Tài liệu tập huấn kỹ thuật PCR chuẩn đoán bệnh trên tôm cá potx

Vi n Nghiên C u Và Nuôi Tr ng Th y S n II ệ ứ ồ ủ ả
Trung Tâm Qu c Gia Quan Tr c, C nh Báo Môi Tr ngố ắ ả ườ
Và Phòng Ng a D ch B nh Th y S n Khu V c Nam Bừ ị ệ ủ ả ự ộ
TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN
ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ
L u hành n i bư ộ ộ
Tp. H Chí Minh 2007ồ
1
CH NG I: ƯƠ LÝ THUY T PHÒNG THÍ NGHI MẾ Ệ
I. AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHI MỆ
Luôn m c qu n áo b o h trong khi làm vi c t i phòng thí nghi m.ặ ầ ả ộ ệ ạ ệ
1. Hóa ch tấ
Hóa ch t s d ng trong phòng thí nghi m sinh h c phân t ph n l n là nh ng ch t đ cấ ử ụ ệ ọ ử ầ ớ ữ ấ ộ
h i vì th , luôn xem k tên hóa ch t tr c khi s d ng và c n ghi chú rõ ràng bên ngoàiạ ế ỹ ấ ướ ử ụ ầ
bao bì m i lo i hóa ch t. ỗ ạ ấ
Tr c khi s d ng m t lo i hóa ch t m i, c n ph i tham kh o thông tin c a chúng tướ ử ụ ộ ạ ấ ớ ầ ả ả ủ ừ
các tài li u c a nhà s n xu t. Ví d :ệ ủ ả ấ ụ
Phenol – r t d gây cháy ấ ễ
Acrylamide – tác đ ng đ c lên h th n kinh ộ ộ ệ ầ
Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư
Luôn đeo găng tay khi làm vi c v i các hóa ch t và không bao gi đ c hút chúng b ngệ ớ ấ ờ ượ ằ
mi ng. N u ti p xúc tr c ti p v i nh ng ch t đ c này ph i nhanh chóng r a vùng ti pệ ế ế ự ế ớ ữ ấ ộ ả ử ế
xúc d i vòi n c và tuân theo ch d n c a ng i h ng d n. ướ ướ ỉ ẫ ủ ườ ướ ẫ
Các hóa ch t c n ph i đ c b o qu n đúng nhi t đ quy đ nh: nhi t đ phòng, trong tấ ầ ả ượ ả ả ệ ộ ị ệ ộ ủ
mát (4
0
C) ho c t l nh âm (-20ặ ủ ạ
0
C) và đ c ghi nhãnượ c n th nẩ ậ .
2. Đèn t ngo i (UV)ử ạ
Ti p xúc tr c ti p v i tia UV có th gây h i m t. Luôn luôn đeo kính b o v khi sế ụ ế ớ ể ạ ắ ả ệ ử

d ng đèn UVụ .
3. Ngu n đi nồ ệ
Đi n th s d ng trong quá trình đi n di có th gây gi t đi n. Đ y n p b n đi n diệ ế ử ụ ệ ể ậ ệ ậ ắ ồ ệ
trong su t quá trình đi n di đ tránh b đi n gi t. Luôn t t ngu n đi n tr c khi l yố ệ ể ị ệ ậ ắ ồ ệ ướ ấ
b n gel ra kh i b n đi n di.ả ỏ ồ ệ
4. Các v t d ngậ ụ
V t d ng th y tinh và nh a dùng trong sinh h c phân t ph i s ch và vô trùng. ngậ ụ ủ ự ọ ử ả ạ Ố
nghi m b n nh nhi m khu n ho c dính các ch t t y đ u có th c ch ph n ngệ ẩ ư ễ ẩ ặ ấ ẩ ề ể ứ ế ả ứ
ho c làm h ng v t li u di truy n (nucleicacid).ặ ỏ ậ ệ ề
V t d ng th y tinh ( ng nghi m, bình tam giác…) t t nh t c n đ c r a b ng n cậ ụ ủ ố ệ ố ấ ầ ượ ử ằ ướ
c t, h p thanh trùng ho c s y 150ấ ấ ặ ấ
0
C trong vòng 1 gi . Đ i v i thí nghi m liên quanờ ố ớ ệ
RNA, v t d ng th y tinh c n đ c x lý b ng diethyl-pyrocarbonate đ c ch enzymeậ ụ ủ ầ ượ ử ằ ể ứ ế
RNases là m t lo i enzyme r t b n đ i v i vi c h p thanh trùng. V t d ng nh a (pipetsộ ạ ấ ề ố ớ ệ ấ ậ ụ ự
và ng nuôi c y, ng nghi m nh …) c n đ c thanh trùng tr c khi s d ng.ố ấ ố ệ ỏ ầ ượ ướ ử ụ
2
5. Rác th i và hóa ch t th aả ấ ừ
Ethidium bromide là m t tác nhân gây ung th vì th khi thao tác v i nh ng v t d ng cóộ ư ế ớ ữ ậ ụ
dính ch t này c n ph i đeo găng tay b o h . Gel agarose có ch a Ethidium bromide c nấ ầ ả ả ộ ứ ầ
ph i đ c v t b trong m t túi riêng có đánh d u.ả ượ ứ ỏ ộ ấ
Quy đ nh túi rác cho t ng khu v c, t ng công đo nị ừ ự ừ ạ
Hóa ch t nguy hi m c n có túi đ riêngấ ể ầ ể
II. PHA CH DUNG D CHẾ Ị
N ng đ mole, % và dung d ch m "X"ồ ộ ị ẹ .
N ng đ moleồ ộ Dung d ch có n ng đ mole 1 M là m t dung d ch có th tích 1 lít vàị ồ ộ ộ ị ể
ch a s gram hóa ch t t ng đ ng v i trong l ng phân t c a ch t đó. ứ ố ấ ươ ươ ớ ượ ử ủ ấ
Ví d : Chu n b 100ml dung d ch NaCl 5M (tr ng l ng phân t : 58.456 đvc)ụ ẩ ị ị ọ ượ ử
Cân 29.29 g NaCl (cách tính: 58.456 g/mol x 5 moles/lít x 0.1 lít)
Pha trong 100ml n c c t ho c dung dung môi.ướ ấ ặ

N ng đ ph n trăm: ồ ộ ầ N ng đ ph n trăm (trong l ng/th tích) = tr ng l ng ch t tanồ ộ ầ ượ ể ọ ượ ấ
(g) pha trong 100 ml n c c t ho c dung dung môi. ướ ấ ặ
Ví d : Chu n b dung d ch agarose 0.7% trong đ m đi n di TBEụ ẩ ị ị ệ ệ
Cân 0.7 g agarose
Thêm dung d ch TBE 1X sao cho th tích cu i cùng là 100ml. ị ể ố
Dung d ch m "X".ị ẹ Nhi u lo i hóa ch t, dung d ch c n đ c chu n b n ng đ caoề ạ ấ ị ầ ượ ẩ ị ở ồ ộ
(dung d ch m ) 5 l n (5X) ho c m i l n (10X) so v i n ng đ c n thi t khi s d ng.ị ẹ ầ ặ ườ ầ ớ ồ ộ ầ ế ử ụ
Tr c khi s d ng chúng s đ c pha loãng thích h p đ đ a v n ng đ c n thi tướ ử ụ ẽ ượ ợ ể ư ề ồ ộ ầ ế
(1X c a dung d ch làm vi c). ủ ị ệ
Ví d : Chu n b dung d ch đi n di TBE 1X: ụ ẩ ị ị ệ
100ml dung d ch TBE 10X ị
Thêm 900ml n c c t đ th tích cu i cùng là 1000 ml dung d ch TBE 1X.ướ ấ ể ể ố ị
Chu n b dung d ch làm vi c t dung d ch mẩ ị ị ệ ừ ị ẹ
Nhi u dung d ch trong nghiên c u và ng d ng sinh h c phân t đòi h i s d ng cùngề ị ứ ứ ụ ọ ử ỏ ử ụ
m t thành ph n hóa ch t nh ng l i khác nhau v n ng đ . Vì th đ tránh ph i ph cộ ầ ấ ư ạ ề ồ ộ ế ể ả ứ
t p khi pha ch riêng r các hóa ch t này chúng ta t t nh t nên chu n b s n m t vàiạ ế ẽ ấ ố ấ ẩ ị ẵ ộ
dung d ch g c đ d dàng pha loãng chúng khi c n thi t.ị ố ể ễ ầ ế
Ví d : có th pha đ m TBE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) b ng cách ph i h p 1ml dungụ ể ệ ằ ố ợ
d ch Tris 1M và 2 ml dung d ch EDTA 0.5 M c ng v i 98.8 ml n c c t vô trùng. ị ị ộ ớ ướ ấ
Công th c chung dùng đ tính toán n ng đ c n thi t nh sau:ứ ể ồ ộ ầ ế ư
3
Ci x Vi = Cf x Vf
C i = n ng đ ban đ u, ho c n ng đ c a ồ ộ ầ ặ ồ ộ ủ dung d ch mị ẹ;
V i = th tích ban đ u, ho c l ng dung d ch m c n thi t, ể ầ ặ ượ ị ẹ ầ ế
C f = n ng đ cu i, ho c n ng đ mong mu n sau khi pha; ồ ộ ố ặ ồ ộ ố
V f = th tích cu i, ho c th tích mong mu n sau khi pha ể ố ặ ể ố
III. S D NG THI T BỬ Ụ Ế Ị
Yêu c u h c viên gi gìn các v t d ng trong phòng thí nghi m c n th n. ầ ọ ữ ậ ụ ệ ẩ ậ
Không đ c t ý s d ng các thi t b khi ch a đ c s đ ng ý ho c ch a đ c h ngượ ự ử ụ ế ị ư ượ ự ồ ặ ư ượ ướ
d n s d ng c a ng i h ng d n. ẫ ử ụ ủ ườ ướ ẫ

Không di d i d ng c , thi t b t khu v c này đ n khu v c khác mà ch a có ý ki n c aờ ụ ụ ế ị ừ ự ế ự ư ế ủ
ng i h ng d nườ ướ ẫ
Thông báo ngay b t kỳ h ng hóc c a thi t b . ấ ỏ ủ ế ị
Máy ly tâm
Khi ly tâm, c n ph i cân b ng rotor tr c khi ly tâm. ầ ả ằ ướ
Lau chùi rotor c a máy ly tâm sau khi s d ng n u b v y b nủ ử ụ ế ị ấ ẩ
Đ y n p máy ly tâm khi s d ng xong.ậ ắ ử ụ
Micropipettors
M i pipette đ u có gi i h n th tích do v y c n ph i ki m tra gi i h n th c aỗ ề ớ ạ ể ậ ầ ả ể ớ ạ ể ủ
t ng pipette tr c khi s d ng. Không đ c đi u ch nh pipette quá m c gi i h n.ừ ướ ử ụ ượ ề ỉ ứ ớ ạ
Không đ r i pipette xu ng đ t.ể ơ ố ấ
IV. NGUYÊN T C PH N NG PCR TRONG CH N ĐOÁNẮ Ả Ứ Ẩ
PCR là ph n ng nhân t o t ng h p vàả ứ ạ ổ ợ
khu ch đ i m t đo n DNA n m gi a haiế ạ ộ ạ ằ ữ
trình t g i là ự ọ m iồ (primer). M i (primer)ồ
là nh ng đo n DNA ng nữ ạ ắ
(oligonucleotides) có kh năng b t c p bả ắ ặ ổ
sung chính xác v i trình t đích (trình tớ ự ự
DNA ho c cDNA) c a đ i t ng c n xácặ ủ ố ươ ầ
đ nh (ví d nh DNA c a WSSV ho cị ụ ư ủ ặ
cDNA c a YHV). Sau khi m i (primer)ủ ồ
b t c p vào trình t đích, m t enzyme cóắ ặ ự ộ
tên DNA polymerase s ti n đ n đ u 3’ẽ ế ế ầ
c a m i m i (primer) đ th c hi n ti nủ ỗ ồ ể ự ệ ế
trình sinh t ng h p đo n DNA c n thi t. ổ ợ ạ ầ ế
Thành ph n c b n c a Master Mix cho ph n ng PCR:ầ ơ ả ủ ả ứ
4
- D ch trích DNA m uị ẫ
- Dung d ch đ m c a ph n ng PCR (PCR buffer ho c Taq buffer)ị ệ ủ ả ứ ặ
- Ion Mg

2+
(MgCl2 )
- Deoxy nucleotide triphosphate (dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- Các m i (m i xuôi: F và m i ng c : R)ồ ồ ồ ượ
- Enzym Taq polymerase
Ph n ng PCR g m có ba ả ứ ồ quá trình trong m t ộ chu kỳ khu ch đ i: ế ạ Bi n tínhế , b t c pắ ặ
và kéo dài , chúng đ c l p l i nhi u l n đ khuy ch đ i trình t DNA mong mu n.ượ ặ ạ ề ầ ể ế ạ ự ố
Sau m i ỗ chu kỳ khu ch đ i s l ngế ạ ố ượ
phân t DNA đích đ c nhân lên g p đôi:ử ượ ấ
t 1 phân t lên 2, lên 4 lên 8, lên 16 phânừ ử
t … 2ử
n
.
Chi ti t ba quá trình trên trong m i chu kỳế ỗ
khu ch đ i nh sau:ế ạ ư
Bi n tínhế : Phân t DNA s i đôi đ cử ợ ượ
hình thành b i m i liên k t hydro gi a haiở ố ế ữ
m ch đ n. Trong quá trình bi n tính,ạ ơ ế
nhi t đ ph n ng gia tăng lên nhanhệ ộ ả ứ
chóng đ n 95ế
o
C và gi nhi t đ nàyữ ở ệ ộ
trong kho ng 15-50 giây. nhi t đ này m i liên k t hydro gi a hai m ch đ n c aả Ở ệ ộ ố ế ữ ạ ơ ủ
phân tử DNA s i đôiợ b phá v . Trong giai đo n ị ỡ ạ b t c pắ ặ ti p theoế , nhi t đ ph n ngệ ộ ả ứ
gi m nhanh chóng làm cho m i liên k t hydro ban đ u không hình thành l i đ c k tả ố ế ầ ạ ượ ế
qu làm t o thành hai phân t DNA m ch đ n.ả ạ ử ạ ơ
B t c pắ ặ : Trong giai đo n b t c p, nhi t đ lai th ng duy trì kho ng 50- 60ạ ắ ặ ệ ộ ườ ả
0
C, trong
th i gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các m i (primer) tìm ki m và b t c p bờ ồ ế ắ ặ ổ

sung đ c hi u v i trình t đích (DNA ho c cDNA) t i v trí mong mu n. Nhi t đ b tặ ệ ớ ự ặ ạ ị ố ệ ộ ắ
c p ph thu c vào s l ng G,C có trong m i (primer).ặ ụ ộ ố ượ ồ
Kéo dài: Sau khi m i (primer) tìm ki m và b t c p b sung v i trình t đích, nhi t đồ ế ắ ặ ổ ớ ự ệ ộ
c a ph n ng l i nhanh chóng chuy n v nhi t đ thích h p v i ho t đ ng c a enzymeủ ả ứ ạ ể ề ệ ộ ợ ớ ạ ộ ủ
DNA polymerase th ng là 72ườ
0
C và gi nhi t đ này 30 giây đ n 2 phút tùy theoữ ở ệ ộ ế
chi u dài c a đo n DNA đích c n t ng h p. Trong quá trình t ng h p ề ủ ạ ầ ổ ợ ổ ợ DNA polymerase
5
s l y ẽ ấ nucleotide (A,T,G,C) t môi tr ng ph n ng đ g n vào đ u 3’ c a m iừ ườ ả ứ ể ắ ầ ủ ồ
(primer) theo nguyên t c b sung v i trình t trên phân t DNA ho c cDNA đích. Năngắ ổ ớ ự ử ặ
l ng dùng trong quá trình g n k t này là ATP cũng có trong môi tr ng ph n ng. K tượ ắ ế ườ ả ứ ế
qu quá trình này ph n ng PCR đã t o ra hai phân t DNA m ch đôi m i t m t phânả ả ứ ạ ử ạ ớ ừ ộ
t DNA m ch đôi ban đ u.ử ạ ầ
Nh v y sau nhi u chu kỳ kh ch đ i (th ng t 30-40 chu kỳ) t m t phân t đích banư ậ ề ế ạ ườ ừ ừ ộ ử
đ u ph n ng PCR đã t o ra vô s ầ ả ứ ạ ố phân tử b n saoả có kích th c xác đ nhướ ị mong
mu n. ố
Cu i cùng s n ph m PCR đ c nhu m v i Ehididum bromide và đem quan sát s phátố ả ẩ ượ ộ ớ ự
quang d i tia UV sau khi phân tách s n ph m PCR trên gel agarose theo kích th c.ướ ả ẩ ướ
Các y u t nh h ng đ n k thu t PCRế ố ả ưở ế ỹ ậ
K thu t PCR có đ nh y r t cao, tuy nhiên, ph ng pháp này cũng có m t s h n chỹ ậ ộ ạ ấ ươ ộ ố ạ ế
sau:
S ngo i nhi mự ạ ễ : ng i ta đã ch ng minh đ c r ng vi c m n p ng nghi m sauườ ứ ượ ằ ệ ở ắ ố ệ
m i l n khu ch đ i trong kho ng không gian kín nh phòng thí nghi m s làm cho 1ỗ ầ ế ạ ả ư ệ ẽ
ph n các phân t DNA đ c khu ch đ i vào không khí và nhi m vào các ph n ng sauầ ử ượ ế ạ ễ ả ứ
làm cho ph n ng PCR v sau có nh ng s n ph m khu ch đ i không mong mu n. ả ứ ề ữ ả ẩ ế ạ ố
6
Các sai sót gây ra do Taq polymerase: S sao chép b i Taq DNA polymerase cho t lự ở ỉ ệ
sai khá cao trung bình 104 Nucleotide thì enzyme g n sai m t nucleotide. Tuy nhiên đ cắ ộ ặ
tính này không nghiêm tr ng n u ta không c n xác đ nh chính xác trình t c a DNA.ọ ế ầ ị ự ủ

VI. PHÂN TÍCH S N PH M PCR B NG ĐI N DI GEL AGAROSEẢ Ẩ Ằ Ệ
Đi n di aệ garose th ng đ c s d ng đ xác đ nh s n ph m PCR d a trên kh năngườ ượ ử ụ ể ị ả ẩ ự ả
phân tách các đo n DNA có kích th c khác nhau khi s n ph m PCR di chuy n quaạ ướ ả ẩ ể
mang l i các vi l có trong gel agarose. ướ ỗ
Do phân t DNA tích đi n âm cao. Khi phân tử ệ ử
DNA đ c đ t d i m t đi n tr ng xácượ ặ ướ ộ ệ ườ
đ nh, nh ng phân t DNA tích đi n âm này sị ữ ử ệ ẽ
di chuy n v phía c c d ng c a đi n tr ng,ể ề ự ươ ủ ệ ườ
trong tr ng h p đi n di agarose chúng s diườ ợ ệ ẽ
chuy n qua gel agarose đ c đ t trong dungể ượ ặ
d ch ị đ m đi n diệ ệ . Các phân t càng nh cóử ỏ
kh năng di chuy n càng nhanh trong gel agarose v phía c c d ng so v i các phân tả ể ề ự ươ ớ ử
DNA l n h n. Nguyên tác này cho phép k thu t đi n di phân tách các đo n DNA cóớ ơ ỹ ậ ệ ạ
kích th c khác nhau.ướ
S n ph m PCR đ c tr n v i ả ẩ ượ ộ ớ dung d ch đ t m u (loading gel)ị ặ ẫ vào chuy n vào cácể
gi ng trên gel agarose đ th c hi n phân tách d i tác đ ng c a đi n tr ng. Gelế ể ự ệ ướ ộ ủ ệ ườ
agarose có ch a s n ứ ẵ Ethidium bromide vì th khi DNA di chuy n trong gel agarose sế ể ẽ
t o liên k t v i Ethidium bromide ạ ế ớ
Dung d ch đ t m u (loading gel)ị ặ ẫ ch a ch t có t tr ng n ng (nh đ ng sucrose ho cứ ấ ỷ ọ ặ ư ườ ặ
glycerol) đ lôi cu n DNA xu ng đáy gi ng trên b n gel agarose và ngăn c n không choể ố ố ế ả ả
DNA khu ch tán vào dung d ch đ m đi n di. Ngoài ra, trong dung dich đ t m u cònế ị ệ ệ ặ ẫ
ch a ch t ch th tích đi n âm. Ch t ch th di chuy n cùng v i DNA giúp cho d dàngứ ấ ỉ ị ệ ấ ỉ ị ể ớ ễ
c l ng s di chuy n c a DNA trong b n gel. Ch t ch th th ng dùng là ướ ượ ự ể ủ ả ấ ỉ ị ườ Xylene
cyanol và Bromophenol blue, chúng di chuy n cùng v i nh ng phân t DNA có chi u dàiể ớ ữ ử ề
t ng ng l n l t là 5000 bp and 300 bpươ ứ ầ ượ
Đ m di n di: ệ ệ Đ m đi n di giúp n đ nh các đi u ki n môi tr ng cho phép quá trình diệ ệ ổ ị ề ệ ườ
chuy n c a DNA đ c n đ nh trong su t quá trình đi n di. Có m t vài lo i đ m đi nể ủ ượ ổ ị ố ệ ộ ạ ệ ệ
di th ng dùng trong phân tích đi n di agarose: Tris acetate ườ ệ EDTA (TAE),
Tris/Borate/EDTA (TBE). Kh năng đ m c a dung d ch đ m TAE th p h n so v i TBE.ả ệ ủ ị ệ ấ ơ ớ
Tuy nhiên, TAE l i cho phép phân tách t t đ i v i nh ng đo n DNA l n h n. Đi u nàyạ ố ố ớ ữ ạ ớ ơ ề

đ ng nghĩa v i vi c ph i dùng đi n th th p h n và m t th i gian đi n di nhi u h n.ồ ớ ệ ả ệ ế ấ ơ ấ ờ ệ ề ơ
K t thúc quá trình đi n di b n gel s đ c đ t d i tác đ ng c a tia UV, các đo nế ệ ả ẽ ượ ặ ướ ộ ủ ạ
DNA s n ph m PCR sau khi phân tách theo kích th c s đ c hi n th d i d ngả ẩ ướ ẽ ượ ể ị ướ ạ
băng v ch màu vàng sáng t i nh ng v trí khác nhau t ng ng v i kích th c chi u dàiạ ạ ữ ị ươ ứ ớ ướ ề
c a chúng. ủ
7
Ethidium bromide có s n trong b n gel s chèn vào gi a các baz nit c a phân t DNAẵ ả ẽ ữ ơ ơ ủ ử
d n đ n chúng bám vào ph n trung tâm c a phân t DNA. S phát sáng là do ph c h pẫ ế ầ ủ ử ự ứ ợ
DNA-Ethidiun bromide phát ra khi ch u tác đ ng c a tia UV.ị ộ ủ
Ghi chú:
1. Khu thao tác tách chi t v t li u di truy n, khu pha ch hoá ch t và khu đi n di s nế ậ ệ ề ế ấ ệ ả
ph m PCR ph i tách bi t, tránh tr ng h p DNA t khu tách chi t và khu đi n di ngo iẩ ả ệ ườ ợ ừ ế ệ ạ
nhi m vào trong hoá ch t tr c khi đem ph n ng.ễ ấ ướ ả ứ
2. T thao tác g n đèn c c tím dùng cho pha ch hoá ch t cho ph n ng PCR.ủ ắ ự ế ấ ả ứ
3. Gel agarose ch y đi n di ph i đ c chu n b trong m t t hút khí đ c.ạ ệ ả ượ ẩ ị ộ ủ ộ
8
CH NG ƯƠ 2: THI T B VÀ HÓA CH TẾ Ị Ấ
I. Thi t b và D ng c ế ị ụ ụ
1. Tinh s ch và tách chi t v t li u di truy nạ ế ậ ệ ề
1. T l nh hai ngăn: 4ủ ạ
0
C và –21
0
C
2. Máy ly tâm 14.000 RPM (làm RT-PCR thì c n có thêm máy ly tâm l nh14.000ầ ạ
RPM)
3. Máy cách th y (water bath) hay block nhi t khô (dry heat block)ủ ệ
4. Máy tr n m u (Vortex)ộ ẫ
5. Micropipette các lo i: 0,5 - 10 ạ µl; 10 -100 µl; 40 -200 µl; 200 -1000 µl; đ u tipầ
micropipette các lo i: 0,5-10ạ µl, 20µl, 200µl, 1000µl

6. Eppendorf các lo i: 0,2ml; 0,5 ml và 1,5 ml (chuyên dùng cho PCR)ạ ; Giá ngố
nghi m cho Eppendorf ệ
7. Giá ng nghi m cho lo i tube PCR 0,2ml và 0,5mlố ệ ạ
8. H p đ ng n c đáộ ự ướ
9. D ng c bào đá b ng tayụ ụ ằ
10. Bình đ ng c n ự ồ
11. H p đ ng gi y th m lau tayộ ự ấ ấ
12. Các b kéo, panh vô trùngộ
13. H p nh a có n p đ ng v t li u dộ ự ắ ự ậ ệ ơ
14. Box vô trùng
15. Máy c t n c 2 l nấ ướ ầ
16. T s y d ng c (hot box oven)ủ ấ ụ ụ
17. V t li u khác: Các l s ch đ đ ng m u, c n 95% đ c đ nh và b o qu nậ ệ ọ ạ ể ự ẫ ồ ể ố ị ả ả
m u, găng tay, gi y lau, bút lông d u, kim tiêm vô trùngẫ ấ ầ
2. Khu ch đ i nucleic acidế ạ
Máy luân nhi t (thermocycler)ệ
B gi đi n UBS: lo i online, công su t 2000 wộ ữ ệ ạ ấ
3. Phân tích k t q aế ủ
1. B đi n di g m ngu n và b n đi n di, bàn đ c k t qu v i tia UV, máy nhộ ệ ồ ồ ồ ệ ọ ế ả ớ ả
dùng đ ch p l i k t quể ụ ạ ế ả
2. Khay đ gel (b n gel kích th c 7 x 10 cm ho c 10 x 15cm), l c t o gi ngổ ả ướ ặ ượ ạ ế
v i dung tích ch a m u 10 - 20ớ ứ ẫ µl
3. Micropipette 5 - 50µl
4. B p đi n ho c lò vi ba dùng đ đun agaroseế ệ ặ ể
5. Cân k thu t đ chính xác 0,1gr hay 0,01grỹ ậ ộ
6. ng đong 100ml và 500ml hay 1000mlỐ
7. Chai th y tinh ch u nhi t có n p, dung tích 250ml đ đun Agaroseủ ị ệ ắ ể
8. T đ gel (có h th ng hút h i Ethidium bromide)ủ ổ ệ ố ơ
9. H p nh a có n p đ y ch a rác th iộ ự ắ ậ ứ ả
10. V t li u khác: Găng tay, gi y lau tay, Gi y paraffin, H p đ u tip 10 -200ậ ệ ấ ấ ộ ầ µl

9
II. Hoá ch t tách chi t acid nucleicấ ế
1. Hoá ch t tách chi t thô DNAấ ế
Dung d ch 0,5 N NaOHị : Cân 1 g NaOH cho vào ng đ nh m c ( ng falcon) 50ml thêmố ị ứ ố
n c c t 2 l n vô trùng cho t i m c 50 ml c a ng. Ta có đ c dung d ch 0,5N NaOH.ướ ấ ầ ớ ứ ủ ố ượ ị
Dung d ch 0,25% SDSị : Cân 0,125 g SDS cho vào ng falcon 50 ml thêm n c c t 2 l nố ướ ấ ầ
vô trùng cho t i m c 50 ml. Ta có đ c dung d ch 0,25 % (W/V) SDS.ớ ứ ượ ị
Dung d ch NaOH 0,25% - SDS 0,125%ị :
5ml NaOH 0,5N
5ml SDS 0,25%
H
2
O đ 100mlủ
B o qu n l nh 4ả ả ạ
o
C
2. Hoá ch t tinh s ch DNAấ ạ
TE ( Tris-EDTA): pha100 ml (1 ml 1M Tris, 0.2ml 0.5M EDTA và cho n c đ 100 ml)ướ ủ
h p kh trùng 121ấ ử
o
C trong 15 phút (autoclave) sau đó b o qu n 4ả ả ở
0
C.
Dung d ch 0.5M EDTAị (Ethylene Diamine TetraAcetic ): cân 18,61 g trong 70ml n cướ
c t. Sau đó cho 15-20 h t NaOH đ chu n cho pH = 8. sau đó thêm n c c t đ 100 mlấ ạ ể ẩ ướ ấ ủ
và đem đi h p autoclave. B o qu n 4ấ ả ả ở
0
C
Phenol pH 8: Cân kho ng 100 g phenol tinh th , đ tan 68ả ể ể ở
0

C . Thêm vào m t th tíchộ ể
100 ml dung d ch Tris HCl 0,5M (pH = 8). Khu y t trong 15 phút , đ yên dung d ch choị ấ ừ ể ị
đ n khi th y hai pha rõ r t, hút b pha bên trên. Ti p t c cho thêm m t th tích Trisế ấ ệ ỏ ế ụ ộ ể
HCL 0,1M (pH = 8). L p l i thao tác nh trên cho đ n khi đo đ c dung d ch phenol pHặ ạ ư ế ượ ị
= 8.
Phenol pH 4: Cân kho ng 100 g phenoltinh th , đ tan 68ả ể ể ở
0
C . Thêm vào m t th tíchộ ể
100 ml n c c t hai l n h p kh trùng. Khu y t trong 15 phút, đ yên dung d ch choướ ấ ầ ấ ử ấ ừ ể ị
đ n khi th y hai pha rõ r t, hút b pha bên trên. Ti p t c cho thêm m t th tích n cế ấ ệ ỏ ế ụ ộ ể ướ
c t nh trên. L p l i thao tác nh trên cho đ n khi đo đ c dung d ch phenol pH = 4ấ ư ặ ạ ư ế ượ ị
Phenol pH 8 : Chloroform : Isomyl alcolhol (25:24:1): Pha 100 ml dung d ch tách chi tị ế
b ng cách dùng đ u tip tinh s ch hút 2ml Isoamyl alcolhol vào 50ml phenol pH = 8, l cằ ầ ạ ắ
tr n đ u; sau đó thêm 48ml dung d ch cholroform vào tr n đ u.ộ ề ị ộ ề
Sodium Acetate 3M (pH: 5.2): Cân 40,8g NaOAc*3H
2
O, hòa tan trong 80 ml H
2
O. Sau đó
chu n pH 5.2 v i acid acetic. Thêm n c cho đ 100 ml.ẩ ớ ướ ủ
C n 70%:ồ Đong 70 ml c n tuy t đ i cho vào 30 ml Hồ ệ ố
2
O c t vô trùng. Ta đ c 100 mlấ ượ
c n 70%ồ
C n tuy t đ iồ ệ ố (100%)
H
2
O – DEPC : Hút 1ml DEPC (diethylpyrocarbonate) cho vào 1lít n c c t lo i Ion. ướ ấ ạ Ủ
qua đêm và đem h p vô trùng.ấ
Dung d ch TNị (20 mM Tris–HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.4)

3. Hoá ch t tách chi t RNA (ấ ế Trizol)
10
Phenol pH = 4 19 ml
Guanidine thiocyanate(0.8M) 5,9 g
Amonium thiocyanate (0.4M) 3,8006 g
Sodium acetate 3M pH = 5.2 1,67 ml
Glycerol 2,5 ml
Thêm H
2
O – DEPC đ 50 mlủ
4. Phân tích s n ph m PCR trên gel agaroseả ẩ
TBE 10X (Tris-Boric acid-EDTA)
108g Tris base
55g Boric acid
9,8 g EDTA
- Hòa tan 108g Tris và 55g Bocic acid trong kho ng 600ml Hả
2
O.
- Thêm 9,8 g EDTA và ch nh pH: 8, thêm th tích Hỉ ể
2
O cho đ 1 lít.ủ
B o qu n nhi t đ phòng (28ả ả ở ệ ộ
0
C).
Dung d ch n p m u (loading gel) Bromophenol 6X: ị ạ ẫ
Bromophenol blue 0,25% (w/v)
Glycerol 40% (v/v)
Agarose tinh cho sinh h c phân t ọ ử
Ethidium bromide stock 10mg/ml
11

CH NGƯƠ 3: PH NG PHÁPƯƠ
I. CHU N B M U Ẩ Ị Ẫ
M u tôm có th đ c s d ng tr c ti p (g i là m u t i) ho c đ c b o qu n trongẫ ể ượ ử ụ ự ế ọ ẫ ươ ặ ượ ả ả
dung d ch c n 95ị ồ
0
. Trong tr ng h p m u đ c b o qu n trong c n thì ph i thay m iườ ợ ẫ ượ ả ả ồ ả ớ
dung d ch c n sau m t tu n b o qu n đ u tiên đ m u đ c b o qu n đ c lâu h n.ị ồ ộ ầ ả ả ầ ể ẫ ượ ả ả ượ ơ
Nh ng m u đ c b o qu n trong c n c n đ c lo i c n tr c khi s d ng. Có thữ ẫ ượ ả ả ồ ầ ượ ạ ồ ướ ử ụ ể
dùng gi y th m đ lo i c n kh i m u tr c khi tinh s ch v t li u di truy n. M u t iấ ấ ể ạ ồ ỏ ẫ ướ ạ ậ ệ ề ẫ ươ
s d ng cho phân tích PCR là t t nh t.ử ụ ố ấ
1. M u DNA virus: MBV, WSSV, HPVẫ
M u tôm gi ng (PL): l y kho ng 50-70 con.ẫ ố ấ ả
M u tôm nuôi: l y m t ph n nh mang c a 10 -15 con (t ng l ng m u không qúa 1ẫ ấ ộ ầ ỏ ủ ổ ượ ẫ
gram).
Tôm b m : l y m u cu n m t, chân bò, ho c chân b i ho c m t ph n mang.ố ẹ ấ ẫ ố ắ ặ ơ ặ ộ ầ
M u giáp xác hoang dã: l y m t ph n mang các lo i đ ng v t này (t ng l ng m uẫ ấ ộ ầ ạ ộ ậ ổ ượ ẫ
không qúa 500 microgram).
2. M u RNA virus: TSV, YHVẫ
M u tôm gi ng: l y kho ng 30-50 PL ẫ ố ấ ả
M u tôm nuôi: l y m t ph n nh mang c a 10-15 con (t ng l ng m u không qúa 200ẫ ấ ộ ầ ỏ ủ ổ ượ ẫ
microgram).
Tôm b m : l y m u cu n m t, chân bò, ho c chân b i ho c m t ph n mang.ố ẹ ấ ẫ ố ắ ặ ơ ặ ộ ầ
M u giáp xác hoang dã: l y m t ph n mang các lo i đ ng v t này (t ng l ng m uẫ ấ ộ ầ ạ ộ ậ ổ ượ ẫ
không qúa 200 microgram).
II. QUY TRÌNH TÁCH CHI T VÀ TINH S CH V T LI U DI TRUY NẾ Ạ Ậ Ệ Ề
1. Tách chi t thô DNA ế
Nguyên t c: Ph ng pháp d a trên nguyên t c ph i h p c h c (nghi n), hóa h cắ ươ ự ắ ố ợ ơ ọ ề ọ
(NaOH-SDS) và s c nhi t đ tách chi t DNA virus ra d ch chi t. ố ệ ể ế ị ế
1. M u tôm đ c nghi n k trong eppendorf v i 600-800ml d ch tách chi t DNA (NaOHẫ ượ ề ỹ ớ ị ế
0.25N, SDS 0,125%)

2. Đem bi n tính b ng cách đun sôi cách thu 5-10 phút và làm l nh nhanh đi u ki nế ằ ỷ ạ ở ề ệ
l nh (nhúng vào n c đá). M u đ c s c nhi t nh m phá v màng t bào và phá huạ ướ ẫ ượ ố ệ ằ ở ế ỷ
ho t tính sinh h c c a m t s ch t có trong d ch chi t gây nh h ng đ n ph n ngạ ọ ủ ộ ố ấ ị ế ả ưở ế ả ứ
PCR)
3. Ti p theo d ch nghi n đ c ly tâm 5 phút t c đ 13.000 vòng/phútế ị ề ượ ở ố ộ
4. Sau ly tâm, thu d ch n i bên trên; d ch chi t này đ c đem phân tích PCR ngay ho cị ổ ị ế ượ ặ
b o qu n –20ả ả ở
0
C đ phân tích sau ể
12
2. Tách chi t tinh DNA b ng phenol-chloroform ế ằ
Nguyên t c: Dung d ch Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol(PCI) (25:24:1) s làmắ ị ẽ
bi n tính và t a các protein, chúng s b t p trung trong l p phân cách gi a phase l ngế ủ ẽ ị ậ ớ ữ ỏ
và phase PCI sau khi ly tâm. DNA trong phase l ng s b k t t a b i ethanol n ng đỏ ẽ ị ế ủ ở ở ồ ộ
mu i cao. ố
1. Trong eppendorf, cho vào 400µl d ch chi t thô DNA b nh ph m (xem ph ng phápị ế ệ ẩ ươ
1), thêm 400µl PCI.
2. Vortex m nh trong 10 giâyạ
3. Ly tâm 13,000RPM trong 2 phút
4. Hút chuy n kho ng 350ể ả µl ph n phase l ng trên ch a DNA vào m t tube ly tâmầ ỏ ở ứ ộ
nh m i (l p l i b c này m t l n n a n u ph n ti p xúc gi a hai phase v nỏ ớ ặ ạ ướ ộ ầ ữ ế ở ầ ế ữ ẫ
còn t a tr ng, và l n 2 này thì hút kho ng 300ủ ắ ầ ả µl ph n phase l ng trên ch a DNAầ ỏ ở ứ
vào m t tube Eppendorf nh m i).ộ ỏ ớ
5. Thêm 35µl hay 30µl (1/10 th tích, tuỳ thu c vào th tích pha l ng l y đ c ể ộ ể ỏ ấ ượ ở
b c trên là 350ướ µl hay 300µl) Sodium acetate 3M, pH 5.2 vào dung d ch DNA đị ể
làm cho DNA d b t a khi cho Ethanol vào.ễ ị ủ
6. Tr n b ng vortex nh hay b ng cách búng ngón tay nh vào tube nhi u l n. Thêmộ ằ ẹ ằ ẹ ề ầ
1ml (2,5V) ethanol 100% đã đ l nh trong đá r i vortex. Gi tube trong trong kemể ạ ồ ữ
đá khô trong h n 5 phút, hay gi trong t - 70ơ ữ ủ °C trong 15 phút, hay trong t l nhủ ạ
ngăn -20°C trong 30 phút.

7. Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút
8. Dùng miropipette hút b ph n n c n i b ng cách v a hút c n d n v a cho đ uỏ ầ ướ ổ ằ ừ ạ ầ ừ ầ
tip vào d c thành ng đ i di n v i ch đóng c n lóng DNA. R a c n lóng DNAọ ố ố ệ ớ ỗ ặ ử ặ
v i 1ml Ethanol 70%, không vortex mà ch úp ng a vài l n.ớ ỉ ử ầ
9. Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, hút b Ethanol, và làm khô c n lóng b ng cách đunỏ ặ ằ
cách th y hay đun trong block nhi t khô nhi t đ 50-56ủ ệ ở ệ ộ
0
C cho đ n khi khô hoànế
toàn (không còn th y các gi t n c đ ng trên thành ng). ấ ọ ướ ọ ố
10. Hoà tan c n lóng DNA trong 50 - 100ặ µl đ m TE.ệ
3. Tinh s ch RNA t ng s b ng Trizolạ ổ ố ằ
Nguyên t cắ : Ph ng pháp này dùng Guanidine Thiocyanate và Amoniumthiocyanate,ươ
ph i h p v i phenol acid và các ch t t y khác đ làm ch t gây bi n tính các protein, nhố ợ ớ ấ ẩ ể ấ ế ờ
đó tách chi t đ c RNA toàn ph n ra kh i DNA và protein. RNA tách chi t đ c s dế ượ ầ ỏ ế ượ ẽ ễ
dàng b k t t a b i isopropanol và ethanol.ị ế ủ ở
Nghi n 150 - 200 mg mô tôm trong ề 300 µl. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút
150 µl dung d ch n i cho vào eppendorf 1,5 ml.ị ổ
1. Thêm 1ml dung d ch Trizolị
2. nhi t đ phòng trong 5 phútỦ ở ệ ộ
3. Thêm vào 200 µl Chloroform
4. Vortex trong 20 giây
13
5. nhi t đ phòng trong 3 phútỦ ở ệ ộ
6. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút
7. Thu d ch n i có ch a RNA vào ng eppendorff 1,5ml khác (hút kho ng 600 µl choị ổ ứ ố ả
m i ng)ỗ ố
8. Thêm vào 600 µl Isopropanol l nh -20ạ
0
C ( Tuỳ theo d ch n i thu đ c mà cho m tị ổ ượ ộ
th tích Isopropanol t ng ng)ể ươ ứ

9. nhi t đ phòng ít nh t 10 phút (qua đêm -20Ủ ở ệ ộ ấ ở
0
C hay đ -70ể ở
0
C trong 1 gi )ờ
10. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Lo i b d ch n i. ạ ỏ ị ổ
11. Hoàn tan c n lóng RNA b ng 1ml Ethanol 70%. ặ ằ
12. Vortex, ly tâm 7500 vòng/phút trong 5 phút. Lo i b d ch n i.ạ ỏ ị ổ
13. Làm khô c n RNA 55ặ ở
0
C b ng cách đun cách thu hay block nhi t. ằ ỷ ệ
14. Hòa c n RNA trong 50-100 µl H2O-DEPC. B o qu n -20ặ ả ả ở
0
C.
III. QUI TRÌNH PCR CH N ĐOÁN VIRUS GÂY B NH TRÊN TÔMẨ Ệ
1. Qui trình ch n đoán virus WSSV (Kiapathomchai, 2001).ẩ
Nguyên tăc: ́ S dung 4 môi: môt môi xuôi (F), ba môi ng c (R1, R2, R3). Đê khuêchử ̣ ̀ ̣ ̀ ̀ ượ ̉ ́
đai ba trinh t khac nhau cua môt đoan gene cua WSSV. Trong ba chu ki nhiêt khac nhau.̣ ̀ ự ́ ̉ ̣ ̣ ̉ ̀ ̣ ́
Đôi v i căp môi F, R1 khuêch đai đoan gene co kich th c 1100bp. V i căp môi F, R2́ ớ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ́ ướ ớ ̣ ̀
khuêch đai đoan gene bên trong cua căp môi F, R1. kich th c san phâm khuêch đai la 526́ ̣ ̣ ̉ ̣ ̀ ́ ướ ̉ ̉ ́ ̣ ̀
bp. V i căp môi F, R3 khuêch đai đoan gene bên trong cua san phâm cua hai căp môi trênớ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ ̉ ̉ ̉ ̣ ̀
va co kich th c sau khi khuêch đai la 250 bp. Gi i han cua qui trinh phat hiên DNA virus̀ ́ ́ ướ ́ ̣ ̀ ớ ̣ ̉ ̀ ́ ̣
trong mâu m c fetogram (10̃ ở ứ
-7
g). Ngoai ra, qui trinh con co thê đanh gia m c đô nhiêm̀ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ́ ứ ̣ ̃
cua virus trên tôm.̉
Qui trinh:̀
a. Chuân bi phan ng: ̉ ̣ ̉ ứ
Thanh phân 50 ̀ ̀ µl phan ng PCR gôm: ̉ ứ ̀
25 µl PCR Master mix (Promega),

0.5µl môi F1 (100pmol/̀ µl)
0.5µl môi R1 (20pmol/̀ µl)
0.5µl môi R2 (30pmol/̀ µl)
0.5µl môi R3 (50pmol/̀ µl)
21 µl n c cât hai lân vô trung, ướ ́ ̀ ̀
Hut 1,5 - 2 ́ µl dich chiêt DNA t mâu phân tich. ̣ ́ ừ ̃ ́
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
Giai đoan 1 (1 chu ky): ̣ ̀ 93
0
C trong 5 phut́
14
Giai đoan 2 (5 chu ky):̣ ̀ 93
0
C trong 20 giây
70
0
C trong 20 giây
72
0
C trong 20 giây
Giai đoan 3 (20 chu ky):̣ ̀ 93
0
C trong 20 giây
55
0
C trong 20 giây
72
0
C trong 20 giây

Giai đoan 4 (25 chu ky):̣ ̀ 93
0
C trong 20 giây
50
0
C trong 20 giây
72
0
C trong 20 giây
Giai đoan 5 (1 chu ky)̣ ̀ 72
0
C trong 7 phut́
4
0
C trong vô cung̀
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ
gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
2. Qui trinh PCR chân đoan YHV̀ ̉ ́
A. Qui trình ch n đoán YHV (ẩ Wongteerasupaya và c ng s , 1997ộ ự )
Nguyên tăć : Căp môi 10 F, 114 R đ c thiêt kê đê khuêch đai đoan gene cua YHV co kicḥ ̀ ượ ́ ́ ̉ ́ ̣ ̣ ̉ ́ ́
th c 135 bp.ướ
a. Chuân bi phan ng ̉ ̣ ̉ ứ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
0,5 µl môi 10 F (70 pmol/̀ µl)
0,5 µl môi 114 R (70 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
15

M : Thang DNA
Gi ng 1, 3 : M u tôm nhi m WSSVế ẫ ễ

n ngặ
Gi ng 2, 8 : M u tôm không nhi m WSSVế ẫ ễ
Gi ng 4, 5, 6, 7 : M u tôm nhi m WSSV nhế ẫ ễ ẹ
1 2 M 3 4 5
6 7 8
20 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C).
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 42
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 94
0
C trong 5 phut́
35 chu ky ̀ 94
0
C trong 30 giây
58
0

C trong 30 giây
72
0
C trong 30 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi nhi t đ 4ữ ở ệ ộ
0
C
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ
gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
B. Qui trình ch n đoán YHV (ẩ Tang K.F.J. & Lightner D.V. 1999)
a. Chuân bi phan ng ̉ ̣ ̉ ứ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi 273F (50 pmol/̀ µl)
16
1 2 3 4 5 6
M 7
M : Thang DNA
Gi ng 1, 2, 4, 7: M u tôm nhi m YHVế ẫ ễ
Gi ng 3, 5, 6 : M u tôm không nhi m YHVế ẫ ễ
1 µl môi 273R (50 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
19 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0

C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 42
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 94
0
C trong 5 phut́
35 chu ky ̀ 94
0
C trong 45 giây
60
0
C trong 45 giây
72
0
C trong 30 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi nhi t đ 4ữ ở ệ ộ
0
C
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ

gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
3. Qui trinh PCR chân đoan TSV (̀ ̉ ́ OIE, 2006)
Nguyên T c:ắ Căp môi TSV F va TSV R se khuêch đai môt đoan gene cua TSV co kicḥ ̀ ̀ ̃ ́ ̣ ̣ ̣ ̉ ́ ́
th c 231 bp.ướ
a. Chuân bi phan ng ̉ ̣ ̉ ứ
17
273b
p


Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi TSV F (46 pmol/̀ µl)
1 µl môi TSV R (46 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
19 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 42
0
C trong 45 phut́

01 chu ky ̀ 94
0
C trong 2 phut́
40 chu ky ̀ 94
0
C trong 45 giây
60
0
C trong 45 giây
60
0
C trong 45 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ
gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
4. Qui trình ch n đoán MBV (ẩ Surachetpong W., 2005)
18
1: M u TSVẫ
M: Thang DNA
2, 3, 4, 5: M u tôm không nhi m TSVẫ ễ
6, 7: M u tôm nhi m TSVẫ ễ
1 M 2 3 4 5
6 7
Qui trinh: S d ng m t c p m i khu ch i m t o n gen (Genbank: AY819785) cú

kớch th c 261 bp.
a. Chuõn bi phan ng:
Thanh phõn 50 àl phan ng PCR gụm:
25 àl PCR Master mix (Promega),
0.5àl mụi 261 F (50pmol/àl)
0.5àl mụi 261 R (50pmol/àl)
22 àl n c cõt hai lõn vụ trung,
Hut 1,5 - 2 àl dich chiờt DNA t mõu phõn tich.
b. Th c hiờn phan ng
Th c hiờn phan ng trờn may luõn nhiờt theo cac chu ky sau:
Giai oan 1 (1 chu ky): 95
0
C trong 5 phut
Giai oan 2 (30 chu ky): 94
0
C trong 30 giõy
60
0
C trong 30 giõy
72
0
C trong 30 giõy
Giai o n 3 chu ky 72
0
C trong 7 phut
Gi 4
0
C cho ờn khi phõn tich
5. Qui trỡnh ch n oỏn HPV ( Sukhusirichart vaứ coọng sử,ù 1999)
a. Chuõn bi phan ng:

Thanh phõn 50 àl phan ng PCR gụm:
25 àl PCR Master mix (Promega),
1 àl mụi HPV F (40pmol/àl)
1 àl mụi HPV R (40pmol/àl)
21 àl n c cõt hai lõn vụ trung,
Hut 1,5 - 2 àl dich chiờt DNA t mõu phõn tich.
b. Th c hiờn phan ng
Th c hiờn phan ng trờn may luõn nhiờt theo cac chu ky sau:
Giai oan 1 (1 chu ky): 95
0
C trong 5 phut
Giai oan 2 (35 chu ky): 94
0
C trong 40 giõy
55
0
C trong 30 giõy
72
0
C trong 30 giõy
Giai o n 3 chu ky 72
0
C trong 7 phut
Gi 4
0
C cho ờn khi phõn tich
19
K t qu đi n diế ả ệ
6. Qui trình RT-nested PCR ch n đoán virus VNN gây b nh trên cá Mú (Leobert D.ẩ ệ
De la Pena, 2002)

Nguyên t c: ắ C p m i VNF1 và VNR1 đ c thi t k đ khu ch đ i vùng T4 gen vặ ồ ượ ế ế ể ế ạ ỏ
protein c a virus VNN. C p m i VNF2 và VNR2 khu ch đ i đo n gen bên trong c aủ ặ ồ ế ạ ạ ủ
b c khu ch đ i l n 1ướ ế ạ ầ
a. Chuân bi phan ng RT-PCR b c 1̉ ̣ ̉ ứ ướ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi VNF1 (40 pmol/̀ µl)
1 µl môi VNR1 (40 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
19 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA VNN (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Thanh phân 50 ̀ ̀ µl phan ng Nested PCR b c 2 gôm: ̉ ứ ướ ̀
25 µl PCR Master mix (Promega),
0.5µl môi ̀ VNF2 (40pmol/µl)
0.5µl môi ̀ VNR2 (40pmol/µl)
22 µl n c cât hai lân vô trungướ ́ ̀ ̀
2 µl s n ph m khu ch đ i b c 1ả ẩ ế ạ ướ
c. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
20
Ph n ng RT-PCRả ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 45

0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
30 chu ky ̀ 95
0
C trong 40 giây
55
0
C trong 40 giây
72
0
C trong 40 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
Ph n ng Nested PCRả ứ
Th c hiên phan ng b c 2 trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ướ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
30 chu ky ̀ 95
0
C trong 30 giây
60
0

C trong 30 giây
72
0
C trong 30 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
d. Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5%̉ ̉ ́ ̣ ̣
th i gian 30-40 phut va 100V.ờ ́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
7. Qui trình RT-nested PCR ch n đoán virus GAV & LOV (Walker. P., 2000)ẩ
Nguyên t c: ắ C p m i GAV5 và GAV6 đ c thi t k đ khu ch đ i đo n gen dòngặ ồ ượ ế ế ể ế ạ ạ
hóa cDNA có kích th c 781c a GAV cho s n ph m khu ch đ i là 618 bp. C p m iướ ủ ả ẩ ế ạ ặ ồ
21
S n ph m RT-PCR trên RNA ả ẩ
VNN
S n ph m nested PCRả ẩ
GAV1 và GAV2 khu ch đ i bên trong (nested PCR) đo n gen c a s n ph m khu ch đ iế ạ ạ ủ ả ẩ ế ạ
b c 1 có kích th c là 317 bp.ướ ướ
a. Chuân bi phan ng RT-PCR b c 1̉ ̣ ̉ ứ ướ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi GAV5 (35 pmol/̀ µl)
1 µl môi GAV6 (35 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
20 µl n c DEPC ướ

2-5µl RNA GAV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh nhanh́ ̀ ̣
băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Thanh phân 50 ̀ ̀ µl phan ng Nested PCR b c 2 gôm: ̉ ứ ướ ̀
25 µl PCR Master mix (Promega),
0.7µl môi ̀ GAV1 (50pmol/µl)
0.7µl môi ̀ GAV2 (50pmol/µl)
21.6 µl n c cât hai lân vô trungướ ́ ̀ ̀
2 µl s n ph m khu ch đ i b c 1ả ẩ ế ạ ướ
c. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Ph n ng RT-PCRả ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 45
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
35 chu ky ̀ 95
0
C trong 45 giây
58
0
C trong 60 giây
72

0
C trong 45 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
Ph n ng Nested PCRả ứ
Th c hiên phan ng b c 2 trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ướ ́ ̣ ́ ̀
22
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
20 chu ky ̀ 95
0
C trong 45 giây
58
0
C trong 60 giây
72
0
C trong 30 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
d. Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5%̉ ̉ ́ ̣ ̣

th i gian 30-40 phut va 100V.ờ ́ ̀ ở
8. Qui trình ch n đoán b nh SVCV trên cá chép và cá c nhẩ ệ ả
a. Chuân bi phan ng RT-PCR ̉ ̣ ̉ ứ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi SCVCF1 (50 pmol/̀ µl)
1 µl môi SCVCR2 (50 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)
19 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA SCVC (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, lam lanh́ ̀ ̣
nhanh băng may luân nhiêt 4̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Thanh phân 50 ̀ ̀ µl phan ng Semi-Nested PCR gôm: ̉ ứ ̀
25 µl PCR Master mix (Promega),
1 µl môi SCVCF1 ̀ (50pmol/µl)
23
618
bp
317
bp
S n ph m khu ch đ i RT-nested PCR trên RNA GAV&LOVả ẩ ế ạ
1 µl môi SCVCR4 ̀ (50pmol/µl)
21µl n c cât hai lân vô trungướ ́ ̀ ̀
2 µl s n ph m khu ch đ i b c 1ả ẩ ế ạ ướ

c. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Ph n ng RT-PCRả ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 42
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 2 phut́
35 chu ky ̀ 95
0
C trong 60 giây
55
0
C trong 60 giây
72
0
C trong 60 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Gi 4ữ
0
C cho đên khi phân tich́ ́
Ph n ng Semi-Nested PCRả ứ
Th c hiên phan ng b c 2 trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ướ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 95
0
C trong 4 phut́
35 chu ky ̀ 95

0
C trong 60 giây
55
0
C trong 60 giây
72
0
C trong 60 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 7 phut́
Giữ 4
0
C cho đên khi phân tich́ ́
9. Qui trình multiplex RT-PCR ch n đoán virus gây b nh tr ng đuôiẩ ệ ắ
Nguyên t cắ : Nguyên t c ph n ng là s d ng hai m i ắ ả ứ ử ụ ồ MrNVR và XSVR là hai m iồ
ng c s b t c p v i t ng ng v i RNA c a t ng virus, sau đó s t o cDNA trongượ ẽ ắ ặ ớ ươ ứ ớ ủ ừ ẽ ạ
m t th i gian, r i gia nhi t đ b t ho t enzym phiên mã ng c, chu kỳ ti p t c đ cộ ờ ồ ệ ể ấ ạ ượ ế ụ ượ
th c hi n cùng v i hai m i ự ệ ớ ồ MrNVF - MrNVR và XSVF - XSVR cho t ng virus. Kíchừ
th c s n ph m khu ch đ i 681 bp là ướ ả ẩ ế ạ MrNV và 500 bp là XSV.
a. Chuân bi phan ng ̉ ̣ ̉ ứ
Hút 25 µl AccessQuick
TM
Master mix (Promega)
1 µl môi ̀ MrNVF (20 pmol/µl)
24
1 µl môi ̀ MrNVR (20 pmol/µl)
1 µl môi XSVF (20 pmol/̀ µl)
1 µl môi XSVR (20 pmol/̀ µl)
1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega)

17 µl n c DEPC ướ
2-5µl RNA MrNV & XSV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 70́ ́ ́ ̣
0
C trong 10 phut, laḿ ̀
lanh nhanh băng may luân nhiêt 4̣ ̀ ́ ̣ ở
0
C ho c trong n c đá).ặ ướ
T t c cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, th c hi n ph n ng trên máy luânấ ả ự ệ ả ứ
nhi tệ
b. Th c hiên phan ngự ̣ ̉ ứ
Th c hiên phan ng trên may luân nhiêt theo cac chu ky sau:ự ̣ ̉ ứ ́ ̣ ́ ̀
01 chu ky ̀ 45
0
C trong 45 phut́
01 chu ky ̀ 94
0
C trong 2 phut́
40 chu ky ̀ 94
0
C trong 40 giây
55
0
C trong 40 giây
68
0
C trong 60 giây
1 chu ky ̀ 72
0
C trong 5 phut́
Gi 4ữ

0
C cho đên khi phân tich́ ́
Xac đinh san phâḿ ̣ ̉ ̉ : S dung 10ử ̣ µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% th ỉ ̉ ́ ̣ ̣ ờ
gian 30-40 phut va 100V.́ ̀ ở
Kêt qua điên di:́ ̉ ̣
10. Qui trình RT-nested PCR ch n đoán virus IMNV (Poulos và ctv, 2006)ẩ
25
0 1 2 3 4 5 M 1 2 3


4 5 0
XSV
M rNV
A B