phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh đắc lắc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

s







NGUYỄN VĂN BỐN







PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH

CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC













BUÔN MA THU
ỘT, NĂM

2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

NGUYỄN VĂN BỐN







PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT
SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH

CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK







Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC





Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào
khác.

Người cam ñoan

Nguyễn Văn Bốn
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:
Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng ñã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này.
Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, thầy TS. Ngô Đại Nghiệp ñã có nhiều ý kiến quý
báu ñóng góp, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Quý thầy cô giáo trường Đại học Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phòng Đào
tạo Sau ñại học, ban giám hiệu nhà trường ñã tận tình giảng dạy và tạo ñiều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian khoá học.
Các bạn sinh viên: Hạnh, Vui, Cương, Cường, Lữ lớp CN Sinh K07 và Được,
Thảo, Hoài, Danh, Lựu, Ana, Oánh, Luận lớp CN Sinh K08 ñã tham gia tích cực trong
quá trình tôi thực hiện ñề tài này.
Các thầy cô trong bộ môn Sinh học thực nghiệm ñã tạo mọi ñiều kiện về thời
gian, ñộng viên tinh thần cho tôi trong suốt khóa học.

Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 ñã ñoàn kết giúp ñỡ,
chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt 3 năm học cao học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia ñình: Bố, mẹ, Các
anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia ñình bố mẹ vợ ñã là chỗ dựa vững
chắc cho tôi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực ñể công tác,
và phấn ñấu.

Nguyễn Văn Bốn
CÁC CHỮ VIẾT TẮT


- HTch:
Hoạt tính chung chitinase

- HTr:
Hoạt tính riêng chitinase

- [chitin]:
Nồng ñộ chitin

- ĐC:
Đ
ối chứng


- GlcNAc:
N-acetyl glucosamine

-
DNS:

Acid 3,5 dinitrosalicylic

-
UI:
ñơn vị hoạt ñộ







MỤC LỤC
Mở ñầu

1. Đặt vấn ñề 1
2. Mục tiêu của ñề tài 1
3. Ý nghĩa khoa học 2
4. Ý nghĩa thực tiễn 2
Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 3
1.1.1. Chitin 3
1.1.1.1. Cấu tạo chitin 3
1.1.1.2. Phân bố và số lượng 3
1.1.1.3. Đặc ñiểm khác 4
1.1.1.4. Ứng dụng 5
1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14)

6

1.2.1. Khái niệm

6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử
7
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7
1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt
9
1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase
9
1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn
9
1.2.3.2. Chitinase nấm 10
1.2.3.3. Chitinase thực vật
10
1.2.3.4. Chitinase ñộng vật 11
1.2.4. Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase
11
1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11
1.2.4.2. Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis
11
1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 12
1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12
1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12
1.2.4.6. Sự ổn ñịnh 14
1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase
14
1.2.5.1. Chitin 14

1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin
14
1.2.6. Cơ chế tác ñộng của các loại enzyme chitinase 15
1.3. T
ổng quan về nấm mốc

15

1.3.1. Khái niệm 15
1.3.2. Hình dạng và kích thước 16
1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm 17
1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 17
1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc 18
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19
Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nội dung nghiên cứu 23
2.2. Vật liệu và thiết bị
23

2.3. Phương pháp nghiên cứu
23

2.3.1. Địa ñiểm thu thập mẫu
23

2.3.2. Các loại môi trường
23

2.3.3. Phương pháp phân lập

24
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24
2.3.5. Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử
với thuốc thử DNS
25
2.3.6. Phương pháp ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28
2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
28
2.3.8. Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp
29
2.3.9. Xác ñịnh tính chất cơ bản của chitinase
30
2.3.9. Xử lý số liệu
33
Chương 3. Kết quả và thảo luận

3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34
3.2. Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37
3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40
3.3. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc
tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao
42
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy 42
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy 45
3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46
3.3.5. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc 48
3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49

3.4. Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc
Penicillium janthinellum
50
3.5. Xác ñịnh một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc
Penicillium janthinell
52
3.5.1. Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính chitinase 52
3.5.2. Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 53
3.5.3. Xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54
3.5.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56
3.5.5. Xác ñịnh thời gian phản ứng tối ưu
57
3.5. Tinh sạch chitinase 58
Kết luận và kiến nghị
61

Tài liệu tham khảo
62
Phụ lục
67

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3 .1. Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 34
Bảng 3.2. Hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các
chủng nấm mốc 37
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
nồng ñộ chitin khác nhau 43
Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung
các nguồn nitơ khác nhau 44
Bảng 3.5. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các

nhiệt ñộ khác nhau 46
Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
pH khác nhau 47
Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các
tốc ñộ lắc khác nhau 48
Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong
các khoảng thời gian khác nhau 49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của
nấm mốc Penicillium janthinellum 51
Bảng 3.10.
Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 55
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57
Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel 59










DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin 3
Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase 25
Hình 2.2. Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS 25
Hình 3.1 . Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 39
Hình 3.2 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 43
Hình 3.3 . Ảnh hưởng của nguồn Nitơ ñến hoạt tính chitinase 44

Hình 3.4 . Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 46
Hình 3.5 . Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 47
Hình 3.6 . Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến hoạt tính chitinase 49
Hình 3.7 . Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 49
Hình 3.8 . Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính
chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum 52
Hình 3.9 . Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng ñến hoạt tính chitinase 53
Hình 3.10 . Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính chitinase 54
Hình 3.11 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 55
Hình 3.12 . Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56
Hình 3.13 . Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57
Hình 3.14 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex 59
Hình 3.15 . Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr
của chitinase 60
Hình 3.16 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin 60
Hình 3.17 . Hình 3.17. Vòng phân giải chitin 60






DANH MỤC ẢNH

Ảnh 3.1 Khuẩn lạc của 34 chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 37
Ảnh 3.2 Hình thái của 3 chủng nấm mốc D4, D9, D31 41

MỞ ĐẦU


1

2

1
1. Đặt vấn ñề
Oligo N – acetyl – Glucosamine (một sản phẩm của quá trình thủy phân chitin)
ñã ñược biết ñến như một loại thuốc quý, một loại thuốc ña hiệu ñược sử dụng ñể
chữa trị nhiều bệnh như: bệnh khớp, bệnh viêm phổi, bệnh viêm dạ dày, Ngoài ra,
Oligo N- acetyl – Glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và
kháng vi khuẩn [1]. Chính vì có ñặc tính quý như vậy mà việc sản xuất Oligo N –
acetyl – Glucosamine ñang ñược quan tâm.
Oligo N – acetyl – Glucosamine ñược thu nhận bằng cách thủy phân chitin dưới
sự xúc tác của enzyme chitinase. Trong tự nhiên, chitinase có thể ñược tách chiết
từ nhiều nguồn khác nhau: ñộng vật (tuyến tuỵ, và dịch dạ dày cá; dịch ruột của ốc
sên; ), thực vật (mủ cao su, thuốc lá, lúa mì, cà rốt, ), các loài chân khớp
(arthropods) [17] Tuy nhiên, quy trình thu nhận chitinase từ các nguồn này khá
phức tạp, không thể tiến hành tự ñộng hoá [25][26], do ñó giá thành chế phẩm cao
và cũng không thể ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tế .
Trong tự nhiên, còn có một nguồn quý giá và vô tận ñể thu nhận enzyme. Đó
chính là vi sinh vật. Trong số các ñối tượng vi sinh vật, nấm mốc là một nguồn khá
phổ biến ñể thu nhận nhiều loại enzyme, trong ñó có chitinase [25].

Trong nước cũng như trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về
chitinase [13]. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu nào về phân lập và
sàng lọc các chủng nấm mốc ñể thu nhận chitinase mang tính hệ thống ở khu vực
Tây Nguyên, cụ thể là ở Đắk Lắk ñược công bố trên các tạp chí trong và ngoài
nước. Để góp phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật
tại Tây Nguyên, chúng tôi ñề xuất ñề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng
nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk”.
2. Mục tiêu của ñề tài
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải chitin.
- Xây dựng quy trình tách chiết chitinase và xác ñịnh một số tính chất cơ bản
của chitinase tách chiết từ môi trường nuôi cấy nấm mốc.


2
3. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của ñề tài góp phần vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh
vật cụ thể là từ nấm mốc trên ñịa bàn tỉnh Đắk Lắk.
4. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của ñề tài là một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao ñược
tuyển chọn. Từ các chủng này, có thể ñưa vào sản xuất chitinase thương phẩm
dùng cho nhiều mục ñích khác nhau hoặc sử dụng trực tiếp các chủng này ñể khảo
sát khả năng ñối kháng với một số nấm bệnh hướng tới tạo chế phẩm sinh học có
hoạt tính kháng bệnh cho cây trồng.

3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU







2


3
Hình 1.1
.

C
ấu trúc của chitin

1.1. Tổng quan về chitin và chitinase
1.1.1. Chitin [17][23]
1.1.1.1. Cấu tạo chitin
Chitin có công thức hóa học (C
8
H
13
NO

5
)
n
trong ñó C chiếm 47,29%, H
chiếm 6,45%, N chiếm 6,89% và O chiếm 39,37%. Ở dạng tự nhiên, chitin là một
chất rắn màu trắng vô ñịnh hình, dai, có sợi, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương
pháp thu nhận.
Về cấu trúc, chitin (còn gọi là poly-[1,4-(N-acetyl-
β
-D-glucosamine)])
là một polysaccharide bao gồm các gốc
N
-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc],
còn gọi là (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-
β
-D-glucose] gắn với nhau bằng liên
kết
β
-1,4-O-glycoside.








Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α,
β, δ.
Sự khác nhau này biểu

hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Ở α-chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở
β
-
chitin thì cùng hướng và ở
δ
-chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng
chiếm nhiều nhất là α-chitin.
1.1.1.2. Phân bố và số lượng
Chitin có mặt ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau. Ở nấm, chitin là thành phần
chính yếu và kết hợp với các hợp chất khác tạo ra thành của khuẩn ty và bào tử
nấm sợi như: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. Ở
những loài ñộng vật không xương sống như: Crustacea (giáp xác), Onychophora
(nhóm có móng), Myriapoda (ña túc) và Arachnida (nhện), chitin ñóng vai trò là

4
bộ xương ngoài dưới dạng phức hợp chitin-protein. Tỉ lệ chitin : protein thông
thường khoảng 55 : 45 và tỉ lệ này thay ñổi trong suốt quá trình phát triển và khác
nhau giữa các loài. Ở Insecta (côn trùng), chitin là vỏ bọc cơ thể và màng bao chất
dinh dưỡng. Ngoài ra, chitin còn có ở tảo lục và nhuyễn thể (Mollusca), trùng ñốt
(Annelida), ruột khoang (Coelenterata-Cnidaria). Ở các loài thực vật, chitin và
ñường amin ñóng vai trò không quan trọng trong quá trình trao ñổi chất hay về cấu
trúc hình thái.
Về số lượng, chitin là một trong ba loại polysaccharide phong phú nhất
trong thiên nhiên (cellulose, tinh bột và chitin). Chitin ñứng ở vị trí thứ hai sau
cellulose. Chitin và cellulose tương ứng với nhau về nhiều ñiểm về cấu tạo và chức
năng. Về chức năng, chúng ñều là những polysaccharide cấu trúc. Về cấu trúc
phân tử, chitin có cấu trúc tương tự cellulose ngoại trừ nhóm -OH ở C
2
ñược thay
thế bằng một nhóm acetylamine. Chitin có thể thay thế một phần hay toàn bộ

cellulose hoặc glucan trong thành tế bào nấm và vài loại tảo.
1.1.1.3. Đặc ñiểm khác
Chitin không tan trong nước, dung dịch kiềm loãng và thuốc thử Schweitzer.
Chitin có thể tan trong một số dung dịch như HCl ñậm ñặc, HNO
3
, acid fomic khan
và một số muối trung tính. Nếu ñun nóng chitin trong dung dịch kiềm mạnh, một
phần nhóm N-acetyl bị khử (deacetyl hóa) tạo thành chitosan. Ngược lại, trong
dung dịch HCl ñậm ñặc, quá trình thủy phân chitin xảy ra ở các nối β-1,4-
glycoside làm [α]
D
từ -14
o
dần ñổi sang +56
o
, sau ñó là sự thay ñổi ở các nhóm
acetyl. Độ nhớt của chitin trong dung dịch acid nitric là 14,3.10
-3
ñối với chitin
nguyên chất từ vỏ cua, 13,1.10
-3
ñối với chitin từ nấm. Các giá trị này xấp xỉ như
nhau chứng tỏ khối lượng của chúng gần như nhau.
Trong việc ñịnh tính cũng như so sánh chitin từ những nguồn thực vật, ñộng
vật khác nhau, phương pháp nhiễu xạ tia X có lẽ là phương pháp vật lý duy nhất có
ý nghĩa và có giá trị. Trong khi ñó, các phương pháp ñịnh lượng chitin ñều có ñộ
chính xác giới hạn, những ñiều kiện cần thiết cho việc tinh chế chitin có khả năng
làm thay ñổi polysaccharide này, vì vậy khó ñạt ñược chitin tinh khiết. Ngoài ra,

5

người ta có thể tạo thành chitin từ Uridin-diphosphate-N-acetyl-D-Glucosamine
nhờ enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) ly trích từ nấm.
1.1.1.4. Ứng dụng
Với kỹ thuật chế biến hiện ñại, chitin và các dẫn xuất của chúng có một tiềm
năng to lớn ñặc biệt là trong các lĩnh vực như y sinh học, dinh dưỡng, chế biến
thực phẩm, dược phẩm, vi sinh, nông nghiệp và mỹ phẩm.
Chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo ñộ bền dai cho
thực phẩm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…). Chitin làm chất
mang trong cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào, làm chất mang tạo các giá thể
trồng cây cảnh. Còn chitosan, dẫn xuất của chitin, có ñộ bền dai, ñàn hồi, có thể tạo
thành các màng mỏng gần như trong suốt, sử dụng các màng chitosan ñể bảo quản
các loại trái cây, làm màng bao thuốc, màng bao thực phẩm (thịt nguội, lạp
xưởng…) còn làm nguyên liệu ñể cố ñịnh enzyme hay cố ñịnh tế bào vi sinh vật.
Chitosan ñược ñánh giá cao trong hàng loạt những ứng dụng trong y học như: băng
bó và làm lành vết thương, màng thẩm tích, chỉ khâu vết thương tự tiêu huỷ, nhân
tố ổn ñịnh liposome, diệt vi khuẩn, diệt virus, chống ung thư, chất làm giảm lượng
cholesterol trong máu, chất kích thích của hệ thống miễn dịch.
Sự phân hủy tự nhiên của chitin rất quan trọng không chỉ trong chu trình
tuần hoàn của carbon và nitơ mà còn tạo ra các chất phản ứng hóa học quan trọng.
Các ñơn phân của chitin và chitosan là N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) và
glucosamine, là những tác nhân chữa bệnh viêm khớp xương mãn tính, viêm ruột
và viêm dạ dày. Các oligomer có nguồn gốc từ chitin cũng có hoạt tính kháng khối
u, kháng nấm, kháng khuẩn, là thành phần tạo nên glycolipid và glycoprotein có
vai trò quan trọng trong sinh học và nhiều ứng dụng khác.
Hàng ngàn bài báo về chitin và các dẫn xuất của chúng ñã ñược xuất bản
cùng với khoảng gần 200 bằng sáng chế ñã ñược lưu hành tại Mỹ. Các công trình
nghiên cứu và bằng sáng chế về các chế phẩm này cũng ñã xuất hiện ở nhiều nước
trên thế giới. Các nhà khoa học từ hàng chục nước trên thế giới trong ñó có Mỹ và
Nga ñã tập trung lại 3 năm một lần ñể trao ñổi các bài báo, nghiên cứu khoa học
mới nhất về chitin và các dẫn xuất của chúng. Những ñiều ñó cho thấy chitin và

6
các dẫn xuất của chúng rất ñược quan tâm trên thế giới vì khả năng ứng dụng rất
rộng cùng với những ñặc tính ñặc biệt của chúng.
Hàng năm chitin ñược sản xuất ra khoảng 5.11 triệu tấn trên toàn thế giới.
Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chitin lớn nhất. Ở Việt Nam, chitin chủ yếu là
phế phụ liệu dạng rắn với số lượng khổng lồ ñược thải ra hằng ngày từ ngành công
nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy hải sản. Vỏ của tôm (tôm hùm, tôm thẻ), cua và
các loài giáp xác trên biển là nguồn cung cấp chitin tốt nhất. Trong vỏ tôm cua,
chitin chiếm từ 20-50% khối lượng khô, khoảng 12% trong tôm nước ngọt, còn lại
là các chất vô cơ, chủ yếu là carbonate calci. Nếu tận dụng ñược nguồn cung cấp
chitin này thì vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường, vừa tạo thành các sản phẩm thực
sự có giá trị [4].
1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) [17][23][25][26]
1.2.1. Khái niệm
Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành các N-acetylglucosamine,
chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy phân liên kết β-1,4-glycoside
giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên kết với nhau trong chitin.
Enzyme này có ở nhiều loài khác nhau như thực vật, ñộng vật không xương
sống, côn trùng, chân khớp, nấm, vi khuẩn và virus. Chân khớp và nấm cần
chitinase trong sự phân chia tế bào ñể tăng trưởng. Chitinase ñược tạo thành trong
suốt quá trình sinh trưởng của nấm. Đối với nấm mốc, chitinase tham gia nhiều
chức năng như phân giải thành tế bào, nảy mầm bào tử, phát triển khuẩn ty và tự
phân khuẩn ty, biệt hóa bào tử, ñồng hóa chitin và ký sinh.
Ở vi khuẩn, chitinase ñược tạo ra ñể sử dụng chitin làm nguồn carbon và
năng lượng. Ở thực vật, chitinase là một thành phần của phản ứng chống lại sự
xâm nhiễm và stress, phối hợp hoạt ñộng với các protein phòng vệ khác.
Chitinase thương phẩm có giá rất ñắt, ñặc biệt là chitinase tinh sạch. Vì vậy
việc sử dụng chitinase thô trở nên phổ biến, thú vị hơn trong việc sản xuất GluNAc
và các oligomer có nguồn gốc từ chitin.

7
1.2.2. Phân loại chitinase
1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase ñược sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzyme thủy phân ñường):
- Họ glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu
trúc xác ñịnh gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, ñược tìm thấy ở nhiều loại sinh vật như vi
khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là
enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase
và N-acetylglucosamineidase. Trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2
motif trình tự ngắn ñược bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid glutamic ñược bảo tồn)
giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các gốc giống nhau). Tuy
nhiên, cả 2 loại chitinase ñều có cùng domain xúc tác barrel (βα)
8
. Trong cả 2
enzyme, rãnh gắn cơ chất ñều nằm ở ñầu C của sợi trong cấu trúc barrel (βα)
8
và
gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vị trí tương ñương. Không giống với các
glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất thường bao gồm
việc tác ñộng lên nhóm N-acetyl của cơ chất trên nguyên tử C anomer. Việc này
dẫn ñến việc tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose của glucosamine kết
hợp với vòng 5 oxazoline.
- Họ glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở
thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), ñậu Hà Lan
(Pisum sativum), ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn
Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme
(EC 3.2.1.17) của ñộng vật và phage, bao gồm motif cuộn α+β và hoạt ñộng thông
qua cơ chế nghịch chuyển.
Thực vật và vi sinh vật như Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong khi

côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18.
1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid
Dựa vào trình tự ñầu amin (N), sự ñịnh vị của enzyme, ñiểm ñẳng ñiện, peptid
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
- Nhóm I: là những ñồng phân enzyme trong phân tử có vùng ñầu N giàu
cysteine chứa khoảng 40 amino acid (giống với vùng ñầu N ở hevein và các

8
enzyme khác có ái lực ñối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc tác
thông qua một ñoạn giàu glycin hoặc prolin ở ñầu carboxyl (C)(peptid nhận biết).
Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng ñối với sự gắn kết enzyme và cơ chất
chitin nhưng không cần cho hoạt ñộng xúc tác. Các vùng gắn chitin này không phải
luôn ñóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính xúc tác enzyme mà
chúng cần ñể tạo các ñặc tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác
nhau. Ở nấm men, vùng gắn chitin nằm ở ñầu C giúp ñịnh vị chitinase trên thành tế
bào nấm men, ñóng vai trò trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị em.
Ở thuốc lá và nhiều loài thực vật khác, các chitinase này nằm trong không bào và
ñược cảm ứng từ sự nhiễm nấm, vi khuẩn hay virus. Chitinase nhóm I của thuốc lá
có vùng ñầu C giàu cystein ñóng vai trò là vùng gắn chitin.
- Nhóm II: là những ñồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác có
trình tự amino acid tương tự ở chitinase nhóm I, thiếu ñoạn giàu cysteine ở ñầu N
và peptid nhận biết ở ñầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn.
Chúng ñược cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein nhóm II
thuộc loại protein kháng bệnh và ñược tế bào tiết ra dưới nhiều ñiều kiện stress
khác nhau.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II,
nhưng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng mang
hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein kháng bệnh
và ñược tiết ra ngoại bào.
- Nhóm IV: là những ñồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-

47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I và
khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có ñoạn giàu cysteine nhưng
kích thước phân tử nhỏ hơn ñáng kể so với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cysteine) có thể ñã giảm ñi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao.