Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu chuyển gen echb1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai up (eucalyptus urophylla x e pellita) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.47 MB, 106 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Việt Hà
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI
SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E.
pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Hà Nội - 2021
Luận văn thạc sỹ Sinh học
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Việt Hà
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI
SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E.
pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS. Trần Hồ Quang
Hƣớng dẫn 2: TS. Lê Sơn
Hà Nội - 2021
Luận văn thạc sỹ Sinh học
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu
của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Hồ Quang và TS. Lê Sơn. Mọi
kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có) đều đƣợc
trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ tại bất kỳ
một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công bố trên
bất kỳ phƣơng tiện nào.
Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2021
Ngƣời cam đoan
Nguyễn Thị Việt Hà
Luận văn thạc sỹ Sinh học
Lời cảm ơn
Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học và Cơng nghệ, phịng Đào tạo, các
thầy giáo, cơ giáo tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận
lợi giúp đỡ tơi trong q trình học tập tại trƣờng.
Tơi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên
cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, cùng tồn thể các cán bộ Bộ
mơn Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hƣớng dẫn, TS. Trần Hồ
Quang (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam) và TS. Lê Sơn (Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tận tình hƣớng dẫn,
giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Luận văn đƣợc sử dụng một phần số liệu và kết quả từ đề tài cấp Nhà
nƣớc “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ
(giai đoạn 2)” do ThS. Trần Đức Vƣợng làm chủ nhiệm, thuộc Chƣơng trình
trọng điểm phát triển và ứng dụng Cơng nghệ sinh học trong Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn đến 2020 mà Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh
học Lâm nghiệp là đơn vị thực hiện. Xin chân thành cám ơn.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè
đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tơi trong suốt thời gian học tập và thực hiện
đề tài.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Học viên
Nguyễn Thị Việt Hà
Luận văn thạc sỹ Sinh học
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
STT
Từ viết tắt
Viết đầy đủ
1.
AS
Acetosyringone
2.
BAP
3.
CNSH
4.
ĐC
5.
ĐHST
Điều hịa sinh trƣởng
6.
ADN
Acid Deoxyribonucleic
7.
IBA
Indole-3-Butyric Acid
8.
IFTIB
9.
Km
Kanamycin
10.
LB
Mơi trƣờng ni cấy Luria and Betani
11.
MS
Môi trƣờng nuôi cấy Murashige & Skoog
12.
NAA
13.
OD
Mật độ quang học (Optical Density)
14.
PCR
Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain
Reaction)
6-Benzyl Amino Purine
Công nghệ sinh học
Đối chứng
Institute of Forest Tree Improvement and
Biotechnology
1-Naphthyl Acetic Acid
Luận văn thạc sỹ Sinh học
Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Các loài bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens ................................................................................................. 27
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 40
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 40
Bảng 2.3. Chu trình phản ứng PCR................................................................. 40
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin .......... 42
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ .. 44
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo .......................... 45
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ
mẫu tạo mô sẹo................................................................................................ 47
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh ........................ 49
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo ................ 50
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo........................................................................................................ 52
Bảng 3.8. Khả năng sống sót của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ....... 56
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi chuyển gen sau các lần
chọn lọc ........................................................................................................... 59
Bảng 3.10. So sánh hình thái thân giữa cây chuyển gen với cây đối chứng... 60
Bảng 3.11. So sánh hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng ........ 61
Bảng 3.12. Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của cây con ngoài vƣờn ƣơm sau
1, 2 và 3 tháng.................................................................................................. 63
Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 2 tháng tuổi ........ 64
Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 3 tháng tuổi ........ 65
Luận văn thạc sỹ Sinh học
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5 nƣớc
trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới .................................................... 7
Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen toàn cầu ..... 9
Hình 1.3. Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm tại Yên Bình – Yên Bái ........ 21
Hình 1.4. Cây con Bạch đàn lai UP bằng phƣơng pháp nhân giống in vitro .. 23
Hình 2.1. Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng trong chuyển gen ...................... 31
Hình 2.2. Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 ............................................. 32
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho Bạch đàn lai UP
......................................................................................................................... 34
Hình 2.4. Vị trí các lá đƣợc chọn để đánh giá hình thái ................................. 38
Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa
chuyển gen....................................................................................................... 43
Hình 3.2. Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mô sẹo trên mơi trƣờng chọn lọc .. 45
Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ ................... 48
Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút, 20
phút .................................................................................................................. 51
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP .............. 54
Hình 3.6. Mẫu chuyển gen tái sinh trên mơi trƣờng chọn lọc ........................ 55
Hình 3.7. Bình nhân chồi dòng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 ............ 55
Hình 3.8. Chồi chuyển gen EcHB1 trên mơi trƣờng chọn lọc ........................ 58
Hình 3.9. Hình thái thân và lá của dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng . 62
Hình 3.10. Cây bạch đàn chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi
......................................................................................................................... 63
Hình 3.11. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai
đoạn 2 tháng tuổi ............................................................................................. 64
Luận văn thạc sỹ Sinh học
Hình 3.12. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai
đoạn 3 tháng tuổi ............................................................................................. 66
Hình 3.13. Bạch đàn chuyển gen ra rễ trên mơi trƣờng chọn lọc và cây con tại
vƣờn ƣơm ........................................................................................................ 67
Hình 3.14. Cây con chuyển gen EcHB1 trồng tại vƣờn ƣơm ......................... 67
Hình 3.15. Kết quả chạy điện di kiểm tra ADN một số dịng Bạch đàn lai UP
......................................................................................................................... 68
Hình 3.16. Kết quả PCR 40 dòng bạch đàn chuyển gen EcHB1 .................... 69
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR ................ 70
Luận văn thạc sỹ Sinh học
1
MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................ 1
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 6
1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ...................................... 6
1.1.1. Hiện trạng và vai trò cây trồng biến đổi gen ........................................... 6
1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ....................................................... 6
1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen ....................................................... 8
1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta ......................................... 9
1.1.2.
Các phƣơng pháp chuyển gen ......................................................... 11
1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp ........................................................................... 11
1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp .......................................................................... 12
1.1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ............................... 13
1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 13
1.1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ................................................................ 15
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP....................................... 17
1.2.1. Tổng quan về bạch đàn và Bạch đàn lai UP ......................................... 17
1.2.1.1. Tổng quan về bạch đàn ...................................................................... 17
1.2.1.2. Nghiên cứu và phát triển giống Bạch đàn lai UP ở Việt Nam .......... 20
1.2.3. Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học
......................................................................................................................... 22
1.2.3.1. Nhân giống vơ tính in vitro cây bạch đàn .......................................... 22
1.2.3.2. Tái sinh in vitro thơng qua sự hình thành callus và phôi soma ......... 24
1.2.3.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo
và lai giống ...................................................................................................... 25
Luận văn thạc sỹ Sinh học
2
1.2.3.4. Chuyển gen cho loài bạch đàn ........................................................... 26
1.2.4. Gen EcHB1 và ứng dụng trong cải thiện chiều dài sợi gỗ .................... 28
1.2.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật ........... 28
1.2.4.2. Nhân tố phiên mã gen EcHB1 ............................................................ 30
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 31
2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ................................. 31
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 31
2.1.2. Vật liệu di truyền và chủng vi khuẩn .................................................... 31
2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất ...................................................................... 32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 33
2.2.1. Nghiên cứu tái sinh in vitro ở các dòng Bạch đàn UP .......................... 33
2.2.2. Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ........................... 35
2.2.3. Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ................................... 35
2.2.4. Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo .................. 36
2.2.5. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 36
2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô
sẹo.................................................................................................................... 36
2.2.7. Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo
mô sẹo ............................................................................................................. 37
2.2.8. Tái sinh cây từ mẫu đã biến nạp gen, nhân các dịng biến nạp gen, ra rễ
và trồng chăm sóc bên ngoài vƣờn ƣơm ......................................................... 37
2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá hình thái cây chuyển gen.................................. 37
2.2.10. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số................................................. 38
2.2.11. Xác định sự có có mặt của gen trong cây chuyển gen bằng PCR ...... 39
2.2.12. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .................................. 41
Luận văn thạc sỹ Sinh học
3
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42
3.1. QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THƠNG
QUA A. TUMEFACIENS ................................................................................ 42
3.1.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ................. 42
3.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo........................................................................................................ 46
3.1.4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 48
3.1.5. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo........................................................................................................ 49
3.1.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu
tạo mô sẹo........................................................................................................ 51
3.1.8. Đánh giá khả năng sống sót của chồi chuyển gen ................................ 56
3.1.9. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra chồi chuyển gen .......................... 58
3.2. PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÌNH THÁI CỦA CÁC DÕNG
BẠCH ĐÀN LAI CHUYỂN GEN ................................................................. 60
3.2.1. So sánh hình thái cây Bạch đàn lai UP chuyển gen và cây đối chứng
giai đoạn in vitro ............................................................................................. 60
3.2.2. So sánh hình thái cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn vƣờn ƣơm
......................................................................................................................... 62
3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG GEN CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN
TẠO ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR .................................................. 66
3.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 66
3.3.2. Xác định sự có có mặt của gen EcHB1 trong cây bằng PCR ............... 68
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 71
4.1. Kết luận .................................................................................................... 71
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 72
Luận văn thạc sỹ Sinh học
4
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, công nghệ gen đƣợc ghi nhận là giải pháp
quan trọng và hữu hiệu trong chọn tạo giống mới đặc biệt là kỹ thuật chuyển
gen. Thông qua việc sử dụng các kỹ thuật trong chuyển gen cho phép tạo ra
những giống cây trồng mới đột phá về năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ khả
năng chống chịu sâu bệnh hại. Không những thế cây trồng tạo ra từ quy trình
chuyển gen có nhiều đặc tính ƣu việt mà ở cây trồng hoang dại ban đầu khơng
có. Chuyển gen ở bạch đàn đã đƣợc thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều
loài bạch đàn nhƣ: Eucalyptus gunnii, E. globulus, E. camaldulensis, E.
nitens,... [1].
Chuyển gen cho cây bạch đàn chủ yếu tập trung vào các tính trạng về
tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lƣợng lignin, cellulose),
chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh, nhiễm mặn) và
chống sâu bệnh hại. Việc chuyển gen trên cây bạch đàn đã đƣợc thực hiện ở
trong và ngoài nƣớc. Tetsu Kawazu và cộng sự (2003) đã đƣợc cấp bằng sáng
chế về quy trình chuyển gen gus vào loài bạch đàn E. camaldulensis, E.
globulus, E. grandis, E. grandis x E.urophylla và E. urophylla bằng các mẫu
cấy sinh dƣỡng lấy từ cây bạch đàn trƣởng thành; Cheng và cộng sự (2006)
cũng đã đƣợc cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen và chọn lọc cây
chuyển gen cho loài bạch đàn E. urophylla. Các kết quả nghiên cứu cho thấy
khi sử dụng các loài bạch đàn, dịng bạch đàn khác nhau thì có quy trình
chuyển gen khác nhau cũng nhƣ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [2]. Do
vậy để chuyển gen hiệu quả vào từng lồi bạch đàn và từng dịng bạch đàn cụ
thể cần có một quy trình thích hợp.
Tetsuya Sonoda và cộng sự (2009) phối hợp nghiên cứu với công ty
giấy Oji đã thành công trong việc phân lập gen EcHB1 mã hóa nhân tố phiên
mã loại II (HD-Zip class II transcription factor) liên quan đến việc hình thành
và phát triển sợi gỗ đƣợc phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên
bạch đàn E. camaldulensis. Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở bạch đàn
E. camaldulensis biến nạp gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của
Luận văn thạc sỹ Sinh học
5
các gen chính liên quan đến q trình sinh tổng hợp lignin nhƣ CCoAOMT,
CAD, CCR và C4H đều giảm [3].
Tại Việt Nam, bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đã
đƣợc Trần Hồ Quang và cộng sự thực hiện trong khuôn khổ đề tài ”Nghiên
cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ” giai đoạn 20112015, kết quả đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn
lai UU (E. urophylla x E. urophylla) làm tăng chiều dài sợi gỗ và chọn đƣợc
dịng bạch đàn lai UU89 có sinh trƣởng nhanh (vƣợt trội về chiều cao hơn
25%, đƣờng kính hơn 10% so với giống đại trà).
Hiện nay, một số dòng Bạch đàn lai UP là giống lai giữa Bạch đàn
urophylla và Bạch đàn pellita (E. urophylla x E. pellita) đƣợc đánh giá có ƣu
thế lai, sinh trƣởng tốt hơn so với các loài bố mẹ trên nhiều dạng lập địa và đã
đƣợc công nhận là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật để phát triển rộng
rãi trong sản xuất, đây là nguồn vật liệu tiềm năng cho chuyển gen làm tăng
chiều dài sợi gỗ.
Xuất phát từ những cơ sở trên đề tài ”Nghiên cứu chuyển gen EcHB1
làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E.
pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đã đƣợc tiến hành
với mục tiêu xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen cho chiều dài sợi gỗ
EcHB1 vào Bạch đàn lai UP từ đó chọn tạo đƣợc các giống bạch đàn biến đổi
gen có năng suất, chất lƣợng cao để phục vụ chƣơng trình trồng rừng gỗ lớn.
Luận văn thạc sỹ Sinh học
6
1.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.1.1. Hiện trạng và vai trị cây trồng biến đổi gen
1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops – GM Crops) đƣợc
thƣơng mại hóa từ năm 1996. Tổ chức Quốc tế về Tiếp thu các Ứng dụng
Công nghệ sinh học trong Nông nghiệp (ISAAA) phát hành báo cáo thƣờng
niên cập nhật tình hình ứng dụng cây trồng Cơng nghệ sinh học (CNSH) hay
cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu năm 2017; cho thấy diện tích canh tác
cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hoá - phát
triển từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên tới 185,1 triệu ha vào năm 2016. Báo cáo
cũng tiếp tục cho thấy các lợi ích lâu dài của cây trồng biến đổi gen đối với
nông dân, đồng thời nhấn mạnh tiềm năng phát triển và lợi ích của một số
giống cây mới đƣợc chấp thuận thƣơng mại hoá trong thời gian gần đây đối
với ngƣời tiêu dùng.
Tính đến năm 2017 đã có 67 quốc gia sử dụng cây trồng biến đổi gen
(bao gồm 26 quốc gia trồng cây biến đổi gen), cấp phép chính thức nhập
khẩu và sử dụng cây trồng biến đổi gen với mục đích làm thực phẩm, thức ăn
chăn nuôi và chế biến. Cụ thể, tại châu Âu, bốn quốc gia là Tây Ban Nha, Bồ
Đào Nha, Séc và Slovakia đã trồng hơn 136.000 ha bắp biến đổi gen trong
năm 2016, tăng 17% so với năm 2015. Ở châu Phi, Nam Phi và Sudan cũng
liên tiếp mở rộng diện tích bắp, đậu nành biến đổi gen và đạt 2,66 triệu ha
trong năm 2016, trong khi năm 2015 mới chỉ có 2,29 triệu ha. Cịn châu Mỹ,
Brazil có diện tích canh tác bắp, đậu nành, bơng và hạt cải dầu GM Crops
tăng 11%, là nƣớc lớn thứ 2 sau Mỹ về diện tích trồng biến đổi gen. Tại châu
Á, Bangladesh là nƣớc thứ 28 trồng cây Cà tím Bt vào tháng 10 năm 2013.
Năm 2018, ở Châu Phi mới có 3 quốc gia ứng dụng cây trồng biến đổi
gen là Nam Phi, Sudan, Vƣơng quốc Eswatini. Trong năm 2019, châu lục
này đã có thêm 3 quốc gia là Malawi, Nigeria và Ethiopia, quyết định khai
thác lợi ích của các cây trồng biến đổi gen. Ngoài ra, Kenya đã công bố việc
Luận văn thạc sỹ Sinh học
7
thƣơng mại hố bơng biến đổi gen vào cuối năm 2019, và chính thức bắt đầu
canh tác vào năm 2020. Với việc bổ sung thêm ba quốc gia ở châu Phi, số
quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen trong năm 2019 tăng lên thành 29 quốc
gia. Trong đó, 5 quốc gia dẫn đầu với diện tích cây trồng biến đổi gen lớn
nhất là Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Canada và Ấn Độ (Hình 1.1). Với tỷ lệ
ứng dụng cao các cây trồng biến đổi gen chính tại các quốc gia này, có
khoảng 1,95 tỷ ngƣời, tƣơng đƣơng với 26% dân số thế giới, đƣợc hƣởng lợi
từ CNSH vào năm 2019 [4].
Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5
nƣớc trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới
(Nguồn: ISAAA)
Tính đến năm 2019, tổng cộng có 190,4 triệu ha cây trồng biến đổi gen
đƣợc canh tác tại 29 quốc gia, góp phần quan trọng vào giải quyết các vấn đề
về an ninh lƣơng thực, tính bền vững, giảm thiểu biến đổi khí hậu cũng nhƣ
nâng cao đời sống của hơn 17 triệu nông dân ứng dụng CNSH cùng gia đình
của họ trên tồn cầu. Tốc độ tăng trƣởng diện tích vùng trồng cây biến đổi
gen đạt đến hai con số đã đƣợc ghi nhận tại các quốc gia đang phát triển, đặc
biệt là ở Việt Nam, Philippines và Colombia [4].
Luận văn thạc sỹ Sinh học
8
1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen có những đóng góp về mặt kinh tế, xã hội và
môi trƣờng nhƣ sau:
- Cây trồng biến đổi gen giúp nông dân các nƣớc đang phát triển cải
thiện thu nhập, góp phần vào xóa đói giảm nghèo. Trong giai đoạn 1996 –
2016 diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm
thƣơng mại hóa, phát triển từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên tới 185,1 triệu ha vào
năm 2016 đã góp phần làm tăng giá trị sản xuất lên đến 186,1 tỷ đô la cho
khoảng 17 triệu nông dân trên toàn cầu [4].
- Cung cấp nguồn lƣơng thực thiết yếu cho tƣơng lai với việc tạo ra các
cây trồng biến đổi gen mang những tính trạng quý nhƣ kháng virus, kháng sâu
bệnh, chịu mặn, năng suất cao hơn... Ngoài ra còn tăng cƣờng chất lƣợng thực
phẩm đƣợc ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới nhƣ các giống lúa giàu
carotenoid (tiền vitamin A), khoai tây biến đổi gen với hơn ⅓ lƣợng protein là
các chất dinh dƣỡng thiết yếu và có giá trị cao.
- Hoạt động nơng nghiệp truyền thống của con ngƣời có tác động rất
lớn với mơi trƣờng. Cây trồng biến đổi gen với các tính trạng kháng sâu,
kháng virus và chống chịu chất diệt cỏ góp phần làm giảm việc sử dụng các
hóa chất trong trồng trọt. Giúp tiết kiệm 671 triệu kg thuốc trừ sâu (giai đoạn
1996 - 2016), và 48,5 triệu kg riêng trong năm 2016; làm giảm EIQ
(Environmental Impact Quotient) đến 18,4% trong giai đoạn 1996-2016, và
riêng năm 2016 đạt 18,3%.
- Cây trồng biến đổi gen có thể giúp giải quyết những lo ngại lớn nhất
về môi trƣờng, Giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu và giảm lƣợng khí gây
hiệu ứng nhà kính, giảm thiểu tác động của thay đổi thời tiết. Theo đánh giá
trong năm 2016, cây trồng biến đổi gen đã làm giảm khoảng là 27,1 tỷ kg
tƣơng đƣơng với khí thải của 16,7 triệu chiếc xe hơi chạy trên đƣờng 1 năm.
- Cây trồng biến đổi gen góp phần giúp xóa đói giảm nghèo và tăng thu
nhập cho ngƣời nông dân. Giá trị thu nhập từ cây trồng biến đổi gen tăng lên
từ 91 triệu USD (năm 1996 - năm bắt đầu trồng cây trồng biến đổi gen) lên
Luận văn thạc sỹ Sinh học
9
đến 15,690 triệu USD năm 2014 (Hình 1.2). Tỷ lệ đóng góp của một số lồi
cây trồng chính vào tổng giá trị cây trồng biến đổi gen trong năm 2014 gồm
8,6 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 5,2 tỷ USD từ đậu tƣơng biến đổi gen, 1,2 tỷ
USD từ ngô biến đổi gen, 0,4 tỷ USD từ cây Canola biến đổi gen, 2 tỷ USD từ
cây củ cải đƣờng biến đổi gen và phần cịn lại từ các lồi cây trồng biến đổi
gen khác. Đến 2018, giá trị từ cây biến đổi gen trên thế giới đạt 18,15 tỷ USD.
Tổng giá trị cây trồng biến đổi gen đạt tới 27,9 tỷ USD vào năm 2020 và đƣợc
dự đốn có thể đạt tới 45 tỷ USD vào năm 2027 [4].
Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen tồn cầu
1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta
Ở nƣớc ta, việc đầu tƣ và khuyến khích các nghiên cứu tạo giống cây
trồng biến đổi gen chính thức đƣợc thực hiện từ năm 2006, sau khi chƣơng
trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học trong lĩnh vực
Nông nghiệp và Phát triển Nơng thơn đến năm 2020 đƣợc chính phủ phê
duyệt (theo Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ). Các
đề tài nghiên cứu về chuyển gen thực vật chủ yếu đƣợc tiến hành ở các cơ sở
nghiên cứu khoa học lớn có đội ngũ cán bộ có trình độ chun mơn cao và có
trang thiết bị hiện đại.
Việt Nam đã phê chuẩn cây trồng công nghệ sinh học và thƣơng mại
hóa vào tháng 9 năm 2014 cho 4 loại ngô lai là MON 89034 (kháng sâu),
Luận văn thạc sỹ Sinh học
10
NK603 (chống chịu chất diệt cỏ), Bt11 và MIR162 (kháng cơn trùng). Năm
2017, có trên 45.000 ha trồng ngơ biến đổi gen ở các tỉnh thành khắp cả nƣớc,
tăng 13 lần so với năm 2015. Ƣớc tính có khoảng 37.500 hộ nông dân tham
gia trồng loại cây này. Đến thời điểm hiện tại, Việt Nam có 22 giống cây
trồng biến đổi gen đƣợc thƣơng mại hóa gồm 14 giống ngơ và 8 giống đậu
nành [4].
Đối với cây nông nghiệp, trong giai đoạn 2006 - 2011 các nhà khoa học
của Việt Nam đã tạo đƣợc một số dịng bơng, ngơ, đậu tƣơng biến đổi gen
mang gen kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ, một số dòng cà chua chuyển gen
kháng bệnh vi rút xoắn vàng lá, thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá và
xoắn đọt. Các dòng cây chuyển gen nay đang đƣợc đánh giá trong phạm vi
nhà lƣới về khả năng biểu hiện của gen chuyển và hình thành các dòng cây
biến đổi gen tiến tới khảo nghiệm và ứng dụng vào sản xuất. Tuy nhiên, để
đƣa các giống cây trồng biến đổi gen này vào sản xuất diện rộng đang gặp rất
nhiều khó khăn [5], [6], [7], [8], [9].
Đối với cây lâm nghiệp, việc nghiên cứu và phát triển giống biến đổi
gen có nhiều thuận lợi hơn so với cây nông nghiệp do các sản phẩm từ cây
lâm nghiệp nghiệp biến đổi gen không sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho
ngƣời và động vật nên ít bị cản trở hay kiểm soát bởi các quy định về quản lý
an tồn sinh vật biến đổi gen. Vì vậy, nhiều nƣớc trên thế giới đã khuyến
khích các nhà khoa học nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen.
Đến nay, Bộ Nông nghiệp & PTNT đã phê duyệt 04 nhiệm vụ nghiên cứu
khoa học cấp nhà nƣớc về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen, trên 3 đối
tƣợng cây lâm nghiệp là: Xoan ta, thông và bạch đàn. Trong đó, Viện CNSH
Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã triển khai 02 nhiệm vụ cấp nhà
nƣớc về tạo giống cây Xoan ta và Bạch đàn urô biến đổi gen. Đề tài “Nghiên
cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen” với mục tiêu tạo giống cây trồng mới có
năng suất cao, chất lƣợng tốt. Kết quả đã xây dựng thành cơng quy trình biến
nạp gen vào đối tƣợng Xoan ta đạt hiệu quả cao, tạo đƣợc 5 dòng Xoan ta
chuyển gen sinh trƣởng nhanh và 3 dòng Xoan ta chuyển gen tăng chất lƣợng
gỗ. Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh
Luận văn thạc sỹ Sinh học
11
trƣởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” triển khai trong 5 năm (2012 2016). Nhóm nghiên cứu đã xây dựng đƣợc hệ thống tái sinh bạch đàn urô
thông qua phôi soma với hiệu suất cao phục vụ biến nạp gen và tạo ra một số
dòng bạch đàn chuyển gen trong phạm vi phịng thí nghiệm.
Sự thành cơng của đề tài cho thấy các nhà khoa học của Việt Nam hoàn
toàn có khả năng tiếp cận và làm chủ loại cơng nghệ mới này. Kết quả của các
đề tài cũng đã khẳng định một hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực chọn tạo
giống cây trồng lâm nghiệp mới và công nghệ này có thể áp dụng đƣợc ở Việt
Nam. Trong tƣơng lai, các nhà khoa học hy vọng hƣớng nghiên cứu tạo giống
cây trồng đặc biệt là đối tƣợng cây lâm nghiệp bằng công nghệ chuyển gen sẽ
tiếp tục đƣợc quan tâm phát triển. Tuy nhiên, nghiên cứu tạo giống cây lâm
nghiệp biến đổi gen cần có nhiều thời gian. Trƣớc tiên, cần xác định những
loài cây chủ lực để tập trung nghiên cứu phát triển, sau đó xây dựng chƣơng
trình nghiên cứu tổng thể dài hạn cho từng loài cây cụ thể với mức đầu tƣ
kinh phí và thời gian nghiên cứu phù hợp (10 - 15 năm), giao nhiệm vụ cho
cơ sở nghiên cứu và nhóm nhà khoa học đủ mạnh tập trung nghiên cứu để tạo
ra đƣợc sản phẩm cuối (giống mới) đáp ứng mục tiêu của con ngƣời.
1.1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen
Hiện nay có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chuyển gen ở thực
vật. Căn cứ vào cách thức đƣa gen vào tế bào thực vật mà ngƣời ta chia thành
hai phƣơng pháp là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.
1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen trực tiếp là việc sử dụng các biện pháp cơ học, vật lý hoặc
hóa học để chuyển trực tiếp các gen vào tế bào thực vật. Một số phƣơng pháp
chuyển gen trực tiếp bao gồm:
- Phương pháp bắn gen:
Là phƣơng pháp sử dụng các hạt kim loại nặng (vàng, vonfram) có kích
thƣớc cực nhỏ, đƣợc bọc bên ngoài bằng ADN rồi bắn trực tiếp vào tế bào
thực vật. Bằng phƣơng pháp này có thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Tuy
Luận văn thạc sỹ Sinh học
12
nhiên, cho đến nay tần số biến nạp bằng phƣơng pháp bắn gen còn thấp và
thƣờng xuyên nhận đƣợc cây biến nạp khảm [10].
- Phương pháp xung điện:
Là phƣơng pháp dùng hiện tƣợng phóng điện để tạo lỗ trên màng tế
bào, làm cho việc đƣa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN đã tiếp giáp
với màng tế bào. Phƣơng pháp này có thể dễ dàng thực hiện trên đối tƣợng
cây một lá mầm [11].
- Phương pháp vi tiêm:
Là phƣơng pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đƣa ADN vào những tế
bào nhất định. Phƣơng pháp này đã tạo ra những dòng biến nạp từ proplast và
cây biến nạp khảm từ các tế bào tiền phôi có nguồn gốc từ hạt phấn [10].
Hạn chế của phƣơng pháp này là cần dùng các thiết bị có độ chính xác
cao và kỹ năng phức tạp từ ngƣời sử dụng [12].
- Phương pháp chuyển gen qua ống phấn:
Đây là phƣơng pháp chuyển gen thông qua nuôi cấy in vitro, dựa trên
nguyên tắc là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đƣờng ống phấn rồi chui
vào bầu nhụy cái.
- Phương pháp siêu âm:
Dùng chuyển gen vào tế bào trần protoplast.
- Phương pháp hóa học:
Chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học nhƣ
polyethylen-glycol.
1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp
- Phương pháp chuyển gen nhờ virus:
Virus là đối tƣợng đƣợc sử dụng chuyển gen vào thực vật vì có một số
ƣu điểm: virus có khả năng xâm nhiễm và chuyển genome của mình sang tế
bào thực vật. Nhƣng sự lây nhiễm virus thƣờng làm yếu tế bào thực vật, vì
vậy đây là phƣơng pháp ít đƣợc sử dụng đến.
Luận văn thạc sỹ Sinh học
13
- Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đƣợc nghiên cứu từ những
năm 1960 - 1970. Việc phát hiện ra A. tumefaciens có khả năng chuyển gen
vào thực vật đã trở thành công cụ quan trọng của CNSH thực vật. Việc sử
dụng A. tumefaciens có ƣu điểm hơn so với các phƣơng pháp khác, số bản sao
khi sử dụng phƣơng pháp này khi chuyển vào thực vật thƣờng thấp (1 – 2 bản
copy) trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn. Do vậy có thể giảm tối
thiểu sự khơng biểu hiện của gen đƣợc chuyển, tăng khả năng chuyển gen,
tránh đƣợc cây chuyển gen thể khảm. Ngoài ra, chuyển gen A. tumefaciens có
kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi thiết bị đắt tiền.
Phƣơng pháp này đã khắc phục đƣợc những hạn chế chủ yếu của các
phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp nhƣ thƣờng thu nhận cây chuyển gen có
nhiều bản sao của gen dẫn tới sự nhiễu gen và không bền vững của gen trong
thực vật. Chuyển gen bằng A. tumefaciens đƣợc thực hiện hiệu quả trên nhiều
loại cây hai lá mầm: thuốc lá, cà chua, khoai tây… và cây một lá mầm nhƣ
lúa.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp
1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Chuyển gen vào cây rừng đƣợc tiến hành từ những năm 1980 bắt đầu
bằng việc chuyển các gen chỉ thị để xác định khả năng tiếp nhận và mức độ
biểu hiện của gen lạ trong hệ gen của cây chủ và làm cơ sở cho chuyển các
gen mục tiêu có giá trị kinh tế.
- Chuyển gen làm thay đổi tính chất gỗ
Các nghiên cứu chuyển gen làm thay đổi tính chất gỗ chủ yếu tập trung
cho việc tăng khối lƣợng riêng của gỗ (wood density), giảm hàm lƣợng lignin,
cải thiện tính chất sợi gỗ. Hu và cộng sự đã tạo ra đƣợc cây Dƣơng (Populus
tremuloides) chuyển gen giảm hàm lƣợng lignin bằng cách làm giảm mức độ
biểu hiện của gen 4CL (gen chính trong chu trình sinh tổng hợp lignin). Sau
10 tháng trồng tại nhà kính, cây Dƣơng chuyển gen có hàm lƣợng lignin giảm
Luận văn thạc sỹ Sinh học
14
45%, hơn nữa, hàm lƣợng cellulose tăng 15% và sinh trƣởng của cây cũng tăng
cao hơn [13].
Cũng trên đối tƣợng cây Dƣơng, Coleman và cộng sự (2008) tạo ra
đƣợc cây Dƣơng chuyển gen với việc làm giảm mức độ biểu hiện của gen C3H
(cũng là gen chính trong chu trình sinh tổng hợp monolignon của lignin). Sau
4 tháng trồng tại nhà kính, các cây Dƣơng này có hàm lƣợng lignin giảm
55%. Tuy nhiên, những nghiên cứu theo hƣớng làm giảm hàm lƣợng lignin
trong cây cho thấy hầu hết đều có tác động khơng tốt tới hình thái và sinh
trƣởng của cây, cây sinh trƣởng chậm lại (cây có thân nhỏ), hệ rễ và hình thái
lá cũng bị thay đổi. Trong giai đoạn vƣờn ƣơm, các cây chuyển gen khơng
thấy có thay đổi khác biệt so với cây đối chứng, còn trong giai đoạn rừng
trồng khảo nghiệm, mức độ khác biệt này lại đáng kể.
- Chuyển gen làm tăng khả năng thích ứng với mơi trường
Các nghiên cứu chuyển gen tăng khả năng thích ứng với mơi trƣờng
đƣợc quan tâm gồm chuyển gen tăng khả năng chống chịu hạn, chống chịu
với sâu bệnh, chống chịu lạnh và chịu mặn. Chuyển gen kháng sâu (gen Bt) đã
đƣợc Lachance và cộng sự (2007) thực hiện trên cây Vân sam (Picea glauca)
[15]. Trong đó 23 dòng chuyển gen đã đƣợc trồng trong 5 năm tại khảo
nghiệm ở Valcartier (Canada). Kết quả theo dõi khảo nghiệm cho thấy tính
kháng sâu hại ngọn (Choristoneura fumiferana) của các dòng Vân sam trắng
chuyển gen ổn định trong suốt thời gian theo dõi. Tƣơng tự nhƣ vậy, khảo
nghiệm trong 3 năm đối với 2,256 cây Dƣơng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
(gen BAR) cho thấy các cây này đều biểu hiện tính kháng ổn định, ngoại trừ
một số dịng không ổn định.
Một số kết quả nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, các gen đƣợc chuyển
thành cơng vào cây có ảnh hƣởng rõ rệt đến hình thái và quá trình trao đổi
chất ở cây chuyển gen: nhƣ gen PtGT1 làm tăng hàm lƣợng lignin và ảnh
hƣởng đến khả năng ra hoa sớm ở cây thuốc lá chuyển gen, hay gen
PtNDPK2 làm tăng sinh trƣởng và khả năng chống chịu với một số điều kiện
môi trƣờng khắc nghiệt ở cây Dƣơng P. trichocarpa chuyển gen [15], [16].
Cây A. thaliana chuyển gen codA, COX, GSMT/SDMT tăng cƣờng khả năng
Luận văn thạc sỹ Sinh học
15
chịu lạnh, nhiệt độ cao, chịu mặn và băng giá, cây cải be (Brassica juncea)
chuyển gen codA có khả năng chịu mặn tốt hơn cây đối chứng [17]. Vì vậy,
việc triển khai các nghiên cứu nhằm tạo ra đƣợc các giống cây trồng nơng lâm nghiệp có khả năng chống chịu đƣợc các điều kiện bất lợi của môi trƣờng
nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc năng suất và chất lƣợng tốt đang là vấn đề cấp bách
và cần thiết hiện nay. Trên thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen
tăng cƣờng chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi chủ yếu tập trung vào
nhóm cây nơng nghiệp, cịn nhóm cây lâm nghiệp mới chỉ có một vài cơng
trình cơng bố [18].
- Chuyển gen làm tăng khả năng sinh trưởng
Cùng với việc chuyển gen là tăng tính chống chịu, các nghiên cứu
chuyển gen nhằm cải thiện tính chất gỗ, chuyển gen làm tăng khả năng sinh
trƣởng cũng đã đƣợc thực hiện trên cây Dƣơng. Một số gen liên quan đến sinh
trƣởng nhƣ gen horseradish peroxidase (gen prxC1a), gen glutamine synthase
(gen GS1) và gen aspergillus xylogluconase (gen AaXEG2) đã đƣợc biến nạp
vào cây Dƣơng. Kết quả khảo nghiệm sau 3 năm trồng tại tỉnh Granda, Tây
Ban Nha cho thấy cây Dƣơng chuyển gen GS1 có sinh trƣởng cao hơn 21%,
36% và 41% so với cây đối chứng ở các năm thứ 1, thứ 2 và thứ 3 (theo thứ tự
tƣơng ứng) [19], [20], [21].
1.1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, cây biến đổi gen trong lĩnh vực lâm nghiệp cũng đƣợc
quan tâm nghiên cứu. Một số loài cây nhƣ dƣơng, vân sam, keo, bạch đàn,
xoan… đƣợc chuyển một số gen chống chịu sâu bệnh, gen kháng với điều
kiện ngoại cảnh bất lợi, gen tăng cƣờng sinh khối, cải thiện tính chất gỗ [22].
Nghiên cứu chuyển gen cho cây lâm nghiệp ở nƣớc ta mới bắt đầu đƣợc tiến
hành từ những năm 2000 và tập trung cho các hƣớng chính sau:
- Chuyển gen làm tăng khả năng thích ứng với môi trường
Chuyển gen kháng sâu (gen Bt Cry 1Ab) cho cây Thông nhựa (Pinus
merkusii) đã đƣợc thực hiện trong giai đoạn 2006 – 2010 [23]. Kết quả nghiên
cứu đã xác định đƣợc các thông số cần thiết cho chuyển gen chỉ thị (gen gus)
Luận văn thạc sỹ Sinh học
16
và gen mục tiêu (Bt Cry 1Ab) vào phôi soma cây Thông nhựa. Tuy nhiên, do
khả năng tái sinh của phơi soma cịn chƣa ổn định nên các nghiên cứu
chuyển gen cho cây Thông nhựa vẫn chỉ ở giai đoạn thăm dị ban đầu.
Chuyển gen P5CsM/codA có khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn và
chịu mặn ở các dịng cây chuyển gen vào cây thuốc lá và cây Xoan ta. Kết
quả đã tạo đƣợc 2 dòng Xoan ta mang gen chịu hạn (gen P5CsM) và 5 dòng
Xoan ta mang gen chịu mặn (gen TP-codA) chịu đƣợc mặn với nồng độ muối
500 mM, cây chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy hàm lƣợng glycine betaine
cao hơn rất nhiều lần so với các cơng trình cơng bố trƣớc đây [24].
- Chuyển gen tăng khả năng sinh trưởng
Gen tăng khả năng sinh trƣởng (gen GA20) phân lập từ cây Arabidopsis
thaliana và gen tăng chất lƣợng gỗ (gen 4CL1) phân lập từ cây Thông đuôi
ngựa (Pinus masoniana) đƣợc gắn vào cấu trúc vector pBI121-GA20 và
pPTN289-4CL1 và pBI121-4CL1. Hoạt động của 2 gen này đƣợc điều khiển
bởi promotor CaMV 35S. Các cấu trúc gen này đã biến nạp thành công vào
cây Xoan ta (Melia azedarach L.). Tuy nhiên, do sử dụng promotor CAMV
35S là loại promotor mạnh nên 2 gen mục tiêu này hoạt động quá mạnh dẫn
đến làm thay đổi quá mức các tính trạng của cây. Cụ thể, các dịng chuyển
gen tăng khả năng sinh trƣởng (gen GA20) có sinh trƣởng chiều cao q
nhanh, lóng cây q dài và đƣờng kính thân cây nhỏ, còn các dòng chuyển
gen tăng chất lƣợng gỗ (gen 4CL1) thì cây lại có thân to và giịn; lá to dày và
có màu xanh đậm.
Dựa trên các kết quả nghiên cứu của đề tài, Hà Văn Huân và cộng sự
(2015) đã hồn thiện quy trình chuyển gen vào Xoan ta (Melia azedarach L.)
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens với hiệu suất chuyển gen GA20 và gen
4CL1 đạt 3 - 5%. Nhóm tác giả chuyển thành cơng gen GA20 và gen 4CL1
vào Xoan ta, tạo đƣợc 5 dòng mang gen GA20 và 3 dòng mang gen 4CL1.
Các dòng Xoan ta chuyển gen đều có sự khác biệt rõ rệt so với các dịng
khơng chuyển gen [25]. Cũng trên đối tƣợng này, Nguyễn Văn Phong và cộng
sự thiết kế cấu trúc vector cải tiến mang gen GA20ox và vector mang gen GS1
để tạo và chọn lọc thành cơng 2 dịng xoan ta chuyển gen GA20ox và 1 dòng
Luận văn thạc sỹ Sinh học
17
xoan ta chuyển gen GS1. Cả 3 dòng mang gen có sức tăng trƣởng vƣợt trội so
với cây đối chứng khơng chuyển gen nhất là về thể tích sinh khối thân cây lấy
gỗ đạt tỉ lệ tăng trƣởng từ 81 - 102% ở cả 2 mơ hình trồng thử nghiệm tại
Xuân Mai và Sơn Tây – Hà Nội [26].
Gen GS1 làm tăng khả năng sinh trƣởng đã đƣợc Bùi Văn Thắng và
cộng sự thực hiện chuyển thành công vào Bạch đàn uro thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens đạt hiệu suất khoảng 3,7% [27].
- Chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ
Bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đã đƣợc Trần Hồ
Quang và cộng sự thực hiện trong khuôn khổ của đề tài ”Nghiên cứu tạo
giống Bạch đàn lai UU biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ” ở trong giai đoạn
2011 - 2015. Đề tài đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 làm tăng
chiều dài sợi gỗ và đã chọn đƣợc dòng bạch đàn lai UU89 sinh trƣởng nhanh
(vƣợt trội về chiều cao hơn 25%, đƣờng kính hơn 10% so với giống đại trà),
có khả năng tái sinh cao làm vật liệu biến nạp gen [28].
1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP
1.2.1. Tổng quan về bạch đàn và Bạch đàn lai UP
1.2.1.1. Tổng quan về bạch đàn
Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae),
bộ Sim (Myrtaces), phân lớp hoa hồng (Rosidae), lớp hai lá mầm
(Dicotyledone). Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên đƣợc nhà thực vật học
ngƣời Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó
đến nay đã có tới 600 lồi và biến chủng đƣợc mơ tả và đặt tên, gần đây 500
lồi đã đƣợc chấp nhận chính thức.
Bạch đàn có xuất xứ từ Australia đƣợc dẫn giống bằng hạt đem về
trồng ở đất nƣớc ta vào khoảng thập niên 1950. Cho đến nay, bạch đàn đã
đƣợc trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là các quốc gia ôn đới
nhƣ: Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam… Chi Bạch đàn bao gồm 700
loài và các giống lai, một số loài có giá trị kinh tế quan trọng (E.
camaldulensis, E. tereticornis, E. grandis, E. globulus, E. urophylla và giống
Luận văn thạc sỹ Sinh học
