocking lần ñầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế
bào và ñã tạo ra số lượng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau ñó ñã ñược hoàn
thiện ñể tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. Năm 1971,
Takebe và cs ñã tái sinh ñược cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell) ở
thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần ñầu tiên thực hiện lai tế bào soma
giữa các loài, tạo ñược cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá
Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo ñược cây
lai soma "cà chua - thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. ðến nay,
việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần ñã thành
công ở nhiều loài thực vật [17].
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần ñầu tiên thành công trong tạo ñược
cây ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau ñó ñã

ñược nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng ñơn bội, dòng
thuần nhị bội kép, cố ñịnh ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng
lai F1 ñể tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai) [18], [19].
Năm 1959, Tulecke và Nickell ñã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô
5

thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs
ñã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20.000 lít. Năm
1978, Tabata và cs ñã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ
sản xuất shikonin. Họ ñã chọn lọc ñược dòng tế bào cho sản lượng các sản
phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, Flores và Filner lần ñầu tiên
sản xuất chất trao ñổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus.
Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện
nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các
bioreactor dung tích lớn ñã ñược thương mại hoá ở mức công nghiệp ñể sản
xuất sinh dược [18], [19].
Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong
nuôi cấy mô và tế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và
Scowcroft ñã ñưa ra thuật ngữ "biến dị dòng soma" (somaclonal variation)
ñể chỉ các thay ñổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in
vitro. Từ các dòng tế bào hoặc cây biến dị di truyền ổn ñịnh có thể nhân
nhanh, tạo ra các dòng và giống ñột biến có năng suất, hàm lượng hoạt chất
hữu ích cao, kháng một số các ñiều kiện bất lợi như bệnh, mặn, hạn,… [18].
ðến nay các nhà khoa học ñã khẳng ñịnh rằng mức ñộ thành công của
chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái
sinh tế bào thành cây in vitro sau chuyển gen. Năm 1974, Zaenen và cs ñã
phát hiện plasmid Ti ñóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall) ở cây trồng.
Năm 1977, Chilton và cs ñã chuyển thành công T- DNA vào thực vật. Năm
1979, Marton và cs ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng
ñồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Năm 1982, Krens ñã chyển

thành công DNA vào tế bào trần. Năm 1985, Fraley và cs thiết kế vector
plasmid Ti ñã loại bỏ các gen ñộc gây hại ñể sử dụng cho việc thiết kế vector
chuyển gen vào thực vật. Cùng trong năm, Horsch và cs ñã chuyển gen vào
mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen. An và
cs (1985) ñã phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật. Năm
6

1987, Klein và cs ñã sử dụng súng bắn gen (particle gun) mang vi ñạn trong
chuyển gen và tái sinh ñược cây biểu hiện gen chuyển. Năm 1994, thương
mại hoá giống cà chua chuyển gen 'FlavrSavr' [19].

1.1.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã phát triển mạnh
mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói ñây là một công cụ cần thiết trong
nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học.
Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh,
callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người ñã
thúc ñẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc ñộ vốn có trong tự
nhiên. ðiều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các
tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian ñể ñưa một giống
mới và sản xuất với quy mô lớn [11], [19].
Ngoài ra, dựa vào kĩ thuậ nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản ñược
nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài
thực vật sinh sản sinh dưỡng. Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào
trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp lai giống
cổ ñiển không thực hiện ñược. Bên cạnh ñó, các nhà nghiên cứu ñã thu nhận
các chất trao ñổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn ñến sự ổn ñịnh và ñộc lập
hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên " mở ra triển vọng
sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những
chất sinh học ñể thu nhận các hợp chất trên quy mô công nghiệp " [9].

Ưu ñiểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong ñiều kiện in vitro ñể
sản xuất các hợp chất thứ cấp:
+ Các tế bào thực vật có thể ñược nuôi cấy trong ñiều kiện nhân tạo
mà không phụ thuộc vào thời tiết và ñịa lý. Không cần thiết ñể vận chuyển và
bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
+ Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ
những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của
7

nguyên liệu thô, sự ñồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá
trình vận chuyển và bảo quản.
+ Một số sản phẩm trao ñổi chất ñược sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền
phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [11].
Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực
vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật
như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – ñột biến, sinh lý
dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn ñề sinh học khác…[19].

1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy
1.2.1.1. Vai trò của chất kích thích sinh trưởng thực vật
Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia
quan trọng nhất quyết ñịnh kết quả nuôi cấy là chất kích thích sinh trưởng.
Chất kích thích sinh trưởng thực vật là những chất ở nồng ñộ sinh lý có tác
dụng kích thích các quá trình sinh trưởng của mô. Tuy vậy, yêu cầu ñối với
những chất này thay ñổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ñiều
hòa sinh trưởng nội sinh của chúng.
* Auxin
Môi trường nuôi cấy ñược bổ sung các auxin khác nhau như: IAA,
NAA, IBA, 2,4-D, NOA. Trong ñó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực
vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các

auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do ñặc ñiểm phân tử của chúng nên
các enzyme oxy hóa auxin (auxin oxydase) không có tác dụng [10].
Năm 1934, Kogl ñã tách ra một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt tính
tương tự chất sinh trưởng và năm 1935 Thiman cũng tách ñược chất này từ
nấm rhyzopus. Sau ñó người ta chiết tách ñược auxin từ các loại thực vật khác
nhau (Hagen Sminth, 1941,1942, 1946 ) và ñã xác ñịnh bản chất hóa học của
nó là 1H- indole-3-acetic acid (IAA). Người ta ñã khẳng ñịnh rằng IAA là
8

dạng auxin chủ yếu, quan trọng nhất của tất cả các loại thực vật, kể cả thực
vật bậc thấp và thực vật bậc cao [13].
ðặc ñiểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào. Các
hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân,
lóng (gióng), tính hướng (sáng, ñất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa
mạch dẫn [5], [10].
Auxin là nhóm chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược sử dụng thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần khác của môi trường dinh dưỡng ñể kích thích sự tăng trưởng của
mô sẹo, huyền phù tế bào và ñiều hòa sự phát sinh hình thái, ñặc biệt là khi nó
ñược phối hợp sử dụng với các cytokinin [5].
ðối với nuôi cấy mô, auxin ñã ñược sử dụng cho việc phân chia tế bào
và phân hóa rễ. Những auxin ñược dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA,
IAA, NAA, 2,4-D và 2,4,5-T. Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử
dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường
ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả ñối với môi trường tạo và phát triển
callus. Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH loãng.
* Cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, ñây là những hormone liên quan
chủ yếu ñến sự phân chia tế bào, sự thay ñổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi
trong nuôi cấy mô. Các cytokinin ñược sử dụng thường xuyên nhất là 6-

benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-
aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-
(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là
các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói
chung, chúng ñược hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng.
Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong
môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa
9

chồi từ callus hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh
chồi phụ.
Kinetin ñược phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau
khi khử trùng ở nhiệt ñộ cao hay ñun sôi. Kinetin không tồn tại trong cơ thể
sống, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy,
nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng ñộ thích hợp thì sẽ kích
thích quá trình phân chia tế bào ở các mô không phân hóa.
Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền
vững hơn zeatin dưới tác ñộng của nhiệt ñộ cao. BAP có khả năng làm tăng
hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm,
kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao ñổi chất.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng ñối với sự phát sinh hình thái
(morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy. ðối với sự phát sinh phôi
(embryogenesis), ñể tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong
khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn ñến sự sinh sản chồi và chồi nách. Vấn ñề
quan trọng không kém là nồng ñộ của hai nhóm chất ñiều khiển sinh trưởng
này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng ñộ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành
callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng ñộ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo
chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 [10], [13].

1.2.1.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính (AC) vào môi trường nuôi cấy ñã kích thích
sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, cà rốt, dây thường xuân và cà
chua. Ngược lại, nó gây ức chế ở thuốc lá, ñậu tương và các loài thuộc chi
Camellia. Nói chung AC ñược rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở
nồng ñộ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy. AC cũng giúp làm giảm ñộc tố
bằng cách ñào thải các hợp chất ñộc (ví dụ: phenol) ñược tạo ra trong quá
trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì.
10

Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự
hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất ñiều hòa sinh
trưởng có trong môi trường. NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với than
hoạt tính. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết
hợp với các hợp chất phenol ñộc tiết ra trong thời gian nuôi cấy [12].

1.2. VÀI NÉT VỀ SA NHÂN TÍM
1.2.1. ðặc ñiểm thực vật
Sa nhân tím hay sa nhân (Amomum Longgiligulare T. L.Wu) còn có
tên ñịa phương là : Mắc néng, Mè tré bà, Dương xuân sa, Mắc nẻng, Sa
ngần, Pa ñooc, La vê…

1.2.1.1. Hình thái
Sa nhân, cây thân thảo cao 1,5 - 2,5m. Thân trên mặt ñất (thân kí sinh)
hình trụ, ñường kính 0,7 – 1,0 cm, nhẵn. Sa nhân sinh sản bằng thân ngầm
bò ngang dưới mặt ñất, mang vẩy và rễ phụ. Từ thân ngầm mọc lên các
thân kí sinh, quả mọc từ gốc cây mẹ. Thân ngầm mọc bò ngang trên mặt
ñất, gồm nhiều ñốt, ñường kính 0,6 - 0,8 cm, bao bọc bởi các lá vảy màu nâu.
Lá mọc so le, xếp thành 2 dãy, mọc xiên hướng lên phía trên. Lá gần như
không có cuống, mọc so le, xếp thành hai dãy. Phiến lá hình elip dài 20 – 40
cm, rộng 5 - 8 cm, gốc lá hình nêm, mặt trên màu lục ñậm, mặt dưới nhạt

hơn, nhẵn, cuống lá dạng bẹ, dài 5 – 10 cm hoặc hơn. Lưỡi bẹ nhỏ, hình
mác nhọn dài 1,5 – 4,0 cm, màu nâu nhạt hoặc xám trắng, mỏng.
Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc; cuống cụm hoa dài 3 – 6
cm, gồm nhiều ñốt, có vảy màu nâu. Có 5 – 8 hoa trên một cụm, màu trắng;
cuống hoa rất ngắn. Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 – 2,5 cm,
rộng 0,8 cm, mép nguyên; lá bắc trong dạng ống, màu nâu nhạt, dài
1,5cm, ñầu chia thành 2 thuỳ nông. ðài hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn,
màu trắng hồng, ñầu xẻ 3 thuỳ. Tràng hoa hình ống, dài 1,6 – 1,7 cm, mặt
11

ngoài có lông thưa, gồm 3 thuỳ, thuỳ giữa dài 1,6 cm, rộng 0,4 cm, lớn hơn
2 thuỳ bên. Cánh môi hình thìa, dài 1,7 - 1,8 cm, rộng 2,0 – 2,2 cm, ñầu
cánh môi thường cuộn ra phía sau; vệt giữa cánh môi màu vàng, kéo dài lên
ñến ñầu cánh môi, có 3 sọc tím hồng. Bộ nhị dạng bản, dài 0,6 – 0,7 cm,
rộng 0,3 cm, nhẵn; bao phấn 2 ô; trung ñới có mào, chia thành 3 thuỳ. Bầu
hình trứng thuôn, dài 0,4 – 0,5 cm; vòi nhuỵ mảnh (dạng chỉ) dài 2,0 – 2,5
cm; ñầu nhuỵ dạng phễu.
Quả dạng quả nang, hình trứng hay gần hình cầu, dài 1,3 – 1,6 cm,
ñường kính 1,2 – 1,3 cm; chia thành 3 múi nông; vỏ ngoài có gai ngắn, dày;
màu tím nâu; khi già gai ngắn bớt và chuyển sang màu tím ñen. Hạt nhiều gồm từ
13 – 28 hạt xếp thành 3 ô, có áo hạt màu trắng, vị hơi ngọt. Hạt hình ña cạnh,
màu nâu ñen, cắn vỡ có vị cay, mùi thơm của tinh dầu [3], [4].

1.1.1.2. Phân bố
Ở Việt Nam sa nhân chủ yếu mọc ở các tỉnh phía Nam: Quảng
Nam (huyện Trà My Tây); Quảng Ngãi (các huyện Sơn Hà, Sơn Tây, Ba Tơ);
Bình ðịnh (các huyện Vĩnh Thạnh, Tây Sơn); Phú Yên (các huyện Sơn Hoà,
Sông Hinh); Ninh Thuận (các huyện Ninh Sơn, Bắc Ái); Kon Tum (các
huyện Ngọc Hồi, Sa Thày); Gia Lai (các huyện K’Bang, An Khê); ðắk
Lắk (các huyện Krông Năng, Krông Ana, M' ðrắk, Krông Bông, Lắk). Ở

miền Bắc mới chỉ phát hiện thấy mọc tự nhiên tại một ñiểm thuộc tỉnh
Thanh Hoá và có thể có ở cả Phú Thọ và Hoà Bình.
Trên thế giới sa nhân có ở Trung Quốc (Hải Nam) và Lào [2].

1.2.2. ðặc ñiểm sinh lý, sinh thái
1.2.2.1. Sinh thái
* ðặc ñiểm sinh thái chung của cây sa nhân tím: Cây ưa ẩm, hơi ưa
sáng và chịu bóng. Thường mọc tụ tập thành ñám dày ñặc trên ñất ẩm ở
ven rừng kín thường xanh còn nguyên sinh hay ñã trở nên thứ sinh; ven bờ
12

các khe suối hay trên các nương rẫy thấp ñã bỏ hoang, liền kề với rừng.
Sa nhân tím mọc tự nhiên trong các quần xã thứ sinh kể trên ở các
tỉnh phía Nam, thường có ñộ tàn che từ 10 – 60%; ñộ cao dưới 600 m. Thuộc
vùng có khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm; nhiệt ñộ trung bình
khoảng hơn 23
o
C; lượng mưa từ gần 1.600 ñến 3.300 mm/năm; ñộ ẩm
không khí trung bình trên 80%.
Cây sinh trưởng phát triển gần như quanh năm, nhưng mạnh nhất vào
mùa mưa ẩm. Sa nhân tím ra hoa quả ñều hàng năm. Tái sinh tự nhiên chủ
yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ.
Sa nhân tím là cây có biên ñộ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể trồng
ñược ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp ñến trung du và cả
ở ñồng bằng.
* ðiều kiện sinh thái
- Khí hậu: Nhìn chung các loài sa nhân (trong ñó có sa nhân tím) chỉ
thấy ở vùng có khí hậu nhiệt ñới, chủ yếu ở Châu Á.
Theo cách phân chia tiểu vùng khí hậu theo quan ñiểm ñịa lý thực vật
thì sa nhân tím mọc tự nhiên ở Việt Nam (chủ yếu ở các tỉnh phía Nam)

nằm trong khu vực nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm, với hai mùa mưa và khô
khá rõ rệt. Mùa mưa tập trung vào vụ hè hay vụ hè – thu, mùa khô ở các
ñiểm có sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía Nam thường trùng
với các tháng là mùa ñông và xuân ngoài miền Bắc. Trong tổng số 4 –
5 tháng mùa khô ñó, có 2 – 3 tháng hoàn toàn không có mưa, nhưng do
sống trong môi trường rừng ẩm, Sa nhân tím vẫn sinh trưởng phát triển
tốt. ðặc biệt là vụ hoa cuối tháng 3 ñầu tháng 4, do không bị mưa, trời
luôn có nắng nên tỷ lệ ñậu quả của cây khá cao.
Từ năm 1992 ñến nay, sa nhân tím ñã ñược thu thập ñưa ra trồng ở
một số ñịa phương ở các tỉnh phía Bắc (Tân Lạc – Hoà Bình, Chân Mộng
- ðoan Hùng – Phú Thọ, huyện Bảo Thắng và thị xã Lào Cai – Lào Cai,
ðại Từ – Thái Nguyên). Mặc dù cây ñược trồng ở môi trường khí hậu –
13

thời tiết hơi khác với nơi mọc tự nhiên, nhưng sa nhân tím vẫn sinh
trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều.
ðặc trưng khí hậu ở những ñịa ñiểm trồng sa nhân tím kể trên là: Khí
hậu nhiệt ñới gió mùa nóng ẩm, có mùa ñông lạnh, mưa tập trung vào
mùa hè – thu và mỗi năm cũng có 1 – 2 tháng ñược coi là khô hạn. Tuy
nhiên mức ñộ khô hạn ở ñây không ñến mức cực ñoan như ở các tỉnh
phía Nam.
Tóm lại, ñặc ñiểm cơ bản về khí hậu ñối với sa nhân tím là nền khí
hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm, nhiệt ñộ trung bình năm vào khoảng trên
23
o
C. Cây ñem trồng ở các tỉnh phía Bắc mặc dù có mùa ñông lạnh trương
ñối kéo dài, nhưng vẫn sinh trưởng phát triển tốt. ðiều ñó chứng tỏ, sa nhân
tím có khả năng thích nghi khá cao với ñiều kiện thời tiết ở các vùng tiểu khí
hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm tại Việt Nam.
* Thổ nhưỡng ñất ñai: Sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía

Nam nhìn chung là ở trên loại ñất nâu - ñỏ phát triển trên bazan hoặc nâu
ñỏ phát triển trên bazan có mùn tích tụ ở chân núi (K’Bang – Gia Lai,
Vĩnh Thạch – Bình ðịnh, Sơn Hoà - Phú Yên…). ðặc ñiểm chung của loại
ñất này là có tầng ñất mặt sâu, tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước.
Tuy nhiên, sa nhân tím là cây thường mọc ở chỗ ñất thấp (ven rừng, thung
lũng, gần hành lang ven suối), nên ở ñây loại ñất nâu - ñỏ bazan kể trên ít
nhiều ñã có sự thay ñổi, do quá trình thường xuyên ñược tích luỹ thêm bởi
lớp thảm mục nên ở tầng ñất mặt có màu nâu xám và nâu ñen. Hàm lượng
mùn và lân tổng số khá cao, nhưng kali lại thấp.
Sa nhân tím trồng ở Tân Lạc – Hoà Bình; Chân Mộng – ðoan Hùng –
Phú Thọ; Quân Chu - ðại Từ – Thái Nguyên; ngoại ô thị xã Lào Cai – Lào
Cai… loại ñất ở ñây thuộc nhóm feralit vàng – ñỏ hay ñỏ – vàng. Về cấu
tượng

cơ bản cũng có tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước, dễ bị rửa trôi
như loại ñất ñỏ – nâu hay nâu - ñỏ trên bazan. Song ñiểm khác biệt cơ bản
của các loại ñất ở các ñiểm kể trên thường nghèo về mặt dinh dưỡng, với
14

hàm lượng mùn, kali và lân tổng số thấp hơn (khoảng 30%) so với ñất nâu -
ñỏ hay ñỏ – nâu trên bazan.
Ngoài ra, sa nhân tím ñem trồng thí nghiệm trên ñất phù sa sông Hồng
(Vườn Trung tâm NC Lâm ðặc Sản và Trung tâm Cây thuốc Hà Nội ở Thanh
Trì - thuộc Viện Dược liệu), cây vẫn sinh trưởng phát triển bình thường và ra
hoa kết quả nhiều. ðiều ñó chứng minh, sa nhân tím cũng có khả năng thích
nghi cao ñối với một số loại ñất có quá trình lập ñịa khác nhau [16], [2].

1.2.2.2. Sinh lý
* Nhu cầu nước và ñộ ẩm: Nước và ñộ ẩm không khí là một nhân tố
sinh thái quan trọng ñối với quá trình sinh trưởng phát triển của cây sa

nhân tím. Nhờ có nước, rễ sa nhân tím mới hấp thụ ñược các chất hữu cơ và
chất khoáng hoà tan trong nước ñể thực hiện quá trình ñồng hoá. Trong
những tháng mùa khô ở các tỉnh phía Nam, cây sa nhân mọc tự nhiên ở
rừng vẫn thực hiện thoát hơi nước ñể mát lá và sinh trưởng phát triển tốt là
do nước ngầm và ñộ ẩm trong không khí từ quần xã rừng cung cấp.
Nhu cầu nước ñối với cây sa nhân khi mới trồng là rất quan trọng.
Nước tưới sẽ làm cho ñất ở gốc ñược lèn chặt hơn (so với không tưới). Mặt
khác, nước làm cho ñất ẩm, duy trì cho các nhánh Sa nhân tím luôn ñược
tươi, tạo ñiều kiện ra rễ và mọc chồi. Sau khi cây sa nhân tím ñã mọc và cho
ñến suốt quá trình sinh trưởng về sau, mặc dù không cần tưới, nhưng do có
hệ thống rễ chùm phát triển rất mạnh nên có khả năng hút ñược nhiều nước
ngầm trong ñất. ðặc biệt khi sa nhân tím ñã phát triển thành thảm dày ñặc
(sau 2 năm tuổi), chúng còn có khả năng giữ nước cho ñất.
Tuy nhiên, cây sa nhân tím không chịu ñược ngập úng lâu ngày. Vào
thời kỳ ra hoa, nếu gặp trời mưa sẽ ảnh hưởng tới khả năng thụ phấn và
tỷ lệ kết quả. ðiều ñó có thể giải thích một phần tại sao vụ hoa tháng 4 – 5
thu ñược nhiều quả gấp 4 lần so với vụ hoa tháng 7 – 8 có mưa nhiều (cây
trồng ở các tỉnh miền Bắc).
15

* Nhu cầu ánh sáng: Ánh sáng ñối với sa nhân tím cũng là một
nhân tố sinh thái cần và ñủ. Có ánh sáng cây mới thực hiện ñược quá
trình quang hợp và ñồng hoá. Trong môi trường tự nhiên, sa nhân tím
thường mọc xen dưới tán những cây bụi và cây gỗ, với ñộ tàn che từ 10 –
60%; thậm chí có chỗ tới 70%. Tuy nhiên, ở ñộ tàn che trên 40% cây
sinh trưởng mạnh về chiều cao.
Ánh sáng là nhân tố cần thiết của cây. Song với ñộ tán che từ 10 –
20% (hoặc 30%) có lẽ là thích hợp nhất cho sa nhân tím sinh trưởng phát
triển mạnh. Trong trường hợp có những ñám sa nhân tím mọc dày ñặc,
không có cây che bóng trực tiếp mà vẫn sinh trưởng phát triển tốt là do ở

xung quanh ñó (ở ñường biên) có những cây gỗ hay cây bụi. Vấn ñề quan
trọng nhất ở ñây chính là môi trường ñất còn ñủ ẩm. Vì thế chưa bao giờ
thấy sa nhân tím xuất hiện ở những nơi ñất khô cằn.
* Nhu cầu về dinh dưỡng khoáng: Cây sa nhân tím mọc tự nhiên
cũng như trồng ñều cần các chất hữu cơ và chất khoáng ñể cho cây sinh
trưởng và phát triển. Những chất này là do lớp thảm mục và các sản
phẩm thứ cấp từ ñộng vật rừng cung cấp.
Vấn ñề này còn phụ thuộc vào các nhân tố khác,
nhưng chắc chắn nhu cầu
lân (P
2
O
5
) là quan trọng ñối với
quá trình ñậu quả và cho quả có hạt chắc. Sa
nhân là cây trồng lấy quả, bởi vậy trong quá trình chăm sóc cần chú ý cung cấp
thêm các chất hữu cơ, chất khoáng trong ñó không thể thiếu phân lân [16], [2].

1.2.3. Bộ phận dùng và giá trị
1.2.3.1. Bộ phận dùng và tiêu chuẩn chất lượng
* Bộ phận dùng: Là quả già ñã phơi hay sấy khô, bóc ra lấy nguyên
khối hạt. Hạt rời ra cũng ñược sử dụng.
* Tiêu chuẩn chất lượng: Theo Qui ñịnh của Dược ðiển Việt
Nam (2002):
- Hạt khô còn nguyên cả khối, hình trứng hay hình gần tròn, màu nâu
16

ñen. Tỷ lệ hạt rời ra dưới 10%. ðộ ẩm còn lại dưới 14%.
- Quan sát từng hạt rời riêng rẽ thấy bề mặt hạt nhẵn (nếu hạt lấy từ quả
non sẽ có bề mặt nhăn nheo), màu nâu ñen; có vị cay, mùi thơm của tinh dầu.

- Hàm lượng tinh dầu trong hạt ñạt tỷ lệ trên 1,5%.
* Thành phần hoá học: Trong hạt sa nhân tím có thành phần
chủ yếu là tinh dầu, với hàm lượng trên 1,9%. Phân tích tinh dầu ñã
xác ñịnh ñược 13 hợp chất khác nhau. ðó là: camphor (37,4% trong tinh
dầu), bonyl acetat (36,1%), camphen

(7,4%), borneol (6,4%), limonen
(6,3%),
α
- pinen (2,3%),
β
- myrcen (1,6%), linalool (0,7%),
α
-phellandren
(0,3%), p-cymen (0,2%),
β
- pinen (0,1%),
α
-thujene (vết),
β
-
caryophylen (vết) [14].

1.2.3.2. Giá trị
* Giá trị kinh tế: Sa nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng trong
nước và xuất khẩu cao. Hàng năm, từ nguồn sa nhân mọc tự nhiên ở Việt
Nam ñã khai thác thu mua ñược khoảng 100-300 tấn (quả khô) sử dụng
trong nước và vài trăm tấn xuất khẩu.
Giá thu mua sa nhân tại chỗ trung bình từ 30.000 ñ ñến 40.000
ñ/kg quả khô (cả vỏ). Giá xuất khẩu 90.000 ñ ñến 120.000 ñ/ kg khô (

7/năm 2006) [16].
* Tác dụng dược lý: Tinh dầu sa nhân (các loài trên) có tác dụng ức
chế hoạt ñộng của các loại vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides,
Dipcoccus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Protues vulgaris,
Shigella dysenteriae, Salmonella typhi; diệt amíp trên Entamoeba
moshkowskii với nồng ñộ ức chế thấp. Ngoài ra, sa nhân còn có tác dụng
làm hạ sốt.
Theo quan niệm của y học cổ truyền (Lính nam bản thảo của Hải
Thượng Lãn Ông thế kỷ 18), sa nhân có vị cay, mùi thơm, tính ấm; tác
dụng vào 3 kinh thận, tỳ, vị; tác dụng ôn trung, hành khí, chỉ thống, khai
vị, tiêu thực, an thai.
17

* Công dụng làm thuốc: Sa nhân ñược sử dụng nhiều ñể làm thuốc
trong y học cổ truyền, nhằm kích thích tiêu hoá; chữa ăn uống
không tiêu, bị nôn mửa, ñau dạ dày, ñau bụng do lạnh, ỉa chảy, kiết lỵ, sẩy
thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu…
Lượng dùng 3 – 6 gam một ngày và thường phối hợp với các vị
thuốc khác. Hiện ñã thống kê ñược khoảng 60 bài thuốc khác nhau có sử
dụng sa nhân.
Ngoài ra, hạt sa nhân còn ñược dùng làm gia vị. Tinh dầu sa nhân
dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [3], [4].

1.3. NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ CÂY HỌ GỪNG

1.3.1 Chi Amomum
Chi Amomum là một chi có số lượng loài lớn trong họ Gừng. Chi này
có rất nhiều loài có giá trị kinh tế cao, cũng như giá trị chữa bệnh Vì vậy,
ñây là ñối tượng ñược nhiều nhà khoa học quan tâm.
Kỹ thuật vi nhân giống có thể ñược sử dụng như một phương tiện có

thể ñể khắc phục những vấn ñề của tình trạng thiếu nguyên liệu trồng.
Chồi nách ñã ñược Wondyifraw Tefera và Surawit Wannakrairoj (2004
) sử dụng trong vi nhân giống Amomum krervanh Pierre ex Gagnep. Chồi
nách ñược tách ra và khử trùng bề mặt sau ñó cấy trên môi trường MS cơ bản
không có chất ñiều hòa sinh trưởng trước khi cấy trên MS, 1/2 MS, MS với
1/2 nitrogen. Từ kết quả nghiên cứu của mình, Wondyifraw Tefera và Surawit
Wannakrairoj kết luận rằng: hệ số nhân chồi cao nhất ñã thu ñược trên môi
trường MS. Khi bổ sung 0, 5, 10, 15 và 20% v/v dừa nước (CW), nhận thấy
rằng 5% CW là tốt nhất cho sự tăng trưởng và phát triển chồi, về số lượng
chồi, cũng như trọng lượng tươi và khô. Tác ñộng của 0, 2 và 4 mg / l imazalil
(IMA) ñã ñược nghiên cứu ñồng thời kết trong hợp với 0,0.1, và 0.5 mg l / 6-
benzyladenine (BA) hoặc thidiazuron (TDZ). Môi trường tốt nhất ñể chồi sinh
trưởng và phát triển là với 2 mg/l IMA và 0,5 mg/l TDZ. Rễ ñược hình thành
18

tương ñối dễ khi sử dụng môi trường MS không có chất ñiều hòa sinh trưởng.
Cây con in vitro có ñầy ñủ rễ ñược huấn luyện thích nghi trên ñất với tỷ lệ
thành công hơn 90% [26].
1.3.2 Chi Alpinia
Khi nghiên cứu về cây riềng (Alpinia galanga Willd) M. Borthakur, J.
Hazarika & R.S. Singh (1999) nhận thấy chồi mới nảy của thân rễ tạo ra các
chồi và rễ ñồng thời khi nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung kinetin 3,0
mg / l. Mỗi chồi thí nghiệm tạo ra trung bình 8 chồi và rễ ñồng thời trong
vòng 8 tuần. Cây con tái sinh chuyển ra ñất thành công, chúng phát triển tốt
trong vòng 10-12 tuần với tỷ lệ sống sót 80% [21].
Chinnasamy Selvakkumar và cs (2007) ñã nghiên cứu sự nhân chồi
chồi in vitro cây riềng tía (Alpinia purpurata). Những chồi có nguồn gốc từ
thân rễ khi ñược cấy trên Murashige và Skoog bổ sung riêng lẽ hay kết hợp
chất kích thích sinh trưởng. Cụm chồi lớn nhất ñã ñược quan sát thấy trên môi
trường MS có chứa 3% (w/v) sucrose và 3,0 mg/l kinetin và 1,0 mg/l NAA.

Mỗi thân rễ hình thành trung bình 11 chồi/mẫu. Chồi ñược cảm ứng rễ trên
môi trường 1/2 MS. Kết quả cho thấy rằng 0,5 mg/l IBA là phù hợp hơn cho
cảm ứng rễ so với IAA và NAA. Cây con in vitro khỏe mạnh ñược chuyển ra
cho chậu có chứa một hỗn hợp khoáng và ñất (1: 1) huấn luyện thích nghi với
khí hậu trong thời gian 3 - 4 tuần, kết quả 93% cây non sống sót trong ñiều
kiện thường [27].

1.3.3 Chi Curcuma
M. Anisuzzaman và cs (2008) khi nghiên cứu thân rễ in vitro ñã sản
xuất thành công ở loài Curcuma zedoaria, một loài có giá trị dược liệu nhưng
bị ñe dọa nghiêm trọng. Cụm chồi 10 ñến 12 tuần tuổi ñược nuôi cấy trong
môi trường MS bổ sung BAP và NAA với mức ñộ khác nhau. Tác ñộng của
nguồn cacbon khác nhau cũng ñược ñánh giá. Sự hình thành thân rễ bắt ñầu
trong vòng 7-9 tuần. Kết quả tốt nhất ñạt ñược ở 4.0 mg L
-1
BAP cùng với 6%
19

ñường trong ñiều kiện tần số và số lượng thân rễ. Khoảng 4 thân rễ với trọng
lượng trung bình 2.5g ñược thu hoạch sau 11-12 tuần. Thân rễ dễ dàng nảy
mầm trong môi trường MS không có chất ñiều hòa sinh trưởng [20].
M. A. Islam, K. Kloppstech và H. -J. Jacobsen (2004) ñã nghiên cứu
cảm ứng thân rễ trong ống nghiệm ở Curcuma longa L Chồi nách từ thân rễ
ñã ñược sử dụng làm mô ban ñầu và nhân nhanh in vitro. Cụm chồi ñược cắt
và cấy lên môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng trong bốn
tuần ñể tạo ra thân rễ. Ảnh hưởng của ánh sáng, ñường và chất kích thích sinh
trưởng trong cảm ứng tạo thân rễ in vitro ñã ñược nghiên cứu. Kết quả cho
thấy 9% ñường ñã ñược tìm thấy là thích hợp nhất cho tạo thân rễ, trong ñiều
kiện bóng tối. Nồng ñộ khác nhau của BA, Kin, và NAA ñược khảo sát. BA
(12,0 µm) và NAA (0,3 µm) cho thấy phù hợp nhất với cảm ứng của thân rễ.

Thân rễ lớndễ dàng phát triển chồi , khi ñược chuyển trực tiếp từ trong ống
nghiệm trồng vào ñất mà không qua huấn luyện thích nghi khí hậu. Thân rễ
tạo ra trong ñiều kiện in vitro có thể ñược cất và dễ dàng vận chuyển, thuận
lợi cho nhân chồi in vitro [24].
Khi nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật Piyamat Srirat kết luận, chồi từ
thân rễ của Curcuma longa L. ñã ñược sử dụng và cấy trên môi trường MS có
chứa 30 và 60 g/l sucrose, bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp 5 mg/l thidiazuron
(TDZ) và 5 mg/l của 6-benzyl-amino-purine (BA). Các thí nghiệm nghiên
cứu ở ñiều kiện nhiệt ñộ 25 ± 1
0
C, 16 chiếu sáng. Kết quả cho thấy các ñiều
kiện thích hợp cho nuôi cấy in vitro là môi trường MS có chứa 60 g/l sucrose
và 5 mg/l của TDZ. Trong ñiều kiện này, số chồi trung bình là 6,65 ± 1,98
sau 8 tuần nuôi cấy. Hơn nữa, sự phát sinh rễ ñã ñạt ñược sau 6 nuôi cấy với
tất cả các nghiệm thức sử dụng môi trường MS có chứa 60 g/l sucrose [29].
S K Shukla (2007) nghiên cứu sự tái sinh in vitro của cây nghệ
Curcuma angustifolia Roxb từ nuôi cấy mô phân sinh chồi. Các chồi từ thân
rễ (2 - 3 cm) ñược cấy trên môi truờng MS có bổ sung 3,0 mg/l BAP ñể thăm
dò sự nảy chồi và kéo dài chồi. Kết quả thu ñược 1,87 ± 0,28 chồi/mẫu. Chồi
20

in vitro ñược chuyển lên môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BAP và 25 mg/l
adenine sulfate ñể nhân chồi. Khoảng 6,9 ± 0,69 vi chồi/mẫu ñược tạo ra
trong 6 tuần. Chồi tạo rễ ngay trên môi trường nhân chồi. Cây in vitro hoàn
chỉnh có rễ ñược chuyển ra chậu cho thấy 83% sống sót trong ñiều kiện bình
thường [28].

1.3.4 Chi Zingiber
Azra Sultana và cs (2009) ñã nghiên cứu sự cảm ứng của lá và rễ in vitro
của cây gừng. Môi trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng riêng

lẻ hoặc kết hợp ñược nghiên cứu ñể có ñược môi trường thích hợp ñể tái sinh cây
non của gừng từ callus. Hai giống gừng: Suruchi và Bari ada-1 ñược nuôi cấy
trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l Dicamba, 0,75 mg/l Dicamba và 1 mg/l
2,4 D. Kết quả cảm ứng callus ñã ñược nghiên cứu thông qua năm ñặc ñiểm như
quy ñịnh ngày cảm ứng callus, kích thước của callus, màu sắc của các callus, bản
chất của callus và phần trăm cảm ứng callus.
- Giống Bari ada-1 cho thấy 62,64% cảm ứng callus, 63,98% cảm ứng
chồi và 68,76% cảm ứng rễ. Mẫu cấy lá ñã cho kết quả tốt nhất hơn cả cấy
ñỉnh chồi và rễ. Kết quả cấy lá ñã cho 67,07% mô sẹo, 67,77% chồi và
66,93% rễ . Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg / l Dicamba là tốt nhất
(70,20%) cho tạo callus, MS + 1,0 mg / l Kn + 1,0 mg / l BAP tốt nhất
(72,03%) ñể tạo chồi và MS + 1 mg / l IBA cho kết quả tốt nhất tạo rễ (
66,43%) hơn các môi trường khác.
- Sự cảm ứng callus cao nhất (73,60%) ñã ñược tìm thấy từ lá của giống
Suruchi. Lá của giống Suruchi ñã cho ñược 74% chồi và 74,13% rễ. Phần trăm
cảm ứng mô sẹo tối ña (76,47%) với giống Suruchi 0,5 mg/l Dicamba. Phần
trăm cảm ứng chồi ñược cao nhất (76,33%) ñạt ñược trên môi trường bổ sung
1,0 mg/l Kin và 1,0 mg/l BAP. Tỷ lệ phần trăm cao nhất (76,87%) cảm ứng rễ
trên môi trường 1 mg/l IBA. Tỷ lệ phần trăm cao nhất của cảm ứng mô sẹo
(87,60%) thu ñược từ cấy lá của giống Suruchi bởi 0,5 mg/l Dicamba. Lá cấy lên
môi trường có 1,0 mg/l Kin + 1,0 mg/l BAP tạo ra chồi với tỷ lệ phần trăm cao
21

nhất (87,60%). Cảm ứng rễ tốt nhất (85,40%) từ lá trên môi trường MS + 1 mg/l
IBA. Các cây non tái sinh thành công ñược chuyển ra ngoài [30].
Ping-Lung Huang and Chi-Chu Tsai ñã nghiên cứu năm 2004 nhân
giống in vitro cây Zingiber spectabile, một loài có giá trị kinh tế, trang trí làm
ñẹp. Mục ñích của thử nghiệm này không chỉ nhân giống in vitro cây Zingiber
spectabile, dự kiến sẽ ñược sử dụng làm các vật liệu của cây chuyển gen. Kết
quả cho thấy khi bổ sung 0,05 ~ 0,1 mg/l ABA thúc ñẩy bình thường sinh cơ

quan và tăng trưởng chồi. Vỏ và rễ ñược cấy trên môi trường vw có chứa
5mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l BA, 3% sucrose và 200ml/l nước dừa, cảm ứng
callus. Tuy nhiên, chỉ có rễ phát sinh từ mô sẹo có thể sản xuất nhiều phôi
soma từ bề mặt [25].
M. Chithra và cs nghiên cứu năm 2005 về việc nhân giống và bước ñầu
chuyển cây con ra môi trường ngoài của Kaempferia galanga L Nguyên liệu
ban ñầu là protocol. Môi trường MS với sự kết hợp của 8.87 mM N6-
benzyladenine (BA) và 2.46 mM indole-3-butyric acid (IBA) tạo ra số chồi
trung bình mỗi mẫu là 6,2. Bổ sung 11.7 mM nitrat bạc vào 8.87 mM BA và
2.46 mM IBA cho môi trường tạo ñiều kiện phát triển số lượng chồi cũng như
rễ cao nhất trong vòng 60 ngày (8,3 chồi). Những chồi riêng lẽ ñược cấy trên
môi trường với tổ hợp BA, IBA và nitrat bạc làm tăng số lượng chồi là 12,1.
Nitrat bạc làm giàu sự phát triển của thân rễ tại mỗi gốc chồi. Tăng nồng ñộ
ñường (6-8%) trong môi trường có BA, IBA và nitrat bạc làm thân rễ phát
triển tốt nhất. Kết quả cho thấy 95% chồi sống sót trong ñiều kiện ñó [22].
Christin (2007) ñã nghiên cứu nhân giống in vitro Curcuma zedoaria và
Zingiber zerumbet, các chồi ñược khử trùng bề mặt với 100 mg/L thủy ngân
Clorua (HgCl
2
) trong năm phút, tiếp theo là 20% (v/v) Clorox với vài giọt
Tween 20 trong 10 phút ở giai ñoạn ñầu tiên và 10% (v/v) Clorox 10 phút ở giai
ñoạn thứ hai. Thí nghiệm này cho phép khử trùng tạo 87% chồi vô trùng và sống
sót ở C. zedoaria và 80% cho Z. zerumbet. Môi trường tối ưu cho sự phát triển
của chồi ở cả hai loài là MS (Murashige và Skoog, 1962) vừa bổ sung 0,5 mg/L
và BA 0,5 mg/L IBA. Chồi ñược cấy của cả hai loài nuôi trong môi trường lỏng
tăng nhanh hơn gấp hai lần số lượng so với môi trường ñặc [23].
22

Phần 2.
ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
ðối tượng nghiên cứu của chúng tôi ở ñây là sa nhân tím (Amomum
longiligulare T.L.Wu) thuộc:
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Monocotyledonae
Bộ: Zingiberales
Họ: Zingiberaceae
Chi: Amomum
Loài: Longiligulare
Vật liệu nghiên cứu là ñoạn thân mang chồi ngủ của cây sa nhân tím
và hạt sa nhân tím ngoài tự nhiên [6].

2.2. THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm ñược tiến hành trong khoảng 4 tháng (từ 1/2010 –
5/2010) tại phòng Sinh lý ðộng vật – Tế bào – Di truyền, khoa Sinh
học, trường ðại học Khoa học Huế.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị mẫu và khử trùng mẫu
* Hạt ñược rửa sạch bằng nước cất. Sau ñó chuyển vào tủ cấy. Tiếp
theo khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút, HgCl
2
0,1% trong khoảng 3
phút , khử trùng liên tiếp với thời gian là 2 phút : 1 phút và cuối cùng rửa lại
bằng nước cất.
* ðỉnh sinh trưởng và ñoạn thân của cây sa nhân tím ñược chọn từ
những cây khỏe mạnh. Mẫu ñược ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng
23

15 phút, sau ñó lắc khoảng 15 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy, lặp lại 3
lần. Tiếp ñến ngâm trong nước javen 50% trong khoảng 10-15 phút, lắc mẫu
khoảng 10-15 phút rồi rửa sạch javen dưới vòi nước chảy. Tiếp ñến, ngâm
trong thuốc diệt nấm VIBEN-C 50BTN theo tỉ lệ 1,25g/500ml nước máy
trong khoảng 30 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy. Mẫu ñược rửa lại bằng
nước cất và chuyển vào tủ cấy. Sau khi khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút,
khử trùng trong HgCl
2
0,1% từ 10 ñến 20 phút liên tục hoặc gián ñoạn, rửa lại
bằng nước cất tiệt trùng 5-7 lần. Mẫu cấy lên môi trường nuôi cấy ban ñầu.
Khả năng khử trùng mẫu ñược ñánh giá thông qua theo dõi tỷ lệ mẫu chết,
mẫu nhiễm và mẫu sống không nhiễm sau 4 tuần theo dõi.

2.3.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường cơ bản dùng ñể nuôi cấy là môi trường MS (Murashige-
Skoog 1962) có bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng khác nhau tuỳ theo
mục ñích của từng thí nghiệm. Nguồn carbon là ñường saccharose. Môi
trường ñược làm ñặc bằng agar, pH của môi trường ñược ñiều chỉnh ñến 5,8
trước khi ñược khử trùng ở 121
o
C trong 15 phút.

2.3.3. Nuôi cấy ban ñầu
Mẫu sau khi khử trùng ñược ñặt lên giấy thấm vô trùng. Dùng dụng cụ
cấy vô trùng cắt mẫu thành các mẫu nhỏ có kích thước khoảng 2 -3 cm. Mẫu
ñược cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có 3,0% ñường, 0,8% agar,1,0
g/l than hoạt tính và bổ sung riêng lẻ BAP; Kin ; tổ hợp BAP và Kin; tổ hợp Kin
và NAA với nồng ñộ khác nhau ñể thăm dò khả năng tái sinh của mẫu.

2.3.4. Nhân nhanh

Các chồi in vitro có kích thước từ 2,0 – 3,0 cm ñược cấy lên môi trường
cơ bản MS có 3,0% ñường, 0,8% agar, 1,0 g/l than hoạt tính và bổ sung BAP
(1 - 3mg/l) kết hợp với NAA (0,3 – 1 mg/l) ñể thăm dò khả năng nhân chồi.
24

2.3.5. Tạo rễ
Các chồi in vitro có chiều cao từ 2,0 – 3,0 cm ñược cấy chuyển sang
môi trường MS bổ sung 1,0 g/l than hoạt tính và NAA từ 0,3 – 1,5 mg/l ñể
thăm dò khả năng tạo rễ của chồi.
Cây Sa nhân tím in vitro hoàn chỉnh có chiều cao từ 3 - 5 cm, có bộ rễ khoẻ
ñược huấn luyện và chuyển ra giá thể, chuẩn bị chuyển ra ñất tạo cây giống.
Trước hết, các bình thủy tinh chứa cây in vitro hoàn chỉnh (ñạt yêu cầu)
ñược ñưa ra khỏi phòng nuôi 7 ngày ñể cây thích nghi dần với ñiều kiện tự
nhiên. Sau ñó, lấy cây ra khỏi bình, rửa sạch agar rồi ñặt trên giấy thấm ñể
làm ráo nước cho rễ.
Mẫu ñược trồng trên giá thể: Cát + trấu hun theo tỷ lệ 1:1.

2.3.6. ðiều kiện nuôi cấy
Mẫu vật ñược nuôi cấy trong chai thủy tinh loại 100ml, ñặt trong phòng
nuôi cấy ở nhiệt ñộ 25 ± 1
0
C, cường ñộ ánh sáng 2000-3000 lux và thời gian
chiếu sáng 8 - 10 giờ/ngày.

2.3.7. Xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm ñược phân tích
Duncan's test bằng phần mềm SPSS 11.5 (SPSS Inc. Headquarters, United
States, 2004) với mức xác suất có ý nghĩa p < 0,10.

25

Phần 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN


3.1. NUÔI CẤY BAN ðẦU
3.1.1. Khử trùng mẫu
ðiều kiện vô trùng quyết ñịnh sự thành bại của quá trình nuôi cấy in
vitro. Do ñó mẫu trước khi ñưa vào nuôi cấy, ngoài việc chọn lọc cây sạch
bệnh và bộ phận sạch bệnh, cần phải ñược khử trùng. Việc khử trùng ñảm
bảo sạch nấm, vi khuẩn nhưng không làm chết mẫu.
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn các nhánh con mọc ra từ cây sa
nhân mẹ và hạt làm nguyên liệu ban ñầu. Mẫu ñược khử trùng sạch bên ngoài
phòng cấy, rồi ñược rửa lại bằng nước cất và chuyển vào tủ cấy. Sau ñó mẫu
ñược khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút. ðối với mẫu hạt, chúng tôi
khử trùng HgCl
2
0,1% 3 phút và 2 : 1 phút. ðối với mẫu cấy là nhánh con,
chúng tôi khử trùng HgCl
2
0,1% từ 10 ñến 20 phút liên tục hoặc gián ñoạn.
Cuối cùng, mẫu ñược rửa lại bằng nước cất tiệt trùng 5 -7 lần. Sau ñó dùng
dụng cụ cấy vô trùng ñể cắt mẫu thành từng ñoạn kích thước 2 – 3 cm, chia

mẫu thành 2 lô thí nghiệm:
+ Lô 1: ðỉnh sinh trưởng
+ Lô 2: ðoạn thân mang chồi bên
Mẫu ñược cấy lên môi trường MS. Các chỉ tiêu theo dõi như tỷ lệ sống,
tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết ở các thời gian khử trùng khác nhau ñược quan sát sau
30 ngày nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu ñược trình bày ở bảng 3.1, bảng 3.2,
bảng 3.3.