nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (larich desidue) và bèo tấm (lemna sp wolffia sp)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CĨ HOẠT TÍNH
SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP
BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO
CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna
sp wolffia sp)
Chủ nhiệm đề tài: LÊ HUY HÀM

7379
26/5/2009

HÀ NỘI – 2008


MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI..........................................................................1
BÀI TÓM TẮT .......................................................................................................................................2
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................................................4
LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................................................5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC....................7
1.1. Tổng quan về bèo tấm.........................................................................................................7
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm............................................................................................................7
1.1.2. Phân bố của bèo tấm ..............................................................................................................7
1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm ..............................................................................8
1.1.4. Đặc điểm sinh học ..................................................................................................................8
1.2. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm...........................................................12

1.3. Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp..............................................13
1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật .....................................................................................13
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .............................................................................15
1.3.3. Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens............................................................19
1.3.4. Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm ..........................................................................................23
1.4. Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna........................................................25
1.4.1. Bệnh Gumboro ở gia cầm.....................................................................................................25
1.4.2. Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới...................................26
1.4.3. Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới .............................27
1.5. Nghiên cứu sản xuất vaccin qua đường miệng .................................................................29
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................................30
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................32
2.1. Mục tiêu của đề tài............................................................................................................32
2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện ..................................................................................32
2.3. Vật liệu..............................................................................................................................33
2.3.1. Vật liệu thực vật ...................................................................................................................33
2.3.2. Vật liệu vi khuẩn...................................................................................................................33
2.3.3. Hoá chất ...............................................................................................................................35
2. 4. Phương pháp ....................................................................................................................35
2.4.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật...............................................................35
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào........................................................................................44
2.4.3. Phương pháp biến nạp gen.................................................................................................45
2.4.4. Phương pháp đánh giá cây chuyển gen..............................................................................49
2.4.5. Thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà......................................................57
CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN................................................58
1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT ....................................................................58
1.1. Kết quả khuyếch đại gen mã hoá protein của virus VP2 bằng phương pháp PCR.................58
1.2. Kết quả tạo dịng gen mã hố protein VP2 của virus Gumboro .............................................58
1.2.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCRđ 2.1.........................................................58
1.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng InVαF’ ............................59

1.2.3. Kết quả tách chiết ADN plasmid ......................................................................................60
1.2.4. Kiểm tra vectơ tái tổ hợp bằng cách cắt với enzyme giới hạn EcoRI...............................60
1.3. Kết quả giải trình tự gen mã hố protein VP2 của virus Gumboro..........................61
1.4. Thiết kế vectơ biểu hiện VP2 .................................................................................................63
2. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ NHÂN SINH KHỐI Ở......... ......................................66
BÈO TẤM WOLFFIA, LEMMA ......................................................................................................... 66

2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm Wolffia australiana................. 66
2.1.1. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W. australiana trong các điều
kiện nuôi khác nhau .................................................................................................................67
2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W. australiana..........................68


2.1.3. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong ống nghiệm W. australiana trong điều kiện nuôi
tủ ổn nhiệt ................................................................................................................................69
2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm Lemna.........................................................................70
2.2.1. Tạo vật liệu vô trùng ...................................................................................................70
2.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường nhân cây bèo phù hợp ...........................................70
2.2.3. Tạo và nhân callus .....................................................................................................75
2.2.4. Nhân sinh khối callus dạng I......................................................................................81
2.2.5. Tái sinh cây từ callus .................................................................................................82
3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN ĐẠT HIỆU QUẢ CAO VÀO BÈO TẤM
WOFFIA SP, LEMMA SP. ..............................................................................................................86
3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Woffia sp ..............................86
3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W. australiana...................86
3.1.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không ...................................87
3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy......................................88
3.1.4. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy..................................................................89
3.1.5. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của kháng sinh Geneticin và Paromycine đến khả năng
gây chết bèo tấm Woffia australiana .......................................................................................90

3.2. Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Lemna....................................92
3.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumerfaciens....................................................................................................92
3.2.2. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng súng bắn gen ............99
4. CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA.............................104
4.1. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana .......................................................104
4.2. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna...........................................................................106
4.2.1. Chuyển gen nguyên cây bèo LA ................................................................................106
4.2.2. Tạo callus và vật liệu chuyển gen ..............................................................................107
4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I và dạng II...........................................................108
5. PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN .............................................................109
THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM.............................................109
5.1. Phân tích đánh giá cây chuyển gen ....................................................................................109
5.1.1. Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng bèo tấm chuyển gen.............................110
5.1.2. Tách chiết và kiểm tra ADN tổng số của bèo tấm.....................................................111
5.1.3. Phân tích PCR các dịng bèo tấm chuyển gen VP2...................................................111
5.1.4. Phân tích lai Southern...............................................................................................113
5.1.5. Xác định protein trong bèo tấm chuyển gen .............................................................113
5.2. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm .................................................................116
5.2.1. Thu mẫu huyết thanh gà............................................................................................116
5.2.2. Phát hiện kháng thể kháng protein VP2 bằng ELISA ...............................................117
CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC..................................121
4.1. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra......................................................................................121
4.2. Kết quả về khoa học.....................................................................................................121
4.3. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng.............................................................................122
4.4. Trình độ cơng nghệ........................................................................................................122
4.5. Khả năng áp dụng.........................................................................................................123
4.6. Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng...................................................................123
4.7. Đào tạo.........................................................................................................................123
4.8. Sản phẩm khoa học của đề tài......................................................................................124

4.9. Hợp tác quốc tế............................................................................................................124
4.10. Tình hình sử dụng kinh phí..........................................................................................124
4.11. Danh sách các cơng trình công bố...............................................................................125
4.12. Hạn chế của đề tài........................................................................................................125
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................126
5.1. Kết luận.........................................................................................................................126
5.2. Đề nghị...... ...................................................................................................................126
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................................128


Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tµi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vịng sinh sản vơ tính của L. aequinoctialis (Landolt, 1986)

Trang
9

Hình 1.2. Hoa của L.A

10

Hình 1.3. Bèo tấm W. australiana ni trên đĩa thạch

12

Hình 1.4. Cấu trúc pPAMksGFP
Hình 1.5. Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine
Hình 1.6. Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể

Hình 1.8. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp
Hình 2.1. Bèo tấm W. australiana No. 7540
Hình 2.2. Bèo tấm Lemna aequinoctialis
Hình 2.3: Cấu trúc của vector nhị phân pBIN GUS-int
Hình 2.4: Vector nhị phân pCAMBIA1301
Hình 2.5: Cấu trúc Vector pPAM-VP2
Hình 3.1. Kết quả sản phẩm PCR
Hình 3.2. Kết quả biến nạp gen mã hố protein VP2 vào InVα F’
Hình 3.3. Kết quả tách chiết ADN plasmid
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra các dịng ADN plasmid sau khi xử lí bằng EcoRI
Hình 3. 5. Trình tự nucleotit của đoạn ADN tách dịng mang gen VP2
Hình 3.6. Phân cắt gen VP2 và vectơ pPAMksGFP với enzym cắt giới hạn.
Hình 3.7. Thiết kế plasmid pPAM- VP2
Hình 3.8. Xác định sự có mặt của gen VP2 trong chủng Agrocaterium GV3101pMp90
Hình 3.9. Một số hình ảnh bèo tấm LA tái sinh sau khử trùng
Hình 3.10. Bèo nhân trên mơi trường H/5 + 1,5% sucrose, pH=6,0
Hình 3.11. Callus tạo được trên nền N6/2 với kết hợp 2,4D +BAP
Hình 3.12. Mơ callus dạng II
Hình 3.13. Tạo callus dạng I từ callus dạng II
Hình 3.14. Nhân callus dạng I trên mơi trường có 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP
Hình 3.15. Tái sinh cây từ callus dạng II
Hình 3.16. Bèo tái sinh từ callus dạng I trên môi trường khơng có chất ĐHST
Hình 3.17. Tái sinh bèo từ callus dạng I
Hình 3.18. Kết quả thí nghiệm thử chủng VK ở W. australiana
Hình 3.19. Xác định thời gian ly tâm chân khơng thích hợp
Hình 3.20: Ảnh hưởng của mật độ VK và thời gian đồng ni cấy
Hình 3.21: Kết quả thi nghiệm thời gian đồng nuôi cấy và mật độ VK lần 2
Hình 3.22: Đánh giá ảnh hưởng của mơi trường đồng ni cấy
Hình 3.23: Ảnh hưởng của geneticin đến khả năng sống của W. australiana
Hình 3.24: Ảnh hưởng của Paramomycin đến khả năng sống của W. australiana

Hình 3.25. Biểu hiện tạm tới của gen GUS trên bèo tấm với các chủng khác nhau
Hình 3.26. Ảnh hưởng của kanamycin tới bèo LA
Hình 3.27. ảnh hưởng của hygromycin tới bèo LA
Hình 3.28. ảnh hưởng của hygromycin tới bèo LA
Hình 3.29. Sàng lọc cây bèo tấm chuyển gen trên môi trường chọn lọc
Hình 3.30: Cánh bèo trên mơi trường diệt khuẩn
Hình 3.31: Kết quả chọn lọc nguyên cánh LA trên môi trường bổ sung hygromycin, geneticin
Hình 3.32. Callus dạng I (A); callus dạng II (B)
Hình 3.33: Mẫu callus dạng I LA trên mơi trường diệt khuẩn
Hình 3.34 : Callus dạng II đang tái sinh
Hình 3.35: Cánh bèo chuyển gen callus dạng II ở loạt thí nghiệm số 12
Hình 3.36: Cánh bèo chuyển gen callus dạng II ở loạt thí nghiệm số 25
Hình 3.37: Biểu hiện gen gus ở cánh bèo tấm W. australiana (1); W. globosa (2) và bèo LA (3)
chuyển gen sau chọn lọc
Hinh 3.38. Kết quả phân tích PCR gen gus các dịng bèo tấm chuyển gen
Hình 3.39. Kết quả phân tích PCR các dịng Lemna aequinoctialis chuyển gen
Hình 3.40 Kết quả phân tích PCR các dịng Wolffia australiana chuyển gen
Hình 3.41. Kết quả lai DNA của các dịng bèo tấm chuyển gen VP2
Hình 3.42. Kết quả phân tích ELISA 6 dịng bèo tấm chuyển gen VP2
Hình 3.43: Mơ tả thí nghiệm thử khả năng gây đáp ứng miễn dịch của bèo tấm chuyển gen trên gà

15
19
21
22
22
33
33
34
34

34
58
59
60
61
63
64
65
65
70
74
75
76
81
82
82
83
85
87
87
88
89
90
91
92
93
97
98
99
106

107
107
108
108
109
109
109
110
111
112
112
113
116
120


Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tµi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau đến khả năng sinh trưởng của W. australiana
Bảng 3.2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W. australiana trong các điều kiện nuôi
khác nhau
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W. australiana
Bảng 3.4: Tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro
Bảng 3.5. Hiệu quả khử trùng của các loại hoá chất khác nhau
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng Hutner tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các nền khống và chất điều hồ sinh trưởng khác nhau đến sự tạo callus
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng khống trong mơi trường N6 đến hiệu quả tạo callus
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của 2,4D và BAP đến hiệu quả tạo callus (%)
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng đường (g/l) đến tỷ lệ tạo callus
Bảng 3.13. ảnh hưởng của hàm lượng CH đến sự hình thành callus
Bảng 3.14. Kết quả tạo callus trên các mơi trường có pH khác nhau
Bảng 3.15. Kết quả tạo callus dạng I từ dạng II
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến chất lượng callus
Bảng 3.17. Kết quả tái sinh callus dạng II
Bảng 3.18. Hiệu quả tái sinh ở các cơng thức có hàm lượng BAP khác nhau
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của IAA và kinetin tới khả năng tái sinh cánh bèo
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của CH tới khả năng tái sinh cây bèo từ callus
Bảng 3.21: Kết quả khảo sát chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W. australiana
Bảng 3.22: Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của mơi trường đồng ni cấy
Bảng 3.26: Kết quả thí nghiệm với geneticin
Bảng 3.27: Kết quả thí nghiệm với paromomycin
Bảng 3.28. Biểu hiện tạm thời của gen GUS trên mẫu bèo với các chủng vi khuẩn khác nhau
Bảng 3.29. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của các biện pháp tăng cường tiếp xúc (%)
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của thời gian hút chân không tới biểu hiện tạm thời
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới biểu hiện tạm thời
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen GUS trên mẫu bèo
Bảng 3.33. Ảnh hưởng của kanamycin tới hệ số nhân và sức sống bèo tấm LA
Bảng 3.34. Ảnh hưởng của hygromycin tới hệ số nhân và sức sống bèo tấm LA
Bảng 3.35. Ảnh hưởng của geneticin tới hệ số nhân và sức sống bèo tấm LA
Bảng 3.36. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây.
Bảng 3.37. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo tấm.
Bảng 3.38. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở

bèo nguyên cây
Bảng 3.39. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở
callus.
Bảng 3.40. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở bèo nguyên cây
Bảng 3.41. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở callus
Bảng 3.42. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây
Bảng 3.43. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus
Bảng 3.44. Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo tấm Wolffia australiana
Bảng 3.45. Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo tấm L.aequinoctialis
Bảng 3.46: Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen chỉ thị vào bèo tấm LA và W. australiana
Bảng 3.47. Xác định protein tổng số trong dịch chiết bèo tấm chuyển gen
Bảng 3.48. Kết quả phân tích ELISA 6 dịng bèo tấm chuyển gen VP2
Bảng 3.49. Danh sách các mẫu huyết thanh gà thu được
Bảng 3.50: Kết quả xét nghiệm ELISA trên các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp ứng miễn dịch
Bảng 3.51: Kết quả xét nghiệm ELISA dương tính của các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp ứng
miễn dịch
Bảng 3.52: Đánh giá mức độ tạo kháng thể kháng protein VP2 trong các mẫu huyết thanh của gà ăn bèo
tấm chuyển gen
.

Trang
8
51
66
67
68
69
70
71
72

73
75
76
77
78
79
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
89
91
91
93
94
94
95
96
96
97
99
100
100

101
101
102
102
103
103
105
106
110
114
115
116
117
118
119


DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI
TT

Họ và tên

Cơ quan cơng tác

A

Chủ nhiệm đề tài

Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

PGS.TS. Lê Huy Hàm

tế bào thực vật, Viện Di truyền Nơng
nghiệp

B

Cán bộ tham gia nghiên cứu
Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

1

ThS. Trần Duy Dương

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông
nghiệp

2

Th.S. Vũ Văn Tiến

nt

3

TS. Phạm Thị Lý Thu

nt

4

TS. Nguyễn Thị Khánh Vân

nt

5

PGS. TS. Lê Thanh Hoà

6

PGS. TS. Đinh Duy Kháng

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa
học và Cơng nghệ Việt Nam
Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ

7

PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh

tế bào thực vật, Viện Di truyền nơng
nghiệp
Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ

8

CN. Trịnh Thị Minh Thuỳ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông
nghiệp

1


BÀI TÓM TẮT
Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng
tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải
ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh. Việc phòng bệnh bằng
vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng và là mục tiêu hàng đầu của ngành y tế và
thú y của các nước. Đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine
cao, ngành chăn nuôi tại các nước đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các
nước phát triển. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành
hạ là một trong những tìm kiếm sơi động trên thế giới những năm gần đây.
Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của
vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, khơng những
góp phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng
dụng CNSH thực vật trong nông nghiệp và y học. Trong các loài thực vật được nghiên
cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang
được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vơ tính rất nhanh, có hàm
lượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiện đặc biệt như:
bảo quản lạnh, chế độ vô trùng... Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất
vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng.
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nơng nghiệp
bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/
Wolffia sp.)“, được thực hiện trên cơ sở hợp tác khoa học với Viện Sinh lý phân tử và
Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần
giải quyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc

sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn ni thú y và bảo vệ sức khoẻ
con người.
Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề sau: i)
Chuyển thành cơng gen mã hố virus gumboro VP2 vào bèo tấm; ii) Đánh giá được
khả năng tạo miễn dịch khi cho gia cầm ăn bèo tấm có protein trên.
Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kết quả
chính như sau:
• Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro biểu hiện ở thực vật
Thu thập đánh giá các nguồn gen protein vỏ virus gumboro ở Việt Nam. Thiết kế
vector pPAM-VP2 mang gen VP2 biểu hiện ở thực vật.

2


• Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemna sp.; Wolffia sp.)
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng để xây dựng và hoàn thiện phương
pháp tạo callus và tái sinh cây ở các loài bèo tấm Wolffia sp. và Lemna sp. Một số
đặc điểm sinh học cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tạo
callus và tái sinh cây đã được tối ưu.
• Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm (Lemna/Wolffia)
Quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây Lemna sp. và Wolfia sp. bằng súng
bắn gen và thông qua Agrobacterium đã được xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối
ưu hố các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình biến nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ
AS, thời gian đồng ni cấy...
• Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna
Các thí nghiệm chuyển gen VP2 đã được thực hiện trên loài bèo tấm Wolffia
australina và Lemna aequinoctialis. Các dịng bèo tấm chuyển gen đã được duy trì
và nhân sinh khối trên mơi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc.
• Phân tích cây chuyển gen. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm
Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen đã được phân tích

bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern). Đã nhận được 06 dòng
bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2. Protein VP2 đã được tách chiết từ
các dòng bèo tấm chuyển gen. Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dịng bèo tấm
chuyển gen có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà.
Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử và công nghệ sinh học thực vật (Đại
học tổng hợp Bonn) đã thực hiện các nghiên cứu trên đối tượng cây thông (Larich
desidue) và đã thu được kết quả sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định các điều
kiện tạo huyền phù và nhân nhanh tế bào thơng; ii) Tối ưu hố quy trình chuyển gen
vào Larich desidue thông qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro
VP2 vào mô sẹo và đánh giá giá biểu hiện của protein VP2 ở các dịng thơng chuyển
gen.
Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu được
những kết quả rất khả quan. Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và
thực tiễn cao. Thành cơng của đề tài là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng
Gumboro giá rẻ dùng trong chăn nuôi gia cầm và xa hơn là sản xuất các hoạt chất sinh
học khác cho nông nghiệp và y học bằng kỹ thuật di truyền thực vật.

3


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid
2iP: 6-(ó,ó-Dimethylallylamino) Purin
AS: acetosyringone
BAP: 6-Benzyl Amino Purin
bp: base pair
CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter
CH: Casein Hydrolysate
cs: cộng sự
CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide

DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid
ĐC: Đối chứng
EC: Embryogenic Callus: mơ sẹo phơi hố
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid
Et-Br: Ethidium Bromide
GMC: Cây trồng chuyển gen
GMO: Sinh vật chuyển gen
gus: β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase
IAA: Indol-3-Acetic Acid
IBA: Indol -3-Butyric Acid
Kbp: Kilobase
Km: Kanamycine
KTST: Kích thích sinh trưởng
LA: Lemna aequinoctialis
LB: Luria and Bertani
MCS: Multi-Cloning Site
MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962)
NAA: ỏ-Naphthalenacetic Acid
NOS: Nopaline Synthetase
NOS-P: Nopaline Synthetase Promotor
nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hố neomyciphosphotransferase
OD600: Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của
hãng Beckman Coulter
PCR: Polymerase Chain Reaction
T-DNA: transferred-DNA = DNA chuyển
TDZ: Thidiazuron
Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật
X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid

4

LỜI MỞ ĐẦU

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong
lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống
cây trồng chuyển gen có các đặc tính hồn tồn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh,
kháng thuốc diệt cỏ... Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen tồn cầu đã đạt 125
triệu ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hồn tồn mới như: chịu hạn,
mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng
cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học... đã
được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (Jame, 2008).
Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây
chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa
bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng
thể, interferon, vaccine... (Mason et al, 1998).
Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau
của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men...
Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược
điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm
men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất
protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và khơng mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh
có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật
có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất ra
thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật"
(Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết
hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể
được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa
vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch
toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). Ý tưởng sử dụng thực vật làm

hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của
nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết
quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).
Bệnh Gumboro là bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng (Infectiuous Bursal
Disease -IBD) cấp tính do virus gây ra ở gà, chủ yếu là ở gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết
và khả năng lây lan cao ở gà con. Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch
do virus gây ra và sự liên - tạp nhiễm các bệnh khác. Cũng do bị suy giảm miễn dịch,
mọi chương trình vaccine phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị

5


ảnh hưởng, gây thiệt hại kinh tế lớn đối với gà ni cơng nghiệp (Lê Thanh Hồ, 1992;
Nguyễn Tiến Dũng, 1996; Lê Thanh Hoà, 2003).
Cấu trúc kháng nguyên của IBDV tập trung ở phần vỏ capsit. Chúng có cấu trúc
protein là VP1, VP2, VP3 và VP4. Sự khác nhau về tính kháng nguyên của các typ
virus là do cấu trúc protein của vỏ capsit quyết định. Kibenge F.S và cộng sự (1988) đã
thông báo rằng VP2 và VP3 là hai thành phần chủ yếu của virus Gumboro, chiếm 57%
và 34%. Trong khi VP1 và VP4 chỉ là protein phụ. VP1 chỉ chiếm 3% còn VP4 chỉ
chiếm 6%. VP2 là protein vỏ của virus IBD, được mã hoá bởi đoạn gen có độ dài
khoảng 1.300 nucleotide. VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’
và 3’ và thành phần amino acid, nhưng lại có một vùng khoảng gần 500 nucleotide ở
chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu
biến đổi”. Vùng này quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy,
được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc
Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008).
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền
Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu
sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nơng nghiệp bằng kỹ thuật di truyền
trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)”. Đây là một

trong những đề tài thuộc chương trình hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và
CHLB Đức, đề tài vừa có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ,
xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ lĩnh vực công nghệ ADN tái tổ hợp.

6


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC
1.1. Tổng quan về bèo tấm
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm
Theo Landolt (1986), bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp
Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae, chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Wolffiella với
trên 40 loài khác nhau.
Les và cộng sự, 2002 đã dựa trên đặc điểm về hình thái, nhiễm sắc thể và vi
phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm có
5 chi tức là thêm một chi mới là Landoltia (Les và cs, 2002).
Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004 dựa trên sự so sánh
trình tự đoạn intron nằm giữa locus trnL và trnF của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ
Lemnaceae và Pistia cùng thuộc họ ráy Araceae (Rothwell và cs, 2004).
1.1.2. Phân bố của bèo tấm
Bèo tấm phân bố khắp thế giới trừ vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá
lạnh. Vùng sa mạc và vùng đất rất ẩm ướt thì khá hiếm. Trong 4 chi bèo tấm thì 3 chi
(Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, Wolffiella ít có ở châu Mĩ và
châu Phi. Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở
Bắc Mĩ và Đơng Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mĩ
và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mĩ, Đông Nam Á và châu Úc.
L. aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng ấm áp trên thế giới. Cùng
với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như Nam Âu,
vùng trung tâm Bắc Mĩ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…(Landolt, 1986).

1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm
Hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao. Bèo tấm có chứa các
vitamin A, B1, B2... và các axit amin không thay thế, trừ methionin. Bèo tấm nuôi ở
điều kiện tối ưu là một trong số các lồi thực vật có hàm lượng protein tổng số đạt cao
nhất. Hầu hết các lồi bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8-45% phụ thuộc chủ yếu vào
điều kiện nuôi cấy (Landolt và Kandeler, 1987).
Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng,
nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khống chất trong mơi trường nuôi (đặc biệt là
nitơ). Hàm lượng protein và các thành phần hữu cơ khác có trong cánh bèo được liệt kê
ở bảng 2.5 (Landolt và Kandeler, 1987).

7


Bảng 1.1.Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo

Thành phần

Hàm lượng (% trọng lượng khô)

Proteins

6,8 – 45

Lipids

1,8 - 9,2

Sợi thô

5,7 - 16,2

Đường

14,1 - 43,6

Tro

12,0 - 27,6

Bèo sinh trưởng trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng và các điều kiện ni cấy
thì hàm lượng protein có thể đạt tới 45% trọng lượng chất khơ (Leng và cs, 1994).
Hàm lượng protein này rất cao so với các loài thực vật khác và tương đương với hàm
lượng protein có trong đậu tương
1.1.4. Đặc điểm sinh học
1.1.4.1. Khái niệm cơ bản về cánh bèo
Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là
một tập hợp của các mơ có sự biệt hố hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong
họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986).
1.1.4.2. Hình dạng và kích thước cánh bèo
Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số lồi có cánh khơng dẹt do có
xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ovan (hay trịn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S.
polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu.
Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm.
Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên
ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng
đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ... (Landolt, 1986).
1.1.4.3.Hình thức sinh sản của bèo tấm
Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vơ tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vơ tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản hữu tính của

bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nịi giống (Landolt,
1986; Landolt và Kandeler, 1987).
*Sinh sản vơ tính

8


Hình 1.1. Vịng sinh sản vơ tính của L. aequinoctialis (Landolt, 1986)
Fo cánh mẹ

a cánh con đầu tiên

F1 cánh con thế hệ thứ nhất

b cánh con thứ hai

F2 cánh con thế hệ thứ 2

+ cạnh dương của
cánh

F2+a (1-a) cánh con đầu tiên của cạnh dương của thế hệ thứ hai - cạnh âm của cánh
phát sinh từ cánh đầu tiên ở cạnh âm của thế hệ đầu tiên

Các loài bèo sinh trưởng bằng phương thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh
nằm trong xoang ở vùng gốc cánh. Ở điều kiện tối ưu tốc độ sinh sản vơ tính của bèo
tấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ. Lượng cánh có thể tăng lên gấp đơi chỉ sau 24
giờ ni cấy ở các lồi sinh trưởng nhanh như L. aequinoctialis, W. microscopica (xem
hình 1.1).
+ Vịng đời của cánh bèo

Với hình thức sinh sản vơ tính, thời gian một vịng đời của cánh bèo chỉ vài
tuần. Theo nhiều tác giả cho biết vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ
ni, ở 30oC, vịng đời giảm cịn một nửa so với ở 20oC. Trong giai đoạn ngủ nghỉ và ở
nhiệt độ thấp, cánh bèo có thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh dưỡng cũng có
thể ảnh hưởng tới vịng đời. Lượng dinh dưỡng khơng đủ có thể làm cánh bèo già hoá
nhanh và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Nói chung, vịng đời của một cánh bèo sẽ dài hơn
nếu tốc độ nhân cánh thấp hơn. Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu
thì cánh bèo bị tổn thương và chết nhanh hơn bình thường (Landolt, 1986).
*Sinh sản hữu tính

9


+Ra hoa
Các cơ quan ra hoa ở bèo tấm LA gồm các
thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị, 1 nhuỵ, hiếm khi có 3
nhị (hình 1.2). Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan
của hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. Ở
Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh trong 1 xoang ở
bề mặt trên của cánh và không ở cùng xoang phát
sinh cánh con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường
trung tâm cánh. Hoa của Wolffia nằm ở cạnh đường
trung tâm của cánh (Landolt, 1986).

Hình 1.2. Hoa của L.A
St: nhị; Pi: Nhuỵ; Pe: lá bắc
(Landolt, 1986)

+ Quả và hạt
Khoảng 2 - 5 tuần sau khi thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khơ và

thường có 1 hạt. Ở hầu hết các loài quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L.
perpusilla. Quả dài từ 0,35 mm – 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy
đen ở đỉnh. Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có dạng hình trứng hoặc tam giác. Kích
thước hạt biến đổi trong cùng 1 lồi và giữa các loài từ 0,3 - 2 mm về chiều dài và 0,2 0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngồi và vỏ trong, nội nhũ và phơi. Vỏ ngồi
gồm 2 - 11 lớp tế bào của biểu bì ngồi, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối
hạt (Landolt, 1986).
1.1.4.4. Đặc điểm sinh học của Wolffia australiana
W. australiana là loài thực vật hạt kín có hoa nhỏ bé nhất. Chúng khơng có rễ,
cây dạng hình trứng hoặc hình elip, có chiều dài từ 0,4 mm đến 0,9 mm. Chúng sống
trôi nổi trên mặt nước, rất khó để quan sát được hoa của chúng. Hoa của W. australiana
được bao bọc trong một cái bao, phát triển bên trên thân của cây chứa một nhị hoa và
một nhụy đơn khơng có đài hoa và những cánh hoa. Hạt phấn có gai, những phần nhơ
lên mặt nước được bao trùm lại. Ở giữa những tế bào được bao bọc bởi một lớp lục lạp,
nhờ đó chúng nổi lên mặt nước.
Ưu điểm của W. australiana so với các lồi thực vật khác
- W. australiana có thể sản xuất từ 6,8% đến 45% protein tính trên trọng lượng
khơ. Protein của bèo tấm có hầu hết các amino acid khơng thay thế. Ngồi ra W.
australiana có các loại vitamine: A, B1, B2, B6, E...
- Thời gian nhân đôi 24-48h tuỳ theo điều kiện ni trồng. Có thể sản xuất sinh
khối lớn trong thời gian rất ngắn.
- Dễ nuôi trồng, chỉ cần nước, ánh sáng, CO và muối khoáng.
- Cây tự thụ, không tạo phấn đảm bảo tốt các điều kiện về an toàn sinh học cho

10


cây biến đổi gen.
- Cải tạo môi trường nước, đặc biệt nó cịn làm giảm sự phát triển của muỗi
Anopheles.
- W. australiana là hệ thống mới cho sản xuất các loại vacxin và những kháng

thể đơn.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển W. australiana
Cũng giống như các lồi cây khác,nhiệt độ, mơi trường, ánh sáng, chất dinh
dưỡng, độ pH... là các yếu tố tác động lên sinh trưởng và phát triển của W. australiana.
W australiana có thể sinh trưởng trong các ao hồ, các mơi trường nước nhân
tạo, các bình ni. Việc thay nước thường xuyên là rất quan trọng, tránh được sự mất
nước do bay hơi. W. australiana cần được nuôi trong môi trường sạch. Khi lấy bèo từ
các ao hồ sẽ bị lẫn nhiều các sinh vật khác: vi khuẩn, nấm, tảo, vi sinh vật, thậm chí các
tế bào động vật rất nhỏ, những ấu trùng. Do đó phải làm sạch bèo trước khi nuôi bằng
cách chuyển các cá thể riêng lẻ vào môi trường nước sạch, việc này được làm hết sức
cẩn thận bởi các tế bào bèo rất dễ bị tổn thương.
Môi trường nuôi
Cây sinh trưởng và phát triển tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào môi trường
nuôi. Nhu cầu dinh dưỡng tối ưu cho các lồi cây là khơng giống nhau, tuỳ thuộc vào
lồi, giống, thậm chí các mơ được lấy từ các cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể
sinh vật.
Cho đến nay người ta đã tìm ra nhiều loại môi trường dinh dưỡng cơ bản như:
môi trường MS, mơi trường Knop, mơi trường B5. Trong đó, môi trường MS được sử
dụng cho nhiều loại cây trồng. Mơi trường MS rất giàu thành phần khống đa lượng,
đặc biệt là nitrat và amonium. Tuy nhiên đối với một số lồi thì hàm lượng khống MS
tỏ ra q cao và có trường hợp gây độc cho mơ ni cấy.
Vì thế, với mỗi đối tượng, ta cần tìm ra mơi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển của chúng. Riêng đối với W. australiana môi trường nuôi nhân tạo thường
dùng là H (Hutner)
Nguồn cacbon
Trong q trình ni cấy cây chủ yếu hút chất dinh dưỡng từ môi trường. Nguồn
cacbon được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy thực vật là sucrose với nồng độ 1-8%,
glucose và fructose thường được sử dụng thay cho sucrose, còn các loại đường khác
như mantose, manose, lactose ít được dùng. Đối với W. globosa đường tốt nhất để
dùng cho nuôi cấy là sucrose với nồng độ 1%

Các muối khoáng
W. australiana sinh trưởng tốt ở những nơi mà trong nước giàu chất khoáng, đặc

11


biệt là photpho và nitơ. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nitơ được sử dụng dưới
dạng muối: CaNO3; KNO3; NaNO3; NH4NO3. Photpho thường được dùng dưới dạng
Kaliphotphat (KH2PO4)
Nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho bèo sinh trưởng khoảng từ 200 - 300C, ở nhiệt độ 35-400C
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng của bèo. Dưới nhiệt độ lạnh bèo hình thành
các chồi ngủ, vì thế bèo có thể sống qua mùa đông ở ao hồ dưới dạng những chồi ngủ.
Ánh sáng
Ánh sáng trực tiếp là điều kiện tự nhiên cho bèo, tuy nhiên, ánh sáng trự tiếp có
thể là một vấn đề nếu ta nuôi bèo trong một vật đựng nhỏ, ánh sáng sẽ làm nước tăng
nhiệt độ và bốc hơi làm cho cây chết. Chính vì vậy thay nước thường xuyên và tránh
mất nước là điều rất quan trọng.
Ánh sáng đèn huỳnh quang là loại ánh sáng dùng phổ biến nhất vì nó phát ra tia
hồng ngoại cung cấp đầy đủ ánh sáng cho quang hợp và cây sẽ khơng bị nóng lên.
Độ pH
Độ pH ảnh hưởng đến quá trình hút chất dinh dưỡng trong cây tương đối phức
tạp, ở các nồng độ pH khác nhau thì quá trình hút chất dinh dưỡng cũng khác nhau. W.
globosa có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH rộng, nhưng sống tốt trong khoảng
pH=4,5 đến pH=7,5.

Hình 1.3. Bèo tấm W. australiana nuôi trên đĩa thạch
1.2. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm

Có rất ít các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh trên bèo tấm được công bố từ

trước tới nay. Theo các tài liệu mà chúng tơi có được từ năm 1978 Chang và Hsing đã
tạo được callus thành công trên L. aequinoctialis khi nuôi cấy các cánh trưởng thành
của L. aequinoctialis trong môi trường lỏng có chứa 10 mg/l 2,4 D. Callus được tạo ra
từ vùng mô phân sinh xung quanh điểm node phát sinh cánh sau 13 tuần nuôi cấy.
Trong thời gian nuôi cấy tiếp theo, hai ông chỉ tạo được dạng cấu trúc giống cánh có
màu xanh mà khơng có tiến triển nào tốt hơn sau đó hai tháng (Chang và Hsing, 1978).

12


Trước đó, vào những năm 1976-1978 Chang và Chiu đã tạo thành cơng callus và tái
sinh cánh ở dịng bèo L.gibba G3 (Chang và Chiu, 1978). Mãi cho đến những năm
1997, 1998, một số nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc Bang Carolina phát triển
một hệ thống tái sinh thông qua callus ở L. gibba G3. Tuy nhiên kết quả cuối cùng mới
chỉ là dạng cấu trúc giống cánh màu xanh hoặc là dạng nốt sần màu xanh (Moon và
Stomp, 1997).
Một quy trình tái sinh được xây dựng trên L.minor L đã được cơng bố năm 2002,
trong đó callus được tạo ra với tỷ lệ 89.11% khi cấy từ mẫu cánh bèo L. minor (4 loại
mẫu: toàn cánh trưởng thành; cánh bị tổn thương do cắt; nửa cánh; mẫu rễ xấp xỉ 1cm)
trên mơi trường có bổ sung 45 mM 2,4 D. Cánh tái sinh từ callus thu được trên mơi
trường tái sinh có 22mM IAA và 4,0 mM Kinetin. Tỷ lệ tái sinh đạt 100%, cánh tái
sinh thu được khi chuyển lên môi trường nhân cánh đã nhanh chóng tạo ra cánh bình
thường (Stefaniak và cs, 2002).
Li và cộng sự, 2004 đã xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và chi tiết trên các
loài bèo Spirodela oligorrhiza, Spirodela punctata, Lemna gibba var Hurfeish. Báo cáo
này đã phân tích ảnh hưởng của các loại đường và các chất KTST tới giai đoạn tạo
callus (Li và cs, 2004). Các auxin sử dụng gồm có dicamba, PCA, NAA, 2,4 D. Các
cytokinin gồm có TDZ, BA, 2iP, zeatin. Các loại đường gồm có galactose, sorbitol,
maltose, sucrose, mannitol. Các chất KTST, đường và hàm lượng của chúng được sử
dụng khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong hệ thống tái sinh và ở mỗi loài bèo (Li

và cs, 2004).
1.3. Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp.
1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật
1.3.1.1. Vectơ tách dòng
Để tách dịng một đoạn ADN, đoạn đó cần phải được đính vào vectơ tách dịng.
Có nhiều loại vectơ: plasmid, phage, cosmid, YAC… Người ta chọn sử dụng vectơ dựa
vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dịng và mục đích tạo dịng. Một vectơ được sử
dụng cho mục đích tách dịng cần có những đặc điểm sau đây:
• Vectơ phải có khả năng sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào
sự sao chép hệ gen tế bào chủ.
• Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng ADN
tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhập vào tế
bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả.
• Vectơ phải có các đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
vectơ, các đặc tính này được mã hố bởi các gen chọn lọc. Thơng thường đó là

13


các đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trên mơi
trường có chất kháng sinh chọn lọc, hoặc có khả năng sản sinh một enzyme
chuyển hoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên mơi trường thạch.
• Vectơ phải tồn tại được trong vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn
nhất cho tế bào chủ.
• Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượng tối đa
enzyme giới hạn. Điều này mở rộng khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp.
Hơn nữa các vị trí nhận biết này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc. Nhờ vậy
mà khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chính giữa gen
và làm bất hoạt gen đấy. Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid khác nhau ra
đời, thế hệ sau là cải tiến của thế hệ trước và ngày càng mang nhiều đặc tính quý

báu cho việc tạo dịng.
Trong số các loại vectơ hiện nay thì plasmid được sử dụng rộng rãi nhất. Về chức
năng, người ta chia vectơ thành hai loại lớn là vectơ nhân dòng (cloning vector) và
vectơ biểu hiện (expression vector).
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vectơ pCRđ 2.1 để tách dòng và
vectơ pPAMksGFP để biểu hiện đoạn gen VP2 của virus gumboro
Vectơ pCRđ 2.1
Để tách dịng và xác định trình tự gen mã hố protein VP2 của virus Gumboro
chúng tơi sử dụng vectơ pCRđ 2.1 của hãng Introgen làm vectơ tách dịng. Đây là một
trong các vectơ có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật
là có thể gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu
dính, mỗi đầu có một base Thymine. Vectơ pCRđ 2.1 có kích thước 3,9 kb, được thiết
kế có gắn một operon chuyển hố đường lactose là operon-lac. Tại vùng ranh giới giữa
promoter của operon này là gen cấu trúc mã hố cho β- galactosidase có vùng cắt đa vị
(multiple cloning site (MCS) – vùng nhân dòng đa điểm cắt) với 17 vị trí cắt cho các
enzyme giới hạn: EcoR I, Hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, BstX I, EcoR V,
Not I, Ava I, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I. Trong đó EcoR I, BstX I có hai vị trí cắt, các
enzyme cịn lại chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng MCS như vậy, sản phẩm βgalactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ khơng được đính đoạn ngoại lai) hoặc
khơng được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó, người
ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vectơ tái tổ hợp với tần suất cao. Ngoài ra,
vectơ pCRđ 2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin, nhờ đó có
thể sinh trưởng bình thường trên mơi trường có chứa Ampicillin và Kanamycin với

14


nồng độ ức chế tối thiểu. Phần trình tự trên biểu thị vectơ pCRđ 2.1 được đính kèm sản
phẩm PCR bởi liên kết TA.
1.1.3.2. Vectơ biểu hiện
Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hố cho protein phải được gắn

vào vectơ biểu hiện. Có rất nhiều vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu
hiện khác nhau. Ở đây để biểu hiện gen VP2 mã hoá một phần kháng nguyên vỏ của
virus gumboro, chúng tôi chọn vectơ pPAMksGFP (6496 bp) để thiết kế pPAM-VP2.
Các vectơ này được điều khiển bởi promotor 35S promoter và gen chỉ thị nptII kháng
với geneticin (Hình 1.4). Vùng nhận biết gắn gen kháng kháng sinh giúp cho việc chọn
lọc chính xác dịng plasmid tái tổ hợp. Những plasmid này được TS. J.Schillberg
(Fraunhofer, Viện sinh học phân tử và kinh tế ứng dụng, Aachen, CHLB Đức cung
cấp).

Hình 1.4. Cấu trúc pPAMksGFP
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, chúng được chia
thành 2 loại chính: gián tiếp và trực tiếp. Phương pháp chuyển gen gián tiếp là phương
pháp dựa trên việc đưa 1 cấu trúc gen mang bởi 1 plasmid vào tế bào đích bằng các vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens hay Agrobacterium rhizogenes. Phương pháp trực
tiếp là phương pháp không sử dụng tế bào vi khuẩn làm đối tượng trung gian
(Trojanowska, 2002).
1.3.2.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens
Số lượng các lồi cây trồng được chuyển gen thơng qua A. tumefaciens tăng mạnh
trong vài năm gần đây. Nhiều loài cây trồng khác nhau đã được chuyển gen bằng việc
áp dụng hai hệ thống chuyển gen:

15


a) Hệ thống chuyển gen in vitro (sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro)
b) Hệ thống chuyển gen in vivo (không sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro)
(Sharma và cs, 2005).
Hệ thống chuyển gen thơng qua Agrobacterium in vitro

Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải có
được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của Agrobacterium và khả năng tái sinh của các tế
bào sau khi lây nhiễm với Agrobacterium (Birch, 1997).
Một số kỹ thuật hỗ trợ trong quá trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ thống
chuyển gen thông qua Agrobacterium bao gồm:
* Xử lý sóng siêu âm
Xử lý mơ thực vật với Agrobacterium trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra các
tổn thương nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép Agrobacterium dễ dàng xâm nhập
vào tế bào thực vật. Bằng phương pháp này đã cải thiện rõ rệt hiệu quả chuyển gen,
biểu hiện gus tạm thời đã tăng từ 100-1400 lần ở các tế bào đậu tương, đậu đũa, cây
vân sam trắng, lúa mỳ và ngô sau khi biến nạp với Agrobacterium theo phương pháp
SAAT (Trick và Finer, 1997).
* Ly tâm tế bào
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đã được
áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phơi hố nhận được từ hoa
chuối đực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger.
Tần số chuyển gen đã được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng chế độ ly tâm tế bào
thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna và cs, 2004).
Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta)
và rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những lồi cây mơ hình đối với các
nghiên cứu về hệ gen học. Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua cơng
đoạn ni cấy mơ và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số
lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mô tả ở các cây trồng
khác nhau như: đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, hoa rum và cây lạc (Rohini
và Rao, 2000).
* Phương pháp chuyển gen vào hạt
Hạt Arabidopsis được lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem trồng và thu
được cây trưởng thành với tần số biến nạp 1%. Hạt Arabidopsis chuyển gen đã được
tạo thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm Agrobacterium tại những

vùng bị tổn thương khi cắt bỏ cụm hoa (Katavic và cs, 1994).
* Phương pháp ngâm cụm hoa

16


Một số nghiên cứu chuyển gen đã được tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách
ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn Agrobacterium
(Desfeux và cs, 2000). Phương pháp này cũng được áp dụng với các cây 1 lá mầm.
* Phương pháp thấm lọc chân không
Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương pháp
ngâm cụm hoa. Phương pháp này đã được áp dụng ở một số cây trồng, đặc biệt là cây
một lá mầm. Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với Agrobacterium
tốt hơn. Người ta đã nhận được các cây Medicago truncatula (cây mô hình thuộc họ
đậu) chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen này (Trieu và cs, 2000).
1.3.2.2 .Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen bằng súng bắn gen
Bắn gen là một kĩ thuật sử dụng các mảnh kim loại kích thước ỡm được bọc các
DNA và được tăng tốc bắn vào các tế bào đích ở tốc độ đủ để xuyên qua thành tế bào
mà không gây tổn hại nghiêm trọng tới tế bào (Taylor và Fauquet, 2002). Theo cách
đó, gen quan tâm được chuyển vào bên trong của tế bào nơi nó được tách khỏi vỏ hạt vi
đạn và được tổ hợp vào nhân hay bộ gen. Phương pháp bắn gen được phát triển vào
những năm 1980 nhằm cạnh tranh với phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium.
Phương pháp được áp dụng cho hầu hết các lồi cây khơng thuộc họ cà, cây ngũ cốc,
cây họ đậu.
Chuyển gen nhờ Silicon Carbide
Nguyên lý: Các sợi Silicon Carbide được đưa vào huyền phù chứa mô thực vật
(màng tế bào, phôi non, callus) và DNA plasmid. Tất cả được trộn bằng máy votex,
máy lắc hoặc máy đảo. Sợi Silicon Carbide bọc DNA sẽ xuyên qua thành tế bào do có
các lỗ nhỏ tạo ra trên thành tế bào khi sợi Silicon Carbide va đập với tế bào. Sợi Silicon

Carbide hay được sử dụng là các tinh thể đơn lẻ của các khoáng chất hữu cơ như thạch
anh (silica). Silicon Carbide có hình dạng ống dài từ 10 - 80 mm, đường kính 0,6 mm
và ít bị co giãn.
Ưu điểm chính của phương pháp này là giá rẻ và có thể sử dụng cho các loại vật
liệu thực vật khác nhau. Nhược điểm chính là tỉ lệ chuyển gen khơng cao, gây tổn
thương tế bào dẫn đến khả năng tái sinh kém và cần phải tuân thủ qui trình cảnh báo
nghiêm ngặt khi làm trong phịng thí nghiệm, nếu hít phải sợi Silicon Carbide, đặc biệt
là sợi amiăng có thể bị bệnh nghiêm trọng.
Có một số kết quả đã đạt được của phương pháp này như thu được dạng chuyển
gen-dòng tế bào hay cây ở ngơ, lúa mì, thuốc lá…
Chuyển gen bằng xung điện

17


Xung điện vào tế bào và mô thực vật rất giống về nguyên lí với xung điện tế bào
trần. Sự khác biệt ở chỗ vật liệu thực vật sử dụng là bao phấn, hạt phấn, mảnh lá, phôi,
callus, hạt hay chồi. Để chuyển gen cả DNA plasmid và vi khuẩn Agrobacterium đều
có thể được sử dụng.
Kĩ thuật này đã được sử dụng trên nhiều loài: thuốc lá, lúa gạo và lúa mì. Các thí
nghiệm để thu cây chuyển gen (bền vững) cũng bắt đầu từ đầu những năm 90. Kết quả
tốt nhất đạt được ở ngô: 6,25 % cây chuyển gen thu được thông qua chuyển vào phôi
và 54,6% với callus ( D’Halluin và cs, 1992). Các tác giả tính tốn rằng cứ 10000 tế
bào thì có 1 nhận được gen chuyển. Ở lúa mì, tỉ lệ thu được cây chuyển gen chỉ đạt
0,28%. Mặc dù phương pháp này rất đơn giản và hiệu quả trên một số lồi, nó vẫn ít
được sử dụng để chuyển gen thực vật.
Kỹ thuật vi tiêm
Biến nạp thông qua vi tiêm dựa trên việc chuyển DNA vào nhân hoặc bào tương
bằng các dụng cụ của một pipet có đầu vi mao dẫn thuỷ tinh (Morikawa và Yamada,
1985). Các bước vi tiêm cần được thực hiện trên một thiết bị vi thao tác. Trong quá

trình đưa DNA vào nhân, tế bào được cố định với một pipet giữ và hút cẩn thận. Cả hai
pipet đều chứa dầu khoáng hoạt động giống như xilanh. Vi tiêm chủ yếu được sử dụng
cho chuyển gen vào các tế bào động vật lớn.
Phương pháp này không được phát triển do qui trình thực hiện mất nhiều thời
gian và thiết bị vi thao tác rất đắt. Tuy nhiên phương pháp này có ưu điểm là nó cho
phép chuyển khơng chỉ DNA plasmid mà cịn tồn bộ gen vào tế bào thực vật
(Griesbach, 1987). Cây chuyển gen chỉ được tạo ra trong vài nghiên cứu bao gồm các
loài như: thuốc lá petunia, cải dầu và lúa mạch và thường ở tỉ lệ rất thấp (Trojanowska,
2002).
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn
Nguyên lý: DNA ngoại lai được đưa vào vòi nhuỵ bị cắt một thời gian ngắn sau
khi thụ phấn. DNA ngoại lai chuyển tới tế bào trứng bằng cách chảy xuống theo ống
phấn. Quy trình được áp dụng lần đầu tiên cho chuyển gen vào lúa gạo. Sau đó nó được
sử dụng cho các lồi khác như lúa mì, đậu tương, Pentunia hybrida và dưa hấu
(Trojanowska, 2002). Vi khuẩn hay DNA plasmid có thể được tiêm vào cụm hoa với
các tế bào mẹ hạt phấn ở giai đoạn tiền giảm phân mà khơng cần loại bỏ nhị. Trong
trường hợp đó người ta hy vọng DNA ngoại lai sẽ hợp với bộ gen thể giao tử.
Phương pháp chuyển gen bằng Liposome
Ý tưởng về một phương pháp chuyển gen trực tiếp hình thành vào giữa những
năm 80 nhằm để chuyển DNA vào tế bào bằng công cụ của liposone. Liposome là các
túi vi thể hình cầu được tạo ra khi các phospho lipid bị hydrat hố. Chúng có thể được

18


mang cùng với rất nhiều loại phân tử, gồm có DNA. Đối với tế bào trần, quá trình
chuyển gen diễn ra sự dung hợp thành tế bào và nội thực bào. Chuyển gen thơng qua
liposome ít được sử dụng dù nó rẻ và khơng u cầu thiết bị. Ngun nhân chính là do
thực hiện nó q tốn nhân cơng và hiệu quả thu được lại thấp. Chỉ có vài báo cáo về
chuyển gen bằng liposome vào bộ gen cây chủ và tạo được cây tái sinh ở thuốc lá và

lúa mì (Zhu và cs, 1993; Trojanowska, 2002).
1.3.3. Chuyển gen thơng qua Agrobacterium tumefaciens
Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây bệnh và tồn tại
bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng
lượng phân tử bằng 3 - 5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Với
kích thước khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập.
Có 2 dạng Ti-plasmid phổ biến. Octopine Ti là plasmid mang các gen cần để tạo
ra các khối u sần sùi sản sinh ra octopine trong khi nopaline Ti- plasmid mang các gen
gây khối u nhẵn sản sinh ra nopaline (Hooykaas và cs, 1979). Octopine Ti plasmid và
Nopaline Ti plasmid có các vùng cơ bản như sau: (i) Vùng T-DNA, (ii) vùng vir-là
vùng điều khiển hoạt động cắt và chuyển T-DNA vào tế bào sinh vật chủ, (iii) vùng
rep-vùng cần thiết cho sự tái bản Ti-plasmid, (iv) các operon tra và trb-đóng vai trò
điều khiển sự chuyển liên hợp của Ti-plasmid và (v) các gen điều khiển sự hấp thu và
sử dụng các opine (hình 1.5) (Zhu và cs, 2000).

Hình 1.5. Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine

Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T-DNA được giới hạn bởi hai đoạn trình tự lặp lại ở hai biên có kích thước 25bp
(Negrotto và cs, 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).
Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật là một đoạn
liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T-DNA là một đoạn gen liên
tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (l) Các gen mã hoá những enzym cần

19


thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmr mã

hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin (Hooykaas
và Schilperoort, 1992).
Cơ chế phân tử của q trình chuyển gen thơng qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất phenol và đường có tác dụng
dẫn dụ A. tumefaciens đến bám vào thành tế bào cây chủ. Các hợp chất này đồng thời
cũng làm cảm ứng hoạt động của các gen vùng vir. Trước tiên protein virA nằm trên
thành tế bào vi khuẩn nhận biết sự có mặt và tương tác với các hợp chất phenol thực
vật. Nhờ đó protein virA được phosphoryl hố, tiếp đó nó chuyển tiếp phosphoryl hoá
phân tử protein virG tạo ra dạng protein virG hoạt hoá. Protein virG đã hoạt hoá kết
hợp với vùng điều khiển của vir-box giúp kích hoạt và tăng cường mức độ phiên mã
các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE (Mclean và cs, 1994; Gelvin, 2003).
Sợi dưới của T-DNA bị cắt ở vị trí cách 4 nucleotid từ đầu bờ phải bởi hoạt
động của protein virD2. Protein này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của mỗi đoạn bị
cắt. Đồng thời với quá trình cắt là quá trình tổng hợp mới sợi thay thế cho sợi bị cắt.
Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T (Wie và cs,
2000; Valentine, 2003).
Trong quá trình di chuyển, protein virE2 gắn với sợi T tạo thành phức hợp T
dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tác động của
các enzym thuỷ phân và các enzym endonuclease có trong dịch bào của tế bào cây chủ.
Protein virB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khẩn và tế bào cây chủ giúp cho sợi T có thể
được vận chuyển sang tế bào cây chủ (Citovsky và cs, 1989; Durenberger và cs, 1989;
Zupan và cs, 2000). Protein virD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trị là tín hiệu nhận
biết trong hệ thống vận chuyển (Hooykaas và Schilperoot, 1992). Quá trình chuyển TDNA này gần giống với q trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein virB tương
đương với yếu tố F.
Ở bên trong nhân, T-complex chuyển tới điểm tổ hợp và các protein bảo vệ sợi
T được tách ra trước khi T-DNA được tổ hợp vào những vị trí ngẫu nhiên trên bộ gen
cây chủ. Quá trình tổ hợp T-DNA vào bộ gen cây chủ là quá trình phụ thuộc nhiều nhất
vào cây tế bào chủ (hình 1.6) (Bako và cs, 2003).
Sau khi kết hợp vào bộ gen cây chủ, các gen trên T-DNA, nhờ sự điều khiển của
gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát

triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Wie và cs,
2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003).

20