(Luận văn thạc sĩ) phân tích đặc điểm phân tử của canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại thành phố hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄNTHANH VIỆT

Nguyễn Thanh Việt

SINHHỌC THỰCNGHIỆM

PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE
PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN
CHĨ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NĂM2021
Thành phố Hồ Chí Minh - 2021


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thanh Việt

PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE PARVOVIRUS
GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHĨ TẠI THÀNH
PHỐ HỒ CHÍ MINH

Chun ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Thân Văn Thái
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Hoàng Dũng
Thành phố Hồ Chí Minh - 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus
gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh” là kết quả của sự
nghiên cứu nghiêm túc, được tiến hành dựa trên sự cố gắng học hỏi của bản thân
dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS. Thân Văn Thái và thầy TS. Nguyễn
Hoàng Dũng.
Tôi xin cam đoan số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là
hồn tồn trung thực.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng
Người cam đoan
(Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thanh Việt

năm 2021


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo
khoa Công nghệ Sinh học, các thầy cô giáo Học viện Khoa học và Công nghệ đã
chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho tôi
trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Thân Văn Thái, Trường
Đại học PHENIKAA; và TS. Nguyễn Hoàng Dũng, Viện Sinh học Nhiệt Đới,Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng
dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các
bạn trong Đại học Nguyễn Tất Thành, đặc biệt là các anh chị tại Viện Khoa học môi
trường nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn
trong tập thể lớp BIO2019B, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi
khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này.
TP. HCM, ngày tháng năm 2021
Học viên

Nguyễn Thanh Việt


1
MỤC LỤC

MỤC LỤC........................................................................................................

1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................

3

DANH MỤC CÁC BẢNG ..............................................................................
DANH MỤC HÌNH.........................................................................................

5
6

MỞ ĐẦU ..........................................................................................................

7

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ..................................................

10

1.1. Tổng quan về Canine parvovirus .............................................................

10

1.2. Phân loại Canine parvovirus ....................................................................

11

1.3. Cấu trúc genome của CPVs .....................................................................
1.4. Phương thức lây nhiễm của CPVs ...........................................................

11
13

1.5. Đặc điểm sinh bệnh học CPVs .................................................................

13

1.6. Phương pháp phòng và điều trị bệnh .......................................................

15

1.7. Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh do CPVs gây ra ..

16

1.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về lưu hành CPVs .........................
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................

16
23

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện...............................................................

23

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................

23

2.3. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................

23

2.4. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................

23

2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu ...................................................................
2.4.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu ............................................................

23
23

2.5.1 Chẩn đốn CPVs bằng Kít xét nghiệm nhanh .......................................

24

2.5.2. Phương pháp PCR .................................................................................

25

2.5.2.1. Tách chiết DNA .................................................................................

25

2.5.2.2. Thực hiện phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)...................

25

2.5.3. Giải trình tự gen ....................................................................................
2.5.4. Phân tích trình tự gene ..........................................................................

27
28

2.5.5. Xây dựng và phân tích cây phát sinh lồi .............................................

28

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................

29

3.1. Kết quả thu nhận mẫu ..............................................................................

29

3.2. Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu bệnh phẩm ..............................
3.3. Kết quả PCR khuyếch đại gen VP2 .........................................................

30
31


2
3.4. Kết quả PCR genome hoàn chỉnh của chủng CPVs trong nghiên cứu này
.........................................................................................................................

32

3.5. Kết quả giải trình tự gen VP2 ..................................................................

33

3.6. Kết quả giải trình tự genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu .........
3.8. Kết quả phân tích và so sánh trình tự amino acid (aa) của VP2 protein ..

33
35

3.9. Kết quả phân tích cây phát sinh lồi ........................................................

38

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ ...................................................

46

4.1. Kết luận ....................................................................................................

46

4.2. Kiến nghị ..................................................................................................

46

CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN CỦA TÁC GIẢ........................

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................

47
58

PHỤ LỤC .......................................................................................................

62


3
DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT

CPV

Canine parvovirus

FPV

Feline panleukopenia virus

PCR

Polymerase Chain Reaction

NS1

Non-structural protein 1

NS2

Non-structural protein 2

ORF

Open reading frame

ssDNA

Single-stranded DNA

dsDNA

Double-stranded DNA

Ori

origin of replication

RCR

rolling-circle replication

PIF

Parvovirus initiation factor

SF3

superfamily 3

ATP

Adenosine triphosphat

DNA

Deoxyribonucleic acid

TfR

Transferrin receptor

HI

Hemagglutination Inhibition

ddNTP

dideoxynucleotide

CL

cell lysis

PBS

Phosphate-buffered saline

WB1

washing buffer 1

WB2

washing buffer 2

EB

elution buffer

TAE

Tris-acetate-EDTA

Arg

Arginine

Lys

Lysine

Asn

Asparagine


4
Glu

Axit glutamic

Gly

Glycine

Ile

Isoleucine

Leu

Leucine

Met

Methionine

Phe

Phenylalanin

Pro

Proline

Ser

Serine

Thr

Threonine

Tyr

Tyrosine

Val

Valine


5
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các thành phần trong phản ứng PCR…………………………………...25
Bảng 2.2. Primers sử dụng trong phản ứng PCR…………………………………..26
Bảng 2.3. Các cặp mồi sử dụng trong khuếch đại trình tự bộ genome CPV………26
Bảng 2.4. Nhiệt độ và thời gian trong phản ứng PCR……………………………..27
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận mẫu phân chó tiêu chảy trong nghiên cứu này………29
Bảng 3.2. Kết quả sau điều trị của có bị nhiễm CPV……………………………...29
Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu thí nghiệm…………………...30
Bảng 3.4. Trình tự nucleotide và amino acid của gene VP2 của các mẫu CPVs sử dụng
trong nghiên cứu này………………………………………………………….37


6
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa của CPVs theo thời gian………………………………….10

Hình 1.2. Cấu trúc của Canine parvovirus ………………………………………...11
Hình 1.3. Sơ đồ minh họa genome của chủng CPV (mã số NC_001539) …………12
Hình 1.4. Kết quả chẩn đốn nhanh kháng ngun CPVs………………………….16
Hình 2.1. Thu thập mẫu ……………………………………………………………24
Hình 2.2. Chẩn đốn nhanh kháng nguyên CPVs ………………………………….24
Hình 2.3. Sơ đồ minh họa genome và vị trí các cặp mồi……………………………27
Hình 3.1. Kết quả PCR chẩn đốn CPVs …………………………………………..30
Hình 3.2. Kết quả PCR kh́ch đại trình tự đầy đủ gen VP2 ………………………31

Hình 3.3. Sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPVs trong nghiên
cứu này……………………………………………………………………………..32
Hình 3.4. Kết quả so sánh tương đồng trình tự trên hệ thống BLAST NCBI ……..33

Hình 3.5. So sánh trình tự genome của các chủng trong nghiên cứu này với chủng
tham chiếu CPV-SH1516 phân lập tại Trung Quốc ……………………………….34
Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên gene VP2 trong nghiên cứu này ……………39
Hình 3.7. Cây phát sinh lồi dựa trên gene VP1 trong nghiên cứu này ……………41
Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gene NS1 trong nghiên cứu này ……………42
Hình 3.9. Cây phát sinh lồi dựa gene NS2 trong nghiên cứu này …………………43

Hình 3.10. Cây phát sinh lồi dựa trên vùng mã hóa genome trong nghiên cứu
này………………………………………………………………………………….44


7
MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết:
Việt Nam là quốc gia có số lượng chó nuôi tương đối lớn và đặc biệt là chó
nuôi làm cảnh (thú cưng) có xu hướng ngày càng tăng do điều kiện kinh tế và nhu
cầu nuôi thú cảnh ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc quản lý và chăm sóc gặp rất

nhiều khó khăn do chó được nuôi rộng rãi với nhiều loại giống khác nhau nên sức
đề kháng và khả năng thích nghi cũng rất khác nhau. Bên cạnh đó các yếu tố như
điều kiện nuôi dưỡng, vệ sinh, khí hậu nóng ẩm, vv... cũng làm cho sự lây lan của
các bệnh truyền nhiễm trở nên nghiêm trọng hơn tại nước ta.
Canine paroviruses (CPVs) là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp tính nguy hiểm
trên chó, đặc biệt là chó ở độ tuổi từ 6 tuần tới 6 tháng và chưa được tiêm vắc-xin.
CPVs có khả năng lây lan rất nhanh chủ yếu qua đường tiêu hóa thông qua thức ăn
hoặc dụng cụ bị nhiễm vi-rút. Bệnh thường phát triển rất nhanh trong vòng từ 3-7 ngày,
tỷ lệ tử vong khoảng 10% đối với chó trưởng thành và 91% đối với chó con. CPVs là
vi-rút DNA sợi đơn, thuộc giống Parvovirus trong họ Parvoviridae. CPVs phân chia
thành 2 nhóm là CPV-1 và CPV-2. Trong đó CPV-2 có 3 phân nhóm là CPV-2a, CPV2b và CPV-2c. Tính đến nay thì CPV-2c được đánh giá là có đặc tính kháng nguyên và
độc lực là mạnh nhất. Bộ gen của CPVs dài khoảng 5,3 kb, có 2 gen mã hóa protein phi
cấu trúc NS1 và NS2, và 2 gen mã hóa protein cấu trúc là VP1 và VP2. Vỏ capsid của
CPVs được tạo thành từ phức hợp của khoảng 60 bản sao của hai protein cấu trúc VP1
(84 kDa) và VP2 (67 kDa) với tỷ lệ tương đương khoảng 10% và 90%. Ngoài ra,
protein VP2 là yếu tố độc lực chính có vai trị quan trọng trong khả năng gây bệnh và
kích thích hệ thống miễn dịch hình thành kháng thể trung hòa; và protein VP1 hình
thành nên một cấu trúc khối 20 mặt (icosahedral) đối xứng giúp vi-rút có khả năng
chống lại axit, bazơ, dung môi và nhiệt độ lên đến 50ºC [1].
Bệnh do CPVs gây ra xuất hiện vào cuối những năm 1970, được công nhận lần
đầu tiên vào năm 1978 và được xác nhận nguồn gốc từ đột biến của vi-rút gây bệnh
bạch cầu ở mèo và có xu hướng lan rộng tại nhiều khu vực trên thế giới [2], [3]. Từ
năm 1979, CPV-2a (một biến thể di truyền của CPV-2) lây lan trên toàn cầu. Các
chủng CPV-2a trải qua các quá trình tiến hóa và giữ lại một số đột biến điểm tại vùng
kháng nguyên vỏ và do đó có khả năng lây lan cao. Ngồi loại kháng nguyên CPV-2a
ban đầu, có hai biến thể kháng nguyên được biết đến, được gọi là CPV-2b và CPV-2c.
CPV-2b được phát hiện lần đầu vào năm 1984 tại Hoa Kỳ [4], [5] và CPV-2c được phát
hiện lần đầu vào năm 2001 tại Ý [6]. Sự khác biệt về kháng nguyên giữa

8
ba biến thể được thể hiện qua biến đổi tại vị trí amino acid 426 (Asn trong CPV-2a,
Asp trong CPV-2b, và Gla trong CPV-2c) trên vùng gene VP2 [4], [5]. Các nghiên cứu
cho thấy khi một biến thể CPV-2 mới xuất hiện, nó sẽ thay thế rất nhanh các biến thể
cũ [6], [7]. Trong những năm gần đây, CPV-2c đã được phát hiện phổ biến ở các nước
Châu Âu [6], Hoa Kỳ [8], Nam Mỹ [9] và Châu Phi [10]. Lần đầu tiên CPV-2c được
báo cáo ở Việt Nam vào năm 2004 [11]. Hiện nay, chủng CPV-2c không còn phổ biến
ở Châu Á [12] mà được thay thế bởi các biến thể CPV-2c mới xuất hiện và phổ biến tại
nhiều quốc gia như Trung Quốc [13-15], Đài Loan [16], Thái Lan và Việt Nam [11].
Nhìn chung, các biến thể của CPV (-2a, -2b và -2c) đang lưu hành trên thế giới với tần
suất và mức độ tiến hóa thay đổi theo địa lý và thời gian [12], [13].

Hiện nay, tại Việt Nam các nghiên cứu về bệnh do CPVs trên chó vẫn cịn hạn
chế, trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phương pháp chẩn đoán phát
hiện, phân lập, và đánh giá đặc điểm di truyền dựa trên phân tích một phần trình tự
đoạn gen VP2 của các chủng CPVs đang lưu hành [11], [14-17]. Gần đây, chỉ có
duy nhất một nghiên cứu phân tích phân tử và phát sinh loài bộ gen đầy đủ của các
biến thể CPV-2c được phân lập từ 2017 đến năm 2018 ở Việt Nam [18]. Điều này,
cho thấy sự thiếu hụt thông tin về đặc điểm di truyền của các chủng CPVs tại Việt
Nam nói riêng và chủng CPVs trên thế giới nói chung. Vì vậy, để xác định các đột
biến có thể ảnh hưởng đến vắc-xin và cơ chế tiến hóa của các chủng CPV thì cần có
thêm nhiều nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về đặc điểm trình tự genome chứa
đầy đủ các vùng mã hóa của protein phi cấu trúc NS1/NS2 và protein cấu trúc VP1/
VP2 của các chủng CPVs đã và đang lưu hành hiện tại.
Chó nhiễm CPVs hiện không có thuốc đặc hiệu để điều trị mà sử dụng các biện
pháp như truyền dịch, bổ sung chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng, kết hợp sử
dụng kháng sinh để tránh bội nhiễm vi khuẩn. Do đó, việc sử dụng vắc-xin được coi là
phương pháp hiệu quả nhất trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra. Tuy nhiên, các
loại vắc-xin CPV-2 được sử dụng ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài
và đa số chỉ được sử dụng tiêm cho các loại chó giống nhập khẩu và chó lai từ

6

tuần đến 6 tháng tuổi. Chó bản địa Việt Nam hiếm khi được tiêm phịng vì vậy đây có

thể là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự lây lan CPV-2 trên khắp cả nước.

Hơn nữa, đây cũng có thể là nguồn gốc dẫn đến sự đột biến, khi có nhiều trường
hợp mặc dù đã được tiêm vắc-xin nhưng vẫn nhiễm bệnh tiêu chảy cấp tính nặng do
các biến thể CPVs mới gây ra được báo cáo trên toàn quốc [19]. Sự bùng phát CPVs
ở những con chó được tiêm chủng cũng được báo cáo ở nhiều quốc giá khác nhau
trên thế giới.


9
Từ các yếu tố thực tiễn trên, các nghiên cứu nhằm bổ sung và cập nhật các
thông tin như dịch tễ học, đặc điểm di truyền phân tử, mức độ tương đồng của các
chủng vắc-xin CPVs thương mại so với các chủng CPVs đang lưu hành, vv… là cần
thiết để hỗ trợ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh do CPVs gây ra. Do đó, để xây
dựng cơ sở dữ liệu nhằm hỗ trợ trong công tác sàng lọc CPV vắc-xin phù hợp và
đồng thời giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tiến hóa của CPVs tại Việt Nam chúng tôi đề
xuất thực hiện đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus gây bệnh
tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh”.
Mục đích của đề tài
Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính
trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh.
Nội dung nghiên cứu:
Thu thập và bảo quản mẫu phân tiêu chảy của chó tại phịng khám Thú y
với kết quả dương tính CPVs bằng Kit chẩn đoán nhanh.
-

Chẩn đoán và nhận diện phân tử CPVs bằng phản ứng PCR.

Giải trình tự và phân tích đặc điểm trình tự (trình tự nucleotides, amino
acids, xây dựng cây phát sinh lồi) của gene mã hóa protein bề mặt VP2.
Giải trình tự và phân tích trình tự genome đầy đủ của 02 mẫu CPVs (trình
tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài).
Kết quả đạt được trong nghiên cứu:
Bổ sung và cập nhật thông tin về dịch tễ học, xác định các đặc điểm di truyền
trên gene VP2 và genome của các chủng CPVs đang lưu hành tại Tp. Hồ Chí Minh
so với các chủng lưu hành trên thế giới. Ngồi ra, kết quả đạt được góp phần xác
định đặc điểm đa dạng trong tiến hóa cũng như cung cấp thông tin nhằm hỗ trợ công
tác sản xuất vắc-xin phù hợp trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra tại nước ta.


10
Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1 . Tổng quan về Canine parvovirus
Canine parvovirus (CPVs) được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1976
trên chó tại Châu Âu. Đến năm 1978, CPV đã lây lan rộng rãi và trở thành đại dịch,
gây ra các chứng bệnh viêm cơ tim và viêm dạ dày và gây chết nhiều ở chó con, chó
trưởng thành trên khắp thế giới. CPVs được xem như là một biến thể của Feline
panleukopenia virus (FPV), một loại vi-rút được phát hiện từ những năm 1920, gây
ra các bệnh trên mèo, chồn và một số động vật khác. CPV có thể phát sinh do quá
trình đột biến gen cho phép nó mở rộng phạm vi vật chủ lên trên chó, chó sói, gấu
trúc cũng như một số động vật hoang dã khác [20].
Ngay sau khi xuất hiện, CPV-2 đã trải qua quá trình tiến hóa liên tiếp tạo ra 2
biến thể kháng nguyên: CPV-2a được báo cáo năm 1979 và CPV-2b năm 1984, hai
biến thể này dần thay thế các chủng CPV ban đầu. Năm 2000, tiếp tục xuất hiện
biến thể kháng nguyên mới là CPV-2c, được phát hiện đầu tiên ở Ý và nhanh chóng
lây lan sang nhiều số quốc gia khác nhau. CPV-2c dần trở nên phổ biến ở các khu

vực địa lý khác nhau và gây ảnh hưởng đến cả trên các loại chó trưởng thành và cả
những giống chó đã được tiêm ngừa vắc-xin [21]. Các nghiên cứu cho thấy các biến
chủng của CPV-2c có khả năng chịu tác động một phần hoặc né tránh được hệ miễn
dịch của chó đã được tiêm phịng với vắc-xin chủng CPV-2b [22] (Hình 1.1).
Mặc dù đã có nhiều loại vắc-xin CPV có hiệu lực giúp giảm tỷ lệ nhiễm và tỷ
lệ tử vong do CPVs gây ra. Tuy nhiên do đặc tính dễ phát sinh những biến chủng
mới của CPVs với độc tính thay đổi thì CPVs vẫn luôn là tác nhân gây bệnh hàng
đầu cho chó nhà và chó hoang [22]. Do đó việc nghiên cứu các biện pháp phòng
ngừa và điều trị bệnh hiệu quả do CPVs là vô cùng quan trọng (Nguồn
/>
Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa của CPVs theo thời gian [22]


11
1.2. Phân loại Canine parvovirus
Phân loại khoa học:
Family (Họ):

Parvoviridae

Subfamilies (Phân họ):

Parvovirinae

Genus (Chi):

Protoparvovirus

Species (Loài):

Carnivore protoparvovirus 1

Virus:

Canine parvovirus

Họ Parvoviridae bao gồm hai phân họ, Parvovirinae và Densovirinae, lây nhiễm
lần lượt trên vật chủ là động vật có xương sống và côn trùng. Tính đến nay, có năm chi
nằm trong phân họ Parvovirinae, bao gồm

Protoparvovirus, Erythrovirus,

Dependovirus, Amdovirus và Bocavirus. CPV nằm trong chi Protoparvovirus, cùng với
Feline panleukopenia virus (FPV), Mink enteritis virus (MEV) và Racoon parvovirus
(RPV). Có hai loại CPV gây bệnh trên chó là CPV-1 và CPV-2. Tuy nhiên, tác nhân
phổ biến gây ra bệnh tiêu chảy cấp trên chó là do CPV-2 còn CPV-1 đã được phân loại
vào trong chi Bocavirus cùng với Parvovirus gây bệnh trên bò [23].

1.3. Cấu trúc genome của CPVs
Canine parvovirus là vi-rút DNA sợi đơn (single strain, ssDNA), đường kính
từ 20-26mm. Genome của CPVs có chiều dài khoảng 5,3 kb. Chứa hai khung đọc
mở (open reading frame, ORF) chính (Hình 1.3).

Hình 1.2. Cấu trúc của Canine parvovirus [24]
Khung đọc mở đầu tiên của nửa đầu 3’ mã hóa hai gen phi cấu trúc NS1 và
NS2, đây là các gen đóng vai trị thiết ́u cho sự nhân lên của vi-rút và gây ra quá
trình apoptosis trong các tế bào vật chủ [24]. Trong đó:


12

NS1 (non-structural protein 1): đây là loại protein đa chức năng hiển thị các
hoạt động endonuclease và helicase cần thiết để bắt đầu và điều khiển quá trình sao
chép DNA của vi-rút. Ngồi ra, NS1 cịn đóng vai trị trong quá trình đóng gói virút và chuyển hóa một số chất xúc tác [24].
NS2 (non-structrual protein 2): đây là loại protein được tạo ra từ khung đọc mở
chứa 87 acid amin đầu tận cùng với NS1 liên kết với 78 acid amin từ một khung đọc
mở tiếp theo. NS2 của CPV gây bệnh trên lồi gặm nhấm đóng vai trị kiểm soát quá
trình lắp ráp và dịch mã protein. Tuy nhiên, theo Wang và cs thì NS2 của CPV được dự
đốn khác với protein của parvovirus gây bệnh ở lồi gặm nhấm. Các đặc tính và chức
năng của protein NS2 của CPV vẫn chưa được nghiên cứu chính xác [24].
Khung đọc mở thứ hai từ nửa đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc, VP1 và VP2,
có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid từ 6 bản sao của VP1 và 54 bản sao của VP2, chúng
còn là kháng ngun chính tạo ra các kháng thể trung hịa và cũng là yếu tố gây độc lực
[25]. Vỏ CPV (capsid) có đường kính khoảng 25 nm, được lắp ráp từ 60 bản sao kết
hợp từ các protein VP1 và VP2, khác nhau bởi sự hiện diện của N- mở rộng đầu cuối
trong minor protein VP1 capsid bao bọc ssDNA của bộ gen. Trong đó:

VP1 chiếm khoảng 10%, hình thành nên một icosa-herdal giúp chúng có khả
năng chống lại acid, bazơ, v.v. Đây là protein có vai trị chủ chốt trong quá trình lây
nhiễm trong tế bào, chúng thường nằm sâu trong capsid và khó bị phát hiện bởi các
kháng thể. Đây là protein cần thiết trong vai trò lây nhiễm của capsid nhưng lại
không đóng góp cao trong việc hình thành vỏ của vi-rút. Vùng kết thúc của VP1 còn
chứa một số nhóm acid amin cơ bản giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm
trình tự được bảo tồn gần cuối vùng kết thúc bao gồm 4 acid amin cơ bản, có nhiệm
vụ vận chuyển các protein vào trong nhân tế bào [26].
VP2 chiếm phần lớn còn lại có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid và là yếu tố
độc lực chính. Các protein Capsid chịu trách nhiệm cho việc gắn vào TFRC
(Transferrin receptor) thụ thể của tế bào chủ. Sự gắn kết này chủ yếu gây ra sự nội
hóa virion thông qua quá trình nội bào hóa clathrin. Liên kết với các thụ thể vật chủ
cũng gây ra sự sắp xếp lại capsid dẫn đến sự tiếp xúc trên bề mặt của VP1 Nendinus, đặc biệt là vùng giống như phospholipase A2 của nó [25].

Hình 1.3. Sơ đồ minh họa genome của chủng CPVs


13
1.4. Phương thức lây nhiễm của CPVs
CPVs có khả năng chống lại tác động của nhiệt độ, chất tẩy rửa và cồn nên
chúng có thể tồn tại rất lâu từ năm tháng trở lên trong môi trường tự nhiên và có khả
năng lây nhiễm rất cao. Nguồn lây nhiễm CPVs là chất thải từ phân của chó bệnh,
nó dễ dàng lây truyền qua lông hoặc chân của những con chó bị nhiễm bệnh và cả
những vật bị ô nhiễm như lồng hoặc giày. Bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp khi tiếp
xúc với phân của chó bệnh hay tiếp xúc gián tiếp qua quần áo, giày dép, thiết bị, dây
xích, chuồn nuôi nhốt, trên da người đã từng tiếp xúc với mầm bệnh hay trong môi
trường bị ô nhiễm như bệnh viện thú y, cửa hàng thú cưng, các cơ sở chăn nuôi
thương mại, vv… Vì vậy việc quản lý và chăm sóc gặp rất nhiều khó khăn do chó
được nuôi rộng rãi với nhiều loại giống khác nhau nên sức đề kháng cũng khác
nhau. Bên cạnh đó các yếu tố như điều kiện nuôi dưỡng, vệ sinh, khí hậu nóng ẩm,
vv... cũng làm cho sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm trở nên nghiêm trọng hơn.
1.5. Đặc điểm sinh bệnh học CPVs
CPVs lây nhiễm trên chó và phát triển rất nhanh, thông thường thời gian ủ
bệnh trong khoảng từ ba đến bảy ngày và sau đó chó xuất hiện các biểu hiện lâm
sàng. CPVs sử dụng nguồn nguyên liệu trong tế bào của vật chủ để tiến hành phân
chia hàng loạt. Đầu tiên, vi-rút tấn công các hạch amidan hoặc hạch bạch huyết tại
vùng hầu họng, tiếp tục xâm nhập vào tế bào lympho trong một hoặc hai ngày rồi
tạo ra nhiều bản sao của nó. Những vi-rút này cản trở đường đi bên trong của các tế
bào lympho, nơi chúng được bảo vệ tránh khỏi hệ thống phòng thủ của vật chủ và
xâm nhập vào máu. Nhiều trong số các tế bào lympho bị nhiễm CPV này cuối cùng
sẽ bị tiêu diệt, làm giảm số lượng bạch cầu. Khi đi vào trong máu, vi-rút tấn công
mạnh vào tủy xương cũng như trong các tế bào xếp dọc theo thành của ruột non.
CPV có thể gây nhiễm trùng tim, dẫn đến viêm cơ tim, chức năng kém và rối
loạn nhịp tim trên và bệnh trở nên đặc biệt nghiêm trọng ở chó non dưới 4 tháng

tuổi. Thống kê cho thấy tỷ lệ tử vong khi nhiễm CPVs trong khoảng 10% đối với
chó trưởng thành và 91% đối với chó con nếu không được điều trị kịp thời [27].
Các thể bệnh điển hình:
Parvovirus đường ruột: tiến triển nhanh, đặc biệt với các chủng mới bao gồm
CPV-2a, -2b, và -2c. Triệu chứng điển hình như nôn mửa dữ dội, tiêu chảy, chán ăn và
mất nước nhiều. Phân chuyển màu xám vàng, có lẫn máu tươi và máu thẫm. Nhiệt độ
o

trực tràng tăng cao (40-41 C) và tăng bạch cầu, đặc biệt là trong các trường hợp
nghiêm trọng. Chết trên chó xảy ra sớm trong vòng 2 ngày sau khi bị bệnh tấn công


14
và thường kết hợp bội khuẩn gram âm hoặc đông tụ nội mạc thành mạch hoặc cả hai
[28].
Bệnh thần kinh: Dấu hiệu thần kinh có thể do sự xuất huyết trong hệ thống
thần kinh trung ương hoặc bị giảm đường huyết trong suốt quá trình bệnh, sự nhiễm
khuẩn hoặc sự rối loạn các ion acid-bazơ [28].
Bệnh về da: Những tổn thương gồm: loét ở gang bàn chân, miệng và màng
nhầy âm đạo. Các hốc trong xoang mũi và các mảng ban đỏ ở bụng và vùng da xung
quanh âm hộ cũng được phát hiện [28].
Viêm cơ tim: CPV gây viêm cơ tim có thể phát triển do lây nhiễm từ dạ con
hoặc bào thai nhỏ hơn 6 tuần thai. Tất cả chó con đều bị ảnh hưởng, chó con bị
nhiễm CPV gây viêm cơ tim đều bị chết hoặc chết sau một thời gian ngắn có biểu
hiện triệu chứng, khó thở, và nôn mửa [28].
Chứng huyết khối: CPV gây ra tình trạng huyết khối động mạch chủ, do sự
xuất hiện các cục máu đông trong động mạch chủ, dẫn đến sự gián đoạn truyền lưu
lượng máu đến các mô được phân đoạn bởi động mạch chủ chó, có thể gây ra các
biến chúng nghiêm trọng [28].
Nhiễm khuẩn nước tiểu: Do sự nhiễm bẩn từ phân của cơ quan sinh dục ngoài kết

hợp với Neutropenia. Bệnh phát triển trên hệ tiết niệu nếu không được điều trị kịp thời
có thể dẫn đến bệnh đường niệu mạn tính (Nguồn: />
Chu kỳ nhân lên của CPV
CPV là một loại vi-rút DNA sợi đơn nhỏ, chưa phát triển. Chu kỳ nhân lên CPV
xảy ra trong nhân của các tế bào đang phân chia vào cuối pha S hoặc đầu pha G2. Sự
lây nhiễm của các tế bào phân chia diễn ra nhanh chóng và vi-rút thường tác động trên
tủy xương và đường tiêu hóa của vật chủ. Một gam phân từ một con chó bị nhiễm trùng
nặng có thể chứa đủ vật chất vi-rút để lây nhiễm cho hơn 10 triệu con chó thông qua
việc tiếp xúc bằng tiêu hóa.[53] Vi-rút ban đầu nhân lên trong mô bạch huyết hầu họng
và sau đó được cho là lây lan qua huyết tương. Biểu mô của đường ruột thường bị
nhiễm vào ngày thứ 4 sau khi nhiễm bệnh. Kháng thể bắt đầu xuất hiện khoảng 5 ngày
sau khi nhiễm trùng và tăng đến mức tối đa vào ngày thứ 7 đến ngày 10. Các dấu hiệu
lâm sàng xuất hiện từ 4 đến 10 ngày sau khi nhiễm bệnh [53].

Sự tương tác giữa virus CPV và vật chủ
Vi-rút tấn công vào tủy xương của vật chủ, làm suy yếu khả năng tự bảo vệ của
cơ thể vật chủ bằng cách phá hủy các tế bào miễn dịch non và gây giảm số lượng bạch
cầu bảo vệ. Vi-rút gây ra sự phá hủy này bằng cách nhắm mục tiêu vào biểu mô


15
của ruột non, lớp niêm mạc có vai trị hấp thụ chất dinh dưỡng và cung cấp màng
bảo vệ quan trọng chống lại sự mất chất lỏng và sự xâm nhập của vi khuẩn từ ruột
vào cơ thể. Các tế bào tạo nên bề mặt biểu mô tồn tại trong thời gian ngắn và được
thay thế liên tục bởi các tế bào mới sinh ra. Vi-rút xâm nhập vào các tế bào biểu mô
mới được sinh ra và vô hiệu hóa khả năng bổ sung chất dinh dưỡng cho bề mặt ruột
của cơ thể vật chủ.
Bằng cách ngăn chặn việc thay thế các tế bào già và gây chết các tế bào mới
sinh ra, khiến cho bề mặt ruột không thể hấp thụ đầy đủ chất dinh dưỡng, gây ra
hiện mất nước trong cơ thể vật chủ. Từ đó, gây ra tiêu chảy dữ dội và buồn nôn là

kết quả ban đầu, nhưng cuối cùng bề mặt ruột có thể bị tổn thương đến mức bắt đầu
phân hủy và vi khuẩn thường sống trong ruột xâm nhập vào thành ruột và đi vào
máu. Điều này gây mất nước đáng kể do tiêu chảy và nhiễm trùng lan rộng bên
trong cơ thể. Tệ hơn nữa, hệ thống miễn dịch của cơ thể đã bị suy yếu, do khả năng
sản xuất các tế bào bạch cầu mới để chống lại nhiễm trùng đã bị cản trở bởi sự xâm
nhập của CPV vào tủy xương có khả năng dẫn đến tỷ lệ tử vong cao đối với vật chủ
(Nguồn: />1.6. Phương pháp phòng và điều trị bệnh
Ở
chó nhiễm CPVs có tỷ lệ tử vong rất cao, do vi-rút gây mất nước, thiếu máu,
nhiễm trùng máu, xuất huyết viêm ruột. Để điều trị bước đầu tiên là điều chỉnh mất nước
và mất cân bằng điện giải. Điều này đòi hỏi phải sử dụng dịch truyền tĩnh mạch có chứa
chất điện giải. Thuốc kháng sinh và thuốc chống viêm được dùng trong trường hợp ngăn
ngừa hoặc kiểm soát nhiễm trùng máu. Thuốc chống co thắt được sử dụng để ức chế tiêu
chảy và nôn mửa. Hầu hết những chó bị nhiễm CPVs có khả năng phục hồi nếu điều trị
tích cực trước khi quá trình nhiễm trùng máu nặng và mất nước xảy ra. Vì những lý do
khác nhau, một số giống có tỷ lệ tử vong cao hơn nhiều so với các giống khác [28].
Sử dụng vắc-xin được coi là phương pháp hiệu quả nhất trong phịng và trị
bệnh do CPVs gây ra. Chó con được tiêm vắc-xin CPVs mũi đầu tiên ở 5 đến 6 tuần
tuổi và tiêm nhắc lại 2 mũi sau mỗi 2 đến 3 tuần và yêu cầu tiêm tăng cường sau
mỗi 1 đến 3 năm [28]. Hiện nay trên thị trường có nhiều loại CPV vắc-xin được
nhập vào nước ta. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào cho thấy được hiệu quả sử
dụng các loại vắc-xin này trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra. Do đó, cần tiếp
tục nghiên cứu về đặc điểm dịch và phân tử của các chủng CPVs nhằm đánh giá khả
năng bảo hộ của CPV vắc-xin cũng như lựa chọn được các chủng vi-rút phù hợp
cho công tác sản xuất CPV vắc-xin đặc hiệu tại nước ta.


16
1.7. Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh do CPVs gây ra
Để chẩn đoán nguyên nhân bệnh là CPVs, có thể sử dụng các phương pháp

dưới đây.
Chẩn đốn theo triệu chứng: CPV có thể gây ra những triệu chứng như lờ
đờ, mệt mỏi, chán ăn, nôn mửa và đi phân ra máu. Tuy nhiên, chỉ dựa vào triệu
chứng bệnh chỉ có thể chẩn đốn trong ít trường hợp. Trên chó, không chỉ có CPV
gây ra các triệu chứng trên mà cịn có một vài chủng vi-rút gây hại đường ruột cũng
biểu hiện như trên.
Chẩn đoán theo nguyên lý kháng thể - kháng nguyên: Đây là phương pháp
phổ biến để phát hiện nhanh sự hiện diện của kháng nguyên CPV trong mẫu bệnh
phẩm (CPV rapid test kit). Kết quả được quan sát thông qua sự biến đổi màu tín
hiệu được thực hiện bởi cơ chất và enzyme của phản ứng (Hình 1.3). Tuy nhiên,
phương pháp này có tỷ lệ kết quả chẩn đốn không chính xác (dương tính giả hoặc
âm tính giả) do thao tác của người sử dụng.

C T
Hình 1.4. Kết quả chẩn đốn nhanh kháng ngun CPVs
Chẩn đoán bằng phương pháp PCR: Đây là phương pháp chẩn đoán dựa trên
trình tự di truyền của CPV. Đây là phương pháp có độ chính xác cao và đặc hiệu
hơn nhiều so với phương pháp kháng thể-kháng nguyên. Phương pháp PCR được
thực hiện dựa trên tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên các vùng trình tự
ít biến đổi nhưng đặc trưng của CPVs (thông tin các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong
chẩn đoán CPVs được trình bày ở phần Phương pháp nghiên cứu). Sản phẩm PCR
được điện di và hiển thị màu trên gel argarose (Hình 3.1).
1.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về lưu hành CPVs
Một số nghiên cứu về CPVs trong nước:
Sự lây nhiễm CPV-2 và sự bùng phát của nó ở Việt Nam đã được nghiên cứu
từ năm 1994 và sau đó được coi là mối quan tâm quan trọng nhất về sức khỏe của
chó với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao ở cả chó nhà và chó hoang [14].