Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày đh CNTP TP HCM

Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
1
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm
Đề tài. Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất
nước mắm ngắn ngày
GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang
SVTH: Nhóm 19
Trần Quốc Huy 3005110114
Trần Thị Mỹ Lan 3005110137
Nguyễn Hoàng Linh 3005110145
Trần Thị Tiến 3005110335
Ngô Thị Minh Tuyền 3005110375
2
Nhóm: 19
Tp.Hồ Chí Minh-2014
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang

Mục lục
Nội dung trang
Lời mở đầu 4
I. Enzyme protease 5
1. Khái quát về enzyme 5
1.1 Enzyme 5
1.2 Đặc tính chung của enzym 5
1.3 Cấu tạo của enzym 5
2 Tổng quan về enzyme protease 6

2.1 Giới thiệu 6
2.2 Đặc điểm chung 6
2.3 Phân loại 8
2.4 Cơ chế tác dụng 10
2.5 Nguồn cung cấp 10
II. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 15
1. Quy trình thu nhận enzyme protease 15
2. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 16
2.1 Tổng quan về Aspergillus oryzae 16
2.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 23
2.2.1. Sơ đồ quy trình 24
2.2.2. Thuyết minh quy trình 25
III. Ứng dụng enzyme Protease trong công nghệ sản xuất nước mắm ngắn
ngày 30
1. Ứng dụng enzyme protease 30
2. Ứng dụng protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày 33
2.1 Giới thiệu 33
3
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
2.2 Phân loại nước mắm 34
2.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm 36
2.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm 37
2.5 Nguồn nguyên liệu 37
2.5.1 Cá 37
2.5.2 Muối 41
2.5.3 Nguyên liệu phụ 43
2.6 Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày 45
2.7 Giải thích quy trình 46
2.7.1 Rửa 46

2.7.2 Xử lý 47
2.7.3 Lên men 47
2.7.4 Lọc 51
2.7.5 Cô đặc chân không 52
2.7.6 Bổ sung hương 54
2.7.7 Đóng chai 56
IV Sản phẩm 58
1. Cách tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày 58
2. Tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm 58
3. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm 58
4. Một số sản phẩm nước mắm sử dụng phương pháp ngắn ngày trên thị
trường 60
Kết luận 62
Tài liệu tham khảo 63
4
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Lời mở đầu
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thời gian gần
đây là nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên
trong mấy chục năm qua, và một trong những enzyme được nghiên cứu rất nhiều, đó là
enzyme protease, đây là enzyme được thu nhận từ rất nhiều nơi, từ động vật, thực vật
cho tới vi sinh vật đều là nguồn gốc của enzyme protease, và điều đặc biệt là enzyme
protease đóng vai trò vô cùng quan trọng trong cuộc sống của chúng ta và được ứng
dụng trong rất nhiều ngành nghề, một trong số đó là ứng dụng quan trọng trong công
nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày.
Bài báo cáo về enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày
sẽ giúp cho chúng ta hiểu rõ về enzym protease, cách thu nhận cũng như hiểu được
tầm quan trọng của enzyme protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày, để có thể
tham khảo và áp dụng thực tế một cách tốt nhất khi đi vào thực tế.

Với sự góp mặt của các thành viên tích cực, sự kết hợp ưng ý cũng như sự phân
công công việc công bằng, hứa hẹn sẽ đem đến một báo cáo hấp dẫn, đầy những kiến
thức thú vị và bổ ích. Dù đã cố gắng hết sức, bài báo cáo chắc chắn không tránh khỏi
những thiếu xót. Nhóm tác giả rất mong sự đóng góp ý kiến của Cô và toàn thể các bạn
nghiên cứu đề tài này để nhóm có được những kiến thức đầy đủ nhất.
Xin cảm ơn!
5
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
I. ENZYME PROTEASE
1. Khái quát về enzyme
1.1. Enzym
- Enzym có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các
phản ứng hóa sinh học.
1.2. Đặc tính chung của enzym
- Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi
trường.
- Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào
sống.
- Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai
đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp
chất hóa học. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm
của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau.
- Enzym có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong
ống nghiệm)
- Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao
- Enzyme tính chọn lọc cao
- Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng.
1.3. Cấu tạo của enzym
Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo chỉ có protein.

Nhóm enzym đa cấu tử :
- Gồm 2 phần:
+ Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym
6
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
+ Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt
(prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym)
Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa
apoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử.
2. Tổng quan về enzyme protease
2.1 . Giới thiệu.
Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các
amino acid. Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi
sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong
y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Protease là một trong những enzyme
được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm,
protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của
con người. Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn
đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease.
Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease,
chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ
được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây.
2.2 . Đặc điểm chung.
Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân
tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton.
7
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Hình 1.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất
dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn
dạng tetramer.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày
bê ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm
khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều
enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách
ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên
protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để
và đa dạng.
8
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Hình 1.2: cấu trúc không gian enzyme protease
2.3. Phân loại.
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .
9
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Hình 1.3: Sơ đồ phân loại protease
Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc
điểm sau để phân loại chúng:
 Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta
chia protease làm 2 nhóm chính:
• Exopeptidase: (Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid,) được phân thành 2 loại:
- Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly
peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid.
- Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly peptid và

giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti.
• Endo peptidase: (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác) được chia thành 4 nhóm:
- Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm
hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao
10
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao
gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine
proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
- Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein
protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase
động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng
PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
- Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin
bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic
proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động
mạnh ở PH trung tính.
- Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn,
nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt
động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.
 Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các
nhóm:
- Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4.
- Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm 9-11.
- Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, … hoạt động ở
vùng pH trung tính 7-8
 Ngoài ra có thể phân làm 2 loại khác:

- Enzyme protease nồi bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên
màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kĩ thuật trích ly.
- Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men hoàn tất hoặc
ngay quá trình lên men đang diễn ra.
2.4. Cơ chế tác dụng
Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học
của enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ
quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung
gian.
E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian)
11
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
2.5. Nguồn cung cấp
Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về
kinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu
suất cao.
Hiên chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận
protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật
a. Nguồn Động vật
Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều
ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai
enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…)
Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều ezyme
nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp men này do tuyến tụy tiết ra, tiền
thân của nó là Trypsiogen, được hoạt hóa bởi Entorokiaza của ruột. Trypsin là một
enzym có chức năng phân cắt các protein.
Ngoài ra tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzym này góp phần phân
giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm

Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi các casein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có nồng độ Ca
2+
(sự đông tụ sữa chua).
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như: ở
các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus.
b. Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ
nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ
dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng
của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của
protease thực vật này là trong công nghệ chế biến thịt nó làm mềm thịt và trong mục
tiêu tiêu hóa.
12
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Ngoài ra còn thu nhận ezyme Ficin tách từ dịch ép thân cây sung. Ezyme được
sử dụng để phân hủy protein tự nhiên.
Hình 1.4: mô hình phân tử enzyme papain
Hình 1.5: nguồn thu nhận ezyme Protease từ thực vật
c. Nguồn vi sinh vật
Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công
nghiệp quy mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì dùng enzyme từ
vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế sau:
- Nguồn nguyên liệu vô hạn.
- Hệ enzyme phong phú.
- Hoạt tính mạnh.
- Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọ giống.
- Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh.

- Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền.
13
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Ezyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn gồm nhiều
loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại
nấm men.
• Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
59 lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại andopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease
của vi khuẩn có tính cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết
peptide trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. Subtilis có khả năng tổng hợp mạnh nhất. Các vi khuẩn
thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 6) và
có khả năng chịu nhiệt thấp.Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực
phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease
trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được
sinh ra nhiều bởi B. Subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống
thuộc chi Clostridium.
Hình 1.6: Clostridium
14
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000 – 30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH

rộng 7 – 12.
Hình 1.7: Bacillus
• Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, A. Terricola, A.
Fumigatus, Penicillium chysogenum, Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba
loại protease: acid, kiềm, trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid,
có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. Candidatus, P. Cameberti, P. Roqueforti cũng
có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat
Hình 1.8: Nấm mốc
• Xạ khuẩn
15
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc.
Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao
như: Streptomyces grieus, S. Fradiae,
Hình 1.9: xạ khuẩn
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi
ích như sau:
- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
- Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch
nhiều lần trong năm.
- Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng
sử dụng và tăng hiệu suất thu hồi).
- Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản
xuất.
Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây

bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có
trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng
hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết.
II. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae
1. Quy trình thu nhận enzyme protease
Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn:
16
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Thu protease thô và tinh sạch protease.
Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì ta nghiền , trích
ly rồi ly tâm. Còn với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào rồi đem ly tâm.
Tinh sạch protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần
không phải protease ra khỏi thành phần protease. Sản phẩm cuối cùng là protease tinh
khiết.
Hình 2.1: Quy trình tổng quát thu nhận protease
2. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.1. Tổng quan về Aspergillus oryzae
17
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
a. Đặc điểm cấu tạo
Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác
nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme .
Trong số này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus,
Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus,
versicolor, Aspergillus oryzae… -
Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,
protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.

Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước
tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc
này để sản xuất tương.
Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty
có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu
xanh lợt có ít vàng.
Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi
sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
 Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.
- Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an
gia súc
- Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung
vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt…
- Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi
trường….
b. Vai trò của giống
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến:
Năng suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme),
vốn đầu tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công
nghệ vi sinh vật.
c. Yêu cầu của giống
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được
sản xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ
enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản
18
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá
trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ
thể mình trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất.

+ Giống phải cho năng suất sinh học cao
+ Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện
sản xuất công nghiệp.
+ Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ
kiếm tại địa phương.
+ Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
+ Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng
tách chiết, tinh sạch
+ Dễ dàng bảo quản và ổn định
Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên
men công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
d. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae
 Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt
chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã
được tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… Có chất
phụ gia là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không
có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ
gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp
hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)

2
10, phospho, nitơ
hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm
sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng
kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng
trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị,
dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện
vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực
nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng
19
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không
đồng đều.
 Nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa
số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất
cacbon là đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được
vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng,
thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá
trình nuôi cấy chìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men
giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự
động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi
sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần
môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều
kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên
khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không
bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.
e. Nguyên liệu sản xuất

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi
trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa
vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng
thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm
của chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở.
Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng
của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, H, ON. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca,
P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác như.
 Nguồn cacbon
Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit
arabinoza glactoza.
20
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
protease. Chảng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở
môi trường tinh bột lớn hơn 8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và
sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 –
1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.
 Nguồn nitơ
Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH
4,
H
2
PO
4

là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã
chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch
ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi
ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa
sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
f. Phương pháp phân lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở
những nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính
vì vậy mà vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất.
Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp
nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng .
 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự
nhiên, được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự
nhiên, khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi
trường cố định đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện
chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết.
21
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất. Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện.
Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những
đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.

Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổng
hợp cao
 Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm nhiều tế bào
vi sinh vật đã bị thoái hoá nhưng cũng có nhiều tế bào không bị thoái hoá.
i. Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae
Quy trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những
miếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vô
trùng và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dich ban đầu sang ống nghiêm khác
chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10
-3
, 10
-4
.
- Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA
- Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch
- Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng sáng quanh
khuẩn lạc
- Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy.
- Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống thạch nghiêng
với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h.
- Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống thạch
nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường
- Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng của nấm.
KH
2
PO
4
1,4g MgSO

4
0,1g
NH
4
NO
3
10g FeO
4
0,01g
KCL 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5
22
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự
trữ. Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.
j. Phương pháp bảo quản
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều
kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra
các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra
lại các đặc tính ban đầu.
 Phương pháp cấy chuyền
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi
trường thạch (thạch nghiêng, hợp petri…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều
kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo
quản ở nhiệt độ lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy
bào tử hoặc khuẩn lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường
mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được).
Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên
giữ trong đất để khử trùng. Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một

năm, người ta phủ một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự
phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ
chín sinh lý. Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men,
vi khuẩn và rất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến
có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc.
 Phương pháp làm khô
Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều
được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của
giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ
khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được một năm.
Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên,
giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.
23
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
 Phương pháp đông khô
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng
thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được
làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị động khô sẽ hút nước và cuối cùng
mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu
là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các nấm
men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng, đối với
tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.
 Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi
trường dịch thế và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ
lạnh sâu (-196
0
C đến -80
0

C). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình
làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các
chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để
khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu
và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfo xide). Việc bảo quản theo
phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như: -20
0
C, -
30
0
C, -40
0
C, -70
0
C, -40
0
C và -196
0
C. Nói chung mức nhiệt cao hơn - 30
0
C cho hiệu
quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp
bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm
men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
2.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.1. Sơ đồ quy trình
24
Nhóm: 19
Môi trường
Asp.oryzae

Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Hình 2.2: Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.2. Thuyết minh quy trình
a. Môi trường
Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốt
25
Nhóm: 19
Sử dụng
enzyme thô
Nuôi cấy
Chế phẩm thô
Bã
Trích ly
Thức ăn chăn
nuôi
Kết tủa
enzyme
Ly tâm
Thu nhận kết
tủa
Sấy
Nghiền và bảo
quản
Chế phẩm
enzyme