nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong giấy và phụ liệu

i

LỜI CAM ĐOAN


Em xin cam đoan tất cả những số liệu trong đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm
linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu” là số liệu thật và chƣa từng đƣợc
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với số liệu nghiên cứu của mình.


Sinh viên
Vũ Mạnh Tùng
















ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong
Giấy và phụ liệu”, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Th.S KHÚC THỊ AN,
ngƣời đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi từ buổi đầu làm quen với công tác nghiên
cứu khoa học và trong suốt quá trình tiến hành hoàn thành đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh
học, cán bộ phòng thí nghiệm - Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng đã nhiệt
tình truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian của khóa học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị em trong gia đình, mọi
ngƣời đã cho tôi những điều kiện tốt nhất về mặt tinh thần cũng nhƣ vật chất giúp
tôi trong suốt khóa học.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn tập thể lớp 48sh và toàn thể đồng bạn đã giúp đỡ,
động viên tôi trong thời gian qua.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!


Nha Trang, tháng 07 năm 2010
Sinh viên
Vũ Mạnh Tùng

iii
Mục lục
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
CHƢƠNG 1 1
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1
1.2. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 2
1.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 3
1.4.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM TRÊN THẾ GIỚI 3
1.4.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM LINH CHI Ở TRONG
NƢỚC 4
1.4.4.1. Đặc điểm sinh học của nấm linh chi 6
CHƢƠNG 2 8
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 8
2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất 8
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
2.2.1. Những nghiệm thức đƣợc thiết lập 9
2.2.2. Dự kiến quy trình thực nghiệm nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể
rong Giấy và phụ liệu 10
2.2.2.1. Phân lập giống nấm hoàng chi cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng 10
2.2.2.2. Nhân giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt lúa cấp 2 11
2.2.2.3. Xử lý nguyên liệu rong Giấy và phụ liệu 12
2.2.2.4. Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trƣờng hạt qua 12
2.2.2.5 . Chăm sóc và đón hái nấm 12

iv
2.2.3. Phƣơng pháp thu nhận kết quả 13
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 13
CHƢƠNG 3 14
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14
3.1. Kết quả nuôi trồng thực nghiệm 14
3.1.1. Kết quả phân lập giống cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng 14
3.1.2. Kết quả nhân giống trên môi trƣờng hạt lúa 16
3.1.3. Kết quả trên môi trƣờng ra quả thể 18
3.1.4 Kết quả phân tích hình thái giải phẫu quả thể nấm linh chi 22
3.1.5 Kết quả phân tích hình thái giải phẫu quả thể nấm hoàng chi 28
3.1.6. Kết quả phân tích thành phần hóa học trong quả thể 29
3.2. Đề xuất quy trình nuôi trồng nấm hoàng chi trên giá thể rong giấy và phụ liệu 31
CHƢƠNG 4 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 32
4.1. Kết luận 32
4.2. Đề xuất ý kiến 33
PHỤ LỤC 1


v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.3. Thành phần sinh học của Rong Giấy 6
Bảng 2.1. Tỷ lệ thành phần cơ chất trong các nghiệm thức . 9
Bảng 3.1. Kết quả số liệu của hệ sợi nấm linh chi ở các nghiệm thức 18
Bảng 3.2. Kết quả giải phẫu sinh học trong các nghiệm thức 28
Bảng 3.3. kết quả tính hiệu suất sinh học ở các nghiệm thức. 29
Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần hóa học 29
Bảng 3.5. Kết quả so sánh tổng hợp sự phát triển của nấm ở 2 môi trƣờng. 30

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Rong giấy tại bờ biển Nha Trang - Khánh Hòa 5
Hình 3.1. Nấm hoàng chi sau 5 ngày phân lập trên môi trƣờng thạch 15
Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn tốc độ lan tơ nấm trên môi trƣờng thạch 15
Hình 3.3. Giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt sau 12 ngày cấy truyền từ môi trƣờng
thạch cấp 1 17
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tốc độ tơ nấm trên môi trƣờng hạt lúa 17
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tốc độ lan tơ của tổ chức hệ sợi ở các nghiệm thức 19
Hình 3.6. Màu sắc và tốc độ lan tơ nấm hoàng chi sau 16 ngày nuôi ở môi trƣờng truyền
thống 20
Hình 3.7. Màu sắc và tốc độ lan tơ nấm hoàng chi sau 16 ngày ở môi trƣờng bổ sung 80 %
rong giấy 21
Hình 3.8. Sự khác nhau về màu sắc, tốc độ lan tơ nấm hoàng chi giữa môi trƣờng truyền
thống và môi trƣờng rong giấy sau 16 ngày 21
Hình 3.9.Ụ nấm sau 10 ngày ở 22
Hình 3.10. Ụ nấm sau 10 ngày ở 22
Hình 3.11. Tai nấm ở MTTT 24
Hình 3.12. Tai nấm ở MT rong 24
Hình 3.13. Tác giả và sản phẩm nấm hoàng chi trên môi trƣờng rong giấy 24
Hình 3.14. Sự khác nhau giữa quả thể nấm hoàng chi ở môi trƣờng rong và môi trƣờng
truyền thống 25
Hình 3.15. Nấm hoàng chi thu trong đợt 2 ở môi trƣờng 80% rong giấy 26
Hình 3.16. Loại nấm mốc (verticillum fungicola) ký sinh trên nấm hoàng chi 27
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MTTT: môi trƣờng truyền thống

NT : nghiệm thức
RG : rong giấy
MT : môi trƣờng



1
CHƢƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nấm linh chi (tên khoa học là Ganoderma lucidum) là một loại dƣợc liệu quý đã
đƣợc dùng trong y học cổ truyền để trị bệnh và bảo vệ sức khỏe từ lâu đời. Hiện nay
có 6 loại nấm linh chi phổ biến đã đƣợc con ngƣời nghiên cứu đầy đủ và đang đƣợc
sử dụng một cách rộng rãi, đó là: linh chi trắng (Bạch chi), linh chi vàng (Hoàng
chi), linh chi xanh (Thanh chi), linh chi đỏ (Xích chi), linh chi tím (Tử chi), linh chi
đen (Hắc chi). Nấm linh chi có tính bình, không độc, có tác dụng làm tăng trí nhớ,
dƣỡng tim, bổ gan khí, an thần, chữa trị tức ngực. Với hệ hô hấp có tác dụng ích
phổi, thông mũi, chữa ho nghịch hơi, an thần, ích tỳ khí. Nấm Linh Chi còn có các
tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí, chữa trị đau nhức khớp xƣơng, gân
cốt…Acid ganoderic cũng là một trong những thành phần chủ yếu của nấm linh chi
nói chung và nấm hoàng chi nói riêng. Chất này có hoạt tính dƣợc lý rất mạnh, có
tác dụng giảm đau, trấn tĩnh, ức chế sự phóng thích histamin tổ chức, giải độc, bảo
vệ tế bào gan, giảm lipid máu và tiêu diệt tế bào ung thƣ. Theo Shiao và cộng sự
(1994), dùng nấm linh chi có thể tăng khả năng miễn dịch và chữa đƣợc nhiều bệnh
nhƣ: hen phế quản, huyết áp cao, mỡ trong máu, chống lão hóa, co thắt tim, an thần,
đau nhức xƣơng, phòng ngừa bệnh ung thƣ, tốt cho hệ tiêu hóa, hệ bài tiết… Do đó
số lƣợng các loài nấm linh chi dùng trong công nghệ dƣợc liệu ngày càng tăng.
Ở Việt Nam có điều kiện tự nhiên, kinh tế và xã hội thuận lợi cho việc sản xuất
nấm, tuy nhiên việc phát triển nấm dƣợc liệu còn khá chậm so với các nƣớc trong
khu vực và trên thế giới và nghề trồng nấm cũng đang đứng trƣớc một số khó khăn

nhƣ: Trình độ công nghệ của ngƣời sản xuất ở quy mô nhỏ lẻ, còn nhiều hạn chế,
nhà xƣởng, trang thiết bị phục vụ cho sản xuất chƣa đƣợc đầu tƣ một cách bài bản
có hệ thống. Bên cạnh đó số giống nấm đang sử dụng bị thoái hóa, thiếu nguồn
giống gốc thay thế, quá trình sản xuất nhiều năm trên một diện tích dễ bị sâu bệnh
phá hoại, chi phí đầu vào khá cao. Việc sử dụng nguồn giá thể để trồng loại nấm

2
dƣợc liệu không đƣợc phổ biến, chủ yếu trên mạt cƣa cao su, gỗ lim, vỏ hạt nhãn
Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này không phải vô tận và không phải địa phƣơng nào
cũng sẵn có. Theo Thạc sĩ Cổ Đức Trọng Trung tâm Nghiên cứu linh chi và nấm
dƣợc liệu TP HCM, hiện nay lƣợng tiêu thụ nấm linh chi ở Việt Nam hàng năm là
70 tấn. Trong đó, lƣợng linh chi nhập về từ Trung Quốc khoảng 36 tấn, từ Hàn
Quốc khoảng 17 tấn, số còn lại do trong nƣớc sản xuất.
Tại khu vực Nha Trang - Khánh Hòa cho đến nay vẫn rất ít cơ sở nuôi trồng
đƣợc nấm linh chi để cung cấp cho thị trƣờng, do đó hàng năm thị trƣờng này phải
nhập một số lƣợng nấm linh chi khá lớn từ nơi khác về để phục vụ nhu cầu của
ngƣời dân. Qua nghiên cứu về những đặc tính sinh học và sinh thái của nấm linh
chi, chúng tôi nhận thấy tại khu vực Nha Trang - Khánh Hòa có đủ những điều kiện
đảm bảo cho loài nấm này sinh trƣởng và phát triển tốt trong việc hình thành thể
quả.
Trong quá trình đa dạng hóa nguồn cơ chất để trồng nấm linh chi nhằm tạo ra
đƣợc sản phẩm có hiệu suất sinh học và có giá trị dƣợc liệu cao, các nhà khoa học
đã không ngừng nghiên cứu, tìm hiểu, nuôi trồng khảo nghiệm loài nấm linh chi
trên những loại giá thể khác nhau nhƣ: mạt cƣa, bã mía, vỏ hạt nhãn… Tuy nhiên ở
mỗi loại môi trƣờng khác nhau thì sẽ cho giá trị sinh học nấm khác nhau.
1.2. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
 Xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật và tạo ra một công thức mới về nuôi trồng
nấm linh chi với nguồn nguyên liệu từ rong biển.
 Đóng góp vào bảo tàng nguồn cơ chất một loại giá thể mà nấm linh chi có
thể sinh trƣởng và phát triển.

 Tạo cơ sở khoa học cho tiến trình nghiên cứu về sau.
 Nâng cao giá trị tiềm năng kinh tế của biển.
1.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
 Tận dụng nguồn rong Giấy dồi dào làm giá thể trồng nấm linh chi, giải quyết
bài toán ô nhiễm môi trƣờng do rong Giấy đang gây ra.

3
 Ứng dụng quy trình kỹ thuật, tận dụng nguồn rong để tạo ra sản phẩm Nấm
hoàng chi có chất lƣợng tốt phục vụ đời sống.
 Chuyển giao quy trình công nghệ cho ngƣời dân địa phƣơng.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
1.4.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM TRÊN THẾ GIỚI
Trong số trên 2000 loài nấm lớn đã đƣợc biết đến trên thế giới có khoảng 300
loài đƣợc xếp vào nhóm nấm đƣợc dùng để làm thuốc nhƣ nấm linh chi, nấm đầu
khỉ, nấm ngân nhĩ, nấm phục linh nhĩ…
Hiện nay nấm linh chi đƣợc sản xuất tập trung ở khu vực Châu Á, trong đó các
nƣớc Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc là các nƣớc sản xuất lớn nhất.
Đặc điểm của nghiên cứu khoa học về nấm dƣợc liệu ở Trung Quốc là có sự
kết hợp chặt chẽ giữa các cơ quan nghiên cứu chuyên trách và cơ quan nghiên cứu
dân lập, giữa nghiên cứu và đào tạo, nghiên cứu mau chóng chuyển thành sản xuất
thƣơng phẩm.
Phúc Kiến - Trung Quốc đã bỏ ra hơn 30 triệu USD nhập các loại công nghệ,
thiết bị: máy hàn, thái lát, rút chân không nắn nắp, đóng túi, sấy khô…Đồng thời đi
tham quan, khảo sát học tập kinh nghiệm và kỹ thuật tiên tiến của nhiều nƣớc trên
thế giới.
Viện Nghiên Cứu Nấm Tam Minh đã đi sâu vào nghiên cứu phân lập nhóm
nấm dƣợc liệu thuần chủng nhƣ nấm đầu khỉ, nấm linh chi, ngân nhĩ và kỹ thuật
nuôi các đối tƣợng này. Để nhằm giảm giá thành của sản phẩm họ đã không ngừng
nghiên cứu cải tiến phƣơng pháp nuôi trồng trên bình bằng nuôi trồng trên túi
polime và đã nghiên cứu thành công phƣơng pháp lai đơn bào nhóm nấm dƣợc liệu

để chọn loại nấm có chất lƣợng cao, sau đó đã sáng tạo công nghệ nuôi cấy nấm
trên túi polime thay cho gỗ khúc.
Tại Hàn Quốc, nấm linh chi đã đƣợc nuôi trồng nhân tạo ở quy mô lớn. Ngoài
phƣơng pháp nuôi trồng trên thân gỗ, trên các bịch phụ phẩm nông lâm nghiệp đã
nghiền nhỏ, còn có thể nuôi cấy chìm để thu nhận sinh khối trong các nồi lên men.


4

1.4.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM LINH CHI Ở TRONG
NƢỚC
TS. NGÔ ANH khoa sinh trƣờng ĐH HUẾ là ngƣời đầu tiên ở nƣớc ta nuôi
trồng thành công nấm hoàng chi trên giá thể mạt cƣa có bổ sung hàm lƣợng dƣỡng
chất.
Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật (Viện Di
truyền nông nghiệp Việt Nam) vừa nghiên cứu thành công trồng nấm linh chi trên
bã mía, nguồn nguyên liệu dƣ thừa ở nhiều địa phƣơng. Nấm linh chi trồng trên bã
mía cho năng suất cao.
Khoa Sinh học, ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) vừa hoàn thiện công
nghệ sản xuất nấm linh chi từ bột sinh khối dạng sợi. Công nghệ này gồm các bƣớc:
Tuyển chọn giống, nhân giống, xử lý nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu, thanh
trùng, cấy giống, lên men, thu hồi, sấy…Có thể nói đây là công nghệ mang tính đột
phá trong ngành sản xuất nấm linh chi.
TS. Trƣơng Bình Nguyên, Viện Sinh Học Tây Nguyên (Lâm Đồng), vừa thành
công trong việc trồng thử nghiệm giống nấm mới có nguồn gốc từ Nhật Bản mang
tên Bunashimeji, còn gọi là nấm linh chi nâu. Theo đề tài “Nghiên cứu nuôi trồng
loài nấm Bunashimeji tại Đà Lạt - Lâm Đồng” của TS. Nguyên, khí hậu Đà Lạt rất
phù hợp để trồng loại nấm này quanh năm, trừ ba tháng 5, 6, 7 khi nhiệt độ phòng
lên trên 20ºC; cho kết quả về hình dáng và hàm lƣợng các chất protein, xơ, lipid
đều đạt chất lƣợng cao.

Nghiên cứu của Viện cơ điện và nông nghiệp: “Trồng Nấm Linh Chi trên vỏ
và hạt nhãn trên qui mô lớn” đƣợc đánh giá là mô hình sản xuất thân thiện với môi
trƣờng và cho giá trị kinh tế rất cao.

5
1.4.3 TỔNG QUAN VỀ RONG GIẤY














Hình 1.1. Rong giấy tại bờ biển Nha Trang - Khánh Hòa

Rong Giấy (Ulva retieulata) là loài thực vật thủy sinh, có đời sống gắn liền với
nƣớc. Rong Giấy sống ở biển, hấp thụ một lƣợng thức ăn phong phú chảy trôi dạt từ
lục địa ra, rong có nhiều tính chất không giống thực vật sống trên cạn. Do đó trong
rong Giấy chứa khá nhiều hàm lƣợng khoáng chất phù hợp cho hệ enzyme có trong
nấm linh chi phân giải, chuyển hóa thành phần dinh dƣỡng nuôi tơ nấm và hình
thành hệ sợi cho ra quả thể. Vì vậy nếu ứng dụng đƣợc nguồn nguyên liệu này làm
cơ chất cho việc trồng nấm thì sẽ không phải bổ sung một số thành phần dinh dƣỡng
nhƣ cám gạo, phân NPK, cám bắp. Đồng thời sẽ làm sạch đƣợc bờ biển, giảm thiểu

ô nhiễm môi trƣờng do loài rong này đang trực tiếp gây ra.
Qua phân tích chúng tôi thấy thành phần hóa học của rong Giấy khá cao. Kết quả
thể hiện ở bảng sau:


6

Bảng 1.3. Thành phần sinh học của Rong Giấy
(Phân tích mẫu tại Viện CNSH & MT-Trƣờng ĐH Nha Trang)

Tên mẫu
Chỉ tiêu phân tích
Protein (%)
Gluxit (%)
Khoáng Ca (mg/kg)
Rong Giấy
10,38
3,39
6,72

Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu ứng dụng nuôi trồng nấm
linh chi trên giá thể là rong Giấy và phụ liệu”, đề tài thành công sẽ mở ra một
tiềm năng khai thác nguồn nguyên liệu vô cùng phong phú từ biển để phục vụ cho
việc nuôi trồng, sản xuất nấm linh chi. Đồng thời sẽ đóng góp vào sự đa dạng hóa
bảo tàng nguồn cơ chất mà nấm linh chi có thể sinh trƣởng và phát triển.
1.4.4. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI
1.4.4.1. Đặc điểm sinh học của nấm linh chi
* Hình dạng và màu sắc quả thể:
Nấm linh chi (quả thể) gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối điện với
mũ nấm).

- Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đƣờng kính 0,5-3 cm.
- Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu
đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm.
- Mũ nấm khi non có hình trứng, màu trắng đục, lớn dần có hình quạt. Trên mặt
mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng
cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng nhƣ láng vecni. Mũ nấm có đƣờng kính 2-15 cm,
dày 0,8-1,2 cm, phần đính cuống thƣờng gồ lên hoặc hơi lõm.
Khi nấm đến tuổi trƣởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm.

Dinh dƣỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose.


7
* Điều kiện nuôi trồng:
- Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm hoàng
chi đều cần có độ thông thoáng tốt, nhà xƣởng phải sạch sẽ, thoáng. Nấm cần có
oxy để phát triển vì vậy nhà trồng cần có độ thông thoáng vừa phải, nhƣng phải
tránh gió lùa trực tiếp.
- Ánh sáng: yếu tố này chỉ cần thiết trong giai đoạn ra quả thể nhằm kích thích nụ
nấm phát triển. Nhà nuôi trồng nấm cần có ánh sáng khoảng 200 – 300 lux (ánh
sáng khuếch tán – ánh sáng phòng). Quá trình hình thành quả thể, nấm hoàng chi
không đƣợc tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời.
- Độ ẩm: độ ẩm rất quan trọng đối với sự phát triển tơ và quả thể của nấm. Trong
giai đoạn tăng trƣởng tơ, độ ẩm nguyên liệu yêu cầu từ 50 – 60%, còn độ ẩm không
khí không đƣợc nhỏ hơn 70%. Ở giai đoạn tƣới đón nấm ra quả thể, độ ẩm không
khí tốt nhất là 80 – 95%. Ở độ ẩm không khí 50%, nấm ngừng phát triển và có thể
chết, tai nấm sẽ bị khô mặt và cháy vàng bìa mũ nấm. Nhƣng nếu độ ẩm cao trên
95%, tai nấm dễ bị nhũn và rũ xuống.
- Nhiệt độ thích hợp:
Giai đoạn ủ tơ: 20

0
-30
0
C
Giai đoạn ra quả thể: 22
0
-28
0
C
- Độ pH: Nấm linh chi chỉ thích nghi trong môi trƣờng trung tính đến axit hơi yếu (5,5-7).






8
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Nấm hoàng chi
Loài nấm linh chi hiện nay có tên khoa học là: Ganoderma lucidum.
Trong đề tài này chúng tôi chọn loài: Nấm hoàng chi (có tên khoa học là
Ganoderma colossum), quả thể đƣợc tuyển chọn tại bảo tàng Vƣờn Quốc Gia Cát
Tiên - Đồng Nai làm đối tƣợng nghiên cứu chính. Có đặc tính sinh học khá phù hợp
điều kiện ở Nha Trang - Khánh Hòa và các địa phƣơng có khí hậu nóng ẩm.
Họ : Ganodermataceae.
Bộ : Ganodermatales
Lớp : Hymenomycetes
Ngành phụ : Basidiomycotina

Giới : Nấm thật
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
 Ống nghiệm
 Bông gòn không thấm nƣớc
 Chai thủy tinh
 Đèn cấy
 Túi nilon chịu nhiệt
 Panh cấy
 Bình tam giác
 Cân phân tích
 Nồi hấp Autoclauve
 Tủ sấy, tủ cấy vi sinh
2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất
 Môi truờng PGA cải tiến (môi trƣờng phân lập và nhân giống cấp 1): nƣớc
chiết (*), Glucose, cao nấm men , Agar, vi lƣợng (KH
2
PO
4
, MgSO
4
…)
(*) Nƣớc chiết gồm có: Giá đỗ, khoai tây, cà rốt.

9
 Môi trƣờng hạt lúa (môi trƣờng nhân giống cấp 2): Thóc, cám gạo, CaCO
3.

 Môi trƣờng nuôi trồng ra quả thể: Rong Giấy, mùn cƣa cao su, cám gạo, vôi bột.
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí Nghiệm Công nghệ Sinh học (Viện
Công nghệ sinh học & Môi trƣờng – Trƣờng ĐH Nha Trang).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Những nghiệm thức đƣợc thiết lập
Bảng 2.1. Tỷ lệ thành phần cơ chất trong các nghiệm thức


Tỷ lệ thành phần cơ chất ở các nghiệm thức (%)
Nƣớc
sạch
Mạt cƣa
Bột đậu
tƣơng
Cám
gạo
CaCO
3
Rong
giấy
Đƣờng
Nghiệm
thức
đối
chứng
(1)
75
1
22

1

1

Đủ ẩm
Nghiệm
thức 2
49


1
50

Đủ ẩm
Nghiệm
thức 3
38


2
60

Đủ ẩm
Nghiệm
thức 4
27


3
70

Đủ ẩm
Nghiệm
thức 5

16


4
80

Đủ ẩm




10
2.2.2. Dự kiến quy trình thực nghiệm nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá
thể rong Giấy và phụ liệu




Xử lý và đóng bịch


Vô trùng



Chăm sóc



2.2.2.1. Phân lập giống nấm hoàng chi cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng

Môi trƣờng thạch là môi trƣờng dùng để nhân giống cấp 1 trong sản xuất và cũng là
môi trƣờng dùng để giữ giống, ở đây là môi trƣờng PGA cải tiến.
Công thức môi trƣờng PGA cải tiến:
- Nƣớc chiết (*) 1 lít.
- Glucose 20 g.
- Cao nấm men 1g, Agar 20g
(*) Nƣớc chiết gồm có: 100g giá đỗ, 200g khoai tây, 100g cà rốt.
Môi trƣờng PGA cải tiến đƣợc thực hiện nhƣ sau: Khoai tây, cà rốt, giá đỗ đƣợc gọt
vỏ, rửa, cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nƣớc, đun sôi khoảng 20 phút, lọc
lấy nƣớc chiết và bổ sung nƣớc cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ sung thêm agar và cao
nấm men, đun cho các chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng
Rong giấy
Bịch giá thể
Bịch giá thể vô
trùng
Tai nấm tự nhiên
Giống cấp 1
Giống cấp 2
Đón hái nấm

11
50
0
C (áp vào má có thể chịu đƣợc) đem rót vào trong các ống nghiệm, và bình tam
giác, dùng để phân lập, cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm.
Với ống nghiệm rót 1/3 ống chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác thì đổ dày
khoảng 1 cm. Không đổ môi trƣờng vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi
nƣớc sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ƣớt bề mặt thạch. Cũng
không đổ môi trƣờng khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trƣờng đã bị đông vón lại.
Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1

o
C (250
0
F), 1atm trong 25 phút sau đó để nguội.
Để nhân giống đối tƣợng nghiên cứu trên môi truờng thạch chúng tôi tiến hành làm
nhƣ sau:
- Cấy các giống đã phân lập đƣợc từ ống giống thuần chủng sang các bình tam
giác và ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn.
- Ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 30
o
C, quá trình
ủ tiến hành trong môi trƣờng ánh sáng khuếch tán nhẹ (ánh sáng phòng đọc).
- Sau 2 ngày tơ nấm bắt đầu bung ra có màu trắng yếu, trong 2-4 ngày tơ nấm
còn yếu nhƣng sau khoảng 1 tuần lễ thì tơ bắt đầu bung mạnh, 15 ngày sau ta có thể
cấy truyền sang môi trƣờng cấp 2.
2.2.2.2. Nhân giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt lúa cấp 2
Môi trƣờng hạt lúa có bổ sung cám gạo là môi trƣờng chúng tôi chọn để nhân giống
cấp 2 đối với đối tƣợng trên.
Công thức môi trƣờng hạt:
- Thóc hạt: 90%
- Cám gạo: 8%
- CaCO
3
: 2%
- Quá trình chuẩn bị môi trƣờng hạt đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lúa ngâm trong nƣớc
lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung
ra thì ngừng lại, để ráo nƣớc, sau đó bổ sung thêm 8% cám gạo, 2% CaCO
3
. Mang
đi khử trùng ở nhiệt độ 121

o
C trong 30 phút sau đó để nguội. Tiếp đó cấy giống từ
trong môi trƣờng thạch vào trong chai có môi trƣờng hạt.

12
- Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng, sau khoảng 3 tuần lễ thì tơ nấm lan kín đáy bình và có
thể chuyển sang môi trƣờng ra quả thể.
2.2.2.3. Xử lý nguyên liệu rong Giấy và phụ liệu
- Rong giấy thu từ bờ biển Nha Trang – Khánh Hòa đƣợc xử lý sơ bộ bằng nƣớc ngọt.
- Mạt cƣa sàng qua bằng rây lỗ nhỏ để loại bỏ các mảnh gỗ vụn, mang ủ trong 3-5 ngày.
2.2.2.4. Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trƣờng hạt qua
Nguyên liệu sau khi đã đƣợc phối trộn và tạo độ ẩm thích hợp, ta cho vào túi
nilon chịu nhiệt, nghiệm thức truyền thống có trọng lƣợng 900 (g), nghiệm thức bổ
sung rong có trọng lƣợng 600 (g) dùng nút cao su chịu nhiệt làm cổ túi và lấy bông
gòn không thấm nƣớc làm nút bông. Bịch nguyên liệu phải đƣợc đóng căng các góc.
Sau đó mang những bịch môi trƣờng hấp ở nồi Autoclave trong 40 phút, hấp làm 2
lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ. Bịch hấp xong, để nơi sạch sẽ trong 12-24 giờ, chờ
nguội rồi mới cấy. Chúng tôi đã tiến hành đo nồng độ pH của bịch phôi, kết quả cho
thấy pH là 6 - 6,5. Chúng tôi tiến hành cấy giống trong tủ cấy vi sinh vô trùng.
2.2.2.5 . Chăm sóc và đón hái nấm
Bịch sau khi cấy giống, đƣợc chuyển vào nhà ủ cho tơ nấm mọc, và nhà ủ cần thỏa
mãn những yêu cầu sau:
 Sạch, thoáng mát và không cần ánh sáng vì trong giai đoạn này để trong
bóng tối sẽ hạn chế đƣợc sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời tơ nấm cũng sẽ
phát triển nhanh hơn.
 Bịch đem ủ có thể xếp trên kệ và treo lên giàn, tuyệt đối không chồng chất
lên nhau thành nhiều lớp, thời gian ƣơm kéo dài khoảng 25- 40 ngày, sợi nấm
phát triển, ăn dần vào bịch nguyên liệu tạo nên màu trắng đồng nhất, bịch rắn
chắc nhìn rất đẹp.
 Tƣới nƣớc: khi nấm bắt đầu nhú ra khỏi miệng cổ nút bông, tiến hành tƣới

nƣớc bên ngoài bịch nấm, về nguyên tắc tƣới nấm ở dạng phun sƣơng, trung bình
mỗi ngày tƣới 2-3 lần tùy theo độ ẩm môi trƣờng.
 Thu hái nấm: nấm linh chi ra ở dạng 1 tai xòe ra ở đầu cổ bông, hái nấm
đúng tuổi sẽ cho năng suất cao, chất lƣợng tốt.

13
2.2.3. Phƣơng pháp thu nhận kết quả
Mẫu đƣợc lấy theo phƣơng pháp lấy mẫu ngẫu nhiên.
Tất cả số liệu thực nghiệm đƣợc đo 3 lần bằng thƣớc, đơn vị cm. Lấy giá trị trung
bình. Hiệu suất sinh học của nấm hoàng chi trên giá thể là tỷ lệ giữa lƣợng thể quả
thu hoạch/trọng lƣợng cơ chất.
Khi nấm ra và đạt kích thƣớc tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến hành thu
hái. Quan sát hình thái bên ngoài, cắt ngang quả thể, đo chiều dài của tai nấm, chiều
dài phi cuống nấm và tiến hành cân.
Phân tích thành phần khoáng Ca, K của nghiệm thức chính.
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng bảng tính Microsoft Excel 2003.

14
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nuôi trồng thực nghiệm
Để bƣớc đầu khảo sát quy trình nuôi trồng, so sánh sự phát triển của tơ nấm trên
môi trƣờng truyền thống và môi trƣờng mới, chúng tôi tiến hành trồng thử nghiệm
nấm hoàng chi với các nghiệm thức trên môi trƣờng mới nhƣ đã nêu trong phần
phƣơng pháp.
3.1.1. Kết quả phân lập giống cấp 1 bằng phƣơng pháp tách mô vô trùng
Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, nấm hoàng chi (Ganoderma colossum) đƣợc phân lập
trên môi trƣờng thạch PGA cải tiến, các mẫu không bị nhiễm bắt đầu có sợi nấm
phát triển bao phủ xung quanh bề mặt mẫu sau 3-4 ngày cấy. Thu đƣợc giống cấp 1.
Phƣơng pháp phân lập giống nhƣ sau:
Từ tán nấm tƣơi thu hái, dùng nƣớc cất rửa 2 - 3 lần cho sạch, dùng bông
thấm cồn 70 độ lau nhanh qua mặt ngoài tán nấm.
Đƣa vào tủ cấy vô trùng dùng dao gọt bỏ toàn bộ phần bên ngoài của nấm,
tách lấy phần mô vô trùng bên trong, cắt thành miếng mẫu bằng hạt gạo, chuyển
vào môi trƣờng đã chuẩn bị ở trên, đem ủ trong tối ở nhiệt độ 27
0
C.
Đối với loài nấm linh chi thì việc phân lập trên môi trƣờng thuần khiết khá dễ
dàng, chỉ sau 2 ngày thì tơ đã bắt đầu bung sợi. Khảo sát khả năng trƣởng hệ sợi
nấm trên môi trƣờng PGA cải tiến ở nhiệt độ phòng (27±2
0

C). Đây là môi trƣờng
tối ƣu cho việc nhân giống cấp 1, bởi lẽ đây là môi trƣờng có chứa nhiều dinh
dƣỡng và cũng là môi trƣờng đƣợc thuần khiết nhất.








15
Hình 3.1. Nấm hoàng chi sau 5 ngày phân lập trên môi trƣờng thạch

Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn tốc độ lan tơ nấm trên môi trƣờng thạch


0
2
4
6
8
10
12
3 5 6 7 9
thời gian (ngày)
độ dài tơ nấm (cm)

16
Nhận xét: Sau 2 ngày phân lập, tơ nấm bắt đầu bung ra và phủ kín toàn bộ mô cấy,

tuy nhiên các sợi tơ nấm còn mỏng nên chƣa bám vào bề mặt môi trƣờng. Nhƣng từ
ngày thứ 3, sợi tơ nấm bắt đầu phát triển và tơ ăn lan xuống bề mặt của môi trƣờng
thạch khá nhanh, sợi tơ nấm mọc ra có màu trắng nhƣ bông. Các ngày tiếp theo tơ
nấm phát triển khá nhanh và sau 7 ngày hệ tơ nấm đã phát triển gần kín bề mặt
thạch. Thời gian phát triển mạnh nhất của hệ tơ nấm vào ngày thứ 5 và thứ 6, sau
ngày thứ 9 thì tổ chức của hệ sợi đã bệt lại khá chặt chẽ và có xu hƣớng lan chậm,
trong khoảng thời gian này hệ sợi đã ăn sâu xuống bề mặt thạch. Nhƣ vậy, trong
giai đoạn này chúng ta có thể cấy truyền sang môi trƣờng hạt lúa cấp 2 hoặc giữ
trong tủ lạnh để làm giống gốc.
Cần chú ý là nấm hoàng chi phát triển trong pha sợi rất kỵ ánh sáng, và tính
chất này thể hiện rõ ở hầu hết các loài Linh chi, khi đặt các ống nghiệm có sợi nấm
đang phát triển ra ngoài ánh sáng nhất là ánh sáng trực tiếp từ mặt trời thì sợi nấm
ngả vàng rất nhanh, có lẽ đây là một hình thức tự bảo vệ của sợi nấm trƣớc các tia
bức xạ nói chung và của ánh sáng mặt trời nói riêng. Do đó chúng tôi đề nghị là khi
phân lập, nhân giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng thạch thì tuyệt đối không đƣa
ra ngoài ánh sáng nhất là ánh sáng mặt trời.
3.1.2. Kết quả nhân giống trên môi trƣờng hạt lúa
Sau khi phân lập thành công giống cấp 1 trên môi trƣờng thạch, chúng tôi tiếp
tục cấy truyền để tạo giống cấp 2 trên môi trƣờng hạt lúa để làm meo giống cấy trên
môi trƣờng ra quả thể. Đây là môi trƣờng dễ kiếm, dễ thực hiện và cũng là môi
trƣờng có thể cung cấp số lƣợng nhiều mà tiết kiệm đƣợc chi phí.
Để nghiên cứu tốc độ lan của tơ nấm trên môi trƣờng, chúng tôi tiến hành
cấy giống nấm đã phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch vào các chai có chứa môi
trƣờng hạt lúa và cơ chất bổ sung (công thức môi trƣờng xem phụ lục 2). Tiến hành
theo dõi và thu nhận kết quả.




17

Hình 3.3. Giống nấm hoàng chi trên môi trƣờng hạt sau 12 ngày cấy
truyền từ môi trƣờng thạch cấp 1


Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tốc độ tơ nấm trên môi trƣờng hạt lúa
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
5 8 11 14 18 20
thời gian ( ngày)
chiều dài tơ nấm (cm)

18
Nhận xét: Môi trƣờng giá thể hạt lúa tỏ ra rất thích hợp cho tơ nấm phát triển,
chúng tôi nhận thấy chỉ sau 5 ngày cấy truyền giống, tơ nấm đã phát triển và bám
vào bề mặt môi trƣờng, tốc độ đo đƣợc là 2,4 cm. Những ngày đầu sợi tơ nấm còn
mỏng và thƣa, nhƣng từ ngày thứ 10 thì tổ chức của tơ nấm bắt đầu chặt chẽ hơn.
Tốc độ ăn sâu của tơ phát triển rất tốt và thời gian tối ƣu cho tơ ăn sâu tốt
nhất là từ ngày 12-18 ngày. Thời gian nhân giống nhanh, chúng ta có thể sử dụng
giống sau ngày thứ 22, bởi vì khi đó tốc độ phát triển của tơ mạnh nhất và ổn định,
đồng thời tổ chức hệ sợi nấm cũng kết cấu chặt chẽ, hệ sợi bệt lại, sợi bên dài.

3.1.3. Kết quả trên môi trƣờng ra quả thể
Bảng 3.1. Kết quả số liệu về tốc độ lan tơ của tổ chức hệ sợi nấm hoàng chi ở
các nghiệm thức
( số liệu lấy với n=3)

Thời
gian
(ngày)
Chiều dài (cm)
NT 1
(đối chứng)
NT 2
NT 3
NT 4
NT 5
5
2,5 ± 0,2
3,1 ± 0,3
3,3 ± 0,2
3,2 ± 0,3
3,3 ± 0,3
10
4,6 ± 0,3
8,2 ± 0,2
8,2 ± 0,2
8,5 ± 0,2
8,7 ± 0,2
15
6,2 ± 0,2
14,4 ± 0,1

13,7 ± 0,3
15,3 ± 0,3
16,4 ± 0,1
20
9,4 ± 0,3
23,4 ± 0,2
24,3 ± 0,2
24,1 ± 0,1
24,5 ± 0,2
15
12,8 ± 0,3




20
16,5 ± 0,2




30
19,4 ± 0,4




40
24,8 ± 0,2

19

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tốc độ lan tơ của tổ chức hệ sợi ở các nghiệm thức
Trong quá trình theo dõi sự lan tơ của tổ chức hệ sợi ở các nghiệm thức, chúng tôi
nhận thấy đã có nhiều sự khác biệt.
- Nhìn vào đồ thị trên ta thấy có sự chênh lệch về thời gian khá rõ ràng giữa 2 môi
trƣờng. Ở môi trƣờng truyền thống thì từ khi cấy giống vào bịch cho đến khi hệ sợi
lan kín đáy bịch vào khoảng 35 đến 40 ngày. Trong khi ở môi trƣờng bổ sung rong
giấy thì trong khoàng 18 đến 20 ngày là hệ sợi đã phủ kín đáy bịch, những nghiệm
thức mới tơ nấm có tốc độ lan khá đồng đều nhau, không có sự khác biệt quá lớn.
Sau ngày thứ 10 thì tổ chức hệ sợi đã ăn sâu vào cơ chất để rút thức ăn, tuy nhiên ở
nghiệm thức 80% rong giấy vẫn tỏ ra chiếm ƣu thế về tốc độ lan.
Tuy nhiên, một điều đáng lƣu ý là tổ chức hệ sợi nấm ở các nghiệm thức
khác nhau là có sự khác nhau khá rõ rệt và ngƣợc lại so với tốc độ lan tơ trên các
nghiệm thức (NT5>NT4>NT3>NT2>NT1). Các sợi nấm trên NT5 rất dày, trên
NT4 ta cũng thấy sợi nấm kết dày hơn hẳn so với TN1. Hiện tƣợng này có thể do
thành phần dinh dƣỡng của các loại môi trƣờng là khác nhau trong các nghiệm thức,
thành phần dinh dƣỡng giảm dần từ nghiệm thức 5 tới nghiệm thức 1. Chính vì giàu
dinh dƣỡng nên sợi nấm phát triển dày hơn, các sợi nấm bện kết chặt chẽ vào nhau
0
5
10
15
20
25

30
0 10 20 30 40 50
THỜI GIAN (ngày)
TỐC ĐỘ LAN TƠ (cm)
NGHIỆM THỨC TRUYỀN
THỐNG (1)
NGHIỆM THỨC 2
NGHIỆM THỨC 3
NGHIỆM THỨC 4
NGHIỆM THỨC 5