Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng sinh học từ cây hoa hoè trồng tại việt nam

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ

THÀNH ĐỒN TP. HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 26 tháng 3 năm2009)

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CÓ
TÁC DỤNG SINH HỌC TỪ CÂY HOA HÕE TRỒNG TẠI
VIỆT NAM

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: Th.S. Hoàng Thị Kim Dung
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Cơng nghệ Trẻ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 4/ 2009


ABSTRACT
On the basis of rutin, a type of flavonoid existing in a majority of plants,
particularly in Sophora japonica L., with high content which is present and grows in
many locations in Vietnam, hydrolysis was realised to produce quercetin. From
rutin and quercetin, we were synthesized 10 derivatives in high purity and
determined their structure by using physical chemistry analyses (IR, LC-MS, 1HNMR,

13

C-NMR, HSQC, HMBC). These compounds were tested their biological

activities to compare with rutin and quercetin.
Research results:
1. The

results

of

antibacterial

and

antifungal

characteristics

testing

demonstrated that 3,3’,4’,7-tetrabutylcarbamoyloxy-5-hydroxyflavone (Q-1)
showed a very significant inhibition against E. coli, B. subtilis, S. aureus,
Asp. niger, F. oxysporum, C. albicans but were inactive against P.
aeruginosa, S. cerevisiae.
2. The testing of antioxidant activity showed the combination of the 5-OH
group in the A ring with the 3-OH group in the C ring with the 2,3-double
bond and o-dihydroxy structure in the B ring for maximum radical
scavenging potential ( the structure of quercetin).
3. The result when we tested antiproliferative activity of these products on
HeLa, MCF-7, NCI-H460 tumor cells showed that 3 synthetic compounds
(3,3’,4’,7-tetrabutylcarbamoyloxy-5-hydroxyflavone

(Q-1),

3,3’,4’,5,7-

pentapropionyloxyflavone (Q-5) and 3,3’,4’,5’,7-pentaacetoxyflavone (Q-6))
exhibited antiproliferative activity higher than quercetin, 3,3’,4’,5,7pentamethoxyflavone (Q-9)

and 3’,4’,5,7-tetramethoxy-3-hydroxyflavone

(R-2) have weaker activity, and the others were inactive.
Research results indicate that we could continue the following research steps
to improve the effectiveness of Vietnamese natural compounds in the health sector.

1


TĨM TẮT
Trên cơ sở rutin, một loại flavonoid có trong nhiều loại cây, đặc biệt với hàm
lượng rất lớn trong cây hịe, một loại cây có sẵn và trồng nhiều ở Việt Nam, chúng
tôi thủy phân ra quercetin. Từ rutin và quercetin đã tổng hợp được 10 dẫn xuất có
độ sạch cao, và xác định cấu trúc bằng các phổ IR, LC-MS, 1H-NMR,

13

C-NMR,

HSQC, HMBC. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất này so sánh với
rutin và quercetin.
1. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cho thấy 3,3’,4’,7tetrabutylcarbamoyloxy-5-hydroxyflavone (Q-1) có khả năng ức chế đáng kể
các dòng E. coli, B. subtilis, S. aureus, Asp. niger, F. oxysporum, C. albicans

nhưng lại khơng có khả năng ức chế P. aeruginosa, S. cerevisiae.
2. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa cho thấy việc kết hợp nhóm 5-OH ở
vịng A với nhóm 3-OH ở vịng C với liên kết đơi 2,3 và cấu trúc odihydroxy ở vịng B như quercetin đã mang lại khả năng bắt gốc tự do tốt
nhất.
3. Kết quả thử khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư MCF-7,
HeLa, NCI-H460 cho thấy 3 dẫn xuất là 3,3’,4’,7-tetrabutylcarbamoyloxy-5hydroxyflavone

(Q-1),

3,3’,4’,5,7-pentapropionyloxyflavone

(Q-5)

và

3,3’,4’,5’,7-pentaacetoxyflavone (Q-6) có khả năng gây độc tế bào cao hơn
quercetin,

3,3’,4’,5,7-pentamethoxyflavone

(Q-9)

and

3’,4’,5,7-

tetramethoxy-3-hydroxyflavone (R-2) có khả năng gây độc tế bào yếu hơn
quercetin còn các hợp chất khác khơng có hoạt tính.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có thể thực hiện các bước nghiên cứu
khác tiếp theo nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng của các hợp chất thiên nhiên Việt

Nam trong lĩnh vực phục vụ sức khỏe con người.

2


PHẦN MỞ ĐẦU
Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng sinh học từ cây
hoa hịe trồng tại Việt Nam.
Chủ nhiệm đề tài: Hồng Thị Kim Dung
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 8/2007 – 8/2008
Kinh phí đƣợc duyệt: 70.000.000đ
Kinh phí đã cấp: 63.000.000đ

theo TB số : 120/TB-SKHCN ngày 8 /8

/2007
Mục tiêu: Nghiên cứu điều chế một số dẫn xuất của rutin và quercetin theo
hướng làm tăng khả năng gây độc lên tế bào ung thư từ đó làm cơ sở cho
những nghiên cứu kế tiếp sau này nhằm nâng cao ý nghĩa khoa học và ý nghĩa
thực tiễn của các flavonoid này.
Nội dung:
Công việc dự kiến

Công việc đã thực hiện

- Tổng hợp ≥ 6 dẫn xuất của rutin - Tổng hợp được 10 dẫn xuất
và quercetin
- Xác định cấu trúc của các chất đã - Đã xác định cấu trúc các chất bằng
tổng hợp

IR, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR,
HSQC, HMBC
- Xác định hoạt tính gây độc tế bào - Đã xác định hoạt tính gây độc tế
của các dẫn xuất trên 3 dòng
bào trên 3 dịng HeLa, MCF-7,
HeLa, MCF-7, NCI-H460 có so
NCI-H460 cùng với hoạt tính
sánh với rutin và quercetin
kháng oxy hóa theo phương pháp
DPPH, MDA và hoạt tính kháng
nấm, kháng khuẩn.
- 1 bài báo
- 2 bài báo đăng trên tạp chí Dược
liệu, 1 bài tham gia Hội nghị Hóa
hữu cơ tồn quốc 10/2007

3


XÁC NHẬN CHỈNH SỬA BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 26/3/2009)
Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CÓ TÁC DỤNG

SINH HỌC TỪ CÂY HOA HÒE TRỒNG TẠI VIỆT NAM
Chủ nhiệm đề tài: Th.S. Hồng Thị Kim Dung
Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
TT

Góp ý của Hội đồng

Chỉnh sửa của chủ nhiệm
đề tài

Trang

1

Nên Việt hóa tên các hợp chất

Đã thực hiện

2

Bổ sung đầy đủ quy trình bán tổng Đã bổ sung
hợp các dẫn xuất từ quercetin

3

Bổ sung phần đặt vấn đề

4

Chỉnh sửa lại các thơng tin về cây hoa Đã chỉnh sửa
hịe

18

5

Chỉnh sửa lại thông tin về giá trị SC50

29

6

Mô tả thêm về phương pháp nghiên Đã bổ sung
cứu tác dụng kháng oxy hóa

27,28

7

Tách riêng đề nghị và kết luận

Đã tách

65,66

8

Trình bày lại tài liệu tham khảo

Đã trình bày theo đúng báo
cáo khoa học

Phần phụ
lục

Đã bổ sung

8

Đã chỉnh sửa

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
Giám đốc

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Nguyễn Cơng Tĩnh

Hồng Thị Kim Dung

PHẢN BIỆN 1

PHẢN BIỆN 2

GS.TSKH. Nguyễn Công Hào

TS.Trần Lê Quan

4

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS.Hoàng Minh Châu


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DMSO: dimethyl sulfoxide

DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin
HeLa: dòng tế bào ung thư cổ tử cung
IC50: nồng độ mẫu có khả năng ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào
IR: phổ hồng ngoại
LC-MS: sắc ký lỏng ghép khối phổ
MCF-7: dòng tế bào ung thư vú
MDA: malonyl dialdehyt
MIC: nồng độ ức chế tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần
như hồn tồn
NCI-H460: dịng tế bào ung thư phổi
NMR: cộng hưởng từ hạt nhân
OD: mật độ quang (optical density)
PBS: phosphat buffer salin
SC50: nồng độ mẫu có khả năng bắt 50% gốc tự do
SRB: sulforhodamine B
TE: Tris EDTA
ĐLC: độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cấu trúc của một số dạng flavonoid
Hình 1.2: Cơng thức hóa học của một số flavonoid tự nhiên
Hình 2.1: Các dịng tế bào ung thư thử nghiệm
Hình 3.1: MCF-7 trong mơi trường
Hình 3.2: MCF-7 xử lý với Camptothecin
Hình 3.3: MCF-7 xử lý với Q-6 (80ppm)
Hình 3.4: MCF-7 xử lý với Q-9 (80ppm)
Hình 3.5: MCF-7 xử lý với Q (80ppm)
Hình 3.6: MCF-7 xử lý với R (400ppm)

5

Trang
12
13
24
55
55
55
55
55
55


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại và một số nguồn thực phẩm chứa flavonoid
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-1
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-2
Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-3
Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-4
Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-5
Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-6
Bảng 3.8: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-9
Bảng 3.9: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-10
Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Q-11
Bảng 3.11: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất R-2
Bảng 3.12: Kết quả ức chế DPPH (%) theo nồng độ của các
flavonol và dẫn xuất
Bảng 3.13: Kết quả tính SC50 của các mẫu có hoạt tính
Bảng 3.14: Kết quả tính SC50 của các mẫu có hoạt tính

Bảng 3.15: Kết quả thử khả năng gây độc tế bào trên dòng HeLa
của các flavonol và dẫn xuất
Bảng 3.16: Kết quả thử khả năng gây độc tế bào trên dòng MCF-7
của các flavonol và dẫn xuất
Bảng 3.17: Kết quả thử khả năng gây độc tế bào trên dòng NCIH460 của các flavonol và dẫn xuất
Bảng 3.18: Kết quả phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7
theo nồng độ của Q
Bảng 3.19: Kết quả phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7
theo nồng độ của Q-1
Bảng 3.20: Kết quả phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7
theo nồng độ của Q-5
Bảng 3.21: Kết quả phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7
theo nồng độ của Q-6
Bảng 3.22: Kết quả phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7
theo nồng độ của Q-9
Bảng 3.23: Kết quả phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7
theo nồng độ của R-2
Bảng 3.24: Kết quả trọng lượng phân tử và tính tốn logP
Bảng 3.25: Kết quả thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của các
flavonol và dẫn xuất

6

Trang
14
36
37
39
40
41

42
44
45
46
48
49
50
51
52
55
56
56
57
58
58
58
59
59
62
64


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Trang
Đồ thị 3.1: Khả năng ức chế DPPH theo nồng độ của Vitamin C
50
Đồ thị 3.2: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của mẫu R-2
51
Đồ thị 3.3: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của Rutin
50

Đồ thị 3.4: Khả năng ức chế DPPH (%) theo nồng độ của Quercetin
51
Đồ thị 3.5: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của Trolox
52
Đồ thị 3.6: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của R-2
52
Đồ thị 3.7: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của Rutin
52
Đồ thị 3.8: Hoạt tính chống oxy hóa (%) theo nồng độ của Quercetin
52
Đồ thị 3.9: Kết quả giá trị SC50 ( g/ml) của một số flavonol và dẫn xuất 53
53
Đồ thị 3.10: Kết quả giá trị SC50 ( g/ml)
Đồ thị 3.11: Khảo sát khả năng khả năng gây độc tế bào (%) của các 57
flavonol và dẫn xuất ở nồng độ 100 g/ml
Đồ thị 3.12: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Q
60
Đồ thị 3.13: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Q-6
60
Đồ thị 3.14: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Q
60
Đồ thị 3.15: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Q-9
60
Đồ thị 3.16: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu Q-5
60
Đồ thị 3.17: Tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo nồng độ của mẫu R-2
60
Đồ thị 3.18: Kết quả giá trị IC50 ( g/ml) của một số flavonol và dẫn xuất 61

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Xử lý nguyên liệu
Sơ đồ 2.2: Tổng hợp các dẫn xuất ester của quercetin
Sơ đồ 2.3: Tổng hợp các dẫn xuất ether của quercetin
Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết Rutin
Sơ đồ 3.2: Quy trình thủy phân Rutin thành Quercetin

7

Trang
23
26
27
34
35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải ngày càng
cao đã đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìm kiếm các
chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên do
khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn trong sử dụng cao để ứng dụng
trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan y, và hiện nay họ flavonoid nhận
được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới do chúng ln có mặt
trong các loại thực phẩm hàng ngày của con người, các nghiên cứu cho thấy
các chất thuộc họ này không gây độc cho cơ thể dù dùng ở liều cao và khi sử
dụng kết hợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảm
tác dụng phụ của các loại thuốc này. Rất nhiều các hợp chất được chiết tách
đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợp chất tổng hợp và bán
tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra trên rất nhiều phịng thí nghiệm trên
thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc, các chất hóa học có tác dụng mạnh

hơn và ít độc hại hơn đối với cơ thể người bệnh.
Trên cơ sở đó, chúng tơi đề ra hướng nghiên cứu cho đề tài là tiến hành
tổng hợp dẫn xuất của rutin, một hợp chất có hàm lượng cao trong cây hoa
hịe ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng nhằm có
được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác sau
này đồng thời hy vọng có thể tìm thêm được những hợp chất mới có khả năng
ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y dược.

8


CHƢƠNG I- TỔNG QUAN
Flavonoid là một nhóm bao gồm khoảng 4000 hợp chất tự nhiên hiện
diện trong nhiều thành phần của cây cối cũng như trong các loại rau quả:
[11][18]
- Hoa: có nhiều màu sắc và bao gồm nhiều thành phần như anthocyanin,
flavon, flavonol, flavanon, chalcon và auron; anthocyanin cho hoa có
màu đậm và tươi, polyhydroxyflavon và flavonol thì lại làm cho hoa có
ánh vàng, những bơng hoa có màu sắc rực rỡ lại do sự có mặt của
chalcon và auron... Hoa là thành phần thích hợp nhất để chiết flavonoid
do hàm lượng nhiều và ít tạp chất.
- Vỏ quả: do có nhiều màu sắc nên cũng là thành phần được nghiên cứu
nhiều, chúng có thể chứa tangeretin, naringin, rhoifolin, hesperidin,
nobiletin… từ các vỏ quả họ cam chanh.
- Hạt: chứa hydroxyflavone, các methyl ether của chúng, glycozit,
furanoflavonoid, các dẫn xuất rotenoid và leucoanthocyanidin.
- Lá
- Gỗ, rễ và vỏ cây
Ngoài ra các loại nước uống như rượu vang đỏ, trà, cà phê, bia hay cả
trong các bài thuốc dân gian cũng được tìm thấy có chứa một lượng lớn

flavonoid. Người ta dự đoán con người tiêu thụ tổng lượng flavonoid trong
thực phẩm vào khoảng vài trăm milligram mỗi ngày. [26]
Với sự đa dạng như vậy, flavonoid là một hợp chất quan trọng khơng
những đối với cây cỏ mà cịn đối với các loài động vật bao gồm cả con người.
1.1-

CẤU TRÚC VÀ PHÂN LOẠI CÁC FLAVONOID:
Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3-

diphenylpropan nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3
carbon hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với
nhau qua một mạch 3 carbon ( C6-C3-C6). Cấu trúc là một vịng kín hoặc mở.
9


Cách đánh số tùy theo dây carbon đóng hay mở. Nếu dây carbon đóng,
thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxy mang số 1 rồi đánh tiếp
đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây carbon mở, thì đánh số chính
trên vịng B và đánh số phụ trên vòng A.
4'

5'
A

3'

3

2
6' OH

1

7

4

B

A

1'
6

8

5

6

2'

3'

2'
O
1 2
3
4

1'

4'

B
6'

5'

5
O

O

Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên
nhân A và ở vị trí 3; 4; 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng
tự do hoặc dạng glycozit. Các đường thường gặp nhất là đường D- glucoz; kế
đó là D-galactoz; L-Rhamnoz; L-Arabinoz; D-Xyloz; D-Apioz và acid
Uronic.
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vịng B) và các mức
độ oxy hóa của mạch 3 carbon (hình 1.1):
- Flavon
Flavon có cấu trúc chung 2 vịng benzen A và B. Vòng B gắn vào vòng
C (pyran) qua dây nối ở C2.
- Flavanon
Flavanon khác với flavon ở chỗ khơng có nối đơi ở vị trí C2 và C3. Tất
cả các flavanon được phát hiện cho đến nay đều có nhóm OH ở vịng A hoặc
B.
- Flavonol
Khác với flavon là có thêm nhóm OH ở C3. Flavonol rất phổ biến trong

tự nhiên.
Thống kê trên 1000 lồi thuộc thực vật hạt kín thì thấy 48% lồi có
kaempferol, 26% lồi có quercetin và myricetin chiếm 10% trong tổng số lồi
có flavonol.

10


- Dihydroflavonol
Cấu trúc cơ bản giống flavonol nhưng khơng có nối đơi C2-C3. Cịn gọi
là 3-hydroxyflavanol hoặc flavanol.
- Chalcon
Chalcon có 2 vòng A và B nối với nhau bởi 1 mạch hở 3 carbon, khơng
có dị vịng như các flavonoid khác và số thứ tự carbon bắt đầu từ vòng B.
- Dihydrochalcon
Là chalcon mất dây nối đôi , . Loại này ít gặp trong tự nhiên.
- Auron
Là nhóm flavonoid có màu vàng sáng. Khung của auron cũng có 12
carbon như các flavonoid khác, nhưng dị vịng C chỉ có 5 cạnh. Số lượng
cũng như sự phân bố trong cây cũng hạn chế.
- Anthocyanidin
Về cấu trúc, nhóm này khác các flavonoid khác ở chỗ khơng có nhóm
carbonyl ở C4.
- Leucoanthocyanidin
Là 3,4-diol flavan, khơng màu, nhưng gặp acid biến thành
anthocyanidin có màu hồng hoặc đỏ, rất phổ biến trong cây, nhất là trong vỏ
cây và gỗ.
- Isoflavon
Là nhóm isoflavonoid phổ biến nhất .
- Rotenoid

Người ta đã biết khoảng 15 chất rotenoid, chất điển hình nhất là
Rotenon có trong cây thuốc cá Derris elliptica. Tác dụng quan trọng của
nhóm hợp chất này là diệt sâu bọ, do hạn chế khả năng thu nhận oxy của sâu
bọ.
- Neoflavonoid
Chất đầu tiên phân lập là calophylolid chiết từ hạt cây Mù u
Calophyllum inophyllum và một số loài Calophyllum khác, họ Guttiferae.
11


Hình 1.1: Cấu trúc của một số dạng flavonoid

12


Hình 1.2: Cơng thức hóa học của một số flavonoid tự nhiên

13


Bảng 1.1: Phân loại và một số nguồn thực phẩm chứa flavonoid [26]
Nhóm
flavonoid
Flavonol

Các flavonoid tiêu biểu
Kaempherol,

myricetin,

Nguồn thực phẩm chính
cung cấp
rutin, Hành, anh đào, táo, bông
cải xanh, cải xoăn, cà chua,

quercetin

trà, rượu vang đỏ, …
Flavon

Apigenin, chrysin, luteolin

Isoflavon

Daidzein,

genistein,

Mùi tây, cỏ xạ hương…

glycitein, Đậu nành, các loại đậu…

formononetin
Táo, trà…

Flavanol

Catechin, gallocatechin

Flavanon

Eriodictyol, hesperetin, naringenin Cam, nho…

1.2-

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID

1.2.1- Vai trị của flavonoid đối với cây cỏ [18], [19]
Các flavonoid đóng một vai trị quan trọng trong q trình sinh trưởng,
phát triển và tự vệ của cây:
- Trong các phản ứng sinh hóa: Các nhóm phenol của flavonoid có vai
trị trong sự hịa tan các chất vì di chuyển dễ dàng qua các màng sinh
lý. Một số flavonoid có tác dụng như một chất chống oxy hóa, bảo vệ
acid ascorbic, một thành phần quan trọng trong tế bào thực vật. Một số
có tác dụng ức chế các enzyme và các chất độc của cây.
- Vai trị ức chế và kích thích sinh trưởng: Nhiều cơng trình nghiên cứu
về tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây của flavonoid. Nhóm
chức hydroxy có vai trị quyết định về tác dụng này. Ví dụ: trong cây
ổi, các flavonoid có nhóm OH ở vị trí 4’ làm tăng cường hoạt tính của
enzyme trong khi các flavonoid có OH ở 3’ và 4’ lại có tính ức chế.
Flavonoid cịn tham gia vào sự hơ hấp quang hợp.

14


- Vai trị tạo màu sắc: Flavonoid đóng vai trị tạo màu sắc hấp dẫn cho
cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả. Sâu
bọ, nhờ hệ thống thị giác đặc biệt, chúng rất nhạy cảm đối với màu sắc
của cây cỏ. Thực nghiệm cho thấy các lồi ong thích màu xanh và màu
vàng, các lồi bướm thích màu hồng và màu trắng, các lồi ruồi thích

màu trắng, cịn các lồi chim sâu lại thích màu đỏ. Trong việc tạo màu,
các flavone, flavonol, aurone, chalcone cho màu vàng trong khi các
anthocyanin cho các màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm.
- Vai trị một chất bảo vệ cây: Một số flavonoid khơng màu trong lá
đóng vai trò một chất bảo vệ cây, ngăn trở đối với các động vật ăn cỏ.
Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm cho động vật khi ăn phải mất
cảm giác ngon và khơng thích ăn các loại cây cỏ này. Ngoài ra, do khả
năng hấp thụ mạnh tia UV mà các flavonoid giúp bảo vệ cây chống lại
các tác hại của tia UV, nhiệt độ,…Chúng còn giúp cây chống lại một số
vi khuẩn, nấm.
1.2.2- Tính chất dƣợc lý của flavonoid
Flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học mà dù ở nồng độ cao cũng không
gây độc cho cơ thể như khả năng kháng oxy hóa, kháng khối u, kháng viêm,
kháng dị ứng và là tác nhân bảo vệ gan. Vì vậy, nghiên cứu về hoạt tính của
các flavonoid ln nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học đặc
biệt là nghiên cứu về khả năng kháng khối u của flavonoid.
1.2.2.1- Khả năng kháng oxy hóa của flavonoid [2]
Các flavonoid là các chất kháng oxy hóa tự nhiên. Các flavonoid có khả
năng bắt các gốc gây oxy hóa như superoxide anion, các gốc hydroxyl,
peroxy.
1.2.2.2- Tác nhân chống ung thƣ
Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ở mức độ in vitro và
in vivo cũng như các nghiên cứu về dịch tễ học đề cập đến vai trò của
flavonoid ở khẩu phần ăn hàng ngày trong việc ngăn ngừa ung thư, một số sự
15


kết hợp trong điều trị được đề cập đến đối với thực phẩm giàu flavonoid như
sử dụng đậu nành và ung thư vú thời kỳ tiền mãn kinh, trà xanh và ung thư
bao tử, hành và ung thư phổi [15]…Vì vậy, hiểu biết thêm về khả năng chống

ung thư của các loại thực phẩm này sẽ giúp bổ sung thói quen trong ăn uống
của chúng ta.
Ngoài ra, bên cạnh các flavonoid tự nhiên thì các flavonoid tổng hợp là
những ứng cử viên cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai, một số
các hợp chất này đang ở trong giai đoạn thăm dò lâm sàng như flavopiridol,
5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid, phenoxodiol hay silybin,… [27]
Cơ chế kháng ung thư của flavonoid
- Flavonoids là tác nhân ngăn ngừa về mặt hóa học
Năm 1996, Calomme M và đồng nghiệp phát hiện flavonoid họ Cam có
khả năng ức chế sự đột biến của vi khuẩn [27]. Các thí nghiệm cho thấy
tangeretin kháng lại tất cả các thử nghiệm trên các chất gây đột biến gián tiếp,
còn nobiletin lại kháng sự đột biến do benzo[a]pyrene và 2-aminofluorene
gây ra. Do tính chất này mà các flavonoid họ Cam (đặc biệt là tangeretin và
nobiletin) đóng vai trị quan trọng trong việc ngăn ngừa ung thư về mặt hóa
học….
- Flavonoid ức chế sự phát triển hoặc sự tăng sinh của tế bào ung thư:
Lee và đồng nghiệp [14] đã thử khả năng gây độc tế bào của 6
isoflavonoid, trong đó tectorigenin và genistein đã thể hiện khả năng gây độc
tế bào trên các tế bào ung thư ở người và genistein gây chết tế bào theo
chương trình bằng cách biến đổi DNA. Năm 2002, Manthey và Guthyie [16]
nghiên cứu tác động của flavonoid họ Cam lên 6 dòng tế bào ung thư ở người.
Họ thấy rằng các hợp chất tổng hợp có khả năng ức chế sự tăng sinh mạnh
tương tự như các hợp chất trong tự nhiên (nhiều hợp chất có IC50 < 10µM).
Cũng trong năm 2005, Zheng và đồng nghiệp [20] đã có báo cáo đầu tiên về
khả năng gây cảm ứng apoptosis của apigenin …..

16


- Flavonoid là tác nhân chống lại sự xâm nhập, sự bám dính và sự phát

triển mạch:
Rooprai vào năm 2001 [21] đã phát hiện ra ảnh hưởng của 4 tác nhân
chống lại sự xâm nhập trong đó có tangeretin và nobiletin dựa trên các thông
số về sự xâm nhập qua khối u não, nobiletin có hiệu quả ức chế tốt nhất sự
xâm nhập, di chuyển và bám dính trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm. Năm
2003, Tan WF [25] đã cho thấy quercetin có khả năng chống lại sự phát triển
mạch, sau đó Ma cũng đã tìm thấy tamoxifen ức chế khối u tuyến tiền liệt
CWR22 bằng cách phân hóa sự phát triển mạch và chống lại các mơ ung thư
mới khi sử dụng kết hợp với quercetin.
- Các dẫn xuất flavonoid có tác dụng ngăn ngừa tác dụng phụ của
doxorubicin:
Năm 2000, Van Acker [8] đã tìm ra rằng khi uống 500mg/kg 7monohydroxyethylrutoside một giờ trước khi dùng doxorubicin sẽ bảo vệ cơ
thể của bệnh nhân ung thư chống lại tác hại gây độc cho tim, năm 2001, họ đã
tìm ra được một số dẫn xuất flavone có thể là tác nhân bảo vệ tim tốt hơn sử
dụng cho phương pháp điều trị ung thư bằng doxorubicin [9] ….
1.2.2.3- Khả năng kháng viêm
Do khả năng của flavonoid ức chế lại sự tạo thành các chất trung gian
của quá trình viêm như prostaglandin, leukotrien hoặc nitric oxide… [10]
1.2.2.4- Vai trò trong phòng ngừa và điều trị bệnh tim
Các flavonoid kháng oxy hóa có mặt trong các loại quả, rau, trà và rượu
vang đều có khả năng ức chế sự oxy hóa của LDL (low-density lipoprotein)
do khi bị ảnh hưởng tác động LDL sẽ gây ra bệnh tim. Các nghiên cứu cho
thấy rượu vang đỏ và các loại thực phẩm giàu flavonoid làm giảm nguy cơ
bệnh tim động mạch vành. [10]
1.2.2.5- Flavonoid ức chế các enzym
Một số flavonoid thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế các enzym là
chìa khóa cho sự hô hấp của các ty thể, ức chế NADH (Nicotinamid adenin
17

dinucleotit – coenzym trong cơ thể có mặt ở các phản ứng oxy hóa khử). Một
số flavonoid cịn có khả năng ức chế enzym oxy hóa xanthin, là enzym xúc
tác cho q trình oxy hóa xanthin và hypoxanthin thành acid uric. [10]
1.2.2.6- Các hoạt tính khác của flavonoid
Flavonoid có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống dị ứng, chống
loét, và là tác nhân bảo vệ gan [10].
1.3- XÁC ĐỊNH ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Cây hịe là một loại cây có vùng nguyên liệu khá lớn trong nước, lượng
nụ hòe chủ yếu chỉ để làm phẩm màu, sắc uống hoặc cung cấp cho các cơng
ty dược để chiết rutin. Vì vậy, trên cơ sở các tính chất dược lý của flavonoid
và nguồn ngun liệu có sẵn trong nước mà chúng tơi chọn nguồn nguyên
liệu ban đầu là hoa hòe để tiến hành chiết tách và sau đó là bán tổng hợp các
hợp chất có được, xác định các tác dụng sinh học của chúng nhằm góp phần
nghiên cứu thêm về các hợp chất này cũng như nâng cao khả năng sử dụng
nguồn ngun liệu thiên nhiên có sẵn trong nước.
1.3.1- Hoa hịe và rutin [5]
Cây hoa hòe mọc ở nhiều nước trên thế giới nhất là ở khu vực châu Á.
Ở nước ta hoa hịe được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc như Hà Nội, Sơn La,
Thái Bình,… với một lượng khá dồi dào có thể đáp ứng nhu cầu lớn trong sản
xuất các sản phẩm dược.
Trong cây hòe chứa 6-35% rutin tùy thuộc vào từng phần của cây (nụ
hòe 30 - 35%, vỏ quả 0,5%, lá cây 4,4%). Ngoài cây hịe, cịn có một số loại
cây thuộc các họ thực vật khác nhau có chứa rutin nhưng với hàm lượng thấp
hơn.
Khi nói đến hoa hịe, người ta nghĩ ngay đến rutin. Rutin là một loại
vitamin P có tác dụng rất quý, giúp tăng cường sức bền của mao mạch (thành
mạch máu), làm giảm tính “dịn” và tính thấm của mao mạch. Khi thủy phân
rutin sẽ cho quercetin, glucoz và rhamnoz. Rutin cịn có tác dụng rất tốt trong
18

phác đồ điều trị các bệnh viêm gan siêu vi B, C và giúp tăng cường sức đề
kháng cho những người có cơ địa gầy yếu, suy nhược cơ thể, lao sơ nhiễm...
Như vậy rutin có hàm lượng khá lớn trong nụ hoa hịe, do đó chúng tơi
tiến hành chiết rutin trong nụ hoa hòe để làm nguyên liệu cho cả quá trình
nghiên cứu sau này.
1.3.2- Quercetin
Quercetin là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều lồi cây
thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốc nhuộm tự
nhiên….
Trong những năm gần đây, quercetin được nghiên cứu rộng rãi trên thế
giới do nó có hoạt tính mạnh so với các loại flavonoid khác. Tuy nhiên nguồn
quercetin có sẵn trong thiên nhiên tương đối thấp, địi hỏi q trình trích chiết
lâu dài và kém hiệu quả do đó người ta đã sử dụng phương pháp thủy phân
rutin, một loại flavonoid có hàm lượng cao trong một số loại cây để tạo ra
quercetin. Phương pháp này đặc biệt phù hợp với điều kiện của Việt Nam, là
nơi trồng nhiều cây Hịe, loại cây có hàm lượng rutin lên đến 30%. Vì vậy,
trong khn khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp thủy
phân rutin thành quercetin để tạo ra nguyên liệu ban đầu cho các phản ứng
tổng hợp tiếp theo.
 Một số tác dụng dược lý của quercetin [3], [4], [6], [7], [13], [23]
 Quercetin làm giảm nguy cơ ung thư
Quercetin giúp làm giảm nguy cơ phát triển của ung thư. Được nhận
biết như là một phytoestrogen, Quercetin có khả năng kháng estrogen đưa
đến làm giảm nguy cơ ung thư. Ở liều thấp, quercetin là một tác nhân hiệu
quả trong ngăn ngừa ung thư da do khóa ( block ) các chất gây chuyển hóa tế
bào. Hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư và hoạt tính chống sự tăng
sinh là do thơng qua tương tác liên kết với type II estrogen binding site ( type
II EBS ).

19


Nghiên cứu hơn 200 loại flavonoid cho thấy quercetin làm tăng tuổi
thọ của chuột bị bệnh bạch cầu. Là chất ái điện tử, quercetin kềm chế hoạt
tính của O và làm mất hoạt tính của các chất gây ung thư hoặc làm giảm
tối thiểu khả năng sinh học của các chất gây ung thư. Một số thử nghiệm
trong ống nghiệm và trên tế bào cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế
bào bệnh bạch cầu và triển vọng cho thấy có thể sử dụng quercetin trong điều
trị bệnh bạch cầu cấp tính.
Một cuộc nghiên cứu cho thấy những người thường xuyên ăn táo (chứa
nhiều quercetin ) có tỉ lệ ung thư phổi thấp hơn 58% so với những người
không thường xuyên ăn táo. Những người ăn thực phẩm giàu quercetin và
các loại flavonoid khác có tỉ lệ ung thư bao tử, phổi, tụy và vú thấp.
 Quercetin giúp ngăn ngừa bệnh tim
Quercetin bảo vệ giúp LDL ( low-density lipoprotein ) cholesterol
không trở nên nguy hiểm. Các phản ứng oxy hóa là những phản ứng sinh học
cơ bản cần thiết cho sự hình thành các hợp chất năng lượng cao sử dụng trong
các q trình chuyển hóa, nhưng đồng thời cũng gây tổn thương cho các tế
bào khi tạo ra quá nhiều. Các mô da đặc biệt nhạy cảm với nguy cơ từ các
gốc oxy hoạt hóa, sự oxy hóa LDL khơi mào là do các bệnh làm giảm sự trao
đổi chất, viêm nhiễm, các yếu tố môi trường hay tuổi tác… Quercetin và rutin
có khả năng ức chế sự peroxy hóa LDL, nguyên nhân gây ra sự nhiễm độc tế
bào.
Một nguyên nhân nữa gây ra bệnh tim mạch là sự phát triển quá mức
của các tế bào cơ mềm ở thành động mạch. Quercetin có khả năng ngăn chặn
sự phát triển này bằng cách khóa các tế bào lại ở trạng thái khơng phát triển.
Quercetin cịn có khả năng ức chế sự tích tụ các tiểu huyết cầu gây đơng máu,
ức chế sự peroxy hóa chất béo, giãn nở và tăng độ bền thành mạch máu …
 Là chất chống oxy hóa và đồng thời cũng là chất tăng cường sự oxy hóa

Quercetin là chất có khả năng chống lại sự oxy hóa cao để ức chế các
gốc tự do trong tế bào ở 3 mức độ khác nhau:
20


. bắt giữ, loại bỏ O2 . ức chế quá trình peroxy hóa chất béo bằng phản ứng với các gốc
peroxyl và peroxyl béo.
. ức chế sự hình thành OH bằng cách tạo chelat với ion Fe.
Khả năng chống oxy hóa của quercetin là do cấu trúc của nó. Quercetin
thể hiện khả năng chống oxy hóa và tăng cường oxy hóa phụ thuộc vào nồng
độ và nguồn gốc của các gốc tự do. Do đó quercetin vừa bảo vệ tế bào khỏi
nguy hiểm do sự oxy hóa và nhiễm độc của các gốc tự do lại vừa có thể là tác
nhân gây nhiễm độc tế bào.
Ảnh hưởng lên tính nhất quán trong cấu trúc của ADN: trong điều kiện
hiếu khí và có mặt ion Cu2+, Fe3+, sự tự oxy hóa của quercetin hình thành nên
H2O2, được xem là chất gây đứt và làm thay đổi ADN. Quercetin tương tác
với ADN và trong điều kiện kéo dài có thể gây phá vỡ cấu trúc xoắn ốc kép.
Tuy nhiên, khi có mặt các chất chống oxy hóa như mannitol hay catalaz,
ADN được bảo vệ khỏi ảnh hưởng của quercetin. Ngược lại khi có mặt các
chất chống oxy hóa như glutathion và diallyl sulfit lại kích thích ảnh hưởng
lên ADN. Hoạt tính tăng sự oxy hóa của quercetin cũng làm tăng sự peroxy
hóa chất béo trong gan chuột, đặc biệt khi có mặt ion Fe3+. Q trình peroxy
hóa chất béo bởi quercetin bị ức chế khi có mặt mannitol và glutathion,
catalaz khơng ảnh hưởng cịn superoxit dismutaz, acid ascorbic và diallyl
sulfit lại kích thích q trình này. Điều này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa
hay tăng oxy hóa của quercetin phụ thuộc vào trạng thái oxy hố khử trong
mơi trường của nó.
 Hoạt tính kháng viêm, kháng virus
Quercetin có khả năng ảnh hưởng lên sự tổng hợp acid nucleic:
quercetin có khả năng ức chế hoạt động của polymeraz ARN của chuột và

polymeraz ARN, ADN của vi khuẩn và thực khuẩn.
Quercetin có thể ức chế sự tổng hợp leukotrien và sự phóng thích
histamin, bắt giữ các peroxyt do đó làm giảm viêm. Cơ thể con người sản xuất
21


ra histamin gây hắt hơi, chảy nước mũi… Là một chất kháng histamin,
quercetin còn hiệu quả hơn các chất kháng histamin truyền thống do không
gây các phản ứng phụ như cơ thể mệt mỏi, buồn ngủ…, hiệu quả trong điều
trị bệnh hen suyễn. Là một chất kháng viêm, quercetin ngăn ngừa viêm loét
dạ dày.
 Đối với bệnh đục thủy tinh thể
Tia tử ngoại (UV), đặc biệt là tia UVB gây nguy hiểm cho protein trong
trịng mắt. Quercetin có khả năng khóa một loạt enzym gây ra việc tích tụ
sorbitol, một dạng đường góp phần hình thành bệnh đục thủy tinh thể mắt.


Một số nghiên cứu mới đây cho thấy quercetin và một số dẫn xuất của

nó có khả năng ứng dụng trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh suy thối
xương.
Đa số các nghiên cứu cho thấy khơng có bằng chứng nào chứng tỏ
quercetin là chất có thể gây những biến đổi về mặt sinh học. Vì vậy, nó được
ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm, y học và dược học và được
sử dụng trong mỹ phẩm.
Quercetin có khả năng là nguyên liệu ban đầu trong các chương trình
nghiên cứu phát triển về thuốc. Ảnh hưởng tích cực của quercetin lên các tế
bào ung thư đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu tổng hợp cũng như thử nghiệm các
dẫn xuất của quercetin để nhằm tìm kiếm các tác nhân chống ung thư hiệu
quả nhất và đã đạt được một số kết quả khả quan. Các kết quả tương tự có thể

đạt được trong q trình phát triển các tác nhân chống tích tụ các tiểu huyết
cầu, kháng virus, kháng viêm…dựa trên nền tảng của quercetin.
1.4- MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:
Mục tiêu của đề tài là tổng hợp các dẫn xuất của rutin và quercetin và
xác định các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và khả năng
gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này để từ đó làm cơ sở khoa học cho
các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa vào sử dụng các flavonoid và dẫn xuất của
chúng cho các ngành y tế, thực phẩm.
22


CHƢƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1-

NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT:
Hoa hòe được mua và đem về xử lý:
Nguyên liệu

Loại tạp
(cành, hoa, đất…)

Sấy khô (50-60oC)

Nghiền mịn

Nguyên liệu
dạng bột

Sơ đồ 2.1: Xử lý nguyên liệu
Các hóa chất tổng hợp:

- Anhydric acetic

Merck

- n-butyl isocyanat

Merck

- Thiophene-2-carboxylic acid chlorid

Merck

- Propionyl chlorid

Merck

- Benzoyl chlorid

Merck

- Dimethyl sulfat

Merck

- Benzyl bromid

Merck

- 1-brompropan

Merck

- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

Sigma
23


- L(+) axit ascorbic

Merck

- Etanol absolut

Prolabo

- Dimethyl sulfoxid

Merck

- Dimethyl formamid

Prolabo

- Sắc ký cột sử dụng Kieselgel 60 F254 (0.063-0.200mm)

Merck

- Sắc ký bản mỏng 25 DC-Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254
Merck

Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dùng trong tổng hợp hữu cơ và
phân tích:
-

Pyridin

-

Acetonitril

-

Etanol

-

Sodium chlorid

-

Metanol

-

Sodium carbonat

-

Aceton

-

Sodium hydroxit

-

Chloroform

-

Potassium carbonat

-

Petroleum eter 60-90

-

Sulfuric axit

-

Dietyl eter

-

Hydrochloric axit

-

Etyl acetat
Vật liệu sinh học và hóa chất dùng trong các thử nghiệm hoạt tính:

- Sử dụng ba dòng tế bào ung thư người là MCF-7 (ung thư vú), HeLa (ung
thư cổ tử cung), NCI-H460 (ung thư phổi) trong sàng lọc tính gây độc tế
bào (hình 2.1). Đây là những dòng tế bào được Viện Ung thư Quốc gia
Hoa Kỳ (NCI) sử dụng trong sàng lọc ban đầu và chúng cũng tương ứng
với một số dạng ung thư phổ biến hiện nay.

Hình 2.1: Các dịng tế bào ung thư thử nghiệm
24