LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ DỨA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.
HCM





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME
BROMELAIN TỪ VỎ DỨA



Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC




Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC CHÂU
MSSV: 0811110006 Lớp: 08CSH2

TP. Hồ Chí Minh, 2011
Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất
enzyme Bromelain từ vỏ dứa” là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu sử dụng trong khóa luận la trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng.
Nội dung khóa luận thực hiện trên cơ sở lý thuyết, kiến thức và co tham khảo thêm
một số tài liệu, sách báo và tập chí theo danh mục của khóa luận.


Sinh viên thực hiệ
n
Phan Thị Ngọc Châu

Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii
MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu dề tài 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme 3
2.2. Enzyme protease 4
2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 5
2.2.1.1. Protease động vật 5
2.2.1.2 Protease thực vật 5
2.2.1.3. Protease vi sinh vật 6
2.2.2. Ứng dụng enzyme protease 9
2.3. Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 11
2.3.1. Giới thiệu enzyme bromelain 11
2.3.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain 11
2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12
2.3.3.1. Cấu tạo hoá học 12

2.3.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain 12
2.3.4. Hoạt tính của enzyme bromelain 13
2.3.4.1. Cơ chế tác động 13
2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain 14
2.3.5. Ứng dụng của enzyme Bromelain 15
2.3.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm 15
2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 16
2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước 16
2.3.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước 17
Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iii
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1. Vật liệu và hóa chất 18
3.1.1. Nguyên liệu 18
3.1.2. Hóa chất 18
3.1.3. Thiết bị 18
3.2. Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain 19
3.2.1. Thuyết minh quy trình 20
3.2.2. khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 96
0
, muối Ammonium
sulfate (NH
4
)
2
SO
4
và aceton (CH
3
COCH

3
) 20
3.2.2.1 Nguyên tắc 20
3.2.2.2. Tủa enzyme bằng cồn 96
0
20
3.2.2.3. Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH
4
)
2
SO
4
21
3.2.2.4. Tủa enzyme bằng aceton (CH
3
COCH
3
) 21
3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch
chiết enzyme 22

3.2.3.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 22
3.3. Enzyme cố định 28
3.3.1. Định nghĩa enzyme cố định 28
3.3.2. Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định 29
3.2.2.1. Ưu điểm 29
3.3.2.2. Nhược điểm 29
3.3.3. Một số phương pháp cố định enzyme 30
3.3.3.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)
30

3.3.3.2. Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption) 30
3.3.3.4. Phương pháp khâu mạch (cross – linking) 32
3.3.4. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp
nhốt 33

3.3.4.1. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate 33
Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iv
3.3.4.2. Tạo dung dịch Natrialginate 3% 33
3.3.4.3. Tiến hành cố định 33
3.3.4.4. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định
hoạt tính của enzyme cố định 33

3.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính của
enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate 34

3.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH 34
3.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 34
3.3.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt 35
3.3.5.4. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate .35
3.3.6. Tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký lọc gel 35
3.3.6.1. Nguyên tắc 36
3.3.6.2. Thiết bị và hóa chất 36
3.3.6.3. Các bước tiến hành 36
3.3.6.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme Bromelain và độ tinh sạch của
enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 38

3.3.7. Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain bằng phương pháp
điện di trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 39

3.3.7.1. Nguyên tắc 39
3.3.7.2. Thiết bị và hóa chất 39
3.3.7.3. Phương pháp 41
3.3.7.4. Xác định trọng lượng phân tử của enzyme Bromelain 43
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
4.1. Kết luận 44
4.2. Kiến nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46



Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản 15
Bảng 3.1. Tỷ lệ bằng cồn 96
o
đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 20
Bảng 3.2. Nồng độ tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 21
Bảng 3.3. Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 22

Bảng 3.4. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin 24
Bảng 3.5. Bảng số liệu dựng đường chuẩn tyrosine 26

Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease 4
Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật 6
Hình 2.3. Vi khuẩn Clostridium 7
Hình 2.4. Vi khuẩn Bacillus 7
Hình 2.5. Nấm mốc 8
Hình 2.6. Xạ khuẩn 8
Hình 3.1. Thiết bị lọc gel áp suất thấp 35
Hình 3.2. Loại muối trước khi chạy sắc ký 38
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 1
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc
tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme
đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm
tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về công nghệ
enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả
như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản
xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những
thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột
protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa….
Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số
bệnh, đặc biệ
t là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số

enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do
hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số
enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc
chẩn đoán bệnh. Enzyme đã trở thành các công cụ thực tế quan trọng không những
trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm…Đối với
nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong
phú ( dứa, đu đủ,… ). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần
của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa
có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm
enzyme bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau:
peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng
hợp, chúng có giá trị kinh tế cao.
Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của
Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học K
ỹ Thuật Công Nghệ
Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu
quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa”.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 2
1.2. Mục tiêu dề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa.
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Thu nhận dịch enzyme bromelain từ vỏ dứa.
Khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 96
0
, muối Ammonium sulfate
((NH

4
)
2
SO
4
) và aceton ( CH
3
COCH
3
).
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.
Tinh sạch enzyme bromelain.
Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di.


Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme
Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học. Chúng có khả năng xúc tác
đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc
tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản
ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợ
p.
Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động sống của
tế bào. Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm
phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi chất mà nhờ đó các chất
dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được lưu dữ và biến đổi, các đại phân
tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân đơ

n giản. Một số enzyme tham gia
trong quá trình trao đổi chất là những enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm đối với
các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng
một cách thích hợp. Thông qua hoạt động của enzyme điều hòa các hệ thống
enzyme phối hợp chặt chẽ với nhau để tạo ra mối quan hệ hài hòa giữa các hoạt tính
trao đổi chất cần thiết cho việc duy trì sự sống.
Enzyme có trong mọi c
ơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác
cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật mà còn xúc tác cho các
phản ứng ngoài tế bào. Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được
gọi là chất xúc tác sinh học ( biocatalisateur ) nhằm phân biệt với các chất xúc tác
hóa học khác.Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó
xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do c
ần nhiệt độ, áp suất cao, acid
mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục
và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ
nhàng (37
0
C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…).
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả
năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo
một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 4
Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận
enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào
động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn
toàn khác nhau.
Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:

− Nguồn động vật.
− Nguồn thực vật.
− Nguồn vi sinh vật.
2.2. Enzyme protease
Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân
liên kết peptit ( -CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối
cùng là axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết
este và vận chuyển axit amin.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và độ
ng vật ( gan, dạ
dày…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất có thể tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhât .
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hi
ệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.


Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 5
2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease
2.2.1.1. Protease động vật
Tuy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều

enzyme nhất.
Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
protease tên renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có đủ nồng độ Ca
2+
. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được
nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm
pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì khi đó dạ dày bê đã phát
triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có
đặc tính renin như ở
các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
Các loại nội tạng khác: Gan, lá lách, thận, phổi, cơ hoành tim, dạ con, huyết,
các loại bộ phận này đều chứa enzyme chúng tồn tại trong tế bào. Chỉ có một số loại
được sản xuất dưới dạng chế phẩm như: gan, tim lợn để tách aspartac-glutamate
aminotransferase, huyết tương ( từ huyết ) để tách ra trombia ( Proenzyme chống
đông máu ).
2.2.1.2 Protease thực vật
Có 3 loại protease thực vật như
Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được
từ nhựa của lá, thân quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa,
vỏ dứa ( Pineapple plant ). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng
tủa trắng của bia khi làm lạnh ( chilling proofing ) do kết tủa protein. Những ứng
dụng khác của protease thực vật này là công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu
hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica). Enzyme được sử dụng thủy
phân protein tự nhiên.

Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa

SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 6

Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật.
2.2.1.3. Protease vi sinh vật
Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…gồm nhiều
loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số
loại nấm men.
 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai lo
ại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai lọai trên. Do đó
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao, chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus,
B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Trong
đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường
tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid
ưa béo và thơm.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 7
Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticis, và
một số giống chi Clostridium.

Hình 2.3. Vi khuẩn Clostridium
Protease của Bacillius ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH
rộng 7-12.


Hình 2.4. Vi khuẩn Bacillius
 Nấm
Nhiều loại nấm có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A.terricola,
A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả 3 loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu là protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 8
Một số nấm mốc như: A.candidatus, P.cameberti, P.roqueforti…cũng có khả
năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat.


Hình 2.5. Nấm mốc
 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cúư ít hơn nấm mốc
và vi khuẩn. Tuy nhiên ngưòi ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng
hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, Strerimosus…


Hình 2.6. Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase ( Nhật ) được
tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân
tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 9
Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Protease
từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các peptide định
trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm cacboxyl hoặc
nhóm amine được l
ựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong
hệ hai pha lỏng.
2.2.2. Ứng dụng enzyme protease
Trong công nghiệp làm chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự
thủy phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có
vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. Có th
ể
ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định-phương pháp này phổ
biến và thuận lợi nhất: Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt ( enzyme, muối, bọt ngọt), tiêm
dung dịch enzyme vào thịt ( tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ ).
Trong chế biến thủy sản: Khi sản xuất nước mắm thường thời gian chế biến là
dài nhất, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thu
ộc rất nhiều địa phương, phương
pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày
đã được hoàn thiện nhờ sử dụng chế phẩm enzyme thực vật ( bromelain và papain )
và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm, cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy
nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về phần công nghệ.

Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng để
sản xuất phomat nhờ hoạt tính
làm đông tụ của chúng. Protease từ một số sinh vật như: A.candidus, P. roqueti, B.
mesentericus,…được dùng trong sản xuất phomat. Trong công nghiệp sản xuất bánh
mì, bánh quy…protease được dùng làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm
nhuyễn bột, tạo độ xốp và nỡ nhiều hơn.
Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thờ
i gian lọc. Protease của A.oryze được dùng
để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 10
Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da nhờ sự thủy
phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị
cứng . Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất
định. Trước đây để làm mềm da người ta thường dùng protease được phân lập từ cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn ( B.
mesentericus, B. subtilis ), nấm mốc ( A. oryzae, A. flavus ) và xạ khuẩn ( S.fradiae,
S. griseus, S. rimosus…) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần
dần chiếm một vị trí quan trọng.
Trong công nghiệp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ
tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân
lớp protein serisine đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các
loại tơ tằm, đó dó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều nghành khác như:
+ Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị
trong thực phẩm và sản xuất một số loại thức ăn kiêng
+ Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn
h

ợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm .
+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,
kháng sinh,…
+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein,
sản xuất mỹ phẩm.
+ Sử dụng nhiều enzyme protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao
động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 11
2.3. Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa
2.3.1. Giới thiệu enzyme bromelain
Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19
nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain
được bắt đầu từ những năm 1968-1970.
Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc
biệt là từ thân ( EC-3.4.22.32 ) và trái dứa ( EC-3.4.22.33 ). Ở mỗi bộ phận khác
nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain
là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein
để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide ( Dương Thị
Hương Giang, 2004).

Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải
protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của
bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả invitro ( Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
2.3.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain
Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi

hữu cơ. Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme
bromelain trích từ cây dứa và thấy như sau:
Bảng 2.1.Tính chất vật lý củ
a enzyme bromelain.( Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Tính chất vật lí Kí hiệu Giá trị
Hằng số sa lắng S 2.73 S
Hằng số khuếch tán D 7.77 x 10
-7
cm
2
/s
Thể tích riêng phần V 0.743 mL/g
Độ nhớt bên trong [l] 0.039 dl/g
Tỉ số ma sát f/f
0
1.26
Điểm đẳng điện Pi 9.55
Sự hấp thu A
1%
cm
ở 280 nm 20.1
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 12
Trọng lượng phân tử

Da
33 200
*
32 100

**

35 500
***



*
: Tính từ phương pháp sa lắng – khuếch tán.
**
: Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong.
***
: Tính bằng phương pháp Archibald.
2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain
2.3.3.1. Cấu tạo hoá học
Bromelain là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như
papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2
glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose ( Nguyễn Đức Lượng 2004).
Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –
NH
2
là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelin quả, acid amin đầu –
NH
2
là alanine ( Nguyễn Đức Lượng 2004).
2.3.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain
Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách
sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

- Gly – Cys – Lys -
Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- (disulfur).
Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Å.
Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu.
Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử
có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra,
trong phân tử bromelain thân còn có sự hiện diện của các ion Zn
2+
với hàm lượng
2 mg/g enzyme có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 13
2.3.4. Hoạt tính của enzyme bromelain
Một số nghiên cứu cho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ
chất khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain
mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai
enzyme này tương đương nhau. Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải
của Bromelain yếu hơn papain.
Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính
esterase ở bromelain hơn papain và ficin ( Nguyễn
Đức Lượng 2004).
2.3.4.1. Cơ chế tác động
Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm
imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain.
Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ
chất ( nơi các liên kết peptide bị cắt ).
Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion

của chất nhận khác.
Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Casein và
hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
Đầu tiên, bromelain kết h
ợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide
và acid amin. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi
nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide.
Ở giai đoạn đầu, Zn
2+
rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm
hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết
phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin,
carboxyl…)

Enzyme –SH +Zn
2+
=> enzyme-S-Zn + H
+

Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc
không gian được bảo vệ ổn định.

Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 14
2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain
Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số
nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch.


Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác
động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.

Bromelain ở dạng tinh khiết thì nhạy với nhiệt: ở 5
o
C, pH = 4-10, bromelain
có hoạt tính tối đa trên Casein trong 24h; ở 55
o
C, pH=6 trong 20 phút, hoạt tính
giảm 50%.

Quá trình sấy thăng hoa ( đông khô ) mất hoạt tính 27% ( Nguyễn Đức Lượng,
2004 ).
 Ảnh hưởng của pH

pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. pH
thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời
gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của
dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt.

Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8
tùy cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Chất kìm hãm là những ion, phân tử vô cơ, hữu cơ, làm giảm hoạt mất hoạt
tính của enzyme, có 2 loại chất kìm hãm:
- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme,
có cấu trúc tương tự như cấu trúc cơ chất, nên có khả năng c

ạnh tranh kìm hãm với
cơ chất ở trung tâm hoạt động của enzyme.
- Chất kìm hãm không cạnh tranh: làm thay đổi cấu trúc không gian của
phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác của enzyme.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 15

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa
Là những chất anion, các ion kim loại, chất hữu cơ, có tác dụng làm tăng hoạt
tính xúc tác của enzyme trong giới hạn nồng độ xác định.

Ảnh hưởng bởi các ion kim loại
Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động,
do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Vì bromelain thuộc nhóm
protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho
bromelain. Ví dụ: Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit…

Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –
SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate,
clo acetophenol, H
2
O
2
, methyl bromur.
Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân
tử bromelain ( Nguyễn Đức Lượng ).
 Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản.

Hoạt tính (UI/mg protein)
Điều kiện bảo quản
Dịch chiết Đông khô
Nguyên liệu tươi 1600 1150
Bảo quản ở 4
o
C trong 5 ngày 830 630
Sấy khô ở 4
o
C 1880 1360

2.3.5. Ứng dụng của enzyme bromelain
2.3.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt.
Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch
enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt.
Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm
từ sữa người ta dùng renin. Renin là loại enzyme được sử dụ
ng làm đông tụ sữa
truyền thống. Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 16
đây sử dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó
bromelain vỏ dứa đang được quan tâm vào mục đích này.

2.3.5.2. Trong y dược học
Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 –
300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược phẩm,
nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc. Ở Mỹ

và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế.
Chữa bệnh đau tim ( làm tan máu tụ gây đau tim ).
Điều trị các bệnh nhiễm trùng ( Jayaran và ctv, 1991 ).
Ngăn ngừa bệnh tiêu ch
ảy ở heo con ( Chandler và Mynott, 1998 ).
Chữa rối loạn tiêu hóa, giúp tiêu hóa chất đạm tốt, tăng khả năng đề kháng.
Phối hợp với kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiễm trùng.
Điều trị bong gân, căng cơ, đau và nhức cơ.
Bromelain trong dứa là hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV.
Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất
khác để bổ sung hay điều tr
ị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên ( Nielsel và ctv,
2001 ).
Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành
tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật Đó là thành quả nghiên cứu của các
nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ ( Viện Hóa học, Viện Khoa học
- công nghệ VN ) năm 2006.
Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ.
2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain
2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước
Ở
nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme
bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch
và khả năng ứng dụng của enzyme này. Một số công trình nghiên cứu về enzyme
bromelain như:
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 17
Lê Thị Thanh Mai ( 1997 ) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng
bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng

aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có
thể tinh sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao.
Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế
biến nước mắm.
Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng ( 2002 ) nghiên cứu điề
u kiện
nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm thô cho thấy có
thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi
ion trên cột SP-Streamline với hiệu suất cao.
Dương Thị Hương Giang và ctv ( 2005 ) nghiên cứu tinh sạch bromelain từ
phụ phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel
mở rộng với hệ thống cột Stream line 50 và gel trao đổi ion âm SP-Streamline XL
với hiệu suất cao.
2.3.6.2. Tình hình nghiên c
ứu enzyme bromelain ngoài nước
Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm
papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của
quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và
shark ). Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất
so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi ( sardine ) sau 180 ngày lên men và cao
hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%.
Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung
polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho th
ấy tính bền nhiệt của
bromelain được tăng lên.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 18
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và hóa chất

3.1.1. Nguyên liệu
Vỏ quả dứa
3.1.2. Hóa chất
Hóa chất để tủa: Cồn 96
o
, muối ammonium sulphate và aceton.
Dung dịch đệm phosphate : NaH
2
PO
4
.12H
2
O, NaH
2
PO
4
.
Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử Bradford.
Hóa chất xác định hoạt tính enzyme.
Hóa chất để cố định enzyme:
- Đệm phosphate 0.1 M pH 7
- CaCl
2
0.02 M
- Acid acetic 1%
3.1.3. Thiết bị
Máy quang phổ UV-Vis
Máy ly tâm.
Máy xay vỏ dứa.
Máy đo PH.

Bể ổn nhiệt.
Cân phân tích.
Ống nghiệm
Bình tam giác.
Giấy lọc.
Pipet thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.
Pipet man các loại.
Đầu típ các loại.
Cốc thủy tinh 100ml, 250ml.
Giá đựng ống nghiệm
Ống đong 50ml, 100ml, 500ml