Nghiên cứu phát hiện quy trình realtime rt pcr phát hiện virus gây bệnh lở mồm long móng ở động vật

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH REALTIME RTPCR PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG
Ở ĐỘNG VẬT

CHỦ NHIỆM NDNC
(Ký tên)

Đoàn Thị Quỳnh Hương

Nguyễn Văn Lượng
CƠ QUAN QUẢN LÝ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 1/2016


TĨM TẮT ĐỀ TÀI
Quy trình real-time RT-PCR đã được xây dựng thành công nhằm phát hiện
virus FMDV gây bệnh Lở mồm long móng (LMLM) trong các mẫu bệnh phẩm thu
nhận từ các gia súc bị lở mồm long móng. Phương pháp tách chiết RNA bằng cách
hấp phụ trên hạt silica được cho để sử dụng trong tách chiết RNA cho quy trình realtime RT-PCR phát hiện FMDV. Độ nhạy kỹ thuật của quy trình real-time RT-PCR
FMDV là 193 copy/mL. Độ biến thiên nội phản ứng của quy trình real-time RTPCR FMDV có %CV là 0,06% và độ biến thiên liên phản ứng là 1,61%. Độ đặc

hiệu chẩn đoán và độ nhạy chẩn đoán đều là 100% trên các mẫu khảo sát dương tính
và âm tính chứa và khơng chứa chứng dương FMDVc. Quy trình này chỉ phát hiện
đặc hiệu FMDV mà khơng có phản ứng chéo với các tác nhân khác. DNA của vật
chủ (heo) và của các loài vi khuẩn gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Salmonella enteritidis, Shigella dysneteria, Vibrio cholera cho kết quả real-time
PCR âm tính với cặp primer FMDVf-FMDVr và Taqman probe FMDVp nhưng lại
cho kết quả real-time PCR dương tính với cặp primer đặc hiệu cho từng tác nhân.
Khi áp dụng quy trình trên các mẫu bệnh phẩm thực tế, kết quả thu nhận được hoàn
toàn tương đồng với một quy trình phát hiện và phân type FMDV bằng quy trình
real-time RT-PCR kết hợp HRM sẵn có tại Trung tâm.
Từ khóa: Bệnh lở mồm long móng, real-time RT-PCR, Taqman probe, độ nhạy kỹ
thuật, độ đặc hiệu kỹ thuật
ABSTRACT: Foot-and-mouth disease virus (FMDV, family Picornaviridae, genus
Aphthovirus) causes an acute vesicular disease of pigs and wild and domesticated
ruminants such as cattle, water buffalo, sheep, goats, and deer. In this study a
realtime reverse transcription-polymerase chain reaction (realtime RT-PCR) was
developed to detect FMDV. Total RNA was extracted using silica-gel based
membranes method. The LoD of the FMDV real‐time RT‐PCR assay was 193 copy
/mL. The intra-assay coefficient of variation was 0,06%. The inter-assay coefficient
of variation was 1,61%. Diagnostic sentitivity and specificity were 100%. The
i


analytical specificity of the FMDV real‐time RT‐PCR assay was evaluated by
testing with nucleic acids extracted from pigs, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Salmonella enteritidis, Shigella dysneteria, Vibrio cholera. Negative results
were obtained with the FMDV Real Time RT‐PCR Assay in all samples. No
cross‐reactivity was observed with any panel member tested. Being applied in
clinical samples, it was shown that realtime RT-PCR gave results in good
correlation with other real-time PCR-high-resolution melt (RT-PCR-HRM) method.

Results indicate that this real-time RT-PCR could be successfully used as a sensitive
and specific diagnostic method.
Key words: FMD, real-time RT-PCR, Taqman probe, analytical specificity,
analytical sensitivity,

ii


MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa
Tóm tắt đề tài

i

Mục lục

iii

Danh sách các chữ viết tắt

v

Danh sách bảng, đồ thị

vi

Danh mục hình

vii

THƠNG TIN ĐỀ TÀI

ix

MỞ ĐẦU

x

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh Lở mồm long móng

1

1.2. Phương pháp chẩn đốn bệnh Lở mồm long móng

5

1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu

8

Chương 2 – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung 1: Thiết kế các cặp primer và Taqman probe đặc hiệu
14

để phát hiện virus FMD
2.2. Nội dung 2: Xây dựng và tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR

phát hiện virus FMD
2.3. Nội dung 3: Khảo sát các đặc tính kỹ thuật của quy trình phát

15

16

hiện virus FMD
2.4. Nội dung 4: Áp dụng quy trình phát hiện và phân type virus

17

FMD trên các mẫu bệnh phẩm thu thập từ thực địa
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nội dung 1: Thiết kế các cặp primer và Taqman probe đặc hiệu
18

để phát hiện virus FMD
3.2. Nội dung 2: Xây dựng và tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR
phát hiện virus FMD
iii

22


3.2.1. Khảo sát nồng độ primer

23

3.2.2. Khảo sát nồng độ Taqman probe FMDVp

24

3.2.3. Khảo sát phương pháp tách chiết RNA

25

3.3. Nội dung 3: Khảo sát các đặc tính kỹ thuật của quy trình phát
hiện virus FMD
3.3.1. Khảo sát độ đặc hiệu kỹ thuật (Analytical specificity)

28

3.3.2. Khảo sát độ nhạy kỹ thuật (Analytical sensitivity)

30

3.3.3. Khảo sát độ biến thiên nội phản ứng

32

3.3.4. Khảo sát hệ số biến thiên liên phản ứng

34

3.3.5. Khảo sát độ nhạy chẩn đoán và độ đặc hiệu chẩn đốn

38

3.4. Nội dung 4: Đánh giá quy trình real-time RT-PCR FMDV trên

40

mẫu thực tế
Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận

42

4.2 Kiến nghị

42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

44

iv


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
VIẾT TẮT

THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT

FMD

Foot and Mouth Disease

LMLM

Bệnh lở mồm long móng

OIE

World Organisation for Animal Health - Tổ chức chăm sóc
sức khỏe thú y quốc tế

IC

Internal Control - Chứng nội

LOD

Limit of Detection - Giới hạn phát hiện

FDA

Food and Drug Administration

RT-PCR

Reverse Transcriptas - Polymerase Chain Reaction

v


DANH SÁCH BẢNG
Số

Tên bảng số liệu

Trang

2.1

Trình tự một số đoạn oligonucleotide được sử dụng

14

2.2

Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng tổng hợp cDNA

15

2.3

Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng real-time PCR

16

3.1

Kết quả kiểm tra các đặc tính của cặp primer và probe

20

3.2

Kết quả khảo sát nồng độ primer trong phản ứng Real-time RT-PCR

phát hiện FMDV

23

3.3

Kết quả khảo sát nồng độ Taqman probe trong phản ứng Real-time
RT-PCR FMDV

24

3.4

Kết quả khảo sát hai phương pháp tách chiết RNA

26

3.5

Kết quả khảo sát độ nhạy kỹ thuật của quy trình real-time RT-PCR
FMDV

32

3.6

Kết quả khảo sát độ biến thiên nội phản ứng của quy trình Real-time
RT-PCR FMDV

33

3.7

Kết quả khảo sát độ biến thiên liên phản ứng của quy trình real-time
RT-PCR FMDV

37

3.8

Kết quả đánh giá quy trình real-time RT-PCR FMDV trên mẫu thực tế

41

vi


DANH SÁCH HÌNH
Số

Tên hình ảnh

Trang

1.1

Bản đồ về sự phân bố của các typ virus gây bệnh lở mồm long móng
ở gia súc

2

1.2

Cấu trúc bề mặt của virus FMD

4

1.3

Cấu trúc gen của virus FMD

4

3.1

Kết quả so hàng trình tự nucleotide vùng gen 3D của các type FMDV

19

3.2

Kết quả khảo sát hoạt động của cặp primer-probe-chứng dương

22

3.3

Kết quả khảo sát nồng độ primer trong phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện FMDV

24

3.4

Kết quả khảo sát nồng độ Taqman probe trong phản ứng Real-time
RT-PCR FMDV

25

3.5

Kết quả khảo sát phương pháp tách chiết RNA

26

3.6

Kết quả khảo sát khả năng nhân bản chọn lọc của cặp primer và
probe đặc hiệu FMDV

29

3.7

Kết quả khảo sát khả năng nhân bản của các loại vật liệu di truyền
khác nhau

30

3.8

Kết quả khảo sát độ nhạy kỹ thuật của quy trình Real-time RTPCRFMDV

31

3.9

Kết quả khảo sát biến thiên nội phản ứng của quy trình Real-time RTPCRFMDV

33

3.10A

Kết quả khảo sát độ biến thiên liên phản ứng của quy trình real-time
RT-PCR FMDV đợt 1

34

3.10B

Kết quả khảo sát độ biến thiên liên phản ứng của quy trình real-time
RT-PCR FMDV đợt 2

35

vii


3.10C

Kết quả khảo sát độ biến thiên liên phản ứng của quy trình real-time
RT-PCR FMDV đợt 3

35

3.10D

Kết quả khảo sát độ biến thiên liên phản ứng của quy trình real-time
RT-PCR FMDV đợt 4

36

3.10E

Kết quả khảo sát độ biến thiên liên phản ứng của quy trình real-time
RT-PCR FMDV đợt 5

36

3.11A

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu và độ nhạy chẩn đoán của quy trình
real-time RT-PCR FMDV đợt 1

39

3.11B

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu và độ nhạy chẩn đoán của quy trình
real-time RT-PCR FMDV đợt 2

39

viii


THÔNG TIN ĐỀ TÀI
1. Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu phát triển quy trình realtime RT-PCR phát hiện
virus gây bệnh lở mồm long móng ở động vật
2. Chủ nhiệm đề tài/dự án:ThS. Đoàn Thị Quỳnh Hương & CN. Nguyễn Văn Lượng
3. Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Nông nghiệp Công nghệ Cao
TP. HCM
4. Thời gian thực hiện: 12 tháng,từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015.
5. Kinh phí được duyệt: 129.247.000đồng
6. Mục tiêu: Phát triển quy trình real-time RT-PCR để phát hiện định tính virus
FMD gây bệnh LMLM ở gia súc đáp ứng nhu cầu của ngành thú y trong cơng tác
kiểm sốt dịch bệnh
7. Sản phẩm của đề tài /dự án:
- Bài báo khoa học

ix


MỞ ĐẦU
Lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh dịch nguy hiểm lây lan nhanh và
gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn ni. Chẩn đốn chính xác sự lây nhiễm và tiêm
vaccine phịng dịch bệnh có ý nghĩa to lớn trong việc kiểm soát tới thanh toán được
dịch bệnh nguy hiểm này. Việc phòng chống bệnh LMLM ở nhiều nước đã trở thành
một chính sách rất quan trọng, nhất là trong nền kinh tế thị trường. Trong thời gian
gần đây, tình hình diễn biến của dịch bệnh LMLM xảy ra ở các nước trên thế giới

nói chung và ở Việt Nam nói riêng ngày càng trở nên phức tạp và khó kiểm sốt. Ở
Việt Nam, một trong những mục tiêu quan trọng nhất của ngành thú y phấn đấu thực
hiện là: khống chế một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc, mà đặc biệt là
bệnh LMLM. Do vậy, nghiên cứu phát triển qui trình phát hiện định tính virus
LMLM lưu hành ở Việt Nam rất cần thiết để phục vụ cơng tác kiểm sốt bệnh
LMLM.
Đề tài nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cao khi hướng tới việc phát triển quy
trình real-time RT-PCR để phát hiện định tính virus FMD gây bệnh LMLM ở gia
súc đáp ứng nhu cầu của ngành thú y trong cơng tác kiểm sốt dịch bệnh. Việc có
thêm một quy trình chẩn đốn bổ sung những khiếm khuyết của các quy trình hiện
có, đặc biệt là tính cập nhật của quy trình là đặc biệt cần thiết nhất là đối với virus
FMD. Đề tài nghiên cứu sẽ đưa ra một giải pháp kỹ thuật nhanh nhạy, cập nhật và
chính xác hơn để chẩn đốn bệnh LMLM.

x


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh Lở mồm long móng
Lở mồm long móng (LMLM) là bệnh do virus gây ra và có khả năng lây lan
mạnh trên các gia súc có móngguốc chẵn như trâu, bị, dê, lợn ... Đây là bệnh nguy
hiểm, có khả năng gây dịch nghiêm trọng khó khống chế do khả năng lây lan nhanh
chóng qua tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với nhau, truyền qua khơng khí, các dụng
cụ dùng trong chăn ni… Lở mồm long móng (FMD) là bệnh truyền nhiễm cấp
tính nguy hiểm do virus gây ra. Đây là bệnh được tổ chức dịch tể thế giới (Office
International des Epizooties _ OIE) xếp vào hàng đầu trong danh mục A gồm 15
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho các loài móng guốc chẵn: trâu, bị, dê, cừu, heo
[1].
Bệnh lở mồm long móng (LMLM) lần đầu tiên được phát hiện tại Nha Trang

vào năm 1898 và sau đó lan rộng ở cả ba miền [1]. Đến nay, bệnh thỉnh thoảng
vẫn gây ra những đợt dịch trầm trọng,làm tổn thất lớn cho người chăn nuôi
và ngân sách nhà nước. Kết quả phân tích số liệu dịch bệnh LMLM từ năm
2006-2012 cho thấy khoảng 2-3 năm lại xuất hiện một đợt dịch lớn [5]. Việt
Nam là nước trong vùng Châu Á được báo cáo trên bản đồ dịch tể bệnh lở mồm
long móng thế giới là vùng dịch địa phương (endemic) [21]. Năm 1995 có 26 tỉnh,
thành có bệnh với hàng ngàn ổ dịch (19.883 trâu, bò và 10.293 heo bệnh, chết 384
trâu bò, 5208 heo) đã gây tác hại lớn đến nền kinh tế cho các trại chăn nuôi (giảm
25% sức sản xuất) và nền kinh tế nước ta. Dịch lở mồm long móng đã xảy ra trên
trâu bị liên tục suốt thời gian từ 1975-2005, trên lợn 1992-2005 và gây thiệt hại
nặng nề nhất vào các năm 1993, 1995, 1999, 2000. Ngoài typ O lưu hành trong
nhiều năm qua, typ A cũng đã được phát hiện năm 2004 trên trâu bò và typ Asia 1
trên lợn năm 2005 ở Việt Nam. Nhà nước đã có Chương trình quốc gia phịng
chống bệnh LMLM giai đoạn từ năm 2006-2015 [1]. Trong những năm trước
đây, đã có một số cơng trình nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ bệnh LMLM
1


[1], các đặc điểm của virus LMLM [35], [36] và vacxin LMLM tại Việt Nam
[10]. Tuy nhiên, nhiều đặc điểm dịch tễ, nhất là tại các vùng trọng điểm
chưa được hiểu biết đầy đủ.

Hình 1.1. Bản đồ về sự phân bố của các typ virus gây bệnh lở mồm long móng ở gia
súc. (J. Hammond, FMD World Reference Laboratory, Pirbright Institute, United
Kingdom).
Tác nhân gây bệnh LMLM là virus FMD (foot and mouth disease virus). Đây
là virus thuộc họ Picornaviridaevà được phân thành 7 serotype gồm type A, O, C,
Asia 1, South African Territories (SAT) SATI, SAT II và SAT III, mỗi serotype lại
được phân thành nhiều subtype [22]. Virus FMD là virus trần,có bộ gen RNA mạch
đơn dương dài khoảng 8.500 nucleotide và chỉ có một ORF duy nhất mã hóa cho

một chuỗi polypeptide và chuỗi polypeptide nầy chính là tiền phân tử của các
protein cấu trúc và không cấu trúc tham gia tạo thành hạt virus [14]. Virus FMD có
phần vỏ được tạo thành từ 4 protein cấu trúc là VP1, VP2, VP3, và VP4. Bên trong
lớp vỏ là các protein không cấu trúc 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D [22].Trong các
protein tham gia tạo cấu trúc vỏ, VP1 là protein quan trọng nhất đối với sự nhiễm
2


virus do khả năng nhận biết và liên kết với thụ thể cho phép virus xâm nhập vào bên
trong tế bào. Hậu quả của nhiễm virus là tế bào sẽ chết đi, mỗi tế bào sẽ giải phóng
hàng ngàn hạt virus mới. Virus mới được tạo thành có thể xâm nhập vào hệ tuần
hoàn và di chuyển đến các cơ quan khác bên trong cơ thể sinh vật.
FMD là một bệnh địa phương và các type huyết thanh phổ biến là O, Asia 1
và A. Các typ huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới. Typ huyết thanh O,
A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái lại các type huyết thanh
SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi. Typ huyết thanh
Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á. Riêng typ huyết thanh C chỉ còn
tồn tại một vài nước như Philippine. Trong các ổ dịch, động vật có thể mắc bệnh do
một hoặc cùng một lúc nhiều typ huyết thanh. Sự biến đổi của các typ huyết thanh
cũng khá phức tạp, đơi khi cịn những điều chưa được hiểu biết rõ. Các chủng virus
lở mồm long móng biến đổi rất nhiều và do sự phân bố rộng rãi, phức tạp của chúng
nên thường gặp rất nhiều khó khăn trong việc xác định nguồn gốc lây lan của chúng.
Chỉ riêng typ O người ta đã các định được 8 nhóm với kiểu di truyền sai khác nhau
từ 15% trở lên khi so sánh trình tự gene VP1. Virus lở mồm long móng typ A là
nhóm có tính đa dạng kháng ngun cao nhất, typ A có đến 32 subtype. Và hiện nay
người ta cũng chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của virus
typ A khi giải trình tự gene VP1. Với virus typ C việc giải trình tự gene VP1 cho
phép phân chúng thành 8 nhóm di truyền. Typ virus Asia 1 có sự đa dạng di truyền
ít nhất, chúng chỉ có 1 nhóm di truyền. Theo kết quả giải trình tự gene VP1 các typ
SAT1 có 3 nhóm, SAT2 có 2 nhóm, SAT3 có 3 nhóm di truyền và phân bố theo khu

vực địa lý rõ ràng. Ở Việt Nam đã xác định có typ O, A, và Asia 1 ở trâu, bò và typ
A, O ở heo.

3


Hình 1.2. Cấu trúc bề mặt của virus FMD[24]

Hình 1.3.Cấu trúc gen của virus FMD [24]
Biểu hiện bệnh lý của nhiễm virus là sốt cao và sau đó hạ đi nhanh chóng
trong vịng 2-3 ngày, xuất hiện các vết lt trong và xung quanh miệng, các vết loét
trên chân và nếu nặng có thể dẫn đến long móng. Ngồi ra các vết loét có thể xuất
hiện ở âm hộ con cái và dương vật con đực. Ở các động vật trưởng thành, nhiễm
virus có thể dẫn đến sự sụt cân nhanh chóng và khó hồi phục trong vịng vài tháng,
các con đực có thể bị sưng tinh hồn kéo dài và con cái có sản lượng sữa giảm. Bệnh
LMLM hiếm khi gây chết ớ các động vật trưởng thành tuy nhiên có thể gây ra tỉ lệ
chết lên cao ở các con non. Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tỉ lệ chết cao ở các động
vật còn non là khả năng gây viêm cơ tim nặng của virus.Bệnh có khả năng lây lan
4


mạnh do virus có nhiều trong các mơ, vết thương, và phát tán thông qua dịch tiết và
chất bài tiết của con vật. Hơn thế nữa, khả năng tồn tại ngồi mơi trường của virus
khá tốt vì thế làm tăng khả năng lây lan virus. Đường truyền nhiễm của virus là qua
đường hơ hấp và tiếp xúc.
1.2.Phương pháp chẩn đốn bệnh Lở mồm long móng
Việc chẩn đốn chính xác tác nhân gây bệnh đang lưu hành có ý nghĩa rất
lớn. Hiện nay việc chẩn đốn virus LMLM có thể được thực hiện bằng các phương
phápkhác nhau. Các kỹ thuật phân tích đã được sử dụng để phát hiện acid nucleic
của virus, kháng nguyên và sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ gồm: kết hợp bổ thể

(complement fixation test_CFT), trung hòa virus (virus neutralization), ELISA
(enzyme_linked immunosorbent assay), RT_PCR (reverse transcriptase polymerase
chain reaction), xác định trình tự chuỗi acid nucleic (nucleic acid sequence_based
amplification, NASBA) [13], [18], [20]. Mẫu dùng trong chẩn đoán là các loại mẫu
là dịch trong các mụn nước chưa vỡ hoặc thành mụn nước, máu toàn phần, huyết
thanh và sữa. Sự hiện diện của kháng thể kháng lại các protein khơng cấu trúc của
virus FMD có trong huyết thanh có thể giúp phân biệt giữa động vật nhiễm FMDV
và động vật được tiêm vaccine. Ngoài ra, phương pháp sandwich-ELISA cũng đã
chứng minh được mức độ hiệu quả trong chẩn đoán FMDV trên heo [17].
Kết hợp bổ thể: dùng kháng thể chuẩn để phát hiện serotype virus O,

-

A, C trong bệnh phẩm. Phản ứng nhanh chỉ trong 12 giờ, đơn giản giúp khẳng định
hoặc loại trừ nghi ngờ bệnh lở mồm long móng (FMD). Phản ứng này cũng đã được
hoàn thiện và nếu sử dụng thành thục sẽ là một phương pháp hữu hiệu để chẩn đoán
phân biệt giữa virus lở mồm long móng và các virus gây viêm mụn nước khác.
-

Trung hòa virus: phát hiện qua xét nghiệm mẫu bằng phản ứng trung

hòa virus dựa trên khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng thể kháng virus (nếu có)
trong mẫu bệnh phẩm với virus lở mồm long móng. Đây là phản ứng được dùng làm
thí nghiệm kiểm chứng do có tính đặc hiệu cao nhưng phản ứng này khơng phân biệt
được kháng thể có được là do tiêm phòng hay nhiễm bệnh. Phương pháp này sử
5


dụng dòng tế bào mẫn cảm BHK-21, hoặc tế bào sơ cấp của thận heo, cừu. Kháng
thể trung hòa được phát hiện sau 4-5 ngày bệnh.

-

ELISA: được dùng phát hiện kháng ngun và kháng thể virus trong

vịng 3-4 giờ, khơng phụ thuộc mơi trường mơ, đặc hiệu nhanh, ít (+) tính giả. Hiện
bộ kit chẩn đốn đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát
hiện 4serotyp kháng nguyên O, A, C, Asia 1, và bộ kháng nguyên chuẩn để chẩn
đoán 3 serotyp O, A, C. Phương pháp này chẩn đoán nhanh, đặc hiệu và độ nhạy
cao, được dùng trong giám định serotype của virus, thay thế phương pháp kết hợp
bổ thể. Có thể đây là 1 kỹ thuật huyết thanh học nhạy nhất với mục đích chẩn đốn
và xác định typ. Cả hai phương pháp trung hòa virus và ELISA cạnh tranh trong pha
lỏng đều phát hiện kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng
khơng phân biệt được đó là kháng thể của động vật đã tiêm vacxin hay do nhiễm
virus. Virus lở mồm long móng (FMDV) khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ sẽ dịch
mã để tạo nên các protein cấu trúc và protein không cấu trúc. Các protein không cấu
trúc liên quan đến hoạt động của virus và biến đổi chức năng tế bào vật chủ. Một số
protein không cấu trúc gây đáp ứng miễn dịch và tạo ra các kháng thể đặc hiệu với
chúng. Vacxin chỉ chứa hạt virus tinh sạch với dung dịch đệm và chất bổ trợ nên đáp
ứng miễn dịch với vacxin chỉ tạo ra kháng thể kháng protein cấu trúc của virus.
Trong trường hợp vacxin không tinh sạch bị nhiễm protein không cấu trúc, cũng xảy
ra một đáp ứng miễn dịch yếu và ngắn ngủi đối với loại protein này, vì hàm lượng
chúng rất thấp. Do đó nếu phát hiện kháng thể kháng protein khơng cấu trúc ta có
thể kết luận con vật bị nhiễm virus lở mồm long móng (FMDV) chứ khơng phải do
vacxin. Một số protein không cấu trúc của virus gây đáp ứng miễn dịch: 3D,
3A/3AB/3ABC, 2C, 2B, 3C và Lpro. Rất nhiều bộ kit ELISA chẩn đốn có độ tin
cậy cao có mặt trên thị trường, trong đó đáng chú ý là các bộ kit CHEKIT FMD3ABC, Ceditest FMDV-NS and 3ABC-ELISA. Nghiên cứu so sánh hiệu quả chẩn
đoán của các bộ kit trên cho thấy Ceditest có độ đặc hiệu cao nhất (99,7% đối với
gia súc tự nhiên và 98,8% đối với gia súc được tiêm vaccine) so với CHEKIT
(97,2%-98.8%) và kit 3ABC-ELISA (98,1-92,2). Ceditest cũng có độ nhạy cao hơn
6

(99,1%) so với CHEKIT và 3ABC-ELISA (98,2%) [30].Tuy nhiên việc phát triển
các các bộ kit ELISA đòi hỏi nhiều thời gian, q trình đánh giá hiệu quả chẩn đốn
phức tạp,và chí phí nghiên cứu lớn.
-

RT_PCR: để xác định gia súc nhiễm bệnh đồng thời xác định typ

virus gây bệnh FMD dai dẳng ở thực địa thì kỹ thuật PCR rất nhạy, nhanh, chính
xác, hiệu quả sẽ cần thiết và được xem như là phương pháp bổ sung hay thay thế cho
phương pháp huyết thanh học. Phương pháp kết hợp bổ thể, phương pháp ELISA
mới chỉ dừng lại ở việc trả lời câu hỏi type gây bệnh thuộc loại gì. Phương pháp RTPCR khơng dừng lại ở đó, chúng cịn có thể phân biệt được sự khác biệt biến chủng
có trong bệnh phẩm đã xác định có cùng một type huyết thanh, thông qua việc định
chuỗi các sản phẩm PCR và so sánh trình tự đoạn DNA với các trình tự DNA khác
của virus lở mồm long móng được chứa sẵn trong ngân hàng dữ liệu gen. Những
mẫu huyết thanh dương tính từ mẫu máu thu nhận có biểu hiện lâm sàn đối với virus
thì khơng đủ cơ sở cho việc chẩn đốn virus. Có thể đó chính là sự hiện diện của
kháng thể mẹ truyền cho con. Vì thế việc dùng kỹ thuật PCR để xác định chính xác
sự hiện diện của FMDV. Dùng kỹ thuật PCR không cần phân lập virus trong mơi
trường ni cấy tế bào. Vì thế PCR sẽ tốn ít thời gian để phát hiện hơn so với
phương pháp ni cấy tế bào. PCR cịn được coi là phương pháp có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao. Thơng thường thời gian chẩn đốn bệnh phải mất trên 10 giờ đồng hồ
đối với kỹ thuật soi bằng mắt, 5- 6 giờ đối với kỹ thuật ELISA (kỹ thuật này độ nhạy
cịn kém và chi phí khá cao). Áp dụng kỹ thuật RT- PCR vào chẩn đoán thời gian đã
được rút ngắn xuống còn 4- 5 giờ với độ chính xác cao, an tồn. Kỹ thuật RT- PCR
cho phép phát hiện bệnh ngay trong giai đoạn đầu tiên. Sở dĩ RT- PCR nhận biết
được bệnh nhanh như vậy vì nhờ việc kết hợp PCR với cặp mồi 1F/1R khả năng xác
định các type O, A, C và ASIA- 1 gây bệnh của virus lở mồm long móng diễn ra rất
nhanh.

Các kỹ thuật phát hiện RNA virus với nhiều ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu,
dễ xây phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán ngày càng được chú trọng. Gầ n đây,
7


phương pháp real-time RT-PCR cũng đã đươ ̣c nghiên cứu và ứng dụng vào chẩn
đốn FMDV. Phương pháp này có thời gian cho kết quả chẩn đoán ngắn hơn với đô ̣
nha ̣y cao hơn và độ tin cậy tốt hơn so với PCR thường. Real-time RT-PCR có thể sử
dụng hai nhóm hóa chấ t khác nhau để phát hiê ̣n sản phẩ m PCR: mẫu dò huỳnh
quang gắ n đặc hiệu lên DNA mu ̣c tiêu, trong đó sử dụng phổ biến nhất là Taqman
Probe,haychấ t nhuô ̣m huỳnh quang và thường được sử dụng nhất là SYBR Green.
Việc sử dụng SYBR Green có ưu điểm đơn giản do không phải thiết kế Taqman
probe tuy nhiên trong một số trường hợp lại không phát hiện đặc hiệu tác nhân đích
có trong phản ứng. Trái lại, real-time PCR với Taqman probe khắc phục được nhược
điểm này vì vậy tín hiệu dương tính trong phản ứng real-time PCR là đặc hiệu cho
tác nhân đích.
1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu
Năm 2015, Nguyễn Thị Thu Hằng và cộng sự đã phân tích đặc điểm di truyền
học của củng virus lở mồm long móng VP02 Type O gây bệnh ở trâu, bị và lợn ở
Việt Nam. Trình tự tồn bộ genome của chủng virus LMLM VP02 type O thuộc
topotype SEA-Mya 98 đã được xác định và so sánh với 26 chủng (propotype) type
O trên GeneBank thể hiện trên sơ đồ gene học. Phân tích tính tương đồng tổng thể
khi so sánh trình tự nucleotide các đoạn protein cấu trúc P1 (VP4, VP3, VP2, VP1)
và phi cấu trúc P2 (2A, 2B,2C), P3 (3A, 3B, 3C, 3D) chủng VP02 với các chủng
tham chiếu cho thấy: chủng VP02 có tính tương đồng cao nhất với chủng
HLJOC12/3 với sự sai khác toàn bộ các đoạn cấu trúc và phi cấu trúc so sánh dao
động chỉ từ 97,6-99,6% (<5%). So sánh trình tự nucleotide gene VP1 của chủng
virus LMLM VP02 với 16 chủng tham chiếu cho thấy có sự tương đồng thấp chỉ từ
77,62-97,81%. Trình tự nucleotide gene VP1 chủng VP02 so với 04 chủng phân lập
tại Việt Nam thấy có sự sai khác với 03 chủng phân lập năm 2010 lần lượt là

94,52%, 90,3%, 89,98% và khác biệt nhiều nhất với chủng O/VIT/1/2008.VP1 phân
lập năm 2008 là 79,19% (sai khác >20%) [3].

8


Nguyễn Xuân Hòa và Bùi Thị Phương (2015) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR
trong khảo sát một số yếu tố nguy cơ dẫn đến dịch bệnh lở mồm long móng, xác
định tỷ lệ nhiễm và định serotype virus gây bệnh trên địa bàn huyện Cẩm Xuyên,
tỉnh Hà Tĩnh. Thông tin về các yếu tố nguy cơ gây ra dịch bệnh lở mồm long móng
(LMLM) đã được thu thập thơng qua điều tra, khảo sát, kết quả phân tích bộ câu hỏi
đã điều tra cho thấy các yếu tố nguy cơ chính bao gồm:Đàn gia súc khơng tiêm
phịng vacxin LMLM có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 7,69 lần so đàn gia súc có tiêm
phịng; Các hộ chăn ni có đàn gia súc đã từng bi dịch bệnh LMLM thì nguy cơ tái
nhiễm gấp 6,89 lần so với các hộ chăn ni có đàn gia súc chưa từng bị dịch bệnh
này;Gia súc mới nhập từ nơi khác về không rõ nguồn gốc có nguy cơ mắc bệnh
LMLM cao gấp 3,44 lần so với gia súc được sản xuất tại chỗ hay giống nhập có
nguồn gốc rõ ràng; Khu vực chăn ni gia súc của những hộ thường có cán bộ thú y
ra vào thì nguy cơ gia súc mắc bệnh LMLM cao gấp 2,62 lần so với các hộ chăn
nuôi khác.Virus LMLM lưu hành tại huyện Cẩm Xuyên thuộc serotype O và A[4].
Năm 2014, Nguyễn Thu Thủy và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu khảo sát
mức độ lưu hành virus lở mồm long móng và các yếu tố nguy cơ tại một số tỉnh
trọng điểm từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2012. Nghiên cứu cắt ngang kết hợp với
nghiên cứu bệnh-chứng được tiến hành nhằm xác định mức độ lưu hành virus lở
mồm long móng (LMLM) và các yếu tố nguy cơ tại tỉnh Lạng Sơn, Nghệ An và
Kon Tum từ tháng 10- 12/2012. Mẫu huyết thanh và mẫu probang được lấy từ 884
trâu, bị của 590 hộ. Thơng tin về yếu tố nguy cơ được thu thập thông qua bộ câu
hỏi. Kết quả phân tích cho thấy: Virus LMLM lưu hành với tỷ lệ rất cao: 24,21%
(95% CI 21,42 – 27,17) ở cấp cá thể gia súc và 29,83% (95% CI 26,16-33,70) ở cấp
hộ chăn nuôi; Virus LMLM lưu hành thuộc serotype O và A; Bò được mua từ nơi

khơng rõ nguồn gốc có tỷ số chênh dương tính với virus LMLM là 5,27 lần (95% CI
2,22-12,52) so với bị do hộ chăn ni tự sản xuất. Việc kiểm soát các yếu tố nguy
cơ ở cấp hộ chăn nuôi là quan trọng nhất và cần phải được triển khai thường xun
nhằm kiểm sốt có hiệu quả dịch bệnh; công tác kiểm dịch vận chuyển cần được chú
9


trọng hơn và khắc phục những tồn tại, bất cập hiện nay để ngăn chặn virus LMLM
lây lan và gây bệnh do vận chuyển gia súc mang trùng [12].
Trong báo cáo công bố vào năm 2013 về đặc điểm dịch tễ không gian và thời
gian của dịch lở mồm long móng tại Việt Nam, giai đoạn 2006-2012, Nguyễn Thu
Thủy và cộng sự đã sử dụng phương pháp dịch tễ họ hồi cứu để tiến hành phân tích
và xác định đặc điểm dịch tễ học mô tả về không gian và thời gian của dịch bệnh lở
mồm long móng (LMLM) trong phạm vi cả nước từ năm 2007 đến năm 2012. Tổng
số có 5.639 ổ dịch LMLM đã được báo cáo. Kết quả phân tích cho thấy về đối tượng
mắc bệnh thì trâu bị mắc bệnh cao nhất (33,4%, 95% CI 32,2% - 34,7%), sau đó đến
bị, lợn và các lồi gia súc khác; về thời gian, sau khoảng 2-3 năm dịch bệnh lại xuất
hiện trầm trọng, tập trung vào các tháng 3 đến tháng 7 (năm 2006) và tháng 9 đến
tháng 3 (năm 2009 và năm 2011); về không gian, trung bình mỗi năm có 5 xã trong
tổng số 100 xã nguy cơ có dịch bệnh LMLM. Phân tích sàng lọc thống kê khơng
gian cho thấy dịch bệnh có tính chất lây lan cục bộ là chủ yếu, tập trung tại các tỉnh
giáp biên giới với Trung Quốc và Lào. Khoảng 26% số xã, phường của 62/63 tỉnh,
thành có ít nhất một báo cáo về ổ dịch LMLM trong giai đoạn 2006 – 2012. Điều
này cho thấy vi rút gây bệnh LMLM đã lưu hành và phát tán rộng rãi ở Việt Nam.
Cần tiếp tục có những nghiên cứu chuyên sâu như nghiên cứu về buôn bán, vận
chuyển gia súc qua biên giới và giữa các tỉnh để đánh giá các yếu tố nguy cơ liên
quan đến xuất hiện các ổ dịch LMLM [11].
Thông tin được thu thập từ 2.753 heo bệnh của 170 hộ chăn nuôi trong đợt
dịch lở mồm long móng (LMLM) vào đầu năm 2011 tại huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền
Giang, từ đó phân tích diễn biến lâm sàng và yếu tố nguy cơ chính liên quan bệnh

LMLM.Virut LMLM được xác định thuộc typ O, topotyp O-PanAsian. Bệnh
LMLM xảy ra trên heo ở các lứa tuổi. Bên cạnh các biểu hiện lâm sàng cổ điển như
nổi mụn nước ở miệng, chân, mõm và vú, heo bệnh LMLM bị chết nhanh với bệnh
tích tim da cọp và tim nhão trên heo ở các lứa tuổi. Tỉ lệ bệnh và tỉ lệ tử vong cao
nhất trên heo con theo mẹ và heo sau cai sữa. Các yếu tố nguy cơ chính đối với dịch
10


LMLM trong mơ hình toán hồi quy logistic được liệt kê từ cao đến thấp: khơng tiêm
phịng heo, gần hộ khác có heo bệnh LMLM, ni heo gần đường giao thơng chính,
có thương nhân đến hộ mua heo hoặc thú y viên ra vào khu vực chăn nuôi trong
khoảng thời gian 21 ngày trước khi xảy ra bệnh LMLM [6].
Năm 2007, Thái Thị Thúy Phượng và Lê Thanh Hòa đã định type virus
LMLM trên heo, bò tại Tiền Giang và Đồng Tháp qua chỉ thị phân tử gene kháng
nguyên 1D-2A-2B (VP1-2A-2B) [8].
Năm 2006, Thái Thị Thúy Phượng và Lê Thanh Hịa đã tách dịng, giải trình
tự và phân tích chuỗi gene từ các mẫu bệnh phẩm từ bò lai và lợn ở Đồng Tháp và
đã phát hiện topotype khác biệt của virus LMLM [9].
Năm 2005, Nguyễn Viết Không và cộng sự đã phát hiện type Asia1 của virus
LMLM tại Khánh Hịa. Như vậy, ở Nha Trang được ghi nhận có 03 type virus
LMLM là O, A và Asia1 [5].
Năm 2004, Tô Long Thành và cộng sự đã phân lập thành công virus LMLM
trên tế bào BHK21. Thiết lập phương pháp RT-PCR với cặp mồi chung 1F/1R đặc
hiệu cho 7 type của virus LMLM gây bệnh LMLM và cặp mồi P33/P38 đặc hiệu
cho type O và đã được xác định virus LMLM phân lập được là virus LMLM type O
[10].
Từ năm 2004, Tạ Hoàng Long và cộng sự đã sử dụng phương pháp LPBE
phát hiện kháng nguyên virut LMLM và phương pháp RT-PCR thông thường để xác
định typ tại 16 ổ dịch và subtyp của 4 chủng đại diện, hồi cứu kết quả định typ ở 49
ổ dịch khác để tìm hiểu nguyên nhân diễn biến phức tạp của dịch LMLM tại một

khu vực (Duyên hải miền Trung). Trong thời gian từ 2003 đến 2010, diễn biến dịch
tại khu vực này không theo quy luật kinh điển 2-3 năm một lần mà xảy ra hàng năm
với tần xuất 0,78 ổ dịch/tỉnh/năm. Diễn biến dịch ngày càng phức tạp do ba nguyên
nhân chính (i) do sự xuất hiện của typ và subtyp mới: typ A xâm nhập 2 lần độc lập,
2 subtyp Asia 1 cũng xuất hiện vào 2 thời điểm khác nhau, (ii) các typ/subtyp mới
xâm nhập có khuynh hướng ngày càng lan rộng (sau 8 năm, typ A đã lan ra 10 tỉnh
và sau 6 năm typ Asia 1 đã có mặt ở 4 tỉnh) gây ra hiện tượng đa nhiễm trong cùng
11


một ổ dịch và (iii) tại một tỉnh/địa phương có sự lưu hành đồng thời của nhiều typ
virut. Các typ/subtyp mới xuất hiện đều có quan hệ họ hàng gần gũi với các typ lưu
hành tại các nước lân cận. Những thông tin này đánh dấu một bước phát triển phức
tạp mới của dịch LMLM, và sự cần thiết sử dụng vacxin LMLM đa giá có khả năng
bảo hộ đối với các typ/subtyp virut LMLM phát hiện trong nghiên cứu này. Việc
giám sát dịch tễ học phân tử của bệnh LMLM, xác định typ/subtyp lưu hành và phát
hiện typ/subtyp mới cần được ưu tiên hàng đầu để nâng cao hiệu quả sử dụng vacxin
[7].
Năm 2003, Hồ Đình Chúc và Ngơ Thanh Long đã sử dụng kit ELISA
CHEKIT-FMD-3ABC để phát hiện trâu bị nhiễm virus Lở mồm long móng, phân
biệt với kháng thể do vacxin LMLM tạo nên. Sau đó Hồ Đình Chúc cũng tiếp tục
nghiên cứu và xây dựng bản đồ dịch tễ về bệnh LMLM [2].
Oem và cộng sự (2005) khi sử dụng phương pháp ELISA kháng nguyên,
phương pháp RT-PCR và giải trình tự đã xác định được 16 trường hợp trâu bò
nhiễm virus LMLM thuộc type O virus tại Hàn Quốc [28]. Từ cuối những năm
1990, virus FMDV type O PanAsia đã gây ra dịch ở Trung Đông, Châu Phi, Anh,
Pháp, Hà Lan và các nước khác ở khắp Châu Âu, Châu Á. Ngược lai, virus FMDV
type O Cathay được phân lập vào năm 1997 tại Đài Loan (O/TAW/97) lại có ký chủ
đặc biệt. Các phương pháp được sử dụng để đánh giá khả năng gây nhiễm và gây
bệnh của FMDV ở trâu bị đã được mơ tả chi tiết trong các tài liệu. Tuy nhiên, các

nghiên cứu về sự truyền và độc tính gây bệnh của virus FMDV trên heo thì cịn hạn
chế [31]. Park và cộng sự (2013) cũng đã sử dụng phương pháp ELISA và RT-PCR
trong đánh giá dịch bệnh lở mồm long móng do type O gây ra ở trâu bị và heo ni
tại Hàn Quốc từ tháng 11/2010 đến 4/2011. Sau 44 ngày kể từ khi trường hợp đầu
tiên được phát hiện, thì số lượng trâu bò bị phát hiện nhiễm virus FMDV là cao nhất
[30]. Olatunde và cộng sự (2015) sử dụng phương pháp realtime RT-PCR (rRTPCR) để chẩn đoán dịch bệnh lở mồm long móng bùng phát Nigeria. Phân tích rRTPCR phát hiện hai mẫu dương tính với giá trị Ct 18.79 và 15.28. Khi đem điện di và
giải trình tự thì xác định được là type A và SAT 2 [29].
12


Daoud và Soliman (2015) đã khảo sát khả năng kháng virus của dịch chiết từ
Spirulina platensis extract đối với virus FMDV (A, O, SAT2) ở tế bào BHK và
chuột. Kết quả cho thấy hàm lượng 50 ug/ml dịch chiết của S. platensis (50 ug/ml)
có tác động làm giảm lượng virus FMDV Type O, A, and SAT2 lần lượt là 35,7%,
28,5%, và 31% ở tế bào BHK. Nghiên cứu này xác nhận hoạt tính sinh học của
ethanol chiết xuất từ S. platensis đối với virus FMD Types O, A, và SAT2. Từ kết
quả trên, S. platensis có thể được sử dụng như là nhân tố giới hạn sự nhiễm bệnh
cho động vật khi dịch bệnh bùng phát. Tuy nhiên cần nghiên cứu sâu hơn để đánh
giá tác động S. platensis trên động vật nhiễm bệnh lở mồm long móng để tính được
liều lượng và tác dụng phụ trong quá trình sử dụng S. platensis [19].

13


CHƯƠNG 2
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung 1: Thiết kế các cặp primer và Taqman probe đặc hiệu để phát
hiện virus FMD
Để lựa chọn các primer, probe, chứng dương thì bộ gen hoàn chỉnh của các
type FMDV bao gồm O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3 đã được thu nhận từ

GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide (với từ khóa “FMDV
complete genome”). Sau đó vùng gen 3D được trích xuất từ các bộ gen này và được
xếp so hàng (alignment) bằng phần mềm ClustalX để tìm ra các vùng bảo tồn giữa
các type FMDV. Trên các vùng bảo tồn này cặp primer FMDVf-FMDVr và Taqman
probe FMDVp được lựa chọn với sự trợ giúp của phần mềm Annhyb. Các
oligonucleotide đã lựa chọn được kiểm tra các đặc tính bằng phần mềm
OligoAnalyzer (IDT DNA). Chứng dương FMDVc được lựa chọn bằng phần mềm
Annhyb. Đây là trình tự nucleotide nằm giữa và bao trọn cặp primer FMDVfFMDVr. Các RNA nucleotide được chèn vào giữa trình tự nucleotide của FMDVc
và có ký hiệu + trước ký hiệu nucleotide.Mẫu chứng dương này được tổng hợp tại
công ty IDT - Mỹ chuyên tổng hợp oligonucleotide.
Bảng 2.1. Trình tự các đoạn oligonucleotide được sử dụng
Tên

Trình tự - sequence

FMDVf

ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA

FMDVr

AGT CCT GCC ACG GAG AT

FMDVp

TCCTTTGCACGCCGTGGGAC

FMDvc

ACTGGGTTTTACAAACCTGTGATGGCTTCGAA

GCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGAC+C+A+TTCC
GTGGCAGGACTCGC

16Sf

GCG ACG ATC CCT AGC TGG TC

14