Bài giảng xu hướng phát triển thực phẩm thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen
u

Một cấu trúc biểu hiện gen cần:
u

Đầy đủ các yếu tố để đảm bảo sự biểu hiện gen đúng
u promoter phù hợp
u Chọn các trình tự tham gia điều hòa biểu hiện gen thích hợp

u

Gen đích phải đúng về trình tự (tạo protein trình tự đúng)

u

Để tạo được cấu trúc biểu hiện cần sử dụng các kỹ thuật: nhân
DNA, cắt, ghép nối, biến nạp gen, tinh sạch….thực hiện trên các
plasmid trung gian trong vật chủ trung gian

u

Cấu trúc biểu hiện thường được giữ trong các plasmid trung gian
để có thể nhân lên số lượng lớn


Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen
u

Promoter: phổ biến là: 35S (CaMV) từ virus gây bệnh
khảm súp lơ (sử dụng trong 80% cây biến đổi gen hiện

nay)

u

Terminator: phổ biến là 3’nos: trình tự kết thúc từ gen
tổng hợp nopaline synthesase của Agrobacterium
tumafeciens (80% cây trồng CNSH sử dụng)

Promoter

Vùng mã hóa protein

Terminator


Đưa lên “phương tiện” chuyển gen
u

Gen chuyển vào vật chủ có thể nằm trên plasmid độc lập với hệ gen
vật chủ (vật chủ là sinh vật nhân sơ), hoặc gắn lên hệ gen của vật chủ
(vật chủ là sinh vật nhân chuẩn).

u

Phương tiện chuyển sử dụng phụ thuộc vào phương pháp chuyển gen:
u

Plasmid chuyển gen: Ti-plasmid với phương pháp dùng Agrobacterium
tumafaciens

u

u

Hạt nano vàng/wolfram: phương pháp bắn gen

Với phương tiện là plasmid, để đưa cấu trúc biểu hiện plasmid cần sử
dụng các kỹ thuật: nhân gen, cắt và ghép nối….


Các phương pháp biến
nạp gen vào vật chủ


Yêu cầu của phương pháp
chuyển gen vào tế bào
u

Ổn định trong hệ gen vật chủ

u

Đoạn gen chuyển đảm bảo không bị sắp xếp lại để đảm bảo gen
hoạt đông tạo sản phẩm và tính trạng mong muốn

u

Đơn giản, dễ kiểm sốt

u

Khơng ảnh hưởng tới các q trình trao đổi chất thông thường
của vật chủ


Ở thực vật
u

Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

u

Súng bắn gen

u

Dung hợp tế bào trần


Chuyển gen bằng
Agrobacterium tumafaciens
u

Vi khuẩn gây khối u ở thực vật

u

Có thể chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật, tạo khối u
để làm nơi cư trú của vi khuẩn

u

tạo opine là nopalin và octopin là chất dinh dưỡng cho
chúng trong khối u

u

Khả năng tạo khối u của vi khuẩn này là nhờ các gen trên
plasmid có trong tế bào vi khuẩn, gọi là Ti plasmid –
(Tumor inducing plasmid)

u

Vi khuẩn xâm nhập vào vết thương của thực vật, nhanh
chóng chuyển 1 đoạn DNA chứa gene tổng hợp opine và
gen tạo u vào hệ gen thực vật, gây u và tạo opine cho
chúng phát triển


Chuyển gen bằng
Agrobacterium tumafaciens
u

u

u

Các gen tạo phytohormone
và sinh tổng hợp nopaline

Đoạn DNA được chuyển
nằm giữa 2 trình tự đặc
trưng 25 bp, gọi là Bờ
phải (Left border) và
bờ trái (right Border)

LB

Đoạn DNA gắn vào hệ
gen của tế bào thực vật
vị trí bất kì
Các gen tạo
phytohormone làm tế
bào thực vật mất kiểm
sốt, tạo thành khối u

Phân
giải
nopaline

Vùng
độc
tính

Vùng khởi
động tái
bản


Hệ thống 2 plasmid dùng để

chuyển gen vào thực vật

Đoạn gen cần chuyển


Chuyển gen bằng
Agrobacterium tumafaciens


Chuyển gen bằng
Agrobacterium tumafaciens
Đoạn DNA cần sử
dụng

Gắn đoạn
DNA vào Ti
plasmid
Điểm cắt
giới hạn

Đưa vào
tế bào
thực vật

Tái sinh
cây
NST thực vật
mang T-DNA

Cây với

đặc tính
mới


Chuyển gen bằng súng bắn gen

u

DNA cần chuyển được phủ lên
hạt vàng / wolfram

u

Kích thước hạt nhỏ khơng làm
ảnh huởng tới tế bào thực vật

u

Súng bắn gen tạo tốc độ bắn
1300 m/s

u

Hiệu quả phụ thuộc tỷ lệ
DNA/hạt, tế bào thực vật


So sánh 2 phương pháp chuyển gen
Gen đích

Vi khuẩn +
tế bào TV

Gen đưa
vào Tiplasmid

Nhân gen

Hạt vàng
phủ DNA
Bắn gen vào tế
bào thực vật, gen
chèn vào NST

Ti-plasmid vào tế
bào thực vật, TDNA chèn vào NST

Chọn lọc
tế bào

Chọn lọc tế bào
mang gen

Chọn lọc tế bào với
chỉ thị chọn lọc

Cây trồng tạo
ra từ tế bào

Chuyển gen bằng dung hợp tế
bào trần
u

Tạo tế bào thực vật khơng có thành tế bào bằng phân
giải pectin, cellulose

u

Chuyển gen bằng 1 trong 2 cách

u

u

Sử dụng polyethyleneglycol, các tế bào trần hoà lẫn, DNA
đi vào tế bào trần

u

Xung điện chuyển DNA vào tế bào trần

Việc tái sinh khó khăn à hạn chế sử dụng


Một số phương pháp chuyển
gen vào thực vật khác
u

Vi tiêm (chủ yếu cho động vật)

u

Siêu âm

u

Dùng tia laser

u

Chuyển gen qua ống phấn


Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật
u

Tế bào vi sinh vật thường dễ hơn thực vật và động vật

u

Các phương pháp chính

u

u

Sốc điện (electroporation)

u

Sốc nhiệt (heat shock)

u

Dung hợp tế bào trần

Yêu cầu tế bào phải được sử lý thành tế bào “khả biến”
(dễ dàng cho sự biến nạp, chuyển DNA vào tế bào)


Chuyển gen vào vi sinh vật
u

Phương pháp sốc điện

Trước khi sốc điện

Trong quá trình sốc

Màng tế bào
Gen đưa vào

Điện trường tạo ra
trong và ngồi màng
tế bào

Sau q trình
Màng tế bào
phục hồi

Chuyển gen vào vi sinh vật
u

Phương pháp sốc nhiệt

u

Tế bào vi sinh vật được
xử lý và bổ sung Ca2+,

u

Khi bổ sung DNA, điện
tích âm, liên kết với
Ca2+, gắn trên màng tế
bào

u

Khi sốc nhiệt (bên ngoài
nhiệt độ cao, bên trong
nhiệt độ thấp, màng tế
bào tạo các lỗ hổng,
phức hợp Ca2+ và DNA
đi vào bên trong tế bào


Chuyển gen vào tế bào động

vật
u

Vi tiêm: Lượng DNA nhỏ được tiêm trực tiếp
vào nhân tế bào phôi trần/hoặc tế bào
nguyên vẹn dưới kính hiển vi quang học


Chuyển gen vào tế bào động vật
u

Sử dụng virus
(retrovirus): đưa DNA
của retrovirus mang
đoạn gen cần chuyển
vào tế bào vật chủ,
nhờ hoạt động của
DNA từ virus, đoạn
gen đích có thể được
chuyển vào hệ gen vật
chủ


Chuyển gen ở động vật

u

Chuyển gen vào tế bào gốc:
Tế bào ở giai đoạn 16-32 tế
bào là tế bào gốc, từ đó có

thể phát triển thành các
loại tế bào nhau của cơ thể
sinh vật. Các tế bào gốc này
được tách chiết và cấy gen
ngoại lai vào.


Đánh giá sự hiện diện của
gen chuyển trong vật chủ


Điều gì xảy ra khi DNA được
chuyển vào vật chủ
u

Khơng chèn được vào hệ gen?

u

Chèn được vào hệ gen
u

Theo như dự kiến: trình tự đúng, sắp xếp P-ORF-T đúng (để đảm bảo sự biểu
hiện của gen)

u

Không như dự kiến: thay đổi sắp xếp trình tự, thay đổi P-ORF-T…làm mất
chức năng của gen đưa vào, bị đội biến, bị cắt nhỏ......

u

Gen chèn được vào hệ gen có tồn tại ổn định theo các thế hệ hay
không? Hay sẽ bị loại bỏ khi sang các thế hệ con cháu sau?

u

Nếu cấu trúc biểu hiện được chèn vào hệ gen ổn định, đúng à liệu sự
biểu hiện ra protein của nó như thế nào? Phân bố như thế nào trong các
bộ phận của vật chủ? (ví dụ, trong lá, rễ, củ, hạt…?)


Phương pháp phát hiện DNA
u

Bằng phương pháp PCR:
•Tách DNA hệ gen từ sinh vật chủ

1
2

•Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để chạy PCR với cặp mồi
đặc hiệu cho gen đích

•Điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen

3
• Nếu có sản phẩm PCR: đúng kích thước dự kiến à có đoạn DNA
chuyển vào trên DNA hệ gen vật chủ
• Nếu khơng có sản phẩm à khơng có đoạn DNA chuyển vào hoặc

bị biến đổi dẫn tới đoạn mồi đặc hiệu không bắt cặp được


Phương pháp phát hiện DNA
u Lai
u

Southern blot:

sử dụng các mẫu dò (probe) là các
đoạn DNA ngắn bắt cặp được (theo
nguyên tắc bổ sung) với một vùng nào
đó trên đoạn gen đưa vào vật chủ cần
phát hiện. Mẫu dò thường được gắn
thêm các đi để có thể phát hiện
được nó.

u

Phương pháp Southern blot được thiết
kế để xác định sự hiện diện, kích
thước, sớ lượng bản sao của đoạn DNA
đó trong hệ gen