nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh của hai giống mía roc26 và bh1 bằng phương pháp nhân nhanh in vitro

1

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp trớc hết tôi xin đợc gửi lời cảm ơn
chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Thị Thuý. Cô đ tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận
tình hớng dẫn tôi trong toàn bộ khoá luận.


Tôi xin đợc gửi lời cảm ơn tới chị Phan Thị Thanh Thúy. Chị đ chỉ bảo tôi
trong suốt quá trình thực tập khoá luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cô chú, các anh chị làm việc tại
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di Truyền Nông
Nghiệp đ giúp đỡ và tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập.

Tôi xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy, cô
giảng dạy tại khoa CNSH - Viện Đại Học Mở Hà Nội đ hớng dẫn, giảng dạy tôi
trong quá trình học tập tại trờng.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đ động viên tạo điều kiện giúp tôi
hoàn thành khoá luận này.

Hà Nội, ngày 13 tháng 06 năm 2010
Sinh viên: Phạm Thị Nguyệt

2


Mục lục



Mở đầu6
1. Đặt vấn đề6
2. ý nghĩa và mục tiêu của đề tài.7
Phần 1: tổng quan tài liệu8
1.1. Giới thiệu chung về cây mía 8
1.1.1. Phân loại thực vật 8
1.1.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trởng.8
1.1.3. Phân loại mía.8
1.1.4. Gía trị của cây mía 10
1.1.5. Thực trạng việc trồng và sử dụng mía11
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào và ứng dụng.13
1.2.1. Lịch sử phát triển13
1.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật15
1.2.3. Các yếu tố ảnh hởng tới nuôi cấy in vitro.16
1.2.4. Các phơng pháp nhân giống in vitro.19
1.2.5. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật.23
1.3. Giới thiệu về chất điều hòa sinh trởng thực vật 24
1.3.1. Nguồn gốc lịch sử 24
1.3.2. Nhóm Auxin 25
1.3.3. Nhóm Cytokinin 26
1.3.4. Các nhóm khác 27

Phần 2: vật liệu và phơng pháp nghiên cứu.28

2.1. Vật liệu nghiên cứu.28
2.2. Phơng pháp nghiên cứu.28
2.2.1: Chọn mẫu và xử lí mẫu.28
2.2.2. Các bớc thực hiện 29
a. Nghiên cứu khả năng tạo chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 29
3

b. Nghiên cứu ảnh hởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,1mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của hai giống mía
ROC26 và BH1 30
c. Nghiên cứu ảnh hởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía ROC26 và
BH1 30
d. Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa tới quá trình nhân chồi của hai giống
mía ROC26 và BH1 31
e. Nghiên cứu ảnh hởng của trạng thái môi trờng tới quá trình nhân chồi
cảu hai giống mía ROC26 và BH1 31
f. Nghiên cứu ảnh hởng của dung tích môi trờng tới quá trình nhân chồi
của hai giống mía ROC26 và BH1 32
g. Nghiên cứu ảnh hởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình
kéo dài chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 32
h. Nghiên cứu ảnh hởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình
hình thành rễ của hai giống mía ROC26 và BH1 33
i. Nghiên cứu ảnh hởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây trên vờn ơm.33
2.2.6. Thu thập và xử lí số liệu33
Phần 3: kết quả và thảo luận 35
3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng từ cây mía 35
3.2. Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ hai giống mía ROC26 và BH1 35

3.3. Nghiên cứu ảnh hởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,1mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của hai giống mía
ROC26 và BH1 37
3.4. ảnh hởng BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l Kinetin
lên quá trình tái sinh chồi của 2 giống mía ROC26 và BH1 40
3.5. ảnh hởng nớc dừa tới sự hình thành chồi từ callus của 2 giống mía
ROC26 và BH1 42
3.6. ảnh hởng của trạng thái môi trờng đến quá trình nhân chồi của 2
giống mía ROC26 và BH1 43
4

3.7 : ảnh hởng dung tích môi trờng tới quá trình nhân nhanh chồi của 2
giống mía ROC26 và BH1 45
3.8 : ảnh hởng BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình kéo dài chồi
của 2 giống mía ROC26 và BH1 46
3.9 : ảnh hởng nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của 2 giống mía
ROC26 và BH1 48
3.10 : ảnh hởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây ngoài vờn ơm 51
Phần 4 : kết luận và kiến nghị 53
4.1. Kết luận 53
4.2. Kiến nghị 53
Tài liệu tham khảo 54
Phụ lục

5

Nh÷ng tõ viÕt t¾t

BAP 6-Benzyl Amino Purin
IAA Indol-3-Axetic Acid
IBA 3-Indol Butyric Acid
NAA
α-Naphthyl Acetic Acid
2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid
MS Mura Shige vµ Skoog
NSTB N¨ng xuÊt trung b×nh
CTMT C«ng thøc m«i tr−êng

6

Mở đầu

I. Đặt vấn đề:
Cây mía là một loại cỏ qua quá trình chọn lọc tự nhiên hàng nghìn năm đ
trở thành một loài cây trồng công nghiệp quan trọng của cả thế giới. Cây mía chứa
80-90% nớc dịch đờng trong đó có khoảng 16-18% là đờng nguyên chất. Cây
mía là cây cho sản lợng đờng cao hơn tất cả các loại cây khác. Hiện nay ở nớc
ta cũng nh nhiều nớc khác trên thế giới cây mía là cây trồng đợc nhà nớc và
chính phủ u tiên chú trọng phát triển nh một cây công nghiệp chính. Niên vụ mía
năm 2009 lợng nguyên liệu mía đa vào sản xuất đờng thiếu trầm trọng, hàng
loạt nhà máy đờng phải đóng cửa sớm. Hậu quả là toàn nghành mía của nớc ta
thiếu khoảng 2000 tấn so với dự tính dẫn tới nhà nớc phải nhập ngoại đờng. Đây
là nguyên nhân chính gây hiện tợng sốt giá đờng trong năm nay. Nhà nớc dự
tính vụ mía năm 2010 sẽ mở rộng diện tích trồng mía để đáp ứng đủ cho nghành
sản xuất mía đờng nhằm đảm bảo giá đờng phù hợp cho nhân dân. Ngoài ra, cây
mía còn là một vị thuốc quý chữa rất nhiều bệnh đ đợc các y bác sỹ chứng nhận
và sử dụng. Bên cạnh đó đối với những vùng sâu, miền núi, vùng đồng bào dân tộc
thiểu số thì cây mía còn là cây trồng chủ đạo góp phần xóa đói giảm nghèo làm
giàu cho bà con.
Diện tích trồng mía của nớc ta hiện nay vào khoảng 325.800 ha, năng suất
bình quân khoảng 54 tấn/ha, tổng sản lợng mía đợc 15,2 triệu tấn. Có khoảng
hơn 200 quốc gia đang trồng và sản xuất mía đờng với sản lợng hàng năm lên tới
1.324,6 triệu tấn gấp khoảng 6 lần so với sản lợng của củ cải đờng. Nhu cầu về
đờng cũng nh tính cấp thiết của cây mía ngày càng đòi hỏi với số lợng lớn.
Qua nhiều năm trải nghiệm của hầu hết các nớc cho thấy vai trò của công
nghệ nuôi cấy mô đối với nhân giống mía, cây mía qua nuôi cấy mô cho năng xuất
cao hơn bình thờng gấp 20-30%. Nuôi cấy mô còn là một biện pháp an toàn trong
công tác cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hóa học, giúp cho việc nhập

nội giống và trao đổi nguồn gen. Để tạo đợc các giống mía cho năng suất, tỷ lệ
đờng cao và cây sạch bệnh thì công nghệ nuôi cấy mô là một đòi hỏi hết sức cấp
bách.
7

Chất kích thích sinh trởng là một yếu tố quyết định sự thành công của công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy để có đợc những giống mía chất lợng
cao ta phải tìm hiểu ảnh hởng của các chất kích thích sinh trởng lên các giống
mía. Chỉ có nh vậy ta mới có thể tạo đợc điều kiện môi trờng tối u cho cây
phát triển nhằm đạt đợc năng xuất cao nhất. Hiện nay hai giống mía chính đợc
đa vào trồng để sản xuất đờng chủ yếu là giống mía ROC26 và giống BH1.Vì
đây là hai giống mía có hàm lợng đờng cao hơn hẳn so với các giống mía nhập
ngoại khác của nớc ta. Để phục vụ cho việc đa hai giống mía ROC26 và BH1 ra
trồng hàng loạt với diện tích lớn mang lại năng xuất cao, chúng tôi đ tiến hành
nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu ảnh hởng của một số chất điều hòa sinh
trởng đến quá trình nhân nhanh của hai giống mía ROC26 và BH1 bằng
phơng pháp nhân nhanh IN VITRO
II. mục đích và yêu cầu của đề tài:
1.1. mục đích:
- Xác định đợc các chất điều hòa sinh trởng thích hợp và nồng độ cần bổ
sung vào môi trờng nuôi cấy hai giống mía ROC26 và BH1 bằng in vitro để đạt
hiệu quả nhân nhanh cao nhất.
1.2. yêu cầu:
- Xác định đợc nồng độ của BAP, NAA, 2,4-D cần bổ sung vào môi trờng
nuôi cấy.
- Xác định đợc nồng độ % của nớc dừa, hàm lợng agar (g/l) cần bổ sung
vào môi trờng nuôi cấy.
- Tìm đợc giá thể thích hợp để đa cây in vitro ra vờn ơm trớc khi đa
cây ra ngoài đồng ruộng.

8

Phần 1: tổng quan tài liệu

1.1. giới thiệu chung về cây mía:

1.1.1. Phân loại thực vật:
Tên Việt Nam: Cây mía
Tên khoa học : Succharum officinarum
Tông : Andoropogoneae
Họ : Hòa thảo (Poaceae)
Chi : Sachcharum
1.1.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trởng:
Cây mía là cây thuộc họ hòa thảo, sống ở các vùng có khí hậu nhiệt đới và
ôn đới ẩm. Thân cây mía to mập, chia đốt, chứa nhiều đờng, cao từ 2-6 m. Trên
cây mía thờng thì phần ngọn nhạt hơn phần gốc do phần ngọn chứa thêm một
lợng nớc lớn để cung cấp cho lá và ngọn. Lá mía cứng, dài, có lông khi già lá
chuyển mầu nâu. Cây mía thuộc cây rễ chùm ăn trên bề mặt đất khoảng 0-60 cm.
Cây mía a sống ở vùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm. Nhiệt độ thích hợp từ
15-26
0
C, thời kỳ mía nảy mầm thì cần nhiệt độ tốt nhất là 26-33
0
C. Thời gian
chiếu sáng phải đạt từ 1200-2000 giờ/ 1 ngày. Độ ẩm cần 100-170 mm nớc/1
tháng, khi mía sắp tới thời kỳ thu hoạch cần khô khoảng 2 tháng nh vậy thì tỉ lệ
đờng trong cây sẽ cao. Mía là loại cây công nghiệp khỏe, không kén đất có thể

trồng mía trên nhiều loại đất khác nhau, từ 70% sét đến 70% cát. Đất thích hợp
nhất cho mía là những loại đất xốp, tầng canh tác sâu, có độ phì cao, giữ ẩm tôt và
dễ thoát nớc. Tuy nhiên ph của đất phải giới hạn từ 4-9, ph thích hợp nhất cho
cây mía phát triển từ 5,5 đến 7,5.
1.1.3. Phân loại giống mía ở Việt Nam:
Trên thực tế hiện nay ở Việt Nam, cây mía đợc chia thành hai loại chính:
Mía ăn và mía ép công nghiệp.
- Mía ăn: Nhóm này chiếm diện tích rất ít, chỉ một phần nhỏ và tập trung chủ
yếu ở các tỉnh nh: Hà Tây, Hng Yên, Hòa Bình Đây là nhóm mía nhiệt đới,
9

thân mềm, nhỏ, hàm lợng đờng glucose và fructoza cao hơn các nhóm khác nên
mát và bổ. Nhóm mía này hoàn toàn là nhóm mía nguyên thủy cha trải qua công
nghệ chuyển gen hiện đại. Nhóm mía này có thể trồng quanh năm không theo mùa
vụ chính, không chịu ảnh hởng của các yếu tố ngoại cảnh, tuy nhiên thì yêu cầu
về chế độ phân bón cao không thích hợp để trồng cây công nghiệp. Một số giống
tiêu biểu nh mía tím, mía chân gà
- Mía ép công nghiệp: Đây là các giống mía dùng để phục vụ cho công
nghiệp chế biến đờng, phần lớn các giống mía này đợc nhập từ Đài Loan, ấn Độ,
Trung Quốc. Căn cứ vào thời điểm chín công nghiệp của mía ngời ta chia mía ép
công nghiệp thành các nhóm chính nh sau:
+ Nhóm mía chín sớm: Nhóm này chiếm khoảng 20-30% diện tích của vụ,
thu hoạch vào đầu tháng 10. Nhóm này gồm:
Giống Việt đờng 54-143 đây là giống mía đợc nhập của Trung Quốc và
đợc trồng ở Việt Nam từ rất lâu, thân cây thẳng để nhánh ít, mầu đỏ, chín sớm,
chiếm 50-60% của nhóm.
Giống Neo 320 là giống của ấn Độ đợc trồng nhiều ở miền Nam, diện tích
chiếm 10% của cả nhóm.
Giống Ja 60-5 chiếm khoảng 40% của cả nhóm, có khả năng cho năng xuất
từ 80-100 tấn/ha, giống này nảy mầm chậm nhng để tập chung, chín sớm, thân to

hình chóp cụt, vỏ màu xanh sáng, ẩn tím, thân có phủ lớp sáp dày.
+ Nhóm mía chín trung bình: Đây là nhóm mía trồng chính của nghành trồng
mía, diện tích trồng chiếm 40-50% diện tích của cả vụ. Nhóm mía này gồm các
giống nh:
Giống F156 là giống mía gốc ở Đài Loan mới đợc nhập vào nớc ta cho
năng suất 70-100 tấn/ha, hàm lợng đờng cao, thân thẳng, vỏ màu xanh vàng ẩn
tím hay bị nứt, thân có lớp sáp phủ dày, giống này trồng chiếm 50% diện tích của
nhóm.
Giống Co 715 là giống mía nhập từ ấn Độ có khả năng thích ứng rộng trên
nhiều loại đất khác nhau kể cả đất chua, phèn, năng xuất đạt 80-110 tấn/ha, thân
cây thẳng, đờng kính lớn, vỏ xanh vàng ẩn tím, có lớp sáp phủ dày.
17

cờng độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cờng độ ánh sáng thấp sẽ
hình thành mô sẹo. Nhìn chung cờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là
1000-7000 lux. Chất lợng ánh sáng cũng ảnh hởng tới sự phát sinh hình thái của
mô thực vật in vitro. ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sự vơn cao của mô
nhng lại ảnh hởng tốt tới sự sinh trởng của mô sẹo.
- Nhiệt độ:
Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hởng tới sự
phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của
mẫu mô nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Thờng cây nhiệt đới đòi hỏi
nhu cầu nhiệt độ cao hơn so với cây ôn đới.
* Môi trờng hóa học:
Môi trờng hóa học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trởng
phát sinh mô trong suốt quá trình sinh hóa của cây. Cơ sở của việc xây dựng các
môi trờng nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự tăng trởng và
phát triển của cây. Hầu hết các loại môi trờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều
bao gồm:

- Các nguyên tố đa lợng và vi lợng:
Nguyên tố đa lợng: Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm. Những nguyên tố N,
S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tợng.
Nitơ: Dùng ở dạng muối NO
3
-
và NH
4
+
riêng rễ hoặc phối hợp với nhau.
Photpho: Là nguyên tố mà mô tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu cao và
thờng đợc đa vào môi trờng ở dạng đờng Photpho.
Lu huỳnh: Đợc sử dụng ở dạng muối SO
4
2-
nồng độ thấp còn dạng SO
3
2-

và SO
2
2-
kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trờng nuôi cấy.
Na
+
và Cl
-
: Cần ở nồng độ thấp và đợc đa vào môi trờng cùng với muối
khoáng khi điều chỉnh ph môi trờng.
Các nguyên tố vi lợng:

Là những nguyên tố đợc sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (< 30mg/l). Các nguyên
tố vi lợng nh Fe, Cu, Zn, Bo, Co, I
2
. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng
18

trong các hoạt động của Enzyme. Chúng đợc dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so
với các nguyên tố đa lợng.
Fe: Thiếu Fe làm giảm ARN, Protein nhng lại làm tăng ADN và các axit amin
tự do làm cho các tế bào không phân chia.
Mn: Thiếu Mn làm cho ADN và các axit amin tự do tăng lên nhng lợng
mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm làm giảm sự phân bào.
Bo: Thiếu Bo trong môi trờng nuôi cấy thờng gây lên biểu hiện thừa Auxin vì
thực tế Bo làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào phát triển. Mô nuôi
cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhng thờng là mô xốp, mọng nớc, kém
tái sinh.
Nguồn Cacbon:
Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phơng thức dị dỡng (hoàn toàn sử dụng
các chất dinh dỡng của môi trờng). Để sử dụng đợc thì nhờ nguồn Cacbon
từ môi trờng đa vào thông qua các loại đờng khác nhau nh: Saccarose,
Mantose, Fructose Hàm lợng đờng bổ sung vào môi trờng nuôi cấy tùy
thuộc vào mô nuôi cấy.
Vitamin:
Nuôi cấy in vitro khi chồi tái sinh chồi vẫn tự tổng hợp đợc vitamin nhng
không đủ do vậy phải bổ sung vitamin vào môi trờng nuôi cấy đặc biệt là
vitamin nhóm B. Tùy thuộc vào các loại mô nuôi cấy và giai đoạn nuôi cấy mà
hàm lợng vitamin bổ sung vào khác nhau.
Các nhóm chất bổ sung:
Một số loài cây đặc biệt thì cần phải bổ sung vào môi trờng nuôi các chất
khác để cung cấp các axit amin tự do, protein, vitamin

Nớc dừa: Trong nớc dừa có nhiều axit amin tự do, axit amin liên kết, axit
hữu cơ, đờng, ARN Nớc dừa là chất bổ sung đặc biệt cho nuôi cấy mía.
Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): Chứa một số đờng, vitamin, một số
chất có hoạt tính điều hòa sinh trởng.
Dịch chiết nấm mem: Thành phần chủ yếu chứa đờng, axit nucleic, axit
amin, vitamin, auxin, muối khoáng
Dịch thủy phân Casein: Làm nguồn bổ sung axit amin.
19

Agar: Đây là thành phần polisaccharit của tảo có tác dụng làm đông môi
trờng ở nhiệt độ < 40
0
C. Thờng bổ sung vào môi trờng nuôi cấy từ 5g/l
đến 6g/l.
Các chất điều hòa sinh trởng:
Các chất kích thích sinh trởng có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất ở một mức độ hợp
lý thì chúng ta có thể điều khiển đợc chiều hớng phát sinh hình thái của
mẫu nuôi cấy. Auxin và Cytokinin là hai chất kích thích sinh trởng đợc sử
dụng phổ biến nhất hiện nay.
Auxin cần bổ sung vào giai đoạn tạo callus, kéo dài chồi và nhân nhanh
in vitro.
Cytokinin bổ sung vào môi trờng nuôi cấy ở giai đoạn ra rễ, nhân chồi.
Tỷ lệ kết hợp giữa Auxin và Cytokinin phù hợp sẽ định hớng cho cây
tạo rễ hay tạo chồi:
Auxin
+ > 1. Mẫu nuôi cấy định hớng u tiên phát triển rễ.
Cytokinin

Auxin

+ < 1. Mẫu nuôi cấy định hớng u tiên phát triển chồi.
Cytokinin
b. Vật liệu nuôi cấy:
Về nguyên tắc thì mọi loại tế bào (tế bào của mô rễ, thân, lá, cành ) của một cơ
thể thực vật đều có tính toàn năng nghĩa là vẫn có khả năng nuôi cấy thành công.
Tuy nhiên các loại tế bào, các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công
khác nhau.
c. Điều kiện vô trùng:
Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô tế
bào Môi trờng và các thiết bị sử dụng cấy phải đợc vô trùng tuyệt đối. Nếu điều
kiện, thiết bị cấy không đảm bảo thì môi trờng sẽ bị nhiễm, mô cấy sẽ bị chết.
1.2.4. Các phơng pháp nhân giống invitro:
Phơng pháp nhân giống in vitro là một phơng pháp nhân giống hiện đại so
với cách nhân giống cổ điển nh ghép, chiết, giâm cành. Nhân giống in vitro hay vi
20

nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng của công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Từ thực tế cho thấy thì phơng pháp nhân nhanh in
vitro đ đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất trong các phơng pháp nuôi cấy mô. Có
ba phơng thức để tạo cây invitro.
a. Hoạt hóa chồi nách :
Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tợng u thế ngọn khi nuôi cấy các
đỉnh chồi hay đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phơng pháp này thì sự hoạt hóa của
chồi nách diễn ra theo hai cách:
- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi nách hoặc chồi đỉnh hiện tợng
này xảy ra khi cây nuôi cấy là loài cây hai lá mầm nh khoai tây, hoa cúc.
- Cách 2: Tạo cụm chồi: Hiện tợng này xảy ra với các cây có một lá mầm
nh cây mía, cây lúa.
b. Phơng pháp tạo chồi bất định:
Chồi bất định là chồi đợc hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác nhau

của cây mà không phải là hợp tử nh chồi hình thành từ callus.
Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây nh: đoạn thân, mô lá Trong
quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để bắt tế bào
sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô
sẹo.
c. Phơng pháp tạo phôi vô tính:
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào soma
gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có
thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tơng tự nh tạo chồi
bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh
tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua
giai đoạn phát triển mô seo. Sự hình thành phôi trải qua hai bớc chính:
Bớc 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình
này cần môi trờng giàu Auxin vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào
phôi, đồng thời Auxin giúp kích thích cho quá trình phát triển số lợng tế bào
thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là
21

các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm
đặc, giàu protein, ARN thông tin.
Bớc 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trờng nuôi cấy của giai
đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, nếu nồng độ của Auxin cao kích thích
sự tạo thành phôi nhng lại ức chế cho quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo
của phôi này. Nh vậy nồng độ chất điều tiết sinh trởng hợp lí rất quan trọng để
có các phản hồi thích hợp. Nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nồng độ cao
có thể gây ức chế hoặc gây độc.
d. Các bớc chính trong nhân giống in vitro:
Theo George (1993), quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm năm
bớc sau:
Bớc 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Trớc khi tiến hành nhân giống in

vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ vì đây là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy. Các
cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt phải sạch virut và đang ở giai đoạn sinh
trởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc
và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm,
tăng khả năng sống và sinh trởng của mẫu cấy in vitro.
Bớc 2: Nuôi cấy khởi động: Là giai đoạn khử trùng đa mẫu cấy in vitro.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu nh tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn
tại và sinh trởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát
triển của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách đợc sử dụng để
nhân nhanh một số cây nh mía, măng tây, khoai tây, hoa cúc
Bớc 3: Nhân nhanh: Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình
thái và tăng nhanh số lợng thông qua các con đờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi
bất định, tạo phôi vô tính. Vấn đề là cần xác định đợc môi trờng và điều kiện
ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trờng
có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thờng là 25-27
0
C và
16h chiếu sáng/1 ngày, cờng độ ánh sáng 2000-4000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi
loại đối tợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau.
Bớc 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Để tạo rễ cho chồi, ngời ta chuyển
chồi từ môi trờng nhân nhanh sang môi trờng tạo rễ. Môi trờng tạo rễ thờng
22

đợc bổ sung một lợng nhỏ Auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi
chuyển sang môi trờng không chứa chất kích thích sinh trởng.
Bớc 5: Đa cây ra ngoài vờn ơm: Để cây đa ra ngoài vờn ơm đợc phát
triển tốt cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau:
+ Cây phải đảm bảo về chiều cao của rễ, lá
+ Giá thể dùng để trồng cây phải tơi, xốp, thoát nớc tốt.
+ Phải điều chỉnh độ ẩm, cờng độ chiếu sáng, chế độ dinh dỡng phù hợp.

Quy trình nhân nhanh của các giống mía đợc thể hiện trong sơ đồ dới đây:


Chọn mẫu và xử
lý mẫu
Chọn cây u việt
từ giống u việt
Chọn mẫu và xử
lý mẫu
Nuôi cấy chồi
đỉnh (chồi nách)
Tạo callus từ lát
cắt lá non
Tạo cụm chồi
Kéo dài chồi

Tái sinh chồi

Đa cây ra ngoài
đồng ruộng
Đa cây ra vờn ơm

Ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh
23


1.2.6. ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật:
Nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm hàng loạt các kĩ thuật khác nhau đ đem lại
khả năng ứng dụng hết sức rộng ri trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

Kĩ thuật
nuôi cấy
ứng dụng


Hạt giống
- Tăng khă năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều
kiện bình thờng.
- Thúc đẩy quá trình nảy mầm bằng cách bổ sung các chất điều
tiết sinh trởng.
- Tạo ra cây con dùng trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc các bộ
phận khác
Hoa cái
(Bầu quả,
non)
- Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa.
- Tạo đơn bội.
- Tạo đa bội.
Hoa đực
(Bao phấn và
hạt phấn)
- Tạo mô sẹo và cây đơn bội.
- Tạo đột biến ở mức đơn bội.
- Tạo dòng đồng hợp tử.

Phôi hợp tử
- Nuôi cấy phôi khi lai xa.
- Nhân các dòng lai xa.
- Phá ngủ nghỉ của hạt.

Tế bào
- Tạo đột biến ở mức độ tế bào.
- Tạo tế bào trần để lai vô tính.
- Biến nạp gen.
- Nuôi cấy tế bào đơn.
Đỉnh chồi
(Đỉnh sinh
trởng)
- Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền.
- Làm sạch virut.
- Nghiên cứu sinh lý phát triển.
- Là đờng hớng tái sinh chủ ứng dụng:
24

Phân hóa phôi
vô tính
+ Nhân nhanh .
+ Sản xuất hạt nhân tạo.
- Cung cấp vật liệu để tạo các Protoplat có khả năng sinh phôi.
- Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor.





Đột biến soma
- Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tởng song cũng
thiếu một số tính trạng mong muốn.
- Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và

thứ cấp.
- Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh chống
chịu stress tốt hơn.
- Tạo các biến dị di truyền thông qua lai hữu tính ở các dòng u
tú.

1.3. Giới thiệu về chất điều hòa sinh trởng:
1.3.1. Nguồn gốc lịch sử:
Chất điều hòa sinh trởng tự nhiên là những hormon, chúng tồn tại tự nhiên
trong cây trồng với hàm lợng rất nhỏ, chúng có khả năng di chuyển từ bộ phận
này sang bộ phân khác của cây và có tác dụng điều hòa quá trình trao đổi chất của
thực vật. Chất điều hòa sinh trởng tự nhiên bao gồm 5 nhóm chính là nhóm
Auxin, nhóm Cytokinin, nhóm Giberellin, nhóm Absisic Acid và nhóm Etylen.
Tên Auxin đợc bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp Auxein, có nghĩa là tăng
trởng. Auxin là nhóm chất kích thích sinh trởng đầu tiên đợc con ngời khám
phá ra. Charles Darwin là một trong các nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về
Auxin. Auxin đợc hình thành liên tục trên đỉnh chồi và rễ của cây. Auxin điều
chỉnh tốc độ mở rộng của tế bào trong vùng sinh trởng của đỉnh thân cây và liên
quan đến phản ứng uốn cong trong tính hớng ánh sáng, hớng đất của cây. Năm
1880 Saclo Đacuyn(Darwin) đ phát hiện ra rằng ở các bao lá mầm của cây họ
hòa thảo rất nhạy cảm với ánh áng. Nếu chiếu một chiều thì gây quang hớng động
nhng nếu che tối hoặc cắt chồi ngọn thì không xảy ra hiện tợng trên. Năm 1934
giáo s khoa học Hà Lan Koc (Kogl) đ tách ra một chất từ dịch chiết nấm men có
hoạt tính tơng tự chất kích thích sinh trởng. Năm 1935 Thiman cũng tách đợc
25

chất này từ nấm Rhyzopus. Sau đó ngời ta tách chiết đợc Auxin từ nhiều loại thực
vật khác nhau. Việc phát hiện ra Cytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật. Năm 1955 Miller và Skoog đ phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu
một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi

cấy mô gọi là Kinetin. Năm 1963 Letham và Miller lần đầu tiên tách đợc
Cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là Zeatin và có hoạt tính tơng tự.
Sau đó ngời ta phát hiện Cytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và
là một nhóm Phytohormone quan trọng ở trong cây.
Trong nuôi đề tài này chúng tôi sử dụng hai nhóm chất điều hòa sinh trởng
chính là Auxin và Cytokinin.
1.3.2. Nhóm Auxin:
- Auxin là nhóm chất điều tiết sinh trởng thực vật đợc sử dụng thờng
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp với các thành phần khác
của môi trờng dinh dỡng để kích thích sự tăng trởng của mô sẹo, huyền phù tế
bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó đợc kết hợp với
Cytokinin.
- Axin có tác dụng nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế bào, hoạt động của
tầng phát sinh, quả Tác dụng sinh lý của Auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế
bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hm sự sinh trởng của chồi bên, kìm hm sự
rụng hoa, rụng quả. Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (Protein, Cellulose,
Pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng. Auxin đợc xem là hormone thực vật quan
trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trởng và
biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thờng của thực vật. Auxin cùng với
một số chất điều hòa khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia
thành cơ quan thực vật hoàn chỉnh.
- Có bốn yếu tố ảnh hởng tới sự lựa chọn loại Auxin:
+ Kiểu tăng trởng hoặc phát triển cần nghiên cứu của mẫu cấy.
+ Hàm lợng Auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy .
+ Khả năng tổng hợp Auxin nội sinh của mẫu cấy.
+ Sự tác dụng qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh.
- Vai trò chính của Auxin: