LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH ĐỊNH HCV BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.1. Giới thiệu về bệnh viêm gan C [1,9]
1.1.1. Giới thiệu chung
Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất và đảm nhận nhiều vai trò chức năng quan
trọng của cơ thể như hỗ trợ tiêu hóa, điều hòa chuyển hóa năng lượng, dự trữ máu,
khử độc,…
Viêm gan là tính trạng gan bị sưng hoại tử tế bào gan, giảm hoặc mất dần
chức năng hoạt động. Có nhiều nguyên nhân gây viêm gan như thuốc, rượu, chất
độc,… quan trọng và phổ biến nhất là do nhiễm siêu vi. Có nhiều loại siêu vi viêm
gan: A, B, C, D, E, G, TT virus, Sen virus,… trong đó, chỉ có virus gây viêm gan B,
C, D là có thể gây viêm gan mãn tính, xơ gan và dẫn đến ung thư gan. Bệnh viêm
gan siêu vi C lần đầu được phát hiện vào năm 1989, do Hepatitis C virus gây ra.
Bệnh thường ít gây triệu chứng rõ ràng và điển hình. Chủ yếu là các dấu hiệu mệt
mỏi, chán ăn rối loạn tiêu hóa, ít khi bị vàng da. Việc phát hiện bệnh hầu hết là do
tình cờ khi xét nghiệm máu hoặc kiểm tra sức khỏe.
Diễn tiến bệnh âm thầm, chưa có vacxin phòng ngừa, tỷ lệ chuyển thành xơ
gan và ung thư gan cao hơn so với bệnh viêm gan so siêu vi B. Mặt khác, chi phí
điều trị bệnh là khá cao và cần tuân theo phát đồ điều trị chặt chẽ . Do đó, việc xét
nghiệm máu định kỳ là rất cần thiết để phát hiện bệnh gan sớm.
1.1.2. Lịch sử phát hiện viêm gan siêu vi C
Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm gan
siêu vi sau truyền máu không do viêm gan siêu vi B và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn
thời ủ bệnh do viêm gan siêu vi A. Sau đó, các tác giả: Bassler và cộng sự (1995),
Lee và cộng sự (1993), Livak và cộng sự (1995) chứng minh về mặt huyết thanh
học rằng bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan
siêu vi A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời.
Vào tháng 5 năm 1989 bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ
những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự (1989) đã tách chiết

nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào bộ gen của
λgt11 và xâm nhiễm E. coli, thu được có một dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng
thể có trong huyết thanh người bị bệnh viêm gan siêu vi không A không B sau
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 2
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
truyền máu. Cuối cùng, Choo và cộng sự (1989) xác định rằng bệnh viêm gan siêu
vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là siêu vi C (HCV).
1.2. Dịch tể học [3,11]
1.2.1 Tình hình nhiễm siêu vi C trên thế giới
Hình 1.1: Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới
(Nguồn: www: WHO, 2008)
Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới WHO, trung bình 3% dân số thế giới
nhiễm viêm gan siêu vi C , 170 triệu người mang virus này dạng mạn tính. Trong
đó, Đông Nam Á có khoảng 32,3 triệu người bị nhiễm, chiếm 2.15% dân số khu
vực này.
Tần suất toàn bộ của HCV ở cộng đồng chung được báo cáo theo từng lục địa
với tần suất trung bình 5.17% ở Châu Phi , 3.5% ở Châu Á, 1,93% ở Châu Mỹ,
1,75% ở Châu Âu, và 1.88% ở Châu Đại Dương. Tính trên toàn cầu là 2.856% có
nghĩa là khoảng 210 triệu người nhiễm HCV trên toàn thế giới.
Ở các nước phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp, 70%
viêm gan mạn, 40% xơ gan giai đoạn cuối, 60% ung thư gan, 30% ca ghép gan. Ở
các nước đang phát triển, HCV là nguyên nhân của 18% các ca viêm gan cấp, 69%
viêm gan mạn, 33% xơ gan giai đoạn cuối, 52% ung thư gan, 32% ca ghép gan. Ở
các nước kém phát triển, HCV là nguyên nhân của 36% các ca viêm gan cấp, 75%
viêm gan mạn, 50% xơ gan giai đoạn cuối, 66% ung thư gan, 38% ca ghép gan.
Trong các genotype của HCV, gen type 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới nói
chung và ở nước Mỹ nói riêng với 35% loại 1a và 35% loại 1b. Genotype 3 thường
thấy ở Pakistan, Úc, Scotland. Genotype 4 ở Trung Đông và Châu Phi cũng như
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 3
Không có

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
South Africa. Genotype 6 tại Hồng Kông và Macau.
1.2.2. Tình hình nhiễm siêu vi C ở Việt Nam [7,13]
Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV 1,8% dân số cả nước. , trung bình từ 1-3 trường
hợp/100000 người mỗi năm.
Theo Trương Xuân Liên (2010), tỷ lệ nhiễm HCV ở một số đối tượng tại
TP.HCM là : trên người tiêm chích ma túy là 96,2%, nhiễm HIV là 73,6%, bệnh
nhân xơ gan : 47,8%, bệnh nhân viêm gan : 26,6%, bệnh nhân ung thư gan :
23,2%, bệnh nhân nghi viên gan :19,3%, người cho máu : 14%, gái mại dâm : 9,9%,
bệnh nhân da liễu : 6,9%, nhân viên y tế : 3,28% và người cho máu bình thường :
2,53%.
Nakata và cộng sự (2007) khảo sát trên người không có bệnh gan ở 2 thành
phố lớn là Hồ Chí Minh và Hà Nội thì thấy tỉ lệ có kháng thể kháng HCV (anti-
HCV) lần lượt là 9% (43/491) và 4% (18/511). Phân bố kháng thể không phụ thuộc
theo tuổi. Cũng trong nghiên cứu này, ở TP.HCM, tần suất nhiễm anti-HCV khá
cao ở người tiêm chính ma túy 87%, bệnh nhân đang thẩm tách máu : 54%, hoặc có
bệnh ưa chảy máu : 29%. Nghiên cứu cũng cảnh báo cần sàng lọc anti-HCV ở
người cho máu vì mục đích thương mại là quan trọng.
Theo Trần Thanh Dương và cộng sự (2009) nghiên cứu kiểu gen của 14
bệnh nhân viêm gan tại Hà Nội thì thấy các kiểu gen 1a, 1b và 6a lần lượt là 4, 4 và
6 trường hợp. Cũng chính tác giả này, phân tích HCV ở phụ nữ mại dâm tại Hà Nội
thì thấy có nhiều kiểu gen : 1a, 1b, 6, 6a, 9a. Cao nhất là 1a, 6a và 1b.
1.3. Con đường lây nhiễm HCV [5,7]
HCV lây truyền theo đường máu và các đường lây chủ yếu sau :
 Người nhận máu, chế phẩm máu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho
nhiễm HCV.
 Nhân viên y tế: tiếp xúc với bệnh phẩm chứa siêu vi trong quá trình làm việc.
 Ðường tình dục.
 Mẹ truyền sang con.
Dùng chung dao cạo, bàn chải răng, kềm cắt móng tay với người bị nhiễm siêu vi

C, kim chích xăm mình hay xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng.
Tuy nhiên, 30-40% các trường hợp là không rõ nguyên nhân.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 4
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.4 Diễn tiến bệnh [13,15]
Sau khi bị nhiễm siêu vi, bệnh nhân có thời gian ủ bệnh từ 2 tuần – 6 tháng.
Đây là giai đoạn nhiễm trùng cấp tính. Phần lớn bệnh nhân không có triệu chứng
lâm sàng. Một số có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, … Việc chẩn đoán bệnh trong giai
đoạn này dựa vào xét nghiệm máu.
Sau 6 tháng, khoảng 85% bệnh nhân chuyển thành dạng mãn tính. Khi đó,
bệnh diễn tiến thầm lặng có thể từ 10-30 năm. Khi bệnh nhân phát hiện thường vào
giai đoạn cuối, khi các tế bào gan đã xơ, viêm và hoại tử
Có hai dạng viêm gan mạn tính
-Viêm gan C mãn tính có men ALT(Aspartate Amino Transferase) bình
thường, (ALT do gan tạo ra thường có một hàm lượng cố định trong máu, trị số
bình thường ALT < 40 U/L ,AST < 40 U/l)
Trường hợp viêm gan C mãn tính có men ALT bình thường là khi bệnh nhân
có sự hiện diện của anti-HCV, RNA HCV (+) bằng phương pháp PCR, và men
ALT bình thường kéo dài.
-Viêm gan C mãn tính có men ALT tăng :
Bệnh nhân viêm gan C mãn tính thuộc vào loại này. Tùy theo tổn thương mô
học mà chia làm hai loại: viêm gan mãn nhẹ và viêm gan mãn mức độ từ vừa đến
nặng. Sự phân biệt này rất quan trọng về tiên lượng và chỉ định điều trị
+ Viêm gan mãn nhẹ:
Viêm gan mãn nhẹ là khi sinh thiết gan cho thấy tổn thương mô học nhẹ.
Theo cách tính của Knodell(1980) viêm gan mãn nhẹ là khi số điểm sơ hóa là 0
hoặc 1 và số điểm hoại tính viêm- hoại tử nhỏ hơn 6.
+ Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng:
Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng là khi sinh thiết gan thấy có tổn thương
viêm- họai tử đáng kể hoặc xơ hóa lan rộng. Theo cách tính của Knodell (1980)

viêm gan mãn vừa và nặng được xác định là khi số điểm sơ hóa là 3 hoặc 4 và số
điểm hoạt tính lớn hơn 6.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 5
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Nhiễm cấp tính
Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng
Hồi phục Viêm gan mãn
Hình 1.2: Sơ đồ diễn tiến bệnh siêu vi
( Nguồn: bệnh viện Hòa Hảo)
1.5. Biện pháp phòng ngừa và điều trị [20.23]
1.5.1. Biện pháp phòng ngừa
Các vết máu khô từ những người nhiễm HCV có thể lây cho người khác trong
khoàng thời gian từ 16 giờ đến 4 ngày, ở nhiệt độ phòng. Do đó, các vết máu cần
phải được tẩy sạch và người thực hiện phải mang bao tay cao su.
Không dùng chung ống chích, kim tiêm, bông băng.
Không dùng chung dao cạo râu, bàn chải đánh răng, dụng cụ cắt móng tay.
Quan hệ tình dục không an toàn.
Băng vết thương để tránh tiếp xúc máu cho người khác.
1.5.2. Điều trị
Điều trị viêm gan siêu vi đòi hỏi phải có kiến thức sâu về viêm gan và thuốc
chống siêu vi . Do đó, bệnh nhân nên được điều trị và theo dõi bởi bác sĩ chuyên về
viêm gan.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 6
6
0
%
2 tuần- 6 tháng
3
9
%

15%
1
%
Nhiễm cấp tính
1
0
-
3
0

n
ă
m
Không triệu chứng
Mệt mỏi
Viêm gan nặng
Hồi phục
85%
Viêm gan
không biến
chứng
20% Biến
chứng xơ và
ung thư
Viêm gan mạn
Viêm gan
không biến
chứng
20% Biến
chứng xơ và

ung thư
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Hiện nay, để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên
của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm: interferon α2b
(Intron A), interferon α2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng
interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp.
Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một thuốc
kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và thành
công ở khoảng 40% số người bị HCV.
Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa có hiệu quả gấp hai lần
interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược phẩm
Mỹ đã cho phép dùng interferon pegyl hóa, interferon-peginterferon alfa-2b để
điều trị viêm gan.
Theo nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Thu Thủy-bệnh viện Hòa Hảo TP.HCM
Hiệu quả điều trị phụ thuộc nhiều yếu tố như: giới tính, thời gian ủ bệnh, độ
tuổi……
Yếu tố Thuận lợi Không thuận lợi
Giới tính
Độ tuổi
Thời gian bệnh
Xơ gan
Cân nặng
Nồng độ virus
Genotype
Nữ
<40
Ngắn
Không
>75 kg
Thấp

Không phải type 1
Nam
>40
Dài
Có
<75 kg
Cao
Type 1
Bảng 1.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh viêm gan C
Do đó, các lời khuyên được đưa ra để giữ gìn sức khỏe và bảo vệ gan:
 Theo dõi và tuân theo sự chỉ dẫn của bác sĩ chuyên khoa.
 Hạn chế tối đa các chất kích thích như rượu bia các loại nước có gas, các loại hóa
chất, các loại phụ gia
Hạn chế chất béo động vật.
Không sử dụng bất ký loại thuốc gì nếu không có chỉ định của bác sĩ đặc biệt các
loại thuốc giảm đau, thuốc an thần, thuốc ngủ…
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 7
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Sống khoẻ mạnh, tập luyện vừa phải, ăn uống điều độ, không uống rượu, nghỉ
ngơi đầy đủ là những phương thức tốt cho bịnh nhân viêm gan C để giữ gìn sức
khoẻ, năng lượng.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 8
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN
SIÊU VI C
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 9
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
2.1. Hepatitis C virus -HCV [10,11]
HCV được xếp vào họ Flaviviridae vì có một số đặc tính về cấu trúc gen
tương tự như Flavivirus và Peptivirus. Do số lượng, việc xử lý protein virus và các

đặc điểm sao chép có một số khác biệt, nên gần đây HCV được xếp vào giống mới
của họ Flaviviridae với tên Hepacivirus. HCV lại có chung các đặc điểm với
Picornavirus và các virus thực vật như Potyvirus, làm cho ta lầm tưởng HCV là một
mắt xích tiến hóa giữa các virus thực vật và động vật.
HCV thuộc nhóm Flavirus HCV là một siêu vi nhỏ, hình cầu, đường kính
khoảng 55-65nm. Trọng lượng phân tử vào khoảng 4106 daltons. Bộ gen của siêu vi
C là một chuỗi đơn RNA độ 95000 nucleotide chứa một khung đọc mở dịch mã dài
mã hóa một polypeptide lớn 3010-3033 amino acid bắt đầu tại codon methionin
trong khung đọc đầu tiên và nằm bên trong phần nucleocapside 30-35nm có cấu
trúc đối xứng 20 mặt. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 tạo
thành các phức hợp primer.
Kiểu đọc mở HCV mã hóa một tiền chất polyprotein mà tiền chất này được
xử lý đồng dịch mã hoặc sau dịch mã để tổng hợp các protein cấu trúc ( C, E1, E2,
p7) và các protein không cấu trúc (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a và NS5b).
HCV có 6 gentype được ký hiệu theo thứ tự từ 1 đến 6. Mỗi gentype có nhiều type
phụ. Trong đó, thường gặp nhất là các type 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6. type 1a và 1b là
khó chửa trị nhất vì độc lực mạnh của virus. Bên cạnh đó, HCV thường bị đột biến
nên có khả năng tránh được các đáp ứng miễn dịch của cơ thể và dễ chuyển sang
nhiễm mạn tính.
2.2. Cấu trúc HCV [4]
Hình 2.1. Cấu trúc HCV
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 10
Protein vỏ E1
Protein vỏ E2
Protein liên
kết màng NS2
Protein lõi
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
(Nguồn: James A. Perkin, 2001)
Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi RNA mạch( +), chứa khoảng 9400

nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể gồm 3011 amino acid. Gen chứa
một khuôn đọc mở với các trình tự được trình bày trong hình 2.2
Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen HCV
(Nguồn: James A. Perkin, 2001)
 Đầu 5’ không dịch mã: có chức năng điều hòa dịch mã.
C (nucleocapsid): protein lõi.
E1 (envelope): protein vỏ.
E2 (envelope): protein vỏ.
NS2 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng.
NS3 (protease/helicase): các enzyme thủy giải và cắt đứt liên kết hydro.
NS4 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng.
NS5 (polymerase): enzyme nhân bản vật liệu di truyền.
Gen của siêu vi C là một chuỗi đơn RNA có cực tính dương, gồm khoảng
9500 nucleotide được chia làm ba vùng:
(i)Đầu 5’ không mã hóa gồm 341-344 nucleotide. Đây là vùng tương đối bị ít
biến đổi nhất giữa các phân type khác nhau. Do đó vùng này như là một chất mồi
để phát hiện RNA của siêu vi C bằng phương pháp PCR. Chức năng của vùng này
là tham gia vào quá trình điều hòa nhân đôi của siêu vi.
(ii)Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một
khung đọc mở duy nhất gồm 9379-9481 nucleotide, được giải mã để tổng hợp một
polyprotein tiền chất của siêu vi gồm khoảng 3000 acid amin. Sau đó, protein này
sẽ được các enzyme protease của siêu vi và các enzyme peptidase tín hiệu của tế
bào phân cắt thành protein cấu trúc và protein không cấu trúc.
(iii)Đầu 3’ không mã hóa:
RNA virus chỉ có một khung đọc mẫu duy nhất mã hóa khoảng 3010-3033
aa, hai đầu được gắn kết bởi các vùng không dịch mã 3’ và 5’. Polyprotein được
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 11
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
phân cắt sau dịch mã với các peptidase tín hiệu và các protease mã hóa virus NS2-3
và NS 3-4 để sinh ra các protein cấu trúc và không cấu trúc trưởng thành.

2.2.1. Các protein cấu trúc
Các protein cấu trúc bao gồm C, E1 và E2 :
Protein capsid = protein C (21 kDa) tạo nên phần nucleocapsid bao bọc bên ngoài
chuỗi gen của siêu vi.
Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ, liên kết với
nhau thành các phức hợp dimer. Ở protein E2 có hai vùng siêu biến là HVR1 (ở vị
trí acid amin 390-410) và HVR2 (ở vị trí acid amin 474-480). Vùng siêu biến này
thường xuyên bị biến đổi qua mỗi lần siêu vi nhân đôi, tạo ra sự khác biệt giữa các
gen của siêu vi C trong cùng một bệnh nhân. HVR1 còn là nơi kích thích hệ thống
miễn dịch tạo ra kháng thể trung hòa. Vì vậy kháng thể mà cơ thể tạo ra không theo
kịp sự biến đổi liên tục tại vùng HVR1. Đây là cơ chế giúp siêu vi trốn tránh được
đáp ứng miễn dịch của ký chủ và làm cho tình trạng nhiễm siêu vi C thường chuyển
sang mãn tính.
Protein p7 (7 kDa) mà chức năng vẫn chưa được biết rõ.
2.2.2. Các protein không cấu trúc:
Protein NS2 (23 kDa).
Protein NS3 (68 kDa).
Protein NS4 ( gồm NS4A và NS4B).
Protein NS5 ( gồm NS5A và NS5B) : NS5A (56-58 kDa) có liên quan đến
chuyển hóa lipid vì nó tương tác với thành phần apolipoprotein Á. Vùng NS5A còn
được xem là vùng quyết định nhạy cảm của siêu vi C đối với interferon-alpha.Vùng
này làm mất tác dụng của interferon qua trung gian việc ức chế men protein kinase
PKR. Một khi PKR bị ức chế, nó sẽ không ức chế quá trình nhân đôi của siêu vi.
Nếu có đột biến xảy ra ở vùng NS5A có thể tạo được sự đáp ứng tốt với interferon.
NS5B (65kDa) chính là men RNA polymerase phụ thuộc RNA. Men này dùng để
tổng hợp chuỗi RNA từ khuôn mẫu là RNA.
2.3. Cơ chế gây bệnh
Đầu tiên, HCV gắn vào một thụ thể trên bề mặt tế bào gan nhờ hai
glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2, thực hiện quá trình hòa màng. RNA mạch
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 12

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
(+) của HCV được dịch mã nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ. Protein tiền thể
tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu để tạo ra các protein cấu trúc C, E1, E2
và các protein không cấu trúc là NS1-NS5. Sau đó bắt đầu phiên mã ngược để tạo ra
mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) đã có nhờ vào enzyme Reverse
Tranriptase. Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2
sẽ kết hợp với RNA kép của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid. Nucleocapsid
này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn
chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác.
2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập vào tế bào vật chủ
Các bước sao chép được mô tả như sau :
Protein màng của E2 giúp gắn kết virus vào tế bào.
 Sự cởi bỏ vỏ ngoài của HCV.
 Quá trình dịch mã và xử lý protein.
 Sự tổng hợp RNA HCV mạch âm nhờ RNA polymerase được mã hóa trong vùng
NS5B.
 Tổng hợp RNA HCV mạch dương : Sau khi hình thành, chuỗi RNA mạch âm
thành khuôn mẫu để tổng hợp bộ gen RNA mạch dương của virus mới. Quá trình
này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase.
 Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi
qua màng bào tương.
 Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 10
12
virion
HCV mỗi ngày.
2.3.1.1. Nhiễm HCV cấp
HCV được truyền từ người sang người theo đường máu hoặc tiếp xúc với
dịch cơ thể người mang HCV. HCV có thể lưu hành tự do trong huyết tương và gây
nhiễm các tế bào di động như lympho bào, bạch cầu đơn nhân. Ngoài ra, bằng
phương pháp lai in situ, PCR và các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang đã tìm thấy

các thành phần virus trong tế bào gan, các tế bào lympho B và T, và các đại thực
bào, và hóa học mô miễn dịch đã chứng minh các kháng nguyên virus trong các tế
bào thượng bì đường mật và trong các tế bào thượng bì tuyến nước bọt. Việc phát
hiên này có nhiều ý nghĩa rất quan trọng :
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 13
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
-Việc nuôi cấy siêu vi C có thể thực hiện được ở các dòng lympho bào.
- Các tế bào đơn nhân có thể là nguồn chứa siêu vi và đặc biệt có thể là
nguyên nhân gây tái nhiễm siêu vi C sau khi ghép gan.
- Sự lây nhiễm ở các tế bào đơn nhân có thể chọn lọc nên một vài biến chủ
đặc biệt và tạo điều kiện cho bệnh tồn tại kéo dái.
-RNA virus thường được phát hiện 2 ngày sau truyền nhiễm, tuy nhiên
không liên tục, cho thấy có các đơn bùng cháy sau chép virus. Khi được xác định
bằng định lượng PCR và bằng xét nghiệm DNA nhánh, tình trạng huyết tương tăng
lên mức độ cao (180 bộ gene/ml hay nhiều hơn) trước khi xuất hiện các triệu chứng
lâm sàng.
Mật độ của các hạt tử HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03 đến
1,72g/ml. Sở dĩ mật độ của HCV thay đổi như vậy là do các virion lưu hành trong
máu dưới nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao
nhưng chỉ hiện diện với mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03) ; hoặc là ở dạng kết
hợp với các đại phân tử, đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức
hợp miễn dịch nhưng mật độ lại cao.
2.3.1.2. Nhiễm HCV mạn
Nhiễm HCV thường có 80% tình trạng virus có trong huyết thanh tồn tại,
cho dù không có các triệu chứng lâm sàng và sinh hóa. Lượng virus trong huyết
thanh được phát hiện trong quá trình tồn tại biến đổi thay đổi theo từng cá nhân, từ
102 – 1010 gene/ml, và có thể dao động mạnh theo thời gian. Tình trạng virus huyết
thanh có lúc không phát hiện được cho là do dao động về số lượng tế bào nhiễm
virus, các yếu tố vật chủ tác động lên sự thanh thải virus cũng như hiệu quả sao
chép của các loài.

SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 14
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN
ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C
3.1. Chẩn đoán lâm sàng
3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 15
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Định lượng các men AST (Alanin Amino Transferase ) và ALT (Aspartate
Amino Transferase). Đặc điểm quan trọng về phương diện sinh hóa trong viêm gan
siêu vi C là sự dao động của men ALT lúc tăng, lúc giảm thậm chí trong giới hạn
bình thường. Sự tăng men gan trong viêm gan C cấp thường thấp hơn so với mức
tăng trong viêm gan A và B.
3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan
Chức năng bài tiết mật bị ảnh hưởng dẫn đến tình trạng tăng bilirubin trong
máu ( cả bilirubin trực tiếp và bilirubin giáp tiếp) gây vàng da. Bilirubin là sản
phẩm chuyển hoá của hemoglobin. Bilirubin gián tiếp và bilirubin trực tiếp thường
được đo để tầm soát và theo dõi bệnh gan hay đường mật.
Đánh giá chức năng tổng hợp yếu tố đông máu của gan bằng cách khảo sát
- Prothrombine bình thường 8,2-10,3
- Taux de prothrombin bình thường lớn hơn 80%.
- INR bình thường 0,9-1,3.
Đánh giá chức năng tổng hợp Albumin màu của gan. Trị số trung bình
Albumin trong máu từ 35-55 g/l và tỷ số Albumin/Globulin bình thường từ 1-1,5.
Albumin là protein quan trọng nhất của huyết thanh tham gia vào hai chức năng
chính : duy trì áp lực thẩm thấu keo trong huyết tương và liên két vận chuyển phân
tử nhỏ như : acid béo, bilirubin… Globulin chủ yếu là immunoglobulins (Ig's)- có
nhiều lọai, IgM, IgE ) được tạo ra từ bạch cầu, thuộc về kháng thể và có chức năng
nhận ra và "tấn công" các vật lạ xâm nhập cơ thể.
Chức năng thải NH

3
bình thường là 9-33µmol/L. Khi gan suy NH
3
sinh độc
cho cơ thể, đặc biệt là hệ thần kinh dẫn đến rối loạn tri giác, hôn mê.
3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát
Giúp chẩn đoán loại trừ các nghuyên nhân gây tắc mật khác như sỏi mật, u
đường mật, u đầu tụy, hoặc các tổn thương như ung thư gan, sán lá gan…
Trong viêm gan cấp, cấu trúc gan đồng nhất, gan có thể hơi to.
Sinh thiết tế bào gan : quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác định mức độ
viêm nhiễm chẩn đoán giai đoạn bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị.
3.1.4. Xét nghiệm miễn dịch học
Tìm anti-HCV trong máu.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 16
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tuy nhiên xét nghiệm này dương tính chỉ có tính chất gợi ý về tình trạng
nhiễm HCV, không cho kết luận mới nhiễm hay đã nhiễm từ lâu và không thể kết
luận chắc chắn là không còn mang HCV.
3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
3.2.1. Phương pháp bDNA
Là một kỹ thuật lai phân tử giữa RNA HCV với những probe bắt cặp bổ sung
với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5’ không mã hóa. Đây là một phương
pháp phát hiện và định lượng trực tiếp. Người ta xử lý huyết tương hoặc huyết
thanh người bệnh với protease K nhằm giải phóng RNA HCV từ các hạt virus.
RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó phức hợp RNA HCV-probe được cố
định trên một vi giếng và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi
probe này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase. Cuối cùng, cơ chất của
enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang sẽ được thu nhận bởi máy đọc
tín hiệu ánh sáng.
Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục

tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai loại probe ( probe cố định RNA HCV vào vi
giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV ) phải được thiết kế sao cho có thể
định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau. Các loại probe này thường
có kích thước từ 16-24 nucleotide và nhiệt độ nóng chảy (Tm) vào khoảng 70
0
C
nhằm đảm bảo tính đồng nhất của phản ứng lai và tín hiệu tối đa.
Phương pháp cho kết quả tuyến tính với các mẫu huyết thanh có nồng độ
RNA HCV từ 200000 đến 120000000 phân tử RNA/1ml máu. Các genotype của
HCV cũng có ảnh hưởng trên việc định lượng RNA HCV giữa genotype 1 và 2 có
độ nhạy chênh lệch nhau vào khoảng 3 lần và giữa genotype 3a và 6a là 1,5 lần.
3.2.2. Phương pháp ELISA
Phương pháp này sử dụng nguyến tắc phát hiện phân tử lai dựa vào sự
chuyển màu cơ chất hoặc tín hiệu quang, hóa quang dưới sự xúc tác của enzyme kết
hợp với kháng thể kháng digoxigenin. Đầu tiên người ta tách chiết RNA HCV từ
huyết thanh và chuyển thành cDNA nhờ phản ứng phiên mã ngược. cDNA này
được dùng làm bản mẫu cho phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR,
một trong hai primer sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy sản phẩm PCR
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 17
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
tạo ra sẽ có một mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản sản phẩm
PCR được biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong
của mỗi vi giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối vớ
biotin sẽ giữ các mạch mang biotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu
cho HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’
với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp kháng
thể kháng digoxigenin – alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một thời
gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi cơ
chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường độ màu tương ứng
với hàm lượng PCR có trong mẫu. Việc định lượng RNA HCV có trong mẫu được

thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ỡ mỗi vi giếng vào một đường chuẩn
xây dựng từ những mẫu có nồng độ RNA HCV biết trước. Phương pháp này có khả
năng phát hiện HCV với nồng độ là 600IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp nằm
trong khoảng 600IU/ml đến 850000IU/ml. Phương pháp định lượng bằng PCR
ELISA có khả năng sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vì không đòi hỏi các
thiết bị chuyên dụng, không mắc tiền và thao tác không phức tạp, việc đánh giá kết
quả đơn giản. Đây là phương pháp định lượng có khả năng thay thế cho định lượng
bằng Real-Time PCR ở những nơi không có thiết bị chuyên dụng cho Real-Time
PCR.
3.2.3. PCR định lượng cạnh tranh
Phương pháp này nhân bản trong cùng eppendorf một trình tự mục tiêu cần
định lượng và một trình tự được gọi là chứng định lượng có nồng độ biết trước. Các
nồng độ giảm dần của chứng định lượng được cho vào từng phản ứng. Ở phản ứng
nào mà tín hiệu sau nhân bản của chứng định lượng và trình tự mục tiêu bằng nhau
thì nồng độ thì nồng độ của trình tự mục tiêu chính là nồng của chứng định lượng
trong phản ứng đó. Thông thường, chứng định lượng được thiết kế sao cho gần
giống với trình tự mục tiêu nhất về kích thước, thành phần nucleotide để sự nhân
bản của trình tự mục tiêu không bị ức chế bởi chứng định lượng và ngược lại.
Tuy nhiên, chứng định lượng cũng phải phân biệt được với trình tự mục tiêu
bằng cách tăng kích thước hay them vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn
vào trình tự của chứng định lượng.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 18
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
3.2.4. Kỹ thuật Hybrid Capture
Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử
DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA. Các mẫu được xủ
lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tế bào. Sau đó các
probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai được tiến hành trong các ống
nghiệm hoặc trong các vi giếng của microtiter plate có phủ một kháng thể đa dòng.
Kháng thể đa dòng này bắt giữ toàn bộ các phân tử lai DNA:RNA hiện diện trong

phản ứng. Các phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạch đơn, RNA, thể lai
DNA:DNA, RNA:RNA không phản ứng với kháng thể này bị rửa trôi. Một phương
pháp khác để cố định các trình tự mục tiêu sử dụng các probe có gắn biotin và phản
ứng bắt giữ xảy ra trong các ống nghiệm hoặc trong các microtiter plate có phủ
treptavidin. Sau đó, các phân tử lai DNA:RNA đã được bắt giữ sẽ liên kết đặc hiệu
với một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase. Một phân tử lai có thể
liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkaline phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ
nhạy của kỹ thuật. Sau đó, cơ chất phát ánh sáng của alkaline phosphatase là CSPD
được cho vào phản ứng và ánh sáng phát ra được phân tích bằng máy đo ánh sáng.
Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU có hàm lượng tương
ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu.
3.2.5. Kỹ thuật Real-Time PCR
Các kỹ thuật cổ điển như Southern blot hay Northern blot đã dẫn đến sự phát
triển các phương pháp định lượng dựa trên cơ sở lai phân tử như RNAse protection,
dot blot,… Tuy nhiên, các phương pháp này có chung nhựơc điểm là thời gian tiến
hành kéo dài và cần một lượng nucleic acid ban đầu lớn. Sự ra đời của kỹ thuật
PCR đã khắc phục các nhược điểm nêu trên. Các phương pháp định lượng dựa trên
kỹ thuật PCR như PCR ELISA, PCR định lượng cạnh tranh,… ngày càng phát triển.
Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khi sử dụng phương pháp này phải giải quyết
hai vấn đề lớn, đó là: ảnh hưởng của pha bão hòa trong phản ứng PCR và sự ức chế
của phản ứng bởi các chất kìm hãm. Càng về cuối khi khi phản ứng PCR bước vào
pha bão hòa, thì hiệu quả nhân bản càng giảm, không còn mang tính lũy thừa. Có
nhiều nguyên nhân cho hiện tượng này như lượng primer giảm, nồng độ các sản
phẩm PCR quá cao khiến cho primer khó kết hợp với mạch khuôn, các thành phần
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 19
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
phản ứng như ezyme, nucleotide, MgCl
2
… cạn kiệt. Lúc đó nếu căn cứ vào hàm
lượng sản phẩm PCR để suy ra hàm lượng nucleic acid ban đầu thì không chính xác

vì các mẫu có hàm lượng nucleic acid ban đầu khác nhau sẽ có hàm lượng sản phẩm
PCR tại pha bão hòa như nhau. Vấn đề thứ hai là sự tồn tại của các chất kìm hãm
phản ứng PCR, cả sau quá trình tách chiết, cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng sản
phẩm PCR sau cùng.
Nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật
PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn. Holland và cộng sự (1991) đã phát
hiện chức năng 5’ exonuclease của Taq polymerase. Bassler và cộng sự (1995), Lee
và cộn sự (1993), Livak và cộng sự (1995) đã phát triển các loại mẫu dò có khả
năng chuyển năng lượng huỳnh quang. Sự phát triển về thiết bị của các công ty như
Perkin Elmer, Idaho Technologies, Acugen… cũng góp phần đáng kể vào việc hình
thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real – Time PCR.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 20
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 4. QUY TRÌNH REAL-TIME PCR
ĐỊNH LƯỢNG HCV
4.1. Kỹ thuật Real-Time PCR
4.1.1. Nguyên tắc
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 21
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này có thể
định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát
huỳnh quang. Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm
lượng theo một thời gian thật của phản ứng.
Hình 4.1: Bước của một chu trình PCR
( Nguồn: Andy Vierstrate, 1999)
Thông thường một chu trình Real-Time PCR ba bước:
Bước 1: biến tính- nhiệt độ phản ứng là 94
o
C trong 30 giây đến 1 phút, hai mạch
DNA khuôn bị biến tính, duỗi xoắn và tách ra.

Bước 2: bắt cặp, Nhiệt độ được hạ thấp xuống nhiệt độ Ta (nhiệt độ bắt cặp) của
mồi, khoảng 40-70
o
C trong 30 giây đến 1 phút, cho phép các mồi bắt cặp vào
khuôn.
Bước 3: kéo dài (nhiệt độ 72
o
C), nhiệt độ được tăng lên 72
o
C, là nhiệt độ thích hợp
nhất cho enzyme DNA polymerase để hoạt động tổng hợp mạch mới từ đoạn mồi.
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 22
Giai đoạn biến
tính
Giai đoạn bắt
cặp
Giai đoạn kéo
dài
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Thời gian này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại (từ 30 giây đến vài
phút).
Thông thường một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ.
4.1.2. Các thành phần trong phản ứng Real-Time PCR
Một phản ứng Real-Time PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản:
4.1.2.1. DNA mạch khuôn
DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản
ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus.
Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng khuếch đại nếu nó được
phiên mã ngược thành cDNA. Nồng độ DNA ban đầu trong phản ứng không được
quá cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng. Thông

thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 10
5
bản
sao/phản ứng.
4.1.2.2. Mồi
Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò
làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế
mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên
biệt của phản ứng PCR. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán
tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch
đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn
nồng độ mồi thường là 0.1-1µl.
Thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau:
-Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5
o
C.
-Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”.
-Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi.
-Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng.
-Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
-Thành phần GC khoảng 40-60%.
-Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản.
4.1.2.3. Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 23
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95
o
C. Một phản ứng PCR từ 25-50µl
thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5-2.5 đơn vị.
4.1.2.4. MgCl

2
Có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động. Ngoài ra,
mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl
2
và do đó sẽ
cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl
2
cao sẽ dẫn đến hiện tượng
khuếch đại kí sinh. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl
2
tối ưu nhất cho từng phản
ứng PCR cụ thể, thông thường là từ 1.5-4mM.
4.1.2.5. Dung dịch đệm PCR
Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra.
Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như
nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng PCR sẽ
có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10nM Tris – HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ
phòng.
4.1.2.6. dNTPs
Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP,
dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl
2
1.5mM) là 200-250µl. Nếu nồng độ dNTPs cao hơn 4µl sẽ làm giảm hiệu quả
khuếch đại phản ứng PCR, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng
lỗi sao chép của DNA polymerase.
4.1.3. Các kiểu phản ứng Real-Time PCR
Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào mẫu dò. Mẫu dò là một
đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác
nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình tự bổ sung với nó. Về
cơ bản, mẫu dò cũng tương tự như mồi, chỉ khác ở chỗ mẫu dò được gắn thêm một

cơ chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng xạ P
32
/P
33
, hoặc chất phát
huỳnh quang).
Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-Time PCR
với độ nhạy tương đương nhau. Cả bốn phương pháp đều sử dụng các chất nhuộm
huỳnh quang, có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu
nhằm theo dõi hàm lượng PCR mục tiêu theo thời gian thật của phản ứng. Phương
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 24
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn
vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Ba phương pháp còn lại sử dụng các probe có
đánh dấu bằng chất huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu.
4.1.3.1. Mẫu dò thủy giải
Còn được gọi là Taqman probe. Mẫu dò này được gắn một chất phát huỳnh
quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh
sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher. Quencher là một là một phân tử
hấp thu năng lượng ở trạng thái bị kích thích. Trong phản ứng PCR, mẫu dò này sẽ
bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài
mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính
5’-3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của mẫu dò và thay bằng
nucleotide mới. Khi đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi mẫu dò và phát tín
hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương
ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Taqman probe có tính đặc
hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn
toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông
thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8-10
o

C
nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase.
4.1.3.2. Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi
Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Khi ở trạng thái tự
do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi
thì phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng
DNA có trong phản ứng PCR. Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử
dụng là SYBR Green I, ethidium bromide. Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm
sẽ gắn vào các DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các
phân tử DNA bị biến tính trong bước biến tính. Mọi DNA mạch đôi hiện diện
trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có
các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác.
Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một
đường cong "nóng chảy" (melting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng
và đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ
SVTH: BÙI QUANG THIỆU Trang 25