bài giảng thí nghiệm công nghệ hợp chất thiên nhiên

THÍ NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ
CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
GV: ThS. Hoàng Minh Hảo
KS. Nguyễn Bình Kha




TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH Quốc Gia
TP. HCM.
[2]. Nguyễn Khác Quỳnh Cứ (1999), Bài giảng chiết xuất dược liệu. Bộ môn dược liệu.
ĐH Y-Dược TP. Hồ Chí Minh, 45-97.

BÀI 1: MỞ ĐẦU

 Hợp chất thiên nhiên (natural product), phân tử sinh học tự nhiên (biological molecule)
là chất biến dưỡng thứ cấp được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật, chất biến dưỡng thứ
cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho cơ thể sinh vật.
 Các chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật thường thuộc các nhóm sau: alcaloid,
quinonoid, steroid, terpenoid, iridoid, flavonoid, glycosid….
 Nếu những chất đại phân tử có trọng lượng phân tử lớn, tính chất hóa học tương đối
đồng nhất, người ta có thể đề xuất được một số qui trình tổng quát để chiết tách cô lập
chúng thì các hợp chất thiên nhiên có trọng lượng phân tử nhỏ, tính chất hóa học đa
dạng, khác biệt nên không có qui trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả
các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số phương pháp khác nhau.
Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên
 Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem
những chất này có hoạt tính sinh học gì? Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp
chất đạt độ tinh khiết >95% mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp
quang phổ hiện đại.
 Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về
hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem xét
có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn.
 Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của
sinh vật (sự sinh tổng hợp).
 Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng một
nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: thí dụ tìm hiểu xem hai thực vật
cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi có diều
kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự nhiên và
những chất này có cùng hàm lượng hay không?
 Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc

ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao.
 Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được
cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây
cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất
phân cực, vì thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên
cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn
bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa
tương đối ít hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng.
 Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ
phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan
nhau”: dung môi không phân cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có
tính phân cực trung bình sẽ hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung
môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực.

BÀI 2: SẮC LÝ LỚP MỎNG VÀ ĐỊNH TÍNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA
MỘT SỐ NHÓM HỮU CƠ

I. Mục đích
 Trang bị những kỹ năng, thao tác khi khảo sát các hợp chất từ cây cỏ bằng kỹ thuật sắc
ký lớp mỏng.
 Sinh viên có thể định tính sự hiện diện của một số nhóm hợp chất hữu cơ bằng phương
pháp vật lý và hóa học.

II. Cơ sở lý thuyết
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin Layer Chromatography (TLC)) còn gọi là sắc ký phẳng
(planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung
môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ. Thí dụ:
silica gel hay oxit alumin. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền
phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp
mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.
 Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ…bằng thủy tinh, có nắp đậy.
 Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu thí dụ như silica
gel, alumin….
 Mẫu phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ

phân cực khác nhau.
 Pha động: Dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm
lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó.
III. Cách tiến hành
1. Các bước chuẩn bị trước khi SKLM
1.1 Chuẩn bị vi quản
Dụng cụ
 Ống vi quản
 Đèn cồn
 Kẹp
 Lọ thủy tinh
 Giấy thấm
 Aceton




Cách tiến hành
Dùng 2 tay cầm 2 đầu ống vi quản, hơ nóng đoạn giữa của vi quản đến khi mềm dẻo.
Đem vi quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai đầu ống ra xa. Giữ yên cho đến khi thủy
tinh đặc cứng lại.
Tiến hành rửa vi quản đã kéo bằng cách chấm vào lọ thủy tinh có chứa aceton, lấy vi quản
ra và chấm vào giấy thấm để rút bỏ aceton. Làm lại vài lần để vi quản được sạch.
1.2 . Chấm mẫu lên tấm bản mỏng
1.2.1. SKLM bản nhỏ
Dụng cụ:
 Tấm bản mỏng thương mại 20x20cm
 Kéo cắt
 Thước
 Bút chì

 Vi quản đã kéo
 Mẫu đã chấm bản mỏng
 Máy sấy
Hóa chất: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất
Cách tiến hành
Mẫu là chất lỏng, lấy mẫu và chấm trực tiếp trên bản mỏng. Mẫu là chất rắn thì phải hòa
tan mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%, dung môi hòa tan mẫu không nhất
thiết là dung môi giải ly.
Cắt tấm bản mỏng nhỏ (5x2cm), dùng viết chì kẻ một đường thẳng phía dưới bảng cao
1cm làm mức xuất phát. Một đường thẳng phía trên bản mỏng cao 0.5cm làm tiền tuyến dung
môi.
Chấm vi quản nhúng vào dung dịch mẫu, chạm nhẹ đầu vi quản vào tấm bản mỏng tại
vạch xuất phát. Nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm bản mỏng để vết chấm chỉ lan rộng ra
thành vết tròn có đường kính 2-5mm.
Sau khi chấm xong, sấy nhẹ để dung môi bay ra khỏi vết chấm rồi nhúng vào dung dịch
giải ly.
Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị và chấm mỗi mẫu một vết trên
bản mỏng. Vết này cách vết kia 1cm. Hai vết ở ngoài bìa phải cách bờ cạnh 1,5cm.
1.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế (20x20cm)
Với SKLM điều chế, dung dịch mẫu chất sẽ được chấm lên thành một đường dài, đều, dọc
theo vạch xuất phát bằng cách dùng vi quản kéo một đường dài dọc theo vạch xuất phát.
1.3. Giải ly bản mỏng
1.3.1. Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng

Dụng cụ
 Bình giải ly (bình phải có nắp đậy)
 Giấy lọc (cắt sao cho bỏ vừa vào bình giải ly)
 Ống đong 10ml, 100ml
 Đũa thủy tinh
Hóa chất: Eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất

1.3.2. Giải ly bản mỏng
Cách tiến hành
Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy thấm
(giấy lọc), nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình
được bão hòa).
Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và
ngập vào dung môi. Các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi.
Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng quá trình giải ly.
Lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi. Tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc
trưng.
2. Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn
các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phương pháp hóa
học hoặc vật lý.
2.1. Phương pháp vật lý
Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV)
Dụng cụ:
 Đèn chiếu UV
 Viết chì
Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát
màu, nếu quan tâm thì dung viết chì khoanh lại.
2.2. Phương pháp hóa học:
Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng
Dụng cụ:
 Kẹp
 Máy sấy
 Cuộn băng keo
 Kéo
Hóa chất
 I

2

 Dd FeCl
3

 Dd H
2
SO
4
50%

Thuốc thử Màu của vết Hợp chất
Hơi I
2

H
2
SO
4
đđ
H
2
SO
4
đđ
H
2
SO
4
đđ

FeCl
3


H
2
SO
4
đđ

Vàng hoặc nâu
Vàng đậm đến da cam
Màu đỏ hoặc xanh dương –đỏ
Màu cam đến đỏ
Xanh lục đến xanh đen


Màu tím
Hợp chất hữu cơ nói chung
Flavon, Flavonol
Chalcon, auron
Flavonoid

Sesquiterpen

Triterpen

Cách tiến hành: Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô. Nếu hiện hình bằng hơi I
2
thì đặt

bản mỏng trong bình chứa I
2
. Nếu hiện hình bằng dung dịch FeCl
3
, hay H
2
SO
4
thì nhúng tấm
bản mỏng vào lọ chứa dung dịch đó, lấy ra và lắc nhẹ cho thuốc thử chảy xuống hết. Tiến hành
nướng bản mỏng bằng máy sấy hay bếp điện, các vết màu sẽ hiện lên, dùng băng keo dán tấm
bản mỏng lại để tấm bản mỏng không bị vỡ để tiện cho quan sát lần sau. Trên tấm bản mỏng
phải ghi rõ dung môi hoặc hệ dung môi giải ly.
















Màu đỏ sậm (λ

max
: 545nm)
Màu xanh dương đen (λ
max
: 595nm)

BÀI 3: CHIẾT XUẤT TINH DẦU

I. Mục đích:
Giúp sinh viên nắm được phương pháp tách chiết tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi
nước.
II. Cơ sở lý thuyết
Muốn khảo sát tinh dầu trong cây nên tiến hành việc lôi cuốn hơi nước trên mẫu cây tươi,
để tránh thất thoát tinh dầu vì tinh dầu có tính bay hơi cao.
Nước khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu.
Dụng cụ, hóa chất và cách tiến hành
Dụng cụ
 Bình cầu, erlen
 Bếp đun, ống ngưng hơi
 Các ống nối bằng thủy tinh
Hóa chất
 Nước
 Vỏ bưởi, vỏ chanh
Cách tiến hành
Mẫu được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể tích
của cả mẫu và nước chỉ chiếm tối đa hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống và cắm bếp
điện đun nóng.


Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang

tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở thành thể lỏng, rơi xuống ống gạn.
Trong ống gạn, dung dịch tách thành hai lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu. Tùy theo tinh
dầu nhẹ hơn nước hay nhẹ hơn nước, khi ráp hệ thống sẽ lựa chọn ống gạn cho phù hợp. Vẫn
tiếp tục đun nóng hệ thống, lớp nước trong ống gạn càng lúc càng nhiều, sẽ được trả về bình
cầu nhờ ống nhánh ngang thông nhau. Nhờ ống này mà không cần phải tiếp thêm nước cho
hệ thống trong quá trình chưng cất. Lúc này chỉ cần mở khóa ống gạn là có thể thu lấy tinh
dầu.

BÀI 4: SẮC KÝ CỘT

I. Mục đích
Đây là một trong những kỹ thuật nhằm phân đoạn cao thô ban đầu (cao etanol, metanol,
butanol) ra thành các phân đoạn cao nhỏ hơn, có độ phân cực khác nhau, hoặc cô lập ra hợp
chất tinh khiết từ một phân đoạn cao nhỏ.
II. Cơ sở lý thuyết
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra
riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối
với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh).
Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không là tùy vào hệ
số phân chia. Bất kỳ một hợp chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm hai pha (hai pha: lỏng-
lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với
một tỷ lệ nồng độ cố định, tỷ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của hợp chất và
của cả hai pha.
Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ
thống gồm hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi
loại hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật
sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất.
Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường những hạt
có kích thước tương đối lớn (50-150µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần
phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để
không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly đươc đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía
dưới cột, rồi đem đi cô quay đuổi dung môi, dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải
ly.
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực
được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau:

Bảng 1: Các loại hợp chất có tính phân cực tăng dần

Loại hợp chất Thứ tự giải ly ra khỏi cột
Hydrocarbon
Alken
Eter
Hydrocarbon R-H
Hợp chất thơm
Ceton
Aldehyde
Ester
Alcol
Amin
Acid carboxylic
Các hợp chất kiềm mạnh Chậm nhất, cần dung môi phân cực

III. Dụng cụ, hóa chất
Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography)
Dụng cụ
 Phễu lọc xốp bằng thủy tinh với độ xốp của lỗ thuộc loại 2 hoặc loại 3 để dòng chảy của
dung môi được thuận lợi, đường kính trung bình của lỗ xốp 41-100µm.
 Chén sứ và chày nhỏ
 Bình tam giác
 Hệ thống tạo chân không nhẹ bằng vòi nước (máy bơm).
 2 cái muỗng
 Bông gòn, kéo
 5 lọ thủy tinh (100ml)
Hóa chất
 Silica gel khô (cỡ hạt 15-40 µm)
 Eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, nước cất, aceton.

Sắc ký cột hở (open-column chromatography)
Dụng cụ

 Cột thủy tinh (đường kính 1.5cm, cao 60cm)
 2 cái kẹp
 1 giá đỡ (giữ cột)
 1 becher 100ml, đũa thủy tinh
 Ống đong 100ml
 Bông gòn thấm nước
 Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (100ml, 50ml)

Hóa chất
 Silica gel (50-150µm)
 Eter dầu hỏa, chloroform, etyl acetat, metanol, acetone, nước.
IV. Cách tiến hành
Sắc ký nhanh-cột khô (Dry-column flash chromatography)
a) Nạp chất hấp thu vào cột
Ráp hệ thống gồm phễu lọc xốp gắn trên bình tam giác, bình này nối với một máy bơm
hút tạo chân không, cho máy bơm hoạt động. Múc từng lượng nhỏ silica gel khô cho vào
phễu, dùng muỗng nén nhẹ silica gel xuống đáy phễu, mỗi lần mỗi ít, từng lớp, tạo thành
một khối rắn, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều dày lớp silica gel khoảng
5cm. Nếu cần tách một lượng mẫu chất nhiều hơn thì sử dụng phễu to hơn, có đường kính
lớn hơn.
Bảng 2: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký-nhanh cột khô.
Lượng mẫu Đường kính trong
của phễu (cm)
Chiều cao lớp hấp
thu
Phân đoạn dung
dịch giải ly (ml)

<100 mg 0,5-1,0 4 10-15
0,5-1,0 g 2,0-3,0 4 20-30
1,0-10,0 g 5 5 30-50
10,0-20,0 g 10 5 50
b) Cân bằng cột sắc ký
Sau khi nạp pha tĩnh xong, chỉnh lớp bề mặt pha tĩnh cho bằng phẳng, đặt một lớp bông
gòn dày lên bề mặt cột để bảo vệ lớp mặt.
Cân bằng cột bằng loại dung môi ít phân cực nhất, loại dung môi dùng để giải ly đầu
tiên. Cho một lượng lớn dung môi lên đầu cột, mở máy bơm, dung môi sẽ được hút xuống
bình tam giác. Thực hiện vài lần, đến khi chất hấp thu đồng nhất trong cột thì dừng, cột
được cân bằng.
c) Nạp mẫu lên đầu cột và giải ly cột
Nạp mẫu thô: Dùng muỗng múc từng lượng nhỏ silica gel vào cao thô ban đầu, nghiền
thành bột, sau khi nghiền thành bột mịn xong, lấy lớp bông gòn ra khỏi cột, dùng muỗng
múc bột nghiền vào đầu cột, dùng muỗng trải đều phần bột này để có một lớp mỏng, không
được đè nén lớp bột này.
Lấy lớp bông gòn lúc nảy phủ trở lại lên mặt cột, bề mặt này sẽ không bị xáo trộn khi
giải ly.
Cho máy bơm hoạt động, rót một lượng vừa phải dung môi lên bề mặt phễu, khi máy
bơm rút hết phần dung môi, ngắt áp suất, rót phần dung dịch vừa giải ly đang chứa trong
bính tam giác và các lọ có đánh số thứ tự. Gắn phễu vào hệ thống, rót dung môi, cho máy
bơm hút hoạt động, hút phễu khô. Mỗi lần phải hút khô phễu rồi mới cho dung môi mới
vào.
Ghi chú: Đôi khi mới bắt đầu giải ly, cột bị nghẹt, dung môi không hút qua được là do các
hợp chất phân cực nào đó đã kết tinh lại khi gặp dung môi ít phân cực. Giải quyết bằng
cách dùng spatule khuấy xới trộn lớp bề mặt của cột lên khoảng 0,5cm, rồi tiếp tục giải ly
bình thường.
Sắc ký cột hở (open-column chromatography)
a) Chọn chất hấp thu để nhồi cột
Silica gel pha thường (50-150µm)

b) Chọn dung môi cho quá trình sắc ký cột
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ
dung môi giải ly cho phù hợp. Các bước tuần tự như sau:
+ Mẫu chất cần sắc ký được hòa tan trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10mg/ml. Gọi là
dd mẫu (A).
+ Chuẩn bị 5-6 tấm bản mỏng (2x5cm), chấm lên những tấm bảng này, mỗi chấm khoảng
2-5µl dung dịch mẫu (A).
+ Mỗi bảng được giải ly với các dung môi hoặc hệ dung môi có độ phân cực khác nhau,
tiến hành hiện hình các vết ở mỗi bảng bằng UV hay thuốc thử.
+ Đối với mẫu cao khô chiết xuất từ cây cỏ (cao chứa các hợp chất từ ít phân cực đến phân
cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao
chiết lên vị trí ở bảng với R
f
= 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có
thể đẩy vết phân cức nhất của cao chiết với R
f
= 0,2.
c) Tỷ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách đối với kích thước cột
- Tỷ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng: Trọng lượng chất hấp thu
phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu.
- Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong cột sắc ký: Chiều cao
chất hấp thu: đường kính trong của của cột = 10:1.
d) Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
- Giữ cho cột thẳng đừng trên giá, đầu ra của cột dùng miếng thủy tinh xốp hoặc miếng
bông gòn để chặn.
- Trong một becher đã có sẵn dung môi (dung môi đầu tiên cho quá trình giải ly cột), cho
chất hấp thu vào becher, đều đặn mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót, vừa khuấy nhẹ đều.
Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt, khiến cho bọt khí sẽ
bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.

- Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở
bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung
môi này được sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.
- Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ
bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để việc nạp cột
được chặt chẽ, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, hứng lượng
dung môi này được sử dụng lại để rót trở lại lên đầu cột, không để cho đầu cột bị khô,
nghĩa là phải luôn có một lượng dung môi ở trên đầu cột.
- Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặt thoáng
không nằm ngang, phải cho them dung môi them lên trên đầu cột, dùng đũa thủy tinh
khuấy đão nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chất hấp thu ở trên
đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống tư từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng.
e) Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký
- Đặt mẫu cao trong một chén sứ, cho một ít silica gel vào, lấy chày nghiền mịn, dùng phễu
thủy tinh để đặt mẫu vào cột. Khi đặt mẫu bột khô lên đầu cột xong, dùng một ít dung môi
(dung môi đầu tiên để chạy cột) để thấm ướt phần bột (mẫu chất và silica gel) để đồng thời
rửa phần còn dính trên cột.
- Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
f) Theo dõi quá trình giải ly cột.
- Hứng dung dịch giải ly trong những lọ thủy tinh có đánh số thứ tự, hứng mỗi lọ 50ml.
- Sử dụng sắc ký lớp mỏng để gom các lọ thành các phân đoạn có kết quả SKLM giống
nhau.

BÀI 5: TÁCH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ CỘT

I. Mục đích
Sinh viên sẽ cô lập một vài hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp các chất ban đầu bằng
phương pháp sắc ký cột kết hợp với SKBM.
II. Cơ sở lý thuyết
Xem lai bài sắc ký cột và sắc ký bản mỏng
III. Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ
 Cột thủy tinh (sẽ được lựa chọn sau)
 2 cái kẹp (giữ cột)
 1 giá đỡ (giữ cột)
 2 becher, đũa thủy tinh
 Ống đong 100ml
 Bông gòn
 Phễu thủy tinh nhỏ, các lọ thủy tinh (các lọ bi)
 Kéo, vi quản đã kéo, bản mỏng (20x20cm)
 1 cái kẹp bản mỏng
 Máy sấy hoặc bếp điện để nướng bản
 Bình giải ly bản
 Đèn soi UV
 H
2
SO
4
50%
Hóa chất: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, aceton, nước cất

IV. Cách tiến hành
Xem lại phần sắc ký cột hở của bài sắc ký cột.