Tinh sạch protein (tt) ppt

Tinh sạch protein
(tt)



V. Phân tách protein bằng điện
di trên gel
Để đánh giá quá trình tinh sạch
protein có hiệu quả hay không, ngoài
cách xác định hoạt tính đặc trưng của
protein có tăng lên sau mỗi bước tinh
sạch, còn một cách là làm hiện hình
các protein hiện diện trong mẫu sau
mỗi bước; điều này được thực hiện
nhờ kỹ thuật điện di.
V.1Điện di một chiều
Một phân tử có mang điện tích sẽ di
chuyển trong điện trường. Hiện tượng
này, được đặt tên là điện di, giúp
hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để
phân tách protein và các đại phân tử
khác như DNA và RNA. Vận tốc di
chuyển (v) của một protein (hay bất
kỳ phân tử nào) trong điện trường phụ
thuộc vào lực điện trường (E), điện
tích thực của protein (z) và hệ số ma
sát (f)

Lực điện Ez kéo phân tử mang điện
tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi

lực kéo của độ nhớt fv tăng lên do sự
ma sát giữa phân tử đang chuyển
động với môi trường. Lực ma sát phụ
thuộc vào cả khối lượng, hình dạng
của phân tử đang di chuyển lẫn độ
nhớt (η) của môi trường. Với một
khối cầu có bán kính là r, ta có
Điện di luôn được thực hiện trên gel
(hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì
gel giống như một cái ray phân tử sẽ
làm tăng sự phân tách. Những phân tử
nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di
chuyển xuyên qua gel, trong khi đó
những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần
như không di chuyển. Những phân tử
có kích thước trung bình di chuyển
trong gel với nhiều vận tốc khác nhau.
điện di được thực hiện trên một bảng
polyacrylamide mỏng, thẳng đứng.
Hướng của dòng điện từ trên xuống.
Gel polyacrylamide, được tạo thành
từ sự polymer hóa acrylamide và sự
liên kết chéo của
methylenebisacrylamide, được chọn
làm môi trường cho điện di vì nó có
tính trơ về mặt hóa học và được tạo
hình nhanh chóng. Điện di là một
cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các
phân tử, không xét về kích thước, sẽ
bị tác động một lực để di chuyển

trong cùng một chất nền. Gel ở đây có
thể xem tương đương với một hạt
trong cột lọc gel.
Các protein có thể được phân tách dựa
trên khối lượng bằng điện di trên
acrylamide dưới điều kiện đã bị biến
tính. Hỗn hợp protein được hòa tan
trong dung dịch sodium dodecyl
sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện
tích âm sẽ phá tất cả các nối không
cộng hóa trị của protein ban đầu.
Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay
dithiothreitol cũng có thể được thêm
vào để làm giảm số nối disulfide.
Phức hợp SDS với protein đã bị biến
tính có một điện tích thực âm tỉ lệ
thuận với khối lượng của protein.
Điện tích âm có được do gắn với SDS
lớn hơn rất nhiều điện tích của bản
thân protein ban đầu; vì thế, điện tích
ban đầu của protein không ảnh hưởng
đáng kể đến điện tích của phức hợp.
Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là
mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết
thúc, những protein trên gel sẽ được
nhìn thấy là một dãy các băng bằng
cách nhuộm với bạc hay một chất
nhuộm màu như Coomassie blue.
Những đánh dấu phóng xạ có thể
được phát hiện bằng cách đặt một tấm

phim chụp x quang lên miếng gel, quá
trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển nhanh
trong gel, trong khi những protein lớn
ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di
động của phần lớn các chuỗi
polypeptide dưới những điều kiện như
thế tỉ lệ với khối lượng của chúng.
Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu
carbohydrate và protein màng không
tuân theo mối tương quan này. SDS-
PAGE có độ phân tách cao, cho kết
quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với
lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol)
protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm
với Coomassie blue và thậm chí ít hơn
(~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện
khi nhuộm bằng bạc. Những protein
chênh lệch về khối lượng khoảng 2%
(ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau
khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt
được bằng SDS-PAGE.
Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta
đánh giá kết quả của quá trình tinh
sạch. Với những phân đoạn đầu tiên,
kết quả là dãy gồm rất nhiều protein.
Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số
lượng protein sẽ giảm và sẽ có một
băng ngày càng đậm. Vạch đó tương
ứng với protein mục tiêu.

V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng
điện
Các protein còn có thể được phân tách
bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid
amin có tính acid và số acid amin có
tính base của chúng. Điểm đẳng điện
của một protein (pI) là điểm pH mà ở
đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại
điểm pH này, tính di động của protein
trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì
z trong công thức (1) bằng 0. Mỗi một
protein có một pI riêng; ví dụ như pI
của cytochrome C, một protein vận
chuyển ion có tính base cao, là 10.6,
trong khi pI của albumin huyết thanh,
một protein có tính acid trong máu, là
4.8. Giả định cho một hỗn hợp protein
chạy trong điện trường trong một
miếng gel với một khuynh độ pH,
không có sự hiện diện của SDS. Mỗi
protein sẽ di chuyển cho đến khi nó
đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của
nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có
phương pháp phân tách protein dựa
vào điểm đẳng điện của protein. để
tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho
vào gel một hỗn hợp polyampholyte
(những polymer nhỏ đa điện tích) có
nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn
hợp này. Điện di dựa vào điểm đẳng

điện phân tách protein nhanh với khả
năng phân biệt được sự chênh lệch pI
khoảng 0.01 hay những protein khác
nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có
thể được phân tách bằng phương pháp
này.

V.3 Điện di hai chiều
Đây là một phương pháp có khả năng
phân tách cao do sư kết hợp SDS-
PAGE với điện di dựa vào điểm đẳng
điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được
chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện.
sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein
vừa được điện di lên tấm gel SDS-
polyacrylamide theo phương nằm
ngang. Protein sẽ chịu một điện
trường theo chiều dọc. Kết quả là một
mô hình các điểm được phân tách hai
chiều, chiều ngang theo điểm đẳng
điện, chiều dọc theo khối lượng. Khả
năng phân tách của phương pháp này
được chứng minh khi hơn một ngàn
protein của vi khuẩn E. coli có thể
được phân tách trong một lần chạy
điện di.
Những protein được phân tách từ tế
bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau
có thể phân tách được bằng phương
pháp này, sau đó cường độ của tính

hiệu sẽ được xác định. Với cách này,
những protein cụ thể sẽ được thấy ở
dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng
sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này
có một hạn chế là có rất nhiều protein
được phân tách nhưng lại phân biệt
rõ. Để khắc phục hạn chế này, người
ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ
thuật khối phổi.

V.4 Đánh giá kết quả tinh sạch
protein
Sau mỗi bước tinh sạch, những thông
số sau cần được ghi nhận để có thể
đánh giá quá trình tinh sạch protein:
- Protein tổng số: lượng protein có
trong một phân đoạn. Thông số này
tính bằng cách nhân nồng độ một
phần của phân đoạn với tổng thể tích
của phân đoạn đó.
- Hoạt tính tổng: hoạt tính của
enzyme trong phân đoạn đó. Thông số
này được tính bằng cách nhân hoạt
tính của enzyme có trong lượng mẫu
được xét nghiệm với tổng thể tích của
phân đoạn đó.
- Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính
tổng chia cho protein tổng số.
- Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi
bước tinh sạch được thể hiện bằng

phần trăm hoạt tính của dịch chiết thô
với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu
là 100%.
- Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh
sạch, được tính bằng cách chia hoạt
tính riêng, được tính sau mỗi bước
tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch
chiết ban đầu.
Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm,
người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh
sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong
khi yield lại giảm. Thật vậy, với kỹ
thuật SDS-PAGE, nếu ta nạp một
lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng
trên bản gel ứng với một bước tinh
sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ
với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ
lượng protein mục tiêu với tổng số
protein hiện diện sẽ tăng .
Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch
phải dựa cả vào 2 thông số mức độ
tinh sạch và yield. Một quá trình tinh
sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và
chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao
còn mức độ tinh sạch thấp có nghĩa là
còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu (nhiều
protein ngoài protein mục tiêu) và làm
phức tạp việc giải thích thí nghiệm.

VI. Xác định khối lượng của

protein
Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ
thuật dùng để phân tích trong hóa học
hữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên,
cho đến gần đây, khả năng bay hơi
quá thấp của protein đã làm mất tác
dụng của phép ghi phổ khối lượng
trong việc nghiên cứu các phân tử
này. Khó khăn này đã được khắc phục
khi có những kỹ thuật chuyển protein
và những đại phân tử khác thành dạng
khí được đưa vào ứng dụng là matrix-
assisted laser desorption-ionization
(MALDI) và electrospray
spectrometry. Ở đây tập trung vào kỹ
thuật MALDI. Trong kỹ thuật này,
những ion protein được phóng ra và
sau đó được tăng tốc qua một điện
trường. Những ion này sẽ di chuyển
qua một đường ống dài được hút chân
không (flight tube), ion nhỏ nhất sẽ di
chuyển nhanh nhất và đến đầu đọc
trước nhất. Vì vậy, dựa vào thời gian
bay (time of flight - TOF) trong điện
trường ta có thể biết khối lượng của
protein (hay chính xác hơn là tỉ lệ
giữa khối lượng với điện tích). Với
một lượng nhỏ phân tử sinh học, dù
nhỏ đến khoảng vài picomole đến vài
femtomole, vẫn có thể phân tích được

với cách này. Một máy phổ ghi khối
lượng dạng MALDI-TOF dược dùng
phân tích hỗn hợp insulin và β-
lactoglobulin. kết quả khối lượng của
2 protein này lần lượt là 5733.9 và
18,364, so với kết quả tính toán la
5733.5 và 18,388. Thí nghiệm này
cho thấy MALDI-TOF thật sự là một
kỹ thuật chính xác để xác định khối
lượng protein. Kỹ thuật này còn được
ứng dụng trong việc xác định dựa vào
khối lượng của peptide (peptide mass
fingerprinting). kỹ thuật này đã mở
rộng khả năng ứng dụng của điện di
hai chiều. Mẫu cần nghiên cứu được
chiết và phân ra một cách riêng biệt
bằng các phương pháp hóa học hay
enzyme học. Khối lượng của các phân
đoạn protein được xác định bằng
phương pháp khối phổ. Cuối cùng,
khối lượng của peptide được so với
những số liệu đã có được tính trên
máy vi tính. Kỹ thuật này cho kết quả
khá tốt. Ví dụ, trong số 150 protein
của nấm men được phân tách bằng
điện di 2 chiều, kỹ thuật này đã giúp
xác định được 80% protein.

VII. Siêu ly tâm
Siêu ly tâm không chỉ là một phương

pháp có thể phân tách một hỗn hợp
thô các thành phần của tế bào mà còn
rất hiệu quả trong việc phân tách và
phân tích những phân tử sinh học. Với
phương pháp này, chúng ta không chỉ
xác định được khối lượng và tỉ trọng
mà còn biết được cả hình dạng của
một phân tử cũng như phân tích
những tương tác giữa các phân tử. Để
có được những điểm này, chúng ta
cần một diễn tả một cách toán học là
một phân tử bị tác động bởi lực ly tâm
như thế nào. Dưới tác động của lực ly
tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua
một môi trường lỏng. Để biết được
tốc độ di chuyển của phân tử ta cần
phải tính hệ số lắng (s) theo công
thức
với m là khối lượng phân tử, v là thể
tích từng phần (nghịch đảo của tỉ
trọng phân tử), p là tỉ trọng của môi
trường và f là hằng số lắng thường
được biểu hiện là đơn vị Svedberg (S)
bằng 10
-3
s. Giá trị S càng nhỏ, phân
tử di chuyển càng chậm.
Vận tốc lắng của một phân tử phụ
thuộc vào khối lượng của nó. Một
phân tử có cùng hình dạng cũng như tỉ

trọng với các phân tử khác nhưng
nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn
Hình dạng cũng ảnh hưởng đến vận
tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt.
Hệ số ma sát của một phân tử cuộn lại
thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh
dù chúng có cùng khối lượng. Vì vậy,
một phần tử dạng thẳng lắng chậm
hơn những phân tử hình cầu dù chúng
có cùng khối lượng.
Một phân tử đặc di chuyển mau hơn
một phân tử ít đặc hơn bởi vì nghịch
đảo của lực đẩy đối với phân tử đặc
nhỏ hơn.
Vận tốc lắng còn phụ thuộc vào tỉ
trọng của dung dịch (p). các phân tử
lằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và không
di chuyển khi p = 1.
Một kỹ thuật tách protein dựa vào hệ
số lắng khác nhau của các protein là
kỹ thuật ly tâm phân đoạn. đầu tiên là
tạo khuynh độ tỉ trọng trong một ống
ly tâm bằng cách trộn 2 dung dịch có
tỉ trọng khác nhau, một có tỉ trọng
cao, một có tỉ trọng thấp. Ví dụ, hỗn
hợp sucrose 20% và sucrose 5% có
khuynh độ tỉ trọng từ 5% ở phía trên
đến 20% ở đáy tube. một lượng nhỏ
dung dịch hổn hợp protein được nạp
vào phía trên của khuynh độ về tỉ

trọng. khi máy quay, protein sẽ di
chuyển theo khuynh độ và tách ra dựa
trên hệ số lắng của chúng. thời gian
và tốc độ ly tâm có được qua thực
nghiệm. Ta tạo một lỗ ở đáy ống ly
tâm để thu nhận các phân đoạn của
protein.
Khối lượng protein được xác định
trực tiếp bằng trạng thái lắng cân bằng
có nghĩa là mẫu được ly tâm ở vận tốc
thấp đủ để sự lắng cân bằng với sự
khuếch tán. kỹ thuật này xác định
khối lượng protein rất chính xác và có
thể sử dụng cho protein không qua
biến tính vì vậy cấu trúc bậc bốn của
protein vẫn được bảo tồn. Đây là điểm
lợi thế của phương pháp này so với
SDS-PAGE, chỉ định được khối lượng
của protein khi đã bị biến tính. Với
hai phương pháp này, SDS-PAGE cho
ta biết khối lượng từng đơn phân, siêu
ly tâm phân đoạn cho ta biết khối
lượng của dạng đa phân, ta có thể kết
hợp để biết có bao nhiêu đơn phân
trong một protein đa phân.