kết quả nghiên cứu chuyển gen bt vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu noãn theo đường ống phấn

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN BT VÀO CÂY BÔNG BẰNG
VI TIÊM VÀO BẦU NOÃN THEO ĐƯỜNG ỐNG PHẤN
Chủ nhiệm đề tài: KS. Trịnh Minh Hợp
Cán bộ thực hiện: KS. Nguyễn Thị Nhã, KS. Nguyễn Thị Dung,
KS. Thái Thị Lệ Hằng
1. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, bông là cây trồng kinh tế và lấy sợi tự nhiên quan trọng,
được trồng ở hơn 70 quốc gia và đóng góp 20-30 tỷ USD/năm giá trị bông xơ
(Bao-Hong Zhang và cs, 2001). Tuy nhiên, cây bông bị nhiều loại sâu gây hại,
hàng năm, mức tổn thất do sâu gây ra chiếm 20-40% tổng sản lượng bông
(Ahmad K.D., 1991) và tiêu tốn lượng thuốc sâu chiếm 24% tổng lượng thuốc
trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp (Colliot và Roux de Bretagne, 1993). Hiện
nay, để khắc phục các thiệt hại do sâu gây ra các nước trồng bông trên thế giới
đã tạo ra giống bông bông Bt kháng sâu.
Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống, tuy nhiên, diện tích và sản
lượng của ta rất thấp, chỉ đáp ứng 10-15% nhu cầu may mặc trong nước
(Nguyễn Hữu Bình, 2002). Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích
và tăng sản lượng của nước ta, nhưng quan trọng nhất vẫn là sâu hại (Nguyễn
Hữu Bình, 1990; Nguyễn Thị Hai, 1996). Theo chương trình phát triển của
Ngành Dệt-May, đến năm 2010, Việt Nam phải sản xuất được 300.000 tấn
bông xơ. Để thực hiện được chỉ tiêu này, bên cạnh việc áp dụng các chính
sách khuyến nông, biện pháp kỹ thuật canh tác mới, thì việc nghiên cứu tạo
giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết.
Bông biến đổi gen được trồng thương mại trên thế giới vào năm 1996,
với diện tích khoảng 0,8 triệu ha (Clive James, 1997). Từ đó đến nay, diện tích
trồng bông biến đổi gen liên tục tăng nhanh, đến năm 2005, diện tích trồng
bông biến đổi gen toàn cầu khoảng 10 triệu ha chiếm trên 30% trong tổng diện
tích bông (Clive James, 2005). Các loại bông biến đổi gen đang được phổ biến
là bông kháng sâu, chịu thuốc trừ cỏ và bông vừa kháng sâu, vừa chịu thuốc
trừ cỏ. Các nước Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc đang trồng bông biến đổi gen nhiều

nhất (Clive James, 2007). Trồng bông chuyển gen đem lại nhiều lợi ích như
tăng năng suất, giảm chi phí bảo vệ thực vật và nguy cơ ô nhiễm môi trường
Để tạo bông chuyển gen, chủ yếu sử dụng hai hệ thống chuyển gen là
phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium và trực
tiếp bằng bắn gen (Hemphill J.K. và cs, 1998). Tuy nhiên, nhược điểm của cả
hai phương pháp là phải thông qua hệ thống tái sinh cây bông bằng nuôi cấy
mô tốn nhiều thời gian, tỷ lệ tái sinh thấp và bị giới hạn chỉ ở giống bông
Coker, vốn không có các đặc tính nông sinh học tốt (Trolinder N.L. và cs,
1989; Fioozabady E. và cs, 1993; Koonce L. và cs, 1996). Chuyển gen trực
tiếp vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy hoa theo đường ống phấn là
phương pháp chuyển gen mới phát triển gần đây, có ưu điểm là dễ thực hiện,
tỷ lệ chuyển gen khá cao, khắc phục được khó khăn về tái sinh cây bông và có
1
thể chuyển gen vào bất kỳ giống bông nào (Hemphill J.K. và cs, 1998). Mặc
dù còn nhiều bàn cãi về cơ chế chuyển gen, nhưng hiện nay, phương pháp
đang được sử dụng rộng rãi và rất có hiệu quả ở Trung Quốc và một số nước
trên thế giới để chuyển gen vào các cây trồng như lúa nước, lúa mỳ, đậu
tương và đặc biệt là cây bông (Li Fuguang và Cui Jinje, 2001). Xuất phát từ
cơ sở trên, trong năm 2007 chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen
Bt vào cây bông bằng vi tiêm trực tiếp vào bầu noãn theo đường ống phấn”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1- Xác định các giống bông thích hợp cho vi tiêm;
2- Xây dựng quy trình chuyển gen Bt cho cây bông bằng phương pháp
vi tiêm vào bầu noãn thông qua đường ống phấn;
3- Tạo ra các dòng bông mang gen chuyển Bt phục vụ cho nghiên cứu
và sản xuất bông hàng hóa trong nước.
1.3. Nội dung nghiên cứu
1.3.1. Nội dung nghiên cứu tổng quát của đề tài
1- Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid để cung cấp cho vi tiêm;
2- Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa bông phục vụ cho vi tiêm;

3- Vi tiêm để tạo hạt bông mang gen chuyển Bt;
4- Sàng lọc cây mang gen chuyển sau vi tiêm;
5- Đánh giá các dòng bông mang gen ở mức phân tử.
1.3.2. Nội dung nghiên cứu cụ thể trong năm 2007
1- Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid để cung cấp cho vi tiêm;
2- Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa cho 3 giống C118, LRA5166
và TM1 phục vụ cho vi tiêm;
3- Vi tiêm cho 3 giống C118, LRA5166 và TM1 để tạo hạt bông mang
gen chuyển Bt;
4- Sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kháng sinh kanamycin.
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
2.1.1. Tình hình sản xuất cây bông biến đổi gen
Bông chuyển gen được nghiên cứu thử nghiệm vào năm 1987, thành
công đầu tiên thuộc về công ty Miorogene của mỹ. Công ty này đã được công
nhận bằng sáng chế về gen Bt kháng sâu. Sau đó, công ty Monsanto của Mỹ
mua lại bản quyền sử dụng gen Bt. Từ đó, Monsanto tổng hợp và chuyển vào
cây bông năm 1988; tạo được giống bông chuyển gen Deltapine năm 1990,
thí nghiệm và trồng thử nghiệm trên đồng ruộng năm 1992; bắt đầu đưa đi
trồng diện rộng trong sản xuất năm 1993-1994; và chính thức được công nhận
vào năm 1995. Cây bông biến đổi gen được trồng đầu tiên trên thế giới vào
2
năm 1996, chủ yếu ở Mỹ, với diện tích khoảng 0,8 triệu ha (Clive James,
1997). Từ đó đến nay, diện tích trồng bông biến đổi gen liên tục tăng nhanh.
Đến năm 2005, diện tích trồng bông biến đổi gen toàn cầu khoảng 10 triệu ha
chiếm trên 30% trong tổng diện tích 32 triệu ha trồng bông toàn thế giới
(Clive James, 2005). Các loại bông biến đổi gen đang được phổ biến là bông
kháng sâu, chịu thuốc trừ cỏ và bông vừa kháng sâu, vừa chịu thuốc trừ cỏ.
Các nước Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc đang trồng bông biến đổi gen nhiều nhất
thế giới (Clive James, 2007).

Mỹ là nước đầu tiên trên thế giới cho phép trồng thử nghiệm cây
chuyển gen vào năm 1995. Cây bông bông Bt được cho phép trồng thương
mại ở Mỹ vào năm 1996 với diện tích ban đầu 0,73 triệu ha, chiếm 14% diện
tích. Đến năm 2001, diện tích trồng bông Bt của Mỹ lên tới 2,08 triệu ha
chiếm 34% diện tích trồng bông toàn đất nước (Edge và cs, 2001). Ở Trung
Quốc, cây bông chuyển gen bắt đầu được trồng thương mại vào năm 1997 với
diện tích rất ít (<0,1 triệu ha), chiếm khoảng dưới 1% diện tích. Tuy nhiên,
sau đó diện tích trồng bông Bt kháng sâu của Trung Quốc tăng lên rất nhanh
và đến năm 2004 diện tích này đã là 3,7 triệu ha chiếm 66% trong tổng diện
tích trồng bông 5,6 triệu ha (Clive James, 2004) và đến nay diện tích trồng
bông Bt là 3,8 triệu ha (Clive James, 2007). Ấn Độ trồng bông Bt sau Trung
Quốc 6 năm, nhưng đến năm 2007, diện tích trồng tăng lên 6,2 triệu ha, vượt
Trung Quốc 2,4 triệu ha (Clive James, 2007). Tại Úc, cây bông biến đổi gen
cũng được cho phép trồng khá sớm. Đến năm 2004, có tới 80 % diện tích
trồng của Úc, tương đương 250.000 ha là bông biến đổi gen (Clive James,
2004) và năm 2007 đã tăng lên 100.000 ha (Clive James, 2007).
2.1.2. Ý nghĩa của trồng cây bông Bt
Có thể nói việc tạo ra giống bông Bt là thành tựu khoa học có ý nghĩa
rất lớn cho sản xuất bông của thể giới, góp phần rất lớn trong việc tăng năng
suất và sản lượng bông, giảm chi phí (chủ yếu là chi phí bảo vệ thực vật), hạ
giá thành sản phẩm, tăng hiệu quả kinh tế, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường
và tăng sức khỏe con người.
Chẳng hạn như việc trồng bông Bt đã làm tăng năng suất bông hạt 10-
38% so với trồng bông thường, trong đó, Ấn Độ, Achentina, Indonesia và
Nam Phi có năng suất bông Bt tăng rất cao (24-38%). Việc sử dụng bông Bt
cũng góp phần giảm chi phí bảo vệ thực vật, như đã giảm được số lần phun
thuốc 3-14 lần, trong đó Trung Quốc (14 lần), Indonesia (8 lần), Nam Phi, Úc
và Ấn Độ (7 lần) có số lần phun thuốc giảm khá nhiều. Do sự giảm về số lần
phun thuốc, nên cũng đã giảm được số lượng thuốc trừ sâu sử dụng trung bình
13% tổng số lượng thuốc trừ sâu sử dụng cho bông. Ở một số nước đã có sự

giảm rất lớn về lượng thuốc trừ sâu sử dụng như Trung Quốc (61%), Mỹ
(31%) và Úc (27%) (Clive James, 2002). Bông Bt liên tục mang lại lợi nhuận
cho người nông dân Ấn Độ, so với các giống bông thường thì bông Bt làm
tăng 50% sản lượng cũng như giúp giảm một nửa số thuốc trừ sâu cần sử
dụng, đem lại tác động tích cực về môi trường và sức khỏe cho người trồng
bông. Tính trên góc độ quốc gia, ước tính thu nhập của nông dân trồng bông
3
Bt tăng từ 840 triệu đô la Mỹ (năm 2006) lên đến 1,7 tỷ đô la (năm 2007), và
Ấn Độ từ một nước có sản lượng bông thấp nhất thế giới, từ một nước nhập
khẩu bông giờ đã trở thành 1 nước xuất khẩu bông (Clive James, 2007).
Tại Mỹ, trồng giống bông Bt cho năng suất bông xơ cao hơn giống
bông không Bt 14,7-20,5% (Benedict và Altman, 2001) và đem lại lợi
nhuận do việc tăng năng suất và giảm chi phí bảo vệ thực vật tính riêng
trong năm 2001 là 2,08 tỷ USD (Carpenter và Gianessi, 2001; Gianessi và
cs, 2002). Tại Trung Quốc, nhờ có sử dụng bông Bt mà đã giảm được 1/2-
2/3 lượng thuốc trừ sâu sử dụng so với trồng bông thường trong các năm
1999-2001 và tổng lợi nhuận thu được do trồng bông Bt kháng sâu trong 3
năm (1999-2001) gần 1,5 tỉ USD (Pray và cs, 2002). Năm 2007, bông Bt
được 7,1 triệu người Trung Quốc trồng trên diện tích 3,8 triệu ha (tăng so
với 3,5 triệu ha năm 2006), đây là chỉ số quan trọng phản ánh niềm tin của
nông dân vào công nghệ mới (Clive James, 2007).
2.1.3. Các loại bông Bt kháng sâu
Hiện nay, trên thế giới đang tồn tại các loại bông Bt kháng sâu:
Bollgard

, bông Bt Trung Quốc ( Chinese Bt Fusion Gene Cotton), Bollgard

II và một số giống bông kháng sâu khác.
Bollgard


là các giống bông Bt do công ty Monsanto của Mỹ tạo ra đầu
tiên và thương mại hoá vào năm 1995-1996, nó chỉ chứa một gen CryIAc, hiện
nay nó đang được trồng rộng rãi ở 9 nước trồng bông lớn trên thế giới với diện
tích khoảng 10 triệu ha. Khả năng kháng các loại sâu bông của giống bông cho
thấy, có khả năng kháng ở mức cao với sâu hồng, sâu xanh, kháng yếu với sâu
xanh da láng (20%) và kháng khá cao với các loại sâu còn lại (70-85%).
Giống bông Bt hỗn hợp là các giống bông do Viện Hàn lâm Khoa học
Nông nghiệp Trung Quốc (CAAS) tạo ra đầu tiên, nó chứa 2 gen CryIAb và
CryIAc được trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Ngoài ra thuộc nhóm bông Bt kháng
sâu này của Trung Quốc còn có loại bông Bt kháng sâu chứa 2 gen là Bt và CpTi.
Giống bông Bollgard

II là thế hệ bông Bt thứ 2 của Monsanto, nó
chứa đồng thời 2 gen CryIAc và CryIIAb, nó là loại bông Bt có phổ diệt
sâu rộng hơn và khả năng diệt sâu cao hơn thế hệ bông Bollgard

. Số
liệu cho thấy, tỷ lệ diệt sâu của bông Bollgard

II (92,2-100%) cao hơn
hẳn bông Bollgard

(1,2-84,4%). Ngoài ra, theo các kết quả nghiên cứu
khác, thì với bông Bollgard

II, sâu hại bông sẽ ít phát sinh tính kháng
hơn so với bông Bollgard

vì nó có chứa nhiều loại độc tố hơn. Bông
Bollgard


II được cho phép trồng lần đầu tiên tại Úc năm 2003 với diện
tích 5.000 ha, sau đó nó được cho phép trồng tại Mỹ và nhiều nước trồng
bông lớn khác trên thế giới.
Ngoài các giống bông nêu trên, năm 2002, công ty Dow AgroScience
cũng đã đưa ra giống bông Bt có phổ diệt sâu rộng chứa 2 gen CryIA(c) và
CryIF. Gần đây nhất công ty Sygenta đã đưa ra sản xuất lần đầu tiên tại Mỹ,
năm 2004 giống bông VIP (VIP Cotton) có chứa gen kháng sâu Vip
4
(Vegetative Insecticidal Protein), đây là loại bông có phổ diệt sâu rất rộng và
có tỷ lệ diệt sâu rất cao và sâu rất khó phát sinh tính kháng.
2.1.4. Nghiên cứu chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm
Chuyển gen bằng con đường ống phấn là phương pháp chuyển gen trực
tiếp vào các tế bào mầm. Nó là sự kết hợp giữa kỹ thuật di truyền hiện đại với
kỹ thuật chọn giống thông thường để cải tiến cây trồng bằng việc tạo ra các
biến dị và chọn lọc các đặc tính nông học quý. Đây là tiến bộ khoa học lớn mà
Trung Quốc đạt được trong những năm gần đây và bằng phương pháp này
một số lượng lớn các dòng/giống bông biến đổi gen đã được tạo ra và hiện
nay đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất bông.
Các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu Cây trồng kinh tế (ICC), Viện
Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Jiangsu (JAAS) đã hợp tác chặt chẽ với các
cơ quan khác, tạo giống bông khởi đầu bằng vi tiêm ADN tổng số vào các cây
bông nhận. Các kết quả đã chỉ ra rằng sự chuyển ADN tổng số giữa các giống
và các loài đã thành công dựa theo đường ống phấn, trong đó phần lớn các
con cháu đã biểu hiện biến dị. Sau 3-4 thế hệ chọn lọc một loạt các dòng ổn
định di truyền đã được chọn lọc (Zhang, 1992).
Năm 1992, nhóm của Gou ở Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học
(BRI), Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc (CAAS) đã thiết
kế và tổng hợp nhân tạo gen Bt GFM CryIA dựa theo mã sử dụng phù hợp
cho cây trồng (Gou và cs, 1995). Từ năm 1993, Ni và cs ở ICC và JAAS

đã chuyển các gen mã hóa cho Bt, Bt + CpTI, Chitinase, β-glucanase,
glucose oxidase, anti-fungal protein (APF) bằng con đường ống phấn vào
các giống bông Trung Quốc như Zhongmiansuo 12 & 19, Zhongzhi 372,
Simian 3, Sumian 8 & 12, Siyang 167 & 168, Shiyuan 321, Xinluzao 4, 7
& 8, Liaomian 15, 3517, 541, 916, C6524, Q010, Suyin A, B & C và
giống bông ít gossypol W8. Kết quả đã thu được một loạt các dòng/giống
bông chuyển gen kháng cao với cả sâu đục quả và các bệnh nấm (Ni và cs,
1996, Gou và cs, 1999). Các phân tích về phân tử, sinh học và di truyền
cây chuyển gen đã xác nhận sự gắn vào genom và biểu hiện của gen mục
tiêu. Điều này chỉ ra rằng, chuyển gen thông qua đường ống phấn là một
hệ thống chuyển gen hiệu quả.
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong lĩnh vực chuyển gen vào cây trồng, Việt Nam lạc hậu so với thế
giới hàng chục năm. Vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ XX, khi những
cây chuyển gen đầu tiên đang được thương mại trên thế giới, lúc đó ở Việt
Nam, mới bắt đầu nghiên cứu tiếp cận kỹ thuật này. Một số công trình nghiên
cứu chuyển gen chọn lọc (kháng kanamycin, hygromycin và gen Bar) và gen
chỉ thị (gen GUS) vào một số cây trồng (lúa, cải bắp và thuốc lá) được tiến
hành ở một số phòng thí nghiệm của các Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di
truyền Nông nghiệp, Viện Sinh học Nhiệt đới và Viện Nghiên cứu Lúa đồng
bằng sông Cửu Long (Lê Huy Hàm, 2003). Những nghiên cứu này nhằm mục
5
đích hoàn thiện các quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng, làm
cơ sở cho các bước nghiên cứu kế tiếp.
Những năm gần đây, một số gen kháng sâu bệnh và chất diệt cỏ
như các gen CryIAb, CryIAc, CryIC kháng sâu; gen GNA kháng rầy; gen
chitinase và gen glucanase kháng nấm; gen Xa21 kháng bệnh bạc lá; và
gen bar chịu thuốc diệt cỏ được chuyển vào một số cây trồng quan trọng
như lúa, khoai, cà chua, cải bắp, cải dầu, thuốc lá, đu đủ Kết quả, chúng
ta đã thu được những cây chuyển gen và lưu giữ chúng trong điều kiện in-

vitro và nhà kính. Tuy nhiên, tất cả những cây trồng chuyển gen được tạo
ra ở Việt Nam mới chỉ tồn tại ở quy mô thí nghiệm (Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, 2002).
Trong Chương trình Công nghệ Sinh học KHCN-02 giai đoạn 1996-
2000 có một đề tài đăng ký thực hiện công nghệ chuyển gen ở cây trồng,
trong đó gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa và nhóm gen Cry
kháng sâu được chuyển vào cây lúa (Lê Thị Muội và cs 2000). Trước đó
cũng đã có những nghiên cứu phân lập gen chịu lạnh ở cây lúa (Lê Trần
Bình và Lê Thị Muội, 1998). Trong chương trình Nghiên cứu Khoa học và
Phát triển Công nghệ Sinh học KC-04 giai đoạn 2001-2005 có đề tài
“Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức
chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi”. Thông qua đề tài, các
gen kháng bệnh đạo ôn lúa (gen Pi-1/Pi-2t), gen kháng sâu (gen Cry và
VIP), gen giữ hoa lâu tàn (gen ACO antisense), gen kháng nấm (gen
Chitinase và OXDC), gen kháng bệnh bạc lá vi khuẩn (gen Xa21), gen
kháng thuốc trừ cỏ (gen Bar), gen tăng tính chịu hạn, mặn (gen P5CS), gen
kháng rầy (gen GNA), gen tăng protein dự trữ (gen AmA1) và gen chín sớm
(gen FPF1) được thu thập, phân lập và thiết kế gen để chuyển cho một số
loại cây hoa (cúc, cẩm chướng, hồng và lan), cây lâm nghiệp (hông, tếch,
bạch đàn lai và keo lai), cây lương thực và thực phẩm (lúa, ngô và đậu
tương) và cây bông. Đối với cây bông, sẽ chuyển các các gen Cry kháng
sâu, gen Bar kháng thuốc trừ cỏ và gen P5CS tăng tính chịu hạn vào cây
bông để tạo các giống bông kháng sâu, chống chịu thuốc trừ cỏ và chịu hạn
(Lê Trần Bình, 2001). Tuy nhiên, các kết quả đạt được mới dừng lại ở thử
nghiệm trong phòng thí nghiệm và nhà kính.
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Giống bông
Ba giống bông được nghiên cứu chuyển gen là C118, LRA5166 và TM1.
3.1.2. Gen kháng sâu

Hai gen kháng sâu được sử dụng để chuyển là VIP3 (được thiết kế
trong vectơ PBI121) và CryIAc (pIBT(C;P)). Các gen này đều do Viện Công
nghệ Sinh Học Hà Nội thiết kế và cung cấp.
6
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Tách chiết và tinh sạch plasmid
* Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
- Nuôi 1-5ml dịch khuẩn (lấy 1 khuẩn lạc cho vào môi trường LB hoặc
LBG) qua đêm hoặc 16 h hoặc 10-12 OD (nếu vượt quá sẽ nhiễm RNA, DNA
của khuẩn).
- Chuyển dịch khuẩn sang ống 2ml. Ly tâm 1 phút, thu lấy cặn.
- Thêm 250µl dung dịch resuspension, vortex hoặc dùng pippet hút lên,
xuống cho đến khi cặn tan hoàn toàn.
- Thêm 250µl dung dịch lysis, đảo 6-8 lần cho đồng nhất (không được vortex
hoặc shake để tránh nhiễm ADN của vi khuẩn), để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thêm 350µl dịch neutralization, đảo 6-8 lần (không được vortex hoặc shake).
- Ly tâm 5 phút cho lắng cặn màu trắng (dịch nổi-phần chứa ADN plasmid).
* Tinh sạch ADN plasmid
- Chuyển dịch nổi sang cột spin (chèn cột lênn ống loại 2ml-có cung
cấp theo kit).
- Ly tâm 1 phút để đẩy ADN plasmid gắn chặt vào màng cột tinh sạch.
- Thêm 750µl dịch rửa 1X (thêm 4 vol cồn tuyệt đối vào dịch rửa có
nồng độ 5X trước khi dùng) và ly tâm 1 phút.
- Ly ly tâm 1 phút để loại bỏ hết dịch rửa, thay cột sang ống rửa mới.
Ly ly tâm 1 phút loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
* Thu thập mẫu tinh sạch
- Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorft mới (loại 1,5-2,0ml).
- Bổ sung 50µl dịch hòa tan ADN plasmid lên màng cột, cố định 1 phút
để nó hàa tan và tách khỏi màng. Ly tâm 1 phút thu lấy dịch plasmid.
- Loại bỏ cột, ADN plasmid tinh sạch có thể được dùng ngay hoặc

được giữ ở 4
0
C (kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%).
* Bảo quản ADN plasmid
ADN plasmid sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được pha loãng bằng
nước khử ion thành dung dịch mẹ có nồng độ 100µg/ml và bảo quản ở tủ -20
0
C.
3.3.2. Nghiên cứu thời điểm nở hoa và kích thước bầu nhụy
- Xác định thời gian nở rộ hoa trong ngày: khi cây bông bắt đầu nở hoa, tiến
hành đếm số hoa nở ở 3 khoảng thời gian (1): trước 6h ; (2): 7-9h; và (3): sau 10h.
- Xác định kích thước của bầu nhụy và chiều dài của trụ noãn: chọn các
hoa nở bình thường ở vị trí thứ nhất và 2 trên các cành quả từ 1 đến 6, ở giai
đoạn sau nở hoa 24 tiếng để đo đến các chỉ tiêu chiều dài, rộng của bầu. Cắt
đôi bầu nhụy để xác định chiều dài của trụ noãn.
7
3.3.3. Chuẩn bị vi tiêm
- Tự thụ phấn trước khi hoa nở: vào chiều ngày trước khi hoa nở (ngày
thứ nhất), chọn các nụ ở vị trí thứ nhất và 2 trên cành quả từ thứ nhất đến thứ
7, có cánh hoa đã nhô dài ra, chấm sơn vào đầu nụ hoặc dùng dây buộc chặt
đầu nụ để cho hoa tự thụ phấn.
- Thời điểm vi tiêm: sáng ngày hôm sau (ngày thứ 2), các nụ chọn tự
thụ sẽ nở hoa và thụ phấn (khoảng 6-9 h). Thời gian từ nở hoa, thụ phấn đến
thụ tinh kép khoảng 24-28 tiếng, nên thời điển thuận lợi cho vi tiêm là sau khi
nở hoa và thụ phấn 20-24 tiếng, tức từ 6 đến 9 h buổi sáng ngày thứ 3.
- Chuẩn bị trước khi vi tiêm
+ Chuẩn bị vi kim tiêm: sử dụng vi kim tiêm loại dung tích 10µl. Trước
khi vi tiêm cần lau chùi sạch sẽ bằng cồn tuyệt đối, sau đó ngâm vào nước cất
khử trùng trước và sau khi sử dụng.
+ Chuẩn bị dung dịch ADN plasmid: trước khi vi tiêm, lấy dung dịch

mẹ (nồng độ 100µg/ml) pha loãng bằng nước khử ion thành các dung dịch
làm việc có nồng độ 10, 20 và 30µg/ml. Thể tích dịch mỗi lần vi tiêm là 10µl.
+ Lấy dung dịch vi tiêm: Dùng 3 ngón giữa, áp út và út của tay phải giữ
chặt thân xi lanh, dùng ngón trỏ và cái điều khiển pít tông. Trước khi hút
dung dịch, cần đảm bảo pít tông khít với đáy xi lanh. Rút pít tông chậm và
đều cho đến khi thể tích dung dịch đã vào xi lanh đủ (10µl). Chú ý, không để
có bọt khí trong dịch hút.
3.3.4. Tiến hành vi tiêm
- Cắt bỏ cánh hoa hoặc đè bẹp chúng ra các bên. Cắt bỏ vòi nhụy đến
sát với bầu hoa (chú ý tránh làm tổn thương các tế bào nhu mô của bầu nhụy
khi cắt bỏ cánh hoa, các hoa chấm sơn bị bung ra phải bỏ đi).
- Dùng 2 ngón áp út và út của tay trái kẹp lấy cuống hoa, dùng 3 ngón
còn lại giữ bầu nhụy thẳng đứng vuông góc với mặt đất. Dùng 3 ngón cái, trỏ
và giữa của tay phải giữ xi lanh. Ấn thẳng đứng mũi kim tiêm vào điểm giữa
của vòi nhụy, đẩy từ từ đến 2/3 chiều dài bầu nhụy, sau đó kéo lùi lại 1/3 để
tạo khoảng trống, dùng ngón cái bơm nhẹ nhàng dịch tiêm vào bầu và cuối
cùng rút từ từ kim tiêm ra.
- Sau khi rút kim ra, để giảm sự rụng quả, cần bôi lên vết tiêm dung
dịch khử trùng và đầu cuối cuống hoa dung dịch gibberellin nồng độ 40ppm.
- Đeo thẻ để đánh dấu quả vi tiêm.
- Chăm sóc sau vi tiêm: chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh triệt để cho
cây sinh trưởng phát triển tốt. Cần cắt ngọn của cành quả để tập trung dinh
dưỡng nuôi quả và hạt bông quả vi tiêm.
- Thu hoạch: các quả bông vi tiêm được thu hoạch và tách lấy hạt để
phục vụ cho sàng lọc cây chuyển gen sau này.
8
3.3.5. Phương pháp sàng lọc cây chuyển gen bằng kanamycin
Gieo hạt bông vi tiêm trong nhà lưới, pha kanamycin với nước cất ở
nồng thích hợp (nồng độ giống bông mẫn cảm), phun ướt toàn bộ lá cây bông
ở giai đoạn cây 15-20 ngày tuổi. Loại bỏ các cây dương tính, các cây âm tính

còn lại được chăm sóc, tự thụ và thu riêng quả cho từng cây để cung cấp hạt
cho nghiên cứu sàng lọc tiếp sau.
3.4. Chỉ tiêu theo dõi
1- Nồng độ, số lượng và chất lượng ADN plasmid tách chiết.
2- Thời điểm nở hoa, kích thước bầu nhụy và chiều dài trụ noãn.
3- Số hoa tiêm, quả đậu, quả dị dạng, số hạt.
4- Tỷ lệ cây và triệu trứng lá cây bông mẫn cảm với kanamycin.
5- Số lượng, tỷ lệ cây âm tính ở mỗi công thức.
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid cung cấp cho vi tiêm
Chất lượng ADN plasmid tốt là thông số rất quan trọng trong chuyển
gen bằng kỹ thuật vi tiêm. Để tách chiết và tinh sạch được ADN plasmid có
chất lượng cao, chúng tôi đã tiến hành nuôi vi khuẩn E.coli chủng DH5α
mang 2 vectơ chuyển gen pBI121 và pIBT (C;P) (ảnh 1), sau đó, tách chiết
và tinh sạch ADN plasmid theo kít (Arrunium mini kit) của Công ty Biorad.
Kết quả thu được trong bảng 1 cho thấy, sau 6 đợt tách chiết, thu được tổng
cộng 39ml dung dịch ADN plasmid, với nồng độ bình quân 953,7µg/ml.
Kết kiểm tra OD cho thấy, ADN plasmid tách chiết được có chất lượng rất
tốt, các thông số OD260/OD280 và OD260/OD230 đều nằm trong phạm
vi cho phép (đều đạt và tương tự với nghiên cứu của Song và cs., 2006, độ
sạch của ADN phải đạt OD260/OD280 > 1,8 và OD260/OD230 > 2). Kết
quả điện di để kiểm tra cũng cho thấy, ADN plasmid có 3 vạch sắc nét,
điều đó chứng tỏ ADN có chất lượng tốt, không lẫn tạp, đủ tiêu chuẩn cho
vi tiêm. Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận thấy, nồng độ và chất lượng ADN
9
Ảnh 1. Các vector chuyển gen
A
B
plasmid thu được giữa các đợt tách không chênh lệch đáng kể, chứng tỏ sử
dụng kít của hãng Biorad để tách chiết là phù hợp.

Bảng 1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid
Đợt Gen Thể tích
(ml)
Nồng độ
(µg/ml)
OD260/
OD280
OD260/
OD230
1 Vip3 9 960 1,82 2,05
2 CryIAc 10 925 1,85 2,12
3 CryIAc 5 988 1,80 2,04
4 Vip3 5 968 1,82 2,08
5 Vip3 5 955 1,82 2,04
6 CryIAc 5 926 1,81 2,10
Tổng/TB 39 953,7 1,82 2,07
Sau khi tách chiết được ADN plasmid sạch, chúng tôi tiến hành pha
loãng thành các nồng độ nghiên cứu (100, 200, 300 µg/ml) bằng nước khử
ion vô trùng và bảo quản ở -20
0
C để phục vụ vi tiêm.
4.2. Kết quả nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa bông phục vụ cho vi tiêm
4.2.1. Xác định thời điểm nở hoa trong ngày
Các nghiên cứu cho thấy, thời gian vi tiêm tốt nhất khoảng 20-24 giờ
sau khi bông nở hoa và tung phấn. Vì vậy, thời điểm hoa bông nở trong ngày
là chỉ tiêu rất quan trọng cho vi tiêm, bởi vì thời điểm này được sử dụng để
làm căn cứ để xác định thời điểm vi tiêm trong ngày.
Bảng 2. Tỷ lệ (%) hoa nở ở các thời điểm trong ngày của 3 giống bông
Giống 6-7 h 7-8 h 8-9 h 9-10 h
1- C118 23,43 76,31 0,26 0,00

2- LRA5166 4,38 92,70 2,92 0,00
3- TM1 11,50 87,22 1,29 0,00
Trung bình 13,1 85,4 1,5 0,00
Số liệu nghiên cứu thời điểm nở hoa trong ngày của 3 giống bông trong
bảng 2 cho thấy, hoa của các giống bông đều nở rộ vào khoảng thời gian 7-8
giờ (85,4%), riêng giống C118 có hoa nở sớm hơn (6-8 giờ, chiếm 23,43%).
Từ kết quả này, chúng tôi đi đến kết luận, thời điểm vi tiêm thích hợp nhất
cho 3 giống bông này là từ 6-8 giờ vào ngày thứ 2 sau khi hoa nở.
4.2.2. Kích thước bầu nhụy
Kích thước bầu nhụy, đặc biệt là chiều dài trụ noãn của hoa bông tại
thời điểm vi tiêm cũng là chỉ tiêu rất quan trọng cho vi tiêm, bởi vì người ta
căn cứ vào các chỉ tiêu này để xác định độ sâu kim tiêm và chọn giống bông
thích hợp cho vi tiêm.
Bảng 3. Kích thước (cm) bầu nhụy và chiều dài trụ noãn của 3 giống bông
Cành quả Đặc tính C118 LRA5166 TM1
Rộng 0,73 0,61 0,84
10
1 Dài bầu 1,01 0,91 1,09
Dài trụ noãn 0,91 0,79 0,95
2
Rộng 0,75 0,62 0,92
Dài bầu 1,06 0,92 1,14
Dài trụ noãn 0,94 0,82 0,98
3
Rộng 0,75 0,66 0,95
Dài bầu 1,06 0,97 1,22
Dài trụ noãn 0,94 0,82 1,07
4
Rộng 0,78 0,67 0,97
Dài bầu 1,12 1,00 1,27

Dài trụ noãn 0,96 0,84 1,09
5
Rộng 0,81 0,68 1,01
Dài bầu 1,13 1,00 1,27
Dài trụ noãn 0,98 0,86 1,10
6
Rộng 0,77 0,67 0,98
Dài bầu 1,12 0,96 1,22
Dài trụ noãn 0,99 0,83 1,04
7

Rộng 0,77 0,67 0,96
Dài bầu 1,12 0,96 1,22
Dài trụ noãn 0,98 0,82 1,04
Trung bình
Rộng 0,77 0,66 0,95
Dài bầu 1,09 0,96 1,21
Dài trụ noãn 0,96 0,83 1,06
Độ sâu kim 1 0,73 0,64 0,80
Độ sâu kim 2 0,72 0,62 0,78
Để xác định kích thước bầu nhụy và chiều dài trụ noãn, chúng tôi tiến
hành lấy hoa bông ở vị trí thứ nhất và hai của các cành quả từ thứ nhất đến
thứ 7 để đo đếm các chỉ tiêu. Kết quả thu được trong bảng 3 cho thấy, giống
TM1 có kích thước bầu nhụy và chiều dài trụ noãn lớn nhất, tiếp theo là C118
và cuối cùng là LRA5166. Căn cứ vào các kích thước này, chúng tôi cũng đã
xác định độ sâu của mũi kim tiêm (khoảng 3/4 chiều dài trụ noãn theo Ni
Wanchao và cs., 1996) cho giống C118 là 0,72-0,73cm, LRA5166 là 0,62-
0,64cm và TM1 là 0,78-0,80cm.
4.3. Kết quả vi tiêm tạo hạt
Sau khi tách chiết được ADN plasmid và xác định các thông số cho vi

tiêm (thời điểm vi tiêm và độ sâu kim tiêm), chúng tôi đã tiến hành vi tiêm 2
gen VIP3 và CryIAc ở 3 nồng độ ADN plasmid (10, 20, 30 µg/µl) cho 3
giống bông. Kết quả vi tiêm thu được trong bảng 4.
Bảng 4. Kết quả vi tiêm 2 gen CryIAc và VIP3 cho các giống bông
Giống Số hoa
tiêm
Số quả đậu Tỷ lệ đậu
quả (%)
Tổng hạt Số hạt/quả
11
Gen CryIAc
1- C118 2.207 1.993 89,4 27.120 13,29
2- LRA5166 2.815 2.542 90,3 34.770 13,34
3- TM1 3.200 2.763 83,2 26.123 9,54
Tổng 8.222 7.298 - 88.013 -
Trung bình - - 87,0 - 11,69
Gen VIP3
1- C118 3.573 3.191 88,8 35.107 11,06
2- LRA5166 1.370 1.242 90,8 18.324 14,58
3- TM1 2.495 2.258 92,2 20.043 9,13
Tổng 7.438 6.691 - 73.474 -
Trung bình - - 90,6 - 11,59
Tổng 15.660 13.989 - 161.487 -
Trung bình - - 88,9 - 11,64
Số liệu bảng 4 cho thấy, qua 6 đợt vi tiêm, đã vi tiêm cho 15.660 hoa,
thu được 13.989 quả và 161.487 hạt bông vi tiêm. Trong đó, vi tiêm gen
CryIAc được 88.013 hạt và vi tiêm gen VIP3 được 73.474 hạt. Trung bình,
khi vi tiêm, tỷ lệ đậu quả đạt 88,9%, số hạt/quả đạt 11,6 hạt thấp hơn khoảng
50% so với quả đậu bình thường. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của
ZHANG Yongquang và JIA Shiring (2004).

Nghiên cứu ảnh hưởng của giống đến kết quả vi tiêm, số liệu bảng 4
cho thấy, các giống có tỷ lệ đậu quả vi tiêm khá cao (83-92%). Trong đó,
giống LRA5166 có tỷ lệ đậu quả nhỉnh hơn (90,5%), hai giống còn lại có tỷ lệ
đậu quả tương đương nhau (88,4 và 88,1%). Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận
thấy, khi vi tiêm cho các giống này, giống LRA5166 cho nhiều hạt/quả nhất
(12-16 hạt/quả), tiếp theo là giống C118 (11-13 hạt/quả), giống TM1 vi tiêm
dễ nhưng cho ít hạt (8-11 hạt/quả).
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ADN plasmid đến tỷ lệ quả đậu, số
liệu thu được ở bảng 5 cho thấy, với 2 giống C118 và LRA5166, tỷ lệ quả đậu
có xu hướng giảm khi tăng nồng độ ADN plasmid. Ngược lại, với giống TM1
thì tỷ lệ này lại có xu hướng tăng khi tăng nồng độ plasmid. Tuy nhiên, xu
hướng này vẫn chưa thể hiện rõ ràng và cần phải được nghiên cứu tiếp, đặc
biệt cần nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ADN plasmid đến tỷ lệ cây
chuyển gen sau này thì mới có ý nghĩa hơn.
Bảng 5. Ảnh hưởng của giống, nồng độ plasmid đến kết quả vi tiêm
Giống Nồng độ Tổng số
hoa tiêm
Tổng số
quả đậu
Tỷ lệ đậu
quả (%)
Tổng hạt Số
hạt/quả
C118
10 1.401 1.255 89,6 15.704 12,51
20 1.508 1.353 89,7 15.903 11,75
30 1.766 1.516 85,8 18.415 12,15
Tổng 4.675 4.124 - 50.022 -
Trung bình - - 88,4 - 12.14
10 1.234 1.132 91,7 14.345 12,67

12
LRA516
6
20 1.452 1.309 90,2 20.090 15,35
30 1.499 1.343 89,6 18.569 13,53
Tổng 4.185 3.784 - 53.004 -
Trung bình - - 90,5 - 13,95
TM1
10 1.844 1.581 85,7 16.812 10,63
20 1.895 1.669 88,1 13.757 8,24
30 1.956 1.771 90,5 15.597 8,81
Tổng 5.695 5.021 - 46.166 -
Trung bình - - 88,1 - 9,23
Khi vi tiêm, ngoài tác động của vết thương cơ giới và hóa chất đến tỷ lệ
đậu quả, thì thời vụ vi tiêm cũng có ảnh hưởng rất lớn. Kết quả số liệu trong
bảng 6 cho thấy, trong cùng một giống, tỷ lệ đậu quả ở thời vụ gieo tháng 6
(trong mùa Mưa) thấp hơn ở các thời vụ gieo tháng 2, 3 và 9 (trong mùa
Khô). Trong cùng một thời vụ, tỷ lệ đậu quả vi tiêm của các giống cũng khác
nhau, giống LRA5166 có tỷ lệ đậu quả tốt nhất (83,6-97,0%) và kém nhất là
giống TM1 ở thời vụ gieo tháng 6 (74,0%). Qua đây, chúng tôi sơ bộ kết luận
nên tiến hành vi tiêm vào thời vụ Khô.
Bảng 6. Ảnh hưởng của thời vụ đến kết quả vi tiêm
Thời vụ C118 LRA5166 TM1
Gieo đầu
tháng 2
Tỷ lệ đậu quả (%) 86,5 90,8 92,9
Số hạt/quả 12,4 14,6 6,6
Gieo đầu
tháng 3
Tỷ lệ đậu quả (%) 91,9 97,0 93,1

Số hạt/quả 13,9 14,0 8,2
Gieo đầu
tháng 6
Tỷ lệ đậu quả (%) - 83,6 74,0
Số hạt/quả - 12,7 12,3
Gieo giữa
tháng 6
Tỷ lệ đậu quả (%) 86,9 - -
Số hạt/quả 8,8 - -
Gieo đầu
tháng 9
Tỷ lệ đậu quả (%) 93,1 - 91,6
Số hạt/quả 11,9 - 11,7
Gieo giữa
tháng 11
Tỷ lệ đậu quả (%) 86,9 - 82,3
Số hạt/quả 12,7 - 8,2
Ghi chú: (-) không thực hiện
Về hình dạng quả vi tiêm, qua quan sát và đánh giá, chúng tôi
thấy, các quả vi tiêm đều có dạng hình không bình thường, hoặc vẻ ngoài
bình thường nhưng không có hạt (chủ yếu trên giống TM1). Kết quả
đánh giá mức độ dị dạng của quả ở các giống được trình bày trong các
phụ lục 1 và 2.
Ngoài ra, chúng tôi cũng đánh giá cảm quan về mức độ thao tác vi tiêm
từ dễ đến khó cho các giống lần lượt là TM1 (bầu to), LRA5166 (bầu nhỏ
nhưng dễ chọc kim tiêm) và cuối cùng là C118 (bầu trung bình nhưng vòi
nhụy dài, khó bẻ và cuống hoa rất dòn).
13
4.4. Kết quả sàng lọc cây bông vi tiêm mang chuyển bằng kanamycin
4.4.1. Xác định nồng độ kanamycin cây bông mẫn cảm

Do trong cả 2 vectơ chuyển gen đều có chứa gen nptII (kháng
kháng sinh kanamycin) đi kèm để phát hiện gen kháng sâu CryIAc và
VIP3, vì vậy, có thể dùng kanamycin để sàng lọc sơ bộ cây mang gen
chuyển. Tuy nhiên, giống bông khác nhau mẫn cảm với kanamycin ở
nồng độ khác nhau. Để xác định nồng độ này, 3 giống bông (C118,
LRA5166 và TM1) được gieo trong nhà lưới, khi cây bông được 15 ngày
tuổi, tiến hành phun trực tiếp dung dịch kanamycin ở các nồng độ khác
nhau lên toàn cây, sau đó tiến hành quan sát triệu chứng và đếm số cây
mẫn cảm ở các giai đoạn 4, 8 và 12 ngày sau phun.
Bảng 7. Tỷ (%) lệ cây bông trong nhà lưới mẫn cảm với kanamycin
Giống
Nồng độ kanamycin (mg/l) sau 4, 8 và 12 ngày phun
0 2.500 5.000 7.500 10.000
4 8 12 4 8 12 4 8 12 4 8 12 4 8 12
D97-5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C118 0 0 0 30 80 100 78 10
0
100 10
0
10
0
100 10
0
10
0
100
LRA516
6
0 0 0 64 64 91 75 10
0

100 10
0
10
0
100 10
0
10
0
100
TM1 0 0 0 100 100 100 20 10
0
100 10
0
10
0
100 10
0
10
0
100
Kết quả quan sát cho thấy, 4 ngày sau phun, xuất hiện các đốm
màu vàng nhạt trên phiến lá, 12 ngày sau phun, các vết đốm này lan rộng
ra (ảnh 5), đây chính là biểu hiện của cây bông mẫn cảm với kanamycin.
Số liệu thu được trong bảng 7 cho thấy, 3 giống C118, LRA5166 và TM1
đều bị mẫn cảm (hay phản ứng dương tính) với kanamycin rất rõ rệt ở
hầu hết các nồng độ kanamycin với tỷ lệ 100%. Cụ thể, ở nồng độ
2.500mg/l kanamycin, 4 ngày sau phun, giống TM1 biểu hiện dương
tính 100%, 12 ngày sau phun giống C118 biểu hiện dương tính 100%.
Giống LRA5166 biểu hiện 100% dương tính ở nồng độ cao hơn
5.000mg/l kanamycin (8 ngày sau phun). Từ kết quả này, chúng tôi kết

luận, trong điều kiện nhà lưới, nên phun kanamycin với nồng độ 2.500-
5.000mg/l để sàng lọc cây mamg gen cho 3 giống bông.
4.4.2. Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển
Sau khi xác định được triệu chứng cây bông mẫn cảm với kanamycin
và nồng độ kanamycin mẫn cảm của 3 giống bông, chúng tôi đã tiến hành
sàng lọc cây mang gen chuyển.
4.4.2.1. Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen VIP3
14
Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen VIP3 (bảng 8) cho
thấy, hạt vi tiêm có tỷ lệ mọc kém (50,6%); sau khi sàng lọc thu được 483 cây
kháng kanamycin (ảnh 6b-6d) từ 41.853 hạt thu được từ vi tiêm gen VIP3, đạt
tỷ lệ 2,27% (so với số cây mọc) và 1,15% (so với tổng số hạt gieo). Trong quá
trình sàng lọc chúng tôi còn nhận thấy, giống V2 (LRA 5166) có tỷ lệ hạt mọc
kém hơn hai giống C118 và TM1.
Bảng 8. Kết quả sàng lọc gen VIP3 (G1) bằng kanamycin
TT Công
thức
Hạt gieo Tỷ lệ
Mọc (%)
Cây +
tính
Cây - tính Tỷ lệ cây -
tính (%)
1 G1V1C1 5.523 74,1 4.058 33 0,81
2 G1V1C2 4.564 47,7 2.419 30 1,38
3 G1V1C3 4.506 50,3 2.748 19 0,69
4 G1V2C1 4.355 36,5 1.581 9 0,57
5 G1V2C2 7.055 50,3 3.490 62 1,75
6 G1V2C3 6.824 44,3 2.926 98 3,24
7 G1V3C1 3.144 57,6 1.742 68 3,76

8 G1V3C2 2.428 43,4 1.005 49 4.65
9 G1V3C3 2.454 50,1 1.136 115 9.19
Tổng 41.853 - 20.835 483 -
Trung bình - 50,6 - - 2,27
Ghi chú: V1-C118; V2-LRA5166; V3-TM1
C1-10µg/ml; C2-20µg/ml; C3-30µg/ml
Công thức 6-9 phun kháng sinh 2 lần
4.4.2.2. Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen CryIAc
Bảng 9. Kết quả sàng lọc gen CryIAc (G2) bằng kanamycin
TT Công
thức
Hạt gieo Tỷ lệ
mọc (%)
Cây +
tính
Cây - tính Tỷ lệ cây
-tính (%)
1 G2V1C1 6.651 65,6 4.283 78 1,79
2 G2V1C2 6.200 60,4 3.642 104 2,78
3 G2V1C3 8.640 55,8 4.415 408 8,46
4 G2V2C1 5.415 30,6 1.541 118 7,11
5 G2V2C2 9.960 35,1 3.335 159 4,77
6 G2V2C3 8.945 44,2 4.541 415 11,72
7 G2V3C1 3.525 58,1 1.751 297 16,96
8 G2V3C2 4.462 62,5 2.433 356 14,63
9 G2V3C3 5.024 64,3 2.908 322 11,07
Tổng 58.822 - 28.849 2.257 -
Trung bình 52,9 -
Ghi chú: V1-C118; V2-LRA5166; V3-TM1
C1-10µg/ml; C2-20µg/ml; C3-30µg/ml

15
Công thức 6-9 phun kháng sinh 2 lần
Tương tự, kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen CryIAc
(bảng 9) cũng cho thấy, hạt vi tiêm có tỷ lệ mọc kém, trung bình đạt 52,9%; sau
khi sàng lọc thu được tới 2.257 cây kháng kanamycin (ảnh 6b-6d) từ 58.822,
cao hơn nhiều so với khi sàng gen VIP3. Sở dĩ khi sàng lọc cây mang gen ở
gen CryIAc thu được số cây âm tính cao như vậy, theo chúng tôi ngoài yếu tố
hiệu quả chuyển gen cao còn do sau khi phun kháng sinh thì gặp mưa, nên hiệu
quả của kháng sinh không cao như mong muốn.
Số cây phản ứng âm tính thu được ở cả 2 gen sau đó được chăm sóc, tự
thụ và thu quả riêng từng cây để tiếp tục cung cấp hạt cho sàng lọc ở các thế hệ
tiếp theo và đánh giá gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
1- Sử dụng kít của hãng Biorad (Arrunium mini kit) để tách chiết ADN
plasmid. Đã tách chiết và tinh sạch ADN plasmid đủ chất lượng và số lượng
phục vụ cho vi tiêm.
2- Thời điểm vi tiêm trong ngày cho các giống bông là 6-8 giờ ngày thứ
hai sau khi hoa nở. Độ sâu của mũi kim cho giống C118 là 0,72-0,73cm,
LRA5166 là 0,62-0,64cm, và TM1 là 0,78-0,80cm.
3- Thời vụ phù hợp cho tiến hành vi tiêm là vụ Khô, 3 giống bông
C118, LRA5166 và TM1 đều thích hợp để vi tiêm.
4- Đã xây được quy trình chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp
vi tiêm qua đường ống phấn cho 3 giống C118, LRA5166 và TM1 (phụ lục
3). Tổng số hạt vi tiêm thu được là 161.487 hạt.
5- Sử dụng nồng độ kanamycin 2.500-5.000mg/l để sàng lọc cây mang
gen cho 3 giống C118, LRA5166, và TM1. Đã thu được 483 cây bông vi tiêm
gen VIP3 và 2.257 cây vi tiêm gen CryIAc kháng kanamycin.
5.2. Đề nghị
1- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen vào cây bông

thông qua đường ống phấn.
2- Tiếp tục sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kanamycin cho
số hạt vi tiêm còn lại.
3- Sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kỹ thuật PCR.
16
PHỤ LỤC
Phụ luc 1. Kết quả vi tiêm gen Vip3
Công thức
Số hoa
tiêm
Số quả
đậu
Tỷ lệ
đậu
(%)
Mức
độ dị
dạng
Số
hat/quả
Số
lượng
hạt
KL 100
hạt (g)
Gieo ngày 9 tháng 2 (đợt 1)
C118
1 467 416 89,07 +++ 13,28 5523 9,63
2 425 382 89,88 +++ 11,95 4564 9,3
3 491 396 80,65 +++ 11,39 4506 9,2

TB - - 86,53 - 12,4 - 9,38
Tổng 1383 1194 - - - 14593 -
LRA
5166
1 411 383 93,19 +++ 11,37 4355 8,44
2 459 415 90,41 ++ 17 7055 7,85
3 500 444 88,8 ++ 15,37 6824 8,17
TB - - 90,8 - 14,58 - 8,15
Tổng 1370 1242 - - - 18324 -
TM1
1 438 396 90,41 ++++ 7,94 3144 12,58
2 501 442 88,2 ++++ 5,49 2428 12,96
3 437 393 99,93 ++++ 6,24 2454 12,95
TB - - 92,85 - 6,56 - 12,83
Tổng 1376 1231 - - - 8026 -
Gieo ngày 17 tháng 6 (đợt 4)
C118
1 294 269 91,5 +++ 8,22 2210 9,46
2 374 327 87,4 +++ 9,76 3190 9,88
3 417 341 81,8 +++ 8,53 2909 9,85
TB - - 86,9 - 8,83 - 9,73
Tổng 1085 982 - - - - 8390 -
Gieo ngày 3 tháng 9 (đợt 5)
C118
1 300 280 93,8 +++ 13,21 3700 10,41
2 410 377 95,6 +++ 11,42 4305 10,25
3 395 358 90,0 +++ 11,51 4119 10,61
TB - 93,13 - 11,94 - 10,42
Tổng 1105 1015 - - 12124
TM1

1 341 303 91,4 +++ 13,26 4018 12,09
2 347 322 89,6 +++ 12,20 3930 12,48
3 431 402 93,7 +++ 10,12 4069 12,95
TB - - 91,6 - 11,70 - 12,51
Tổng 1119 1027 - - - 12017 -
Phụ lục 2. Kết quả vi tiêm gen CryIAc
17
Công thức
Số
hoa
tiêm
Số
quả
đậu
Tỷ lệ
đậu
(%)
Mức
độ dị
dạng
Số
hat/quả
Số
lượng
hạt
KL 100
hạt (g)
Gieo ngày 7 tháng 3 (đợt 2)
C118
1 493 443 90,8 +++ 15,01 6651 11,17

2 535 490 92,2 +++ 12,65 6200 11,05
3 668 616 92,8 +++ 14,03 8640 11,28
TB - - 91,93 - 13,90 - 11,17
Tổng 1696 1549 - - - 21491 -
LRA
5166
1 422 413 97,9 +++ 13,11 5415 7,99
2 694 662 95,6 +++ 15,05 9960 8,33
3 656 649 97,5 +++ 13,78 8945 8,18
TB - - 97 - 13,98 - 8,17
Tổng 1772 1724 - - - 24320 -
TM1
1 454 404 90,1 +++ 8,72 3525 14,08
2 672 620 92,8 +++ 7,20 4462 13,88
3 608 586 96,5 +++ 8,57 5024 14,53
TB - - 93,13 - 8,16 - 14,16
Tổng 1734 1610 - - - 13011 -
Gieo ngày 6 tháng 6 (đợt 3)
LRA
5166
1 401 336 84,4 +++ 13,62 4575 8,11
2 299 232 86,5 +++ 13,25 3075 8,39
3 343 250 79,9 +++ 11,20 2800 8,0
TB - - 83,6 - 12,69 - 8,17
Tổng 1043 818 - - - 10450 -
TM1
1 464 357 72,9 +++ 14,36 5125 12,77
2 266 198 68,8 +++ 11,14 2205 12,81
3 355 284 80,5 +++ 11,29 3205 12,43
TB - - 74,07 - 12,26 - 12,67

Tổng 1085 839 - - - 10535 -
Gieo ngày 16 tháng 11 (đợt 6)
C118
1 147 127 86,4 +++ 10,39 1320 10,87
2 174 154 88,5 +++ 12,66 1949 10,55
3 190 163 85,8 +++ 14,78 2360 11,01
TB - - 86,9 - 12,68 - 10,81
Tổng 511 444 - - 5629 -
TM1
1 147 121 82,3 ++++ 8,27 1000 12,59
2 109 87 79,8 ++++ 8,41 732 13,11
3 125 106 84,8 ++++ 7,97 845 12,83
TB - - 82,3 - 8,21 - 12,84
Tổng 381 314 - - - 2577 -
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chen CH, Wang ZJ, Sun L và cs. Research of transfomation exogenous DNA
into rice via pollen tube pathway. Guang Dong Agriculture Science 1998; 4: 2-3.
2. Clive James (2004). Global status of commercialized transgenic crop,
preview: 2004. ISAAA Briefs No. 30-2004.
18
3. Clive James (2007). Hiện trạng cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu năm
2007, ISAAA Briefs No. 37-2007.
4. Cousins YL, Lyon RB, Llewellyn DJ (1991). Transformation of an
Australian cotton cultivar: Prospects for cotton improvement through genetic
engineering. Aust J plant Physiol 18: 481-494.
5. Hou WS, Gou SD, Lu M., 2003. Development transgenic wheat with
Galanthus navies Aggletinin gene (s gna) via pollen tube pathway. Chinese
Bullectin of Botany; 20 (2):198-204.
6. Hsu,H.H., ADN F.Gale.2001. Regional shifts in China’s cotton production
ADN use. Cotton Wool Situation Outlook 11:19-25.

7. Huang GC, Dong YM, Sun JS. Transfomation exogenous DNA via pollen
tube patnway with GFP gene. Chinese Science Bullectin 1998; 43(23): 2531-
2533.
8. Huang JQ, Qian SY, Liu GL và cs. Variations in the characters of upland
cotton (Gossypium hirsutum) induced by exotic DNA of sea-island cotton
(Gossypium barbadense). Acta Genertica Sinica 1981; 8 (1): 56-62.
9. Lê Huy Hàm (2003). Cây trồng biến đổi gen-Tình hình nghiên cứu ứng dụng
và các quan điểm phát triển. Tổng luận Khoa học-Công nghệ-Kinh tế, số 4-
2003 (182), Trung tâm Thông tin Tư liệu Khoa học và Công nghệ Quốc gia,
Bộ Khoa học và Công nghệ.
10. Lê Quang Quyến và cs (2003). Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học:
Nghiên cứu chuyển gen kháng (Bt và CpTI) vào cây bông và phát triển cây
bông ở Việt Nam, Ninh Thuận, tháng 11/2003.
11. Lê Trần Bình và cs (2003). Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu
tài nguyên sinh vật Việt Nam. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
12. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội và cs (2000). Báo cáo tổng kết đề tài
KHCN0201B: Chọn lọc và đánh giá ở mức độ phân tử các dòng cây trồng tạo
được bằng công nghệ tế bào và công nghệ gen. Hà Nội.
13. Ni WC, Huang JQ, Guo SD và cs., 1996. New germplasm oF bollworm-
resistant cotton derived from Bt gene transfer. Jiangsu J Agri Sci.
14. Sambrook, J., Fritsch, E. F. ADN Maniatis, T., Molecular Cloning- A
Laboratory Manual, USA, Cold Spring Harbor, 1989, 2nd edn.
15. Singh, P. ADN Mayee, C. D., Present status ADN future prospects of hybrid
cotton in India. Hybrid Cotton Newsl., 2001, 10, 2–7.
19
16. Xiaoming Song, Yunhong Gu, Guangyong Qin. Application of a
transfomation method via pollen-tube pathway in agriculture molecular
breeding. Life Science Jounal, 2007; 77-79; ISSN: 1097-8135.
MỤC LỤC
1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1

1.3. Nội dung nghiên cứu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2
20
2.1.1. Tình hình sản xuất cây bông biến đổi gen 2
2.1.2. Ý nghĩa của trồng cây bông Bt 3
2.1.3. Các loại bông Bt kháng sâu 4
2.1.4. Nghiên cứu chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm 5
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
3.1. Vật liệu nghiên cứu 6
3.1.2. Gen kháng sâu 6
3.3. Phương pháp nghiên cứu 7
3.3.5. Phương pháp sàng lọc cây chuyển gen bằng kanamycin 9
3.4. Chỉ tiêu theo dõi 9
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9
4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid cung cấp cho vi tiêm 9
4.3. Kết quả vi tiêm tạo hạt 11
4.4. Kết quả sàng lọc cây bông vi tiêm mang chuyển bằng kanamycin 14
4.4.1. Xác định nồng độ kanamycin cây bông mẫn cảm 14
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 16
5.1. Kết luận 16
5.2. Đề nghị 16
21