Nuôi cấy tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phủ tế bào cây thông đỏ himalaya

Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007

243
NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ TÁI TẠO MÔ SẸO TỪ HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY THÔNG ĐỎ
HYMALAYA (THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG) (Taxus wallichiana Zucc.)

Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên
Phân viện sinh học tại Đà lạt
TÓM TẮT
Thông đỏ Taxus wallichiana là loài cây trong vỏ có chứa nhiều Taxol, được dùng để chữa ung
thư buồng trứng và ung thư vú. Đây cũng là loài thực vật rất khó nuôi trồng. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi thiết lập điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo T. wallichiana. Điều kiện tốt để
khởi tạo huyền phù tế bào là môi trường B5 cơ bản có bổ sung 20% nước dừa tươi, 60 g/L sucrose,
4 mg/L 2,4-D và 1mg/L kinetin. Tuy nhiên, môi trường này không thích hợp cho sự tăng trưởng mô
sẹo. Tế bào nuôi cấy tăng trưởng tốt trong 24 ngày khảo sát, trong đó tám ngày đầu là giai đoạn
phát triển chậm (phase lag). Chúng tôi thu tế bào từ huyền phù nuôi cấy vào nhiều thời điểm và trải
lên các môi trường thạch khác nhau để khảo sát sự hình thành mô sẹo. Mô sẹo tái tạo tốt nhất là từ
huyền phù 25 ngày trải lên môi trường thạch B5 cơ bản có bổ sung 4 mg/L 2,4-D, 1 mg/L kinetin,
20 g/L sucrose và nuôi cấy trong điều kiện tối. Tế bào và mô sẹo thu được từ nghiên cứu này là
nguyên liệu cho nuôi cấy trên quy mô lớn, đồng thời phục vụ việc tách chiết và định lượng taxoid.
Từ khóa: Mô sẹo, huyền phù tế bào, Taxol, Taxus wallichiana Zucc.
TỔNG QUAN
Thông đỏ (Taxus) là một chi gồm nhiều loài
phân bố ở các vùng ôn đới của bắc bán cầu. Trong
những thập niên gần đây, thông đỏ được coi là một
nguồn dược liệu quan trọng sau việc khám phá một
hợp chất diterpene amide chống ung thư mới với tên
thương mại là “Taxol” từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình
Dương (Taxus brevifolia) (Wani et al., 1971;
Edgington 1991). Hợp chất này còn được gọi là
paclitaxel, hay tên đầy đủ theo IUPAC (Liên đoàn

hóa học thuần túy và ứng dụng quốc tế) là 5-α-20-
epoxy-1,2-α-4,7-β-10-β-13-α-hexahydroxytax-11-
en-9-one-4,10-diacetate-2-benzoate-13-ester. Taxol
đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa
Kỳ (FDA) chứng nhận khả năng chữa ung thư buồng
trứng và ung thư vú; ngoài ra, hợp chất này còn có
khả năng chống các khối u ác tính, ung thư phổi và
một số dạng khối u rắn khác (Wickremesinhe và
Arteca, 1993, 1994). Taxol cũng đã được tách chiết
từ nhiều bộ phận của nhiều loài thông đỏ khác nhau
bao gồm hạt phấn, hạt, lá, thân non, thân gỗ, vỏ và rễ
(Wani et al., 1971; Witherup et al., 1990; Vidensek
et al., 1990; Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe
và Arteca, 1994). Nguồn cung cấp Taxol cho nhu
cầu chữa trị phụ thuộc phần lớn vào cây thông đỏ,
gần 7 tấn vỏ cây mới sản xuất được 1 kg Taxol
(Cragg et al., 1993). Vì thông đỏ tăng trưởng rất
chập và thời gian ngủ của hạt kéo dài từ 1,5 đến 2
năm (Steinfeld, 1992) nên việc tìm kiếm các nguồn
nguyên liệu để tách chiết Taxol khác ngoài vỏ cây là
điều rất cần thiết. Nuôi cấy mô Taxus spp. được coi
như một cách tiếp cận rất khả quan trong việc cung
cấp nguồn nguyên liệu quý này vì nó có thể tạo ra
một lượng lớn cây trong thời gian ngắn ở điều kiện
có thể kiểm soát được.
Tuleke (1959) là một trong những nhà khoa học
tiên phong trong nuôi cấy in vitro giao tử thể và hạt
phấn Taxus mặc dù con người vẫn chưa biết đến
Taxol vào thời điểm đó. Nhiều nghiên cứu vi nhân
giống Taxus spp. khác đã được thực hiện rộng rãi

như các nghiên cứu sự nảy mầm của phôi T. baccata,
đặc biệt chú trọng đến việc khảo sát sự ngủ của hạt
(Lepage-Degivry, 1973; Lepage-Degivry và Garello,
1973), các phương pháp nuôi cấy phôi để giảm thời
gian ngủ của hạt T. brevifolia (Flores và Sgrignoli,
1991; Chee, 1994), và phương pháp nuôi cấy đoạn
cắt thân để tạo cây con T. brevifolia (Eccher, 1988;
Chee 1994). Đã có nhiều báo cáo về các phương
pháp sản xuất Taxol từ mô Taxus spp. trong nuôi cấy
mô sẹo và huyền phù tế bào (Fett-Neto et al., 1992;
Wickremesinhe và Arteca, 1994). Để tăng hàm
lượng các hợp chất thứ cấp, các nhà khoa học cũng
nghiên cứu việc bổ sung các hợp chất kích thích
(elicitor) (Christen et al., 1991; Zhong et al., 1995)
hay các tiền chất của paclitaxel như kalium acetate,
mevalonolactone, glucose, leucine và phenylalanine
(Strobel et al., 1992; Fett-Neto et al., 1994; Shuler et
Duong Tan Nhut et al.

244
al., 1994) vào môi trường. Phương pháp nuôi cấy
lỏng đã cho thấy nhiều ưu thế vượt trội trong việc
thu nhận tế bào so với phương pháp nuôi cấy trên
môi trường thạch truyền thống vì nó cho phép việc
tối ưu hóa tốc độ tăng trưởng, cho phép thu nhận tế
bào bằng cách lọc, và quan trọng là tế bào trong nuôi
cấy lỏng vẫn giữ được khả năng phát triển thành mô
sẹo (Phillips et al., 1996). Nuôi cấy tế bào trong các
bình phản ứng sinh học (bioreactor) cũng đã được
thực hiện để thu một lượng lớn sinh khối và Taxol

(Park et al., 1994; Yoon và Park, 1994).
Loài thông đỏ T. wallichiana đã được CITES
(Công ước quốc tế về buôn bán các loài động thực
vật nguy cấp) coi là mộ loài đang nguy cấp. Loài cây
này có hàm lượng cao các taxoid (0.01–0.02%) và
10-deacetyl baccatin III trong vỏ và lá (Nhut et al.,
chưa công bố). Người ta dự đoán rằng loài thông đỏ
này sẽ hoàn toàn biến mất khỏi thiên nhiên trong vài
thấp niên tới do sự khai thác ngoài tầm kiểm soát
Taxol và gỗ; sự nguy cấp đối với loài này còn có
nguyên nhân từ bản chất đơn tính và thời gian ngủ kéo
dài của chồi. Nguyễn Thị Thanh Hiền et al. (2005) đã
tạo mô sẹo thành công từ thân non và chồi của T.
wallichiana. Tuy nhiên, các loại nguyên liệu khác như
huyền phù tế bào và mô sẹo tái tạo vẫn có thể được
thu nhận để góp phần bảo tồn loài và tách chiết Taxol.
Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về việc thiết
lập quy trình sản xuất lượng lớn sinh khối Taxus ở
dạng mô sẹo và huyền phù tế bào nhằm phục vụ cho
các nghiên cứu tương lại về tách chiết và định tính
taxoid, đồng thời góp phần bảo tồn loài T.
wallichinana đang trong tình trạng nguy cấp. Bài báo
mô tả chi tiết điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo
mô sẹo từ huyền phù.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguồn mẫu thực vật
Để tạo mô sẹo, chúng tôi nuôi cấy các đoạn cắt
từ chồi 14 đến 25 ngày tuổi của cây Taxus
wallichiana trồng tại Phân viện sinh học tại Đà Lạt
(Đà Lạt, Lâm Đồng). Môi trường nuôi cấy được ký

hiệu là C3, là môi trường B5 cơ bản (Gamborg et al.,
1968) có bổ sung 4 mg/L 2,4-D (acid 2,4-
dichlorophenoxyacetic) và 1 mg/L kinetin. Mô sẹo
tạo thành được tiếp tục duy trì trên cùng môi trường
dưới ánh sáng cường độ 45 μmol/m
2
/s (12 giờ chiếu
sáng/ngày) và sử dụng làm mẫu cấy tiếp theo.
Môi trường và điều kiện thí nghiệm
Môi trường với các thành phần khoáng và
vitamin B5 được dùng làm môi trường cơ bản cho tất
cả các thí nghiệm. Ảnh hưởng của 2,4-d, kinetin,
nước dừa tươi và sucrose được khảo sát bằng cách
bổ sung các thành phần này vào môi trường với các
nồng độ khác nhau (Bảng 1). Môi trường được làm
rắn với 9 g/L thạch (Agar Hải Phòng). Chúng tôi
dùng bình nuôi cấy 250 mL (40 mL môi
trường/bình) để tạo mô sẹo, bình tam giác
Erlenmeyer 250 mL (60 mL môi trường/bình) để
nuôi cấy huyền phù, và bình 500 mL để tái tạo mô
sẹo. Môi trường được điều chỉnh pH 5,8–5,9 trước
khi hấp khử trùng ở 121
o
C, 1 atm trong 30–40 phút.

Bảng 1. Thành phần của các môi trường thí nghiệm.

Ký hiệu 2,4-D (mg/L) Kinetin (mg/L) Tỷ lệ nước dừa (theo thể tích)
C2 1 - -
C3 4 1 -

C3∙CW 4 1 20%
C4 8 - -
C5 8 1 -

Thí nghiệm được tiến hành trong phòng nuôi
cấy, 25 ± 2
o
C, độ ẩm tương đối 80%, cường độ sáng
45 μmol/m
2
/s (12 giờ/ngày). Các mẫu nuôi cấy trong
tối cũng có cùng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm.
Các mảnh mô sẹo được lắc trong bình 250 mL
trên máy lắc SO1 (Stuart Scientific, Anh) với tốc độ
110 vòng/phút. Đèn ống huỳnh quang trắng (Rạng
Đông) được dùng cho các thí nghiệm có chiếu sáng.
Thiết kế thí nghiệm
Nước dừa đối với tăng trưởng mô sẹo
Các mô sẹo xanh trên môi trường C3 được
chuyển sang môi trường đặc C3 và C3∙CW có 20 g/L
sucrose. Lượng mô sẹo ban đầu là 7.25 mg/mL môi
trường. Sau 5 tuần, trọng lượng tươi và khô cùng
Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007

245
hình thái mô sẹo được ghi nhận. Thí nghiệm được
lặp lại ba lần.
Một số yếu tố tác động đến việc khởi tạo huyền phù
Chúng tôi khảo sát các yếu tố như: nguồn mô
sẹo (nuôi cấy trong tối và sáng); nồng độ 2,4-D và

kinetin; nước dừa; điều kiện sáng (trong tối hoàn
toàn và cường độ sáng 45 mol/m
2
/s; nồng độ
sucrose (20–80 g/L). Lượng mô sẹo ban đầu là 2,30
g. Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Mật độ tế bào
được ghi nhận sau hai đến ba tuần nuôi cấy.
Tăng trưởng huyền phù tế bào
Huyền phù tế bào được chuyển sang môi trường
mới (50% thể tích). Mật độ và trọng lượng tươi tế
bào trong huyền phù được ghi nhận 4 ngày/lần trong
24 ngày. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Tái tạo mô sẹo từ huyền phù
Môi trường thạch bổ sung 2,4-D và kinetin được
dùng để trải 2 mL huyền phù tế bào. Sự tái tạo mô
sẹo được ghi nhận sau 1, 2, 3, và 4 tháng. Mỗi
nghiệm thức được tiến hành với 30 bình nuôi cấy.
Đo sinh khối
Trọng lượng tươi và khô của mô sẹo và tế bào
huyền phù thu bằng cách lọc qua giấy lọc được đo
bằng cân phân tích (Sartorius, Đức).
Để tính mật độ tế bào, chúng tôi trải 10 µL
huyền phù tế bào lên một lamelle úp ngược trên một
lame kính lõm. Số lượng tế bào được đếm với một
buồng đếm dưới kính hiển vi (Olympus, Hoa Kỳ)
với độ phóng đại 10 X.
Phân tích số liệu
Số liệu được phân tích bằng phương pháp kiểm
tra Duncan (Duncan, 1995).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nước dừa đối với tăng trưởng mô sẹo
Mô sẹo T. wallichiana tăng trưởng tốt trên các
môi trường không có nước dừa, trong đó môi trường
C3 trong tối là điều kiện tối ưu, cho các mô sẹo mềm
và màu trắng ngà (Hình 1). Trong môi trường có
nước dừa (C3∙CW medium), một ít mô sẹo chuyển
sang màu nâu rồi chết dần (Bảng 2). Tỷ lệ mô sẹo
hóa nâu là 7.45% dưới điều kiện sáng và 3.88%
trong tối. Mô sẹo trong tối tăng trưởng tốt hơn mô
sẹo dưới điều kiện sáng do tác động ức chế của ánh
sáng đối với mô sẹo (Gibson et al., 1993). Ảnh
hưởng của nước dừa đối với sự tăng trưởng và phát
triển in vitro của thực vật đã được nghiên cứu rộng
rãi nhưng riêng cho đối với nuôi cấy Taxus và tách
chiết Taxol thì vẫn chưa có nhiều công trình. Kết quả
trong nghiên cứu này cho thấy nước dừa ở nồng độ
20% là không phù hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo T.
wallichiana cho dù nước dừa có tác động tốt đến
nhiều loài khác.
Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo, ánh sáng, nồng độ
sucrose đối với sự hình thành huyền phù
Huyền phù từ nguồn mô sẹo sinh trưởng trong
tối sẽ cho màu đỏ đặc trưng, trong khi mô sẹo dưới
ánh sáng sẽ tạo ra huyền phù có màu hơi vàng.
Huyền phù tăng trưởng chậm hơn khi mật độ tế bào
ban đầu thấp hơn do khả năng phân chia thấp
(Torres, 1989). Trong nghiên cứu của chúng tôi, mô
sẹo nuôi cấy trong bong tối bở xốp hơn so với mô
sẹo dưới điều kiện sáng, do đó chúng dễ dàng hình
thành các tế bào đơn và cụm tế bào hơn nếu được

chuyển qua nuôi cấy lỏng lắc (Bảng 3).

Bảng 2. Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng đối với sự tăng trưởng mô sẹo của thông đỏ Lâm Đồng (Taxus
wallichiana Zucc.) sau 6 tuần nuôi cấy.

Môi trường
Sáng/tối
Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Hình thái
C3 Sáng 1.25 ± 0.11a 0.12 ± 0.03a Hơi xanh, cứng, tăng trưởng chậm
C3∙CW Sáng 0.45 ± 0.12c 0.05 ± 0.02b Hơi xanh, tăng trưởng chậm
C3 Tối 1.37 ± 0.11a 0.13 ± 0.04a Hơi vàng, mềm, tăng trưởng mạnh
C3∙CW Tối 0.87 ± 0.09b 0.03 ± 0.02b Nâu, bở
Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD). Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý
nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất.

Duong Tan Nhut et al.

246


Hình 1. Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng lên sự tăng trưởng mô sẹo: Trên môi trường C3 dưới điều kiện
sáng (a) và tối (c); và trên môi trường C3∙CW dưới điều kiện sáng (b) và tối (d).

Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo đối với sự khởi tạo huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus
wallichiana Zucc.) sau 3 tuần nuôi cấy.

Nguồn mô sẹo Mật độ (tế bào/mL) Trọng lượng tươi sinh khối (mg/mL)
Nuôi cấy có ánh sáng 3.884.15 ± 114.03b 12.56 ± 1.44b
Nuôi cấy trong tối 6.421.22 ± 105.11a 21.94 ± 1.58a
Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD). Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý

nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất.

Môi trường C3 là môi trường thích hợp nhất cho
sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo, đồng thời cho
sự hình thành huyền phù tế bào T. wallichiana (Hình
2, 3). Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi
trường C3∙CW trong điều kiện tối. Nước dừa có
chứa zeatin và một số cytokinin khác có tác dụng
thúc đẩy hoạt động phân chia tế bào; nước dừa cũng
có chứa một số acid amine hạn chế khác (Letham,
1974). Tổ chức y tế thế giới (WHO) cũng cho biết
trong nước dừa có nhiều protein, carbohydrate,
calcium, các hợp chất sắt, đường, và một số vitamin
như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic. Các
Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007

247
chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc
thúc đẩy hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào.
Các thành phần trong nước dừa cũng có thể có tác
động lên sự phân tách các tế bào trong huyền phù;
quan sát dưới kính hiển vi cho thấy trong môi trường
có nước dừa, các cụm gồm 20–30 tế bào hình thành
với tế bào tách rời nhiều hơn so với môi trường
không nước dừa.
Ánh sáng có tác dụng ức chế đối với sự hình
thành huyền phù tế bào và mô sẹo (Gibson et al.,
1993). Trong cả hai trường hợp, nuôi cấy trong tối
cho kết quả tốt hơn dưới điều kiện sáng (Bảng 4) với
mật độ tế bào và trọng lượng tươi sinh khối cao hơn

khoảng 1,5 lần.
Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi
trường có 60 g/L sucrose (Hình 4). Nồng độ đường
cao hơn làm giảm sự tăng trưởng của huyền phù.
Trong giai đoạn tăng trưởng hàm mũ (phase log),
vách tế bào và tinh bột được tổng hợp mạnh bằng
nguồn carbon từ môi trường (Stepan-Sarkissian and
Grey, 1990); tuy nhiên, đường ở nồng độ cao có thể
gây stress thẩm thấu cho tế bào.




Hình 2. Ảnh hưởng của môi trường đối với mật độ tế bào huyền phù cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus
wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện sáng. Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE).













Hình 3. Ảnh hưởng của môi trường đối với trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm
Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng. Thanh sai số biểu diễn sai số

chuẩn (SE).
Tế bào/mL
Môi trường
Môi trường
Trọng lượng tươi
sinh khối (µg/mL)