Tạp chí kiểm nghiệm và an toàn thực phẩm tập 4

Tập 4 - Số 1

2021

Địa chỉ: 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội * Tel: 024.39335735 * Fax: 024.39335738
Email: * Website: nifc.gov.vn


Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - tập 4, số 1, 2021
Vietnamese Journal of Food Control - vol. 4, no. 1, 2021

MỤC LỤC

Trang

1. Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex kháng
kháng sinh carbapenem phân lập trong rau ăn sống và thịt chế biến sẵn trên địa bàn thành
phố Hà Nội
Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii
complex in ready-to-eat vegetables and meats in Hanoi

1

2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương thỏ bằng sắc
ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
Determination of esomeprazole in rabbit plasma by liquid chromatography tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS)

10

3.

Lactobacillus sp. và thử nghiệm ứng dụng
trong bảo quản nông sản
Collection of phenyllactic acid from a strain of Lactobacillus sp. and application in agricultural
products preservation

22

4. Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong sản phẩm thịt đã chế biến tại một số chợ khu vực
nam sông Hương thành phố Huế
Assessment of microbiological contamination levels in processed meat products from markets
in southern Hue city

34

5. Xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng khối
phổ hai lần (LC-MS/MS)
Simultaneous determination of Nisin A and Nisin Z in nutritional food by liquid chromatography
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

43

6. Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella spp. phân lập từ thủy
hải sản tươi sống tại các chợ truyền thống trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh
Investigation into infectability and antimicrobial susceptibility of Salmonella spp. isolated from
fresh seafood at traditional markets in Ho Chi Minh city
Trương Huỳnh Anh Vũ, Nguyễn Hoàng Khuê Tú, Huỳnh Yên Hà, Chu Vân Hải

52

7. Chế tạo và khảo sát khả năng tăng cường tín hiệu Raman của đế Silic cấu trúc kim tự tháp/
nano bạc
Fabrication and study of Raman signal enhancement of pyramid/nano-Ag structured Silic
substrate

62

8. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng một số oligosaccharide từ sữa mẹ
trong thực phẩm bổ sung bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

73

dietary supplements by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)


Nghiên cứu khoa học

Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter
baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem phân lập
trong rau ăn sống và thịt chế biến sẵn trên địa bàn
thành phố Hà Nội
Tạ Thị Yến*, Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh, Vũ Thị Hải Hà
Phạm Văn Quân, Nguyễn Thành Trung
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Hà Nội, Việt Nam
(Ngày đến tòa soạn: 26/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 18/03/2021)
Tóm tắt
Acinetobacter spp. là vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở người. Chi Acinetobacter bao gồm
khoảng 65 loài, trong đó nhóm Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex
được xác định là nguyên nhân gây ra hơn 80% trường hợp nhiễm trùng tại bệnh viện ở bệnh
nhân suy giảm miễn dịch. Các phân tích kiểu hình hiện có khơng đủ để xác định chính xác và

phân biệt các lồi Acinetobacter spp. quan trọng về mặt lâm sàng. Trong tổng số 480 mẫu rau ăn
sống và thịt chế biến sẵn được thu thập tại 06 quận nội thành Hà Nội gồm Đống Đa, Hồng Mai,
Hai Bà Trưng, Long Biên, Hà Đơng, Cầu Giấy, có 288 mẫu (chiếm 60%) nhiễm Acinetobacter
spp. Kết quả định danh bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS ghi nhận 208 mẫu (43%, n = 480) nhiễm
Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, trong đó 156 mẫu rau ăn sống
(65%, n = 240) và 52 mẫu thịt (22%, n = 240) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter
baumannii complex. Thử nghiệm kháng sinh đồ bằng các khoanh giấy kháng sinh cho thấy
82% số chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kháng với
kháng sinh imipenem và 30% số chủng kháng với meropenem.
Từ khóa: Acinetobacter spp., Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex,
MALDI-TOF MS, carbapenem.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn Acinetobacter spp. là vi khuẩn gây bệnh phổ biến gây ra các triệu chứng nhiễm
trùng máu, nhiễm khuẩn bệnh viện và tiêu chảy. Ngoài môi trường bệnh viện, vi khuẩn
Acinetobacter spp. cũng đã được tìm thấy trong thực phẩm như rau, táo, dưa, cải bắp, súp lơ,
rau diếp, dưa chuột, ớt, phòng bệnh, củ cải, cà rốt cũng như các loại củ như khoai tây và ngũ
cốc như ngô ngọt. Acinetobacter spp. cũng được xem là ngun nhân gây hỏng thịt xơng khói,
thịt gà, thịt lợn, cá và trứng ngay cả khi chúng được bảo quản trong tủ lạnh hoặc sau khi chiếu
xạ gamma [1].
Trong các lồi vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter thì Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex là tập hợp gồm 04 loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh đã
được phân lập từ đất, nước và thực phẩm bao gồm thịt, cá, trái cây và rau, làm dấy lên lo ngại
*

Điện thoại: 0904959050

Email:
Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

1

Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ...

thực phẩm có thể là nguồn lây nhiễm tiềm ẩn cho con người, đặc biệt là trong các cơ sở y tế [1].
Bên cạnh đó, hiện tượng vi khuẩn kháng đa kháng sinh (MDR) là vấn đề quan ngại trong
điều trị đối với các bệnh nhiễm trùng mắc phải tại bệnh viện và cộng đồng. Tổ chức Y tế Thế giới
gần đây đã xác định tình trạng kháng thuốc kháng sinh là một trong ba vấn đề quan trọng mà
con người đang phải đối mặt. Các vi khuẩn kháng đa kháng sinh nghiêm trọng và phổ biến nhất
được xác định là các loài Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter spp. [2]. Tại Việt Nam, Bộ
Y tế đã ban hành các thông tư và tài liệu hướng dẫn về kháng sinh sử dụng trong điều trị. Dựa
trên Hướng dẫn sử dụng kháng kháng sinh (Ban hành kèm theo Quyết định số 708/QĐ-BYT
ngày 02/3/2015) tác dụng trên Acinetobacter baumannii và Thông tư 19/2018/TT-BYT về Ban
hành danh mục thuốc thiết yếu điều trị nhiễm khuẩn, các kháng sinh carbapenem đang được
khuyến cáo sử dụng điều trị nhiễm khuẩn Acinetobacter baumannii, đặc biệt là imipenem và
meropenem.
Rau và thịt là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam.
Theo báo cáo của Ngân hàng thế giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ rau tại Việt Nam là 0,4 kg rau
mỗi ngày trên người và tỉ lệ tiêu thụ rau tại Hà Nội là 2.800 tấn mỗi ngày [3]. Theo Niên giám
thống kê năm 2019, sản lượng giết mổ và bán ra của gia cầm, thịt lợn tại Hà Nội là 1302,5 và
3328,8 nghìn tấn [4]. Từ đó cho thấy rau và thịt là nguồn tiêu thụ chính cho nhu cầu ăn uống
hằng ngày của người dân Hà Nội. Cũng như các loại thực phẩm khác, thịt và rau ăn sống là
nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và có thể lây truyền chủng vi khuẩn kháng kháng sinh lên
người. Vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex đã được phát
hiện trong một số loại thực phẩm. Tuy nhiên cho đến nay chưa có báo cáo nào về thực trạng
nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex trong rau ăn sống và sản
phẩm thịt kháng kháng sinh được tiêu thụ tại Hà Nội được bán tại các quán bán đồ ăn sẵn để
cung cấp dữ liệu về thực trạng thực phẩm nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh carbapenem tại Hà
Nội cũng như Việt Nam.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định sự lưu hành và tỉ lệ kháng kháng sinh

carbapenem của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex trong mẫu rau
ăn sống và thịt chế biến sẵn bán tại các cửa hàng bán đồ ăn sẵn.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này gồm:
- Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả điều tra cắt ngang, thu thập mẫu ngẫu nhiên và
dựa trên công thức cỡ mẫu để xác định lượng mẫu tiến hành nghiên cứu:
+ 240 mẫu thịt chế biến sẵn (sản phẩm từ thịt lợn, vịt, gà: thịt lợn quay, giò, chả, vịt nướng,
gà luộc).
+ 240 mẫu rau ăn sống bán kèm các sản phẩm thịt (rau diếp, xà lách, húng láng, húng quế,
mùi ta, mùi tàu, ngổ, hành,...).
- Địa điểm thu thập mẫu: tại các cửa hàng bán đồ ăn có kèm rau ăn sống trên địa bàn 06
quận nội thành Hà Nội, bao gồm: Đống Đa, Hồng Mai, Hai Bà Trưng, Long Biên, Hà Đơng,
Cầu Giấy.
2

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung

- Thời gian thu thập mẫu: Năm 2019 - 2020.
- Các mẫu sau đó được bảo quản tại phịng thí nghiệm ở nhiệt độ 4oC - 8oC và được phân
tích trong ngày hoặc vào ngày hơm sau.
2.2. Hóa chất, chất chuẩn
2.2.1. Hóa chất và dụng cụ
Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Buffer Peptone water
(Merck, Đức), TSA agar (Merck, Đức), chromagar Acinetobacter (Chromagar), Mueller Hinton
agar (Merck, Đức), VITEK MS-CHCA (Biomerieux, Mỹ), khoanh giấy kháng sinh carbapenem
(Liofilchem, Ý), mipenem (IMP, 10 µg), meropenem (MRP, 10 µg).

Các dụng cụ được sử dụng bao gồm: Đĩa petri vô trùng (Corning, Mỹ), que cấy vô trùng
(Biologix, Mỹ), khay Vitek (Biomerieux, Mỹ).
2.2.2. Chủng chuẩn
Phát hiện Acinetobacter baumannii trên rau, tính kháng kháng sinh: sử dụng chủng E. coli
ATCC 25922, chủng Acinetobacter baumannii được phân lập trên mẫu bệnh phẩm của bệnh
nhân tại Bệnh viện Thanh Nhàn [5]. Chủng thu nhận từ Bệnh viện đã được giải trình tự, so sánh
với dữ liệu ngân hàng Gen Hoa Kỳ ( xác định độ tương
đồng 100% với chủng Acinetobacter baumannii 2008S11-069.
Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật khối phổ thời gian bay sử dụng nguồn tia laser với sự
trợ giúp của chất nền (MALDI TOF), sử dụng chủng E. coli ATCC 8739.
2.3. Thiết bị
Nồi hấp (Hymaraya, Nhật), tủ sấy (Sanyo, Nhật), cân kỹ thuật D = 0,1 ML802 (Metter
Toledor, Thụy Sĩ), tủ ấm (Memert, Đức), tủ an toàn sinh học cấp 2 (Bio II, Anh), máy đồng nhất
mẫu (Anh), hệ thống VITEK MS (Biomerieux, Mỹ).
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phát hiện Acinetobacter spp. bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống
Việc phát hiện Acinetobacter spp. theo phương pháp truyền thống được thực hiện theo các
bước như sau:
- Cân mẫu: Cân 25 g (từ 0,1 kg rau hoặc thịt đã được đồng nhất).
- Tăng sinh 25g mẫu trong 225 mL đệm peptone kép. Tiến hành nuôi qua đêm 37oC/18 ± 2h.
- Ria lên mơi trường Chromagar Acinetobacter có bổ sung chất bổ sung [6].
- Thu nhận các khuẩn lạc màu đỏ là Acinetobacter spp.
2.4.2. Định danh Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex bằng kỹ thuật
MALDI TOF
Các bước tiến hành định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật MALDI TOF trên thiết bị VITEK
MS theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị, cụ thể như sau:
- Bước 1: Chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA ở 37oC/24h.
Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

3

Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ...

- Bước 2: Vi khuẩn được phết lên từng giếng của khay.
- Bước 3: Nhỏ 0,1 μL dung dịch CHCA.
- Bước 4: Quét mã khay, nhập mã mẫu vào phần mềm Malditof preparation.
- Bước 5: Phân tích trên thiết bị.
- Bước 6: Đọc kết quả trên phần mềm Myla.
2.4.3. Xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter
baumannii complex bằng kỹ thuật kháng sinh đồ
Tính kháng kháng sinh của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex
được thử nghiệm bằng các khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn của tổ chức sức
khỏe động vật thế giới [7], cụ thể như sau:
- Bước 1: Tạo dung dịch chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
complex: 106 - 108 CFU/mL.
- Bước 2: Sử dụng bông tăm vô trùng dàn dịch chủng Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex lên đĩa thạch Muller Hinton agar.
- Bước 3: Hong khô ở nhiệt độ phịng và đặt khoanh giấy kháng sinh có chứa kháng sinh
(nồng độ và các kháng sinh được thể hiện trong (Bảng 1).
- Bước 4: Đo kích thước vịng kháng, đối chiếu với kích thước của chủng đối chiếu (E. coli
ATCC 25922, A. baumannii đối chứng) theo hướng dẫn của tổ chức Phịng Thí nghiệm và lâm
sàng Hoa Kỳ về chuẩn kháng sinh theo Bảng 1 [8].
- Bước 5: Đọc kết quả: kháng, nhạy cảm, không kháng.
Bảng 1. Kháng sinh, nồng độ kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ
(kháng, trung gian, không kháng)
Kháng sinh
Carbapenem

Tên viết tắt

Điểm đọc tiêu chuẩn

Nồng độ
kháng sinh (µg)

S

I

R

Imipenem

IMI

10

≥ 22

19 - 21

≤ 18

Meropenem

MRP

10

≥ 18

13 - 17

≤ 14

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Sự lưu hành vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex
3.1.1. Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Acinetobacter spp. trong thịt và rau sống
Nghiên cứu tiến hành phân tích phát hiện và định lượng vi khuẩn Acinetobacter spp. trong
480 mẫu thịt chế biến sẵn và rau ăn sống tại các quán bán đồ ăn có kèm rau ăn sống thuộc 06
Quận nội thành Hà Nội từ năm 2019 - 2020. Các chủng vi khuẩn màu đỏ xuất hiện trên mơi
trường Chromagar Acinetobacter có bổ sung kháng sinh được xác định là Acinetobacter spp.
(Hình 1).
4

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung

A

B

Hình 1. Vi khuẩn Acinetobacter spp. trên thạch Chromagar Acinetobacter
Chủng vi khuẩn Acinetobacter phân lập từ mẫu
Chủng vi khuẩn A. baumannii đối chứng
Kết quả phân tích 480 mẫu cho thấy có tới 288 mẫu (chiếm 60%) nhiễm Acinetobacter
spp., trong đó có 178/240 mẫu rau (chiếm 74%) và 110/240 mẫu thịt (chiếm 46%) nhiễm
Acinetobacter spp. Xét theo thời gian, năm 2019, trong tổng số 240 mẫu được lấy có 165/240

mẫu rau và thịt (65%) nhiễm Acinetobacter spp. Năm 2020, tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp. trong
240 mẫu thu thập cho tỉ lệ thấp hơn với 123/240 mẫu nhiễm, chiếm 51%. (Bảng 2).
Bảng 2. Tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp. trong thịt chế biến sẵn và rau ăn sống
2019 (n = 240)
Thực phẩm

Mẫu
nhiễm

Thịt chế
biến sẵn
(n = 240)

2020 (n = 240)

Tỉ lệ nhiễm Mẫu nhiễm

Tỉ lệ
nhiễm

2019 - 2020 (n = 480)
Mẫu nhiễm

Tỉ lệ nhiễm

63

53%

47

39%

110

46%

sống
(n = 240)

102

85%

76

63%

178

74%

Tổng

165

65%

123

51%

288

60%

Rau ăn

Kết quả phân tích của nghiên cứu này tương đồng với các kết quả ở nhiều nước trên thế
giới về sự hiện diện của vi khuẩn Acinetobacter spp. trên đối tượng rau ăn sống nhưng có tỉ lệ
nhiễm cao hơn. Trong một nghiên cứu của Berlau và cộng sự [9] được thực hiện năm 1999 ghi
nhận tỉ lệ nhiêm Acinetobacter spp. trong mẫu rau và quả tươi là 17%. Nghiên cứu của HamitonMiler và Shah (2001) cho thấy sự xuất hiện của 02 chủng Acinetobacter spp. trên mẫu rau salad
ăn sống [10]. Tại Hồng Kông (2001), 51% mẫu rau (n = 21) nhiễm Acinetobacter spp [11]. Kết
quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp. trong rau ăn sống (74%)
thấp hơn nghiên cứu của Carvalheira và cộng sự (2017), thực hiện tại Bồ Đào Nha, đã ghi nhận
86,7% rau diếp nhiễm Acinetobacter spp. [12].
Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

5


Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ...

Sự nhiễm các vi khuẩn Acinetobacter spp. có tỉ lệ cao trên rau ăn sống được xác định có
thể do lây nhiễm trong quá trình trồng trọt bắt nguồn từ nguồn nước tưới và đất, hoặc một
nguyên nhân thường thấy tại các nước đang phát triển là rau có thể được rửa tại nguồn nước
ô nhiễm trước khi phân phối ra thị trường. Trong sản xuất nông nghiệp, rau nhiễm các vi sinh
vật gây bệnh có thể liên quan tới quá trình sử dụng nước ao và nước sơng để rửa rau, cách thức
xử lý rau của người trồng rau và lưu trữ rau ở những nơi bị ô nhiễm. Các nghiên cứu trên thế
giới và trong nước đều cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong nước rửa rau, rau ăn sống và

sự ô nhiễm vi sinh lên sản phẩm thực vật bởi nguồn chất thải của con người là một thực tế tại
các nước đang phát triển, nông nghiệp canh tác theo mơ hình vườn ao chuồng. Sự lây truyền
vi khuẩn từ nguồn nước lên rau sống xảy ra trong quá trình trồng trọt đã được biết đến như là
một con đường lây nhiễm trong chuỗi cung ứng thực phẩm và là một hiện tượng tất yếu. Điều
này lý giải cho sự nhiễm khuẩn Acinetobacter spp. trong rau ăn sống thu thập trên địa bàn Hà
Nội với tỉ lệ cao chiếm 74%, khi tại Việt Nam vẫn còn các vùng thâm canh, sử dụng nguồn nước
tưới chưa qua kiểm soát chất lượng để trồng rau, và dễ dàng bắt gặp hình ảnh những người nơng
dân, người bán hàng rửa rau tại các ao hồ, kênh mương trước khi đưa đi tiêu thụ.
Kết quả nghiên cứu này của chúng tơi có sự tương đồng về sự có mặt của vi khuẩn
Acinetobacter spp. với các nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới trong thịt chế biến
sẵn, tuy khác nhau về tỉ lệ nhiễm. Nghiên cứu của Chalchisa và Kenasa tại Nigeria (2019) trên
thịt chế biến sẵn trong cửa hàng ăn của Trường đại học Wollega, cho thấy 10.3 % mẫu nhiễm
Acinetobacter spp. [13]. Một nghiên cứu khác của Oranusl và Bralde [14] cho thấy sự hiện diện
của Acinetobacter spp. trong bánh thịt. Trong đó, chủng vi khuẩn này được xác định là 01 trong
03 chủng vi sinh vật là nguyên nhân gây hỏng thịt trong nghiên cứu của Lulietto và cộng sự [15].
Sự ô nhiễm Acinetobacter spp. trong sản phẩm thịt chế biến sẵn có thể là do q trình xử lý, cắt
lát, đóng gói, và làm lạnh. Nguồn gốc của sự lây nhiễm có thể đến từ các nguyên liệu thô được
sử dụng đã dẫn đến sự lây nhiễm Acinetobacter spp. trong sản phẩm thịt và môi trường nhà bếp
nơi chế biến sản phẩm thịt [15].
3.1.2. Định danh vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex
288 chủng vi khuẩn Acinetobacter spp. thu thập được từ các mẫu nghiên cứu và tiến
hành định danh xác định nhóm vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
complex bằng kỹ thuật MALDI-TOF trên thiết bị VITEK MS. Kết quả cho thấy 208/288 (72%)
chủng Acinetobacter spp. là Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex được
xác định với độ tương đồng 99,9%, tương đương với 43% (208/480) mẫu rau và thịt nhiễm
Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex. Trong đó 156/178 chủng phân
lập từ mẫu rau và 52/110 chủng phân lập từ mẫu thịt là Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter
baumannii complex, lần lượt là 88% và 47% trong nhóm Acinetobacter spp. đã được phân lập;
tương đương 65% (n = 240) mẫu rau ăn sống và 22% (n = 240) mẫu thịt nhiễm Acinetobacter
calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex.

3.2. Vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kháng kháng
sinh carbapenem
Kết quả kiểm tra khoanh giấy kháng sinh thu được tỉ lệ kháng carbapenem cao trên các
chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex được thu thập (Bảng 3). Tỉ lệ
kháng kháng sinh được phát hiện với 82% và 30% của chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex tương ứng với kháng với kháng sinh imipenem và meropenmem.
6

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung

Bảng 3. Tính kháng kháng sinh carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex
Kháng sinh
carbapenem

Tên viết tắt

Nồng độ kháng
sinh (µg)

Số chủng kháng

Tỉ lệ kháng (%)

Imipenem

IMI

10

171

82

Meropenem

MRP

10

62

30

Tỉ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (imipenem và meropenem) trên sản
phẩm thịt và rau ăn sống cao với các chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
complex phân lập được trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân. Trong nghiên cứu của Tran và
cộng sự thực hiện từ năm 2010 - 2014 tại 03 bệnh viện lớn tại Hà Nội (Việt Đức, Thanh Nhàn và
Xanh Pôn), cho thấy 23/528 chủng kháng carbapenem [16]. Điều này cho thấy thực phẩm có thể
là vật chủ trung gian lây truyền vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
complex lên người. Tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm carbapenem cao (82% với immipenem
và 30% với meropenem) có thể xuất phát từ việc sử dụng kháng sinh carbapenem cho điều trị
bệnh nhiễm khuẩn do Acinetobacter baumannii tại các bệnh viện. Nguồn nước thải từ bệnh
viện có chứa mầm bệnh, phát tán ra mơi trường khi chưa xử lý, sẽ phát tán mầm bệnh chứa gen
kháng kháng sinh lên các thực phẩm (rau sống, thịt tươi, …) trong q trình chăn ni, trồng
trọt và giết mổ.
4. KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu trên 480 mẫu rau và thịt sống thu thập tại các cửa hàng bán đồ ăn
sẵn ở 06 quận nội thành Hà Nội cho thấy vi khuẩn Acinetobacter spp. được phát hành trên 288

mẫu (60%), trong đó, 208 mẫu (43%, n = 480) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter
baumannii complex với 156 mẫu rau ăn sống (65%, n = 240) và 52 mẫu thịt (22%, n = 240).
Trong đó, 82% và 30% chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
complex đã được phân lập (n = 208) kháng với kháng sinh imipenem và meropenem.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. H. J. Doughari, P. A. Ndakidemi, I. S. Human, & S. Benade, “The Ecology, Biology and
Pathogenesis of Acinetobacter spp.: An Overview,” Microbes Environments, vol. 26, no. 2,
pp. 101-112, 2011.
[2]. A. Howard, M. O’Donoghue, A Feeney, & R. D. Sleator, “Acinetobacter baumannii: An
emerging opportunistic pathogen,” Virulence, vol. 3, no. 3, pp. 243-250, 2012.
[3]. World Bank, Vietnam food safety risks management : challenges and opportunities: Quản
lý nguy cơ an toàn thực phẩm ở Việt Nam : những thách thức và cơ hội (Vietnamese).
Washington, D.C.: World Bank Group, 2017.
[4]. Tổng cục thống kê, Niên giám thống kê. Nhà xuất bản thống kê. Hà Nội: Nhà xuất bản
Thống Kê, 2019.
[5]. Bệnh viện Thanh Nhàn, “Đề tài: Nghiên cứu qui trình chế tạo bộ kit Multiplex Realtime
Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

7


Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ...

PCR phát hiện một số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại các bệnh viện
Hà Nội,” mã số 01C-08/02-2016, 2016 – 2018.
[6]. A. Y. Ciftci, E. Karakece, A. R. Atasoy, G. Asik, and I. H. Ciftci, “Culture media for detection
of Acinetobacter baumannii selective media for detection of A. baumannii,” Journal of
Microbioly and Experimentation, vol. 2, no. 3, pp. 87-90, 2015.
[7]. World Organisation for Animal Health, “Chapter 2.1.1 Laboratory Methodologies for
Bacterial Antimicrobial Susceptibility Testing,” OIE Manual of diagnostic tests and vaccines

for Terrestrial Animals, 2019.
[8]. Clinical and Laboratory Standard Institute, Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing, 2019.
[9]. J. Berlau, H. M. Aucken, E. Houang, T. L. Pitt, “Isolation of Acinetobacter spp.
including A. baumannii from vegetables: implications for hospital-acquired infections”,
Journal of Hospital Infection, vol. 42, 201-204, 1999.
[10]. J. M. T. Hamilton-MillerSarojShah, “Identity and antibiotic susceptibility of enterobacterial
flora of salad vegetables,” International Journal of Antimicrobial Agents, vol. 18, no. 1, pp.
81-83, 2001.
[11]. E. T. Houang, Y. W. Chu, C. M. Leung, K. Y. Chu, J. Berlan, K. C. Ng, and A. F. B. Chong,
“Epidemiology and infection control implications of Acinetobacter spp. in Hong Kong,”
Journal Clinical Microbiology, vol. 39, no.1, pp. 228-234, 2001.
[12]. A. Carvalheira, Joana Silva, Paula Teixeira, “Acinetobacter spp. in food and drinking water
– A review,” Food Microbiology, 2020.
[13]. W. Chalchisa & G. Kenasa, “Microbial Quality and Safety of Ready-to-Eat Foods in
Cafeterias around Wollega University, Nekemte Campus (Ethiopia),” Research & Reviews:
Journal of Food and Dairy Technology, 2019.
[14]. U. S. Oranusi & W. Braide, “A study of microbial safety of ready-to-eat foods vended
on highways: Onitsha-Owerri, south east Nigeria,” International Research Journal of
Microbiology, vol. 3, no. 2, pp. 066-071, 2012.
[15]. M. F. Lulietto, P. Sechi, E. Borgogni, and B. T. Cenci-Goga, “Meat Spoilage: A Critical
Review of a Neglected Alteration Due to Ropy Slime Producing Bacteria,” Italian Journal
of Animal Science, vol. 14, no. 3, pp. 4011, 2015.
[16]. D. N. Tran, H. H. Tran, M. Matsui, M. Suzuki, K. Shibayama, T. D. Pham, T. T. Van Phuong,
D. A. Dang, H. S. Trinh, C. T. Loan, L. T. V. Nga, H. R. Van. Doom, and H. F. L. Wertheim,
“Emergence of New Delhi metallo-beta-lactamase 1 and other carbapenemase-producing
Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex among patients in hospitals in Ha Noi,
Viet Nam,” European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, vol. 36, pp.
219-225, 2017.

8

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung

Identification of carbapenem - resistant Acinetobacter
calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex
in ready-to-eat vegetables and meats in Hanoi
Ta Thi Yen, Pham Thi Loan, Ninh Thi Hanh, Vu Thi Hai Ha
Pham Van Quan, Nguyen Thanh Trung
National Institute for Food Control, Hanoi, Vietnam
Abstract
Acinetobacter spp. are common pathogenic bacteria. The Acinetobacter genus includes 65
species, of which the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex group has
been identified as the cause of more than 80% of hospital infections in immunocompromised
patients. Existing phenotypic techniques are not sufficient to accurately identify and distinguish
clinically important Acinetobacter spp. In total of 480 samples including raw vegetables and
processed meat which collected in six districts of Hanoi (Dong Da, Hoang Mai, Hai Ba Trung, Long
Bien, Ha Dong, Cau Giay) in which 288 samples (60%) were contaminated with Acinetobacter
spp. The results of identification by MALDI-TOF MS technique recorded 208 (43%, n = 480)
of samples contaminated with Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex,
of which 156 (65%, n = 240) of vegetables and 52 (22%, n = 240) of meat samples. Antibiotic
susceptibility tests using antibiotic paper strips showed that 82% of Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter baumannii complex strains were resistant to imipenem and 30% of the complex
was resistant to meropenem.
Keywords: Acinetobacter spp., Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii
complex, MALDI-TOF MS, carbapenem.

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

9


Nghiên cứu khoa học

Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol trong
huyết tương thỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
Lê Minh Anh1, Nguyễn Thạch Tùng1*, Nguyễn Như Nam1
Bùi Quang Đông2, Phạm Thành Đạt1, Nguyễn Thị Hồng Ngọc2, Trần Cao Sơn2*
1
Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam
2
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Hà Nội, Việt Nam
(Ngày đến tòa soạn: 28/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 15/03/2021)
Tóm tắt
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã được phát triển để định lượng
nồng độ esomeprazol trong huyết tương thỏ. Kỹ thuật QuEChERS được sử dụng để chiết và làm
sạch esomeprazol trong huyết tương. Sau đó, chất phân tích được tách bằng sắc ký lỏng pha đảo
với cột C18 và định lượng bằng khối phổ ba tứ cực. Nguồn ion hóa ESI dương, chế độ theo dõi
ion MRM đã được sử dụng trong nghiên cứu. Pantoprazol được sử dụng làm chất chuẩn nội cho
esomeprazol. Giá trị sử dụng của phương pháp được xác nhận theo hướng dẫn của ICH về thẩm
định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. Kết quả thẩm định cho thấy phương
pháp có độ đặc hiệu tốt, đường chuẩn được xây dựng trong khoảng nồng độ 0,1 - 20 ng/mL,
giới hạn định lượng dưới là 0,1 ng/mL; độ đúng và độ chính xác trong khoảng nồng độ từ 0,1
đến 20 ng/mL đều đáp ứng theo yêu cầu của ICH và AOAC. Hàm lượng chất phân tích trong
mẫu huyết tương ổn định trong 3 chu kỳ đông - rã đơng trong vịng 03 tháng và nồng độ chất
phân tích trong dịch chiết ổn định trong 24 giờ lưu giữ trong bộ tiêm mẫu. Phương pháp được
áp dụng để định lượng nồng độ esomeprazol trong huyết tương thỏ và ứng dụng để so sánh sinh
khả dụng của hai chế phẩm có chứa esomeprazol.

Từ khóa: Esomeprazol, pantoprazol, LC-MS/MS, huyết tương thỏ, QuEChERS.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Esomeprazol (5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl) methyl] sulfinyl}1H-benzimidazol) là hoạt chất thuộc nhóm ức chế bơm proton, được chỉ định điều trị loét dạ
dày - tá tràng, trào ngược dạ dày - thực quản, hội chứng tăng tiết acid dịch vị, dự phòng loét dạ
dày - tá tràng khi sử dụng thuốc chống viêm không steroid, do stress [1-2]. Do đặc tính kém bền
trong mơi trường acid dịch vị nên các chế phẩm chứa esomeprazol đều được bào chế dưới dạng
thuốc giải phóng tại ruột [3].
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu để xác định nồng độ esomeprazol trong dịch
sinh học bằng HPLC-UV hoặc LC-MS/MS. Với HPLC-UV, Talaat và cộng sự (2017) đã xây
dựng phương pháp định lượng nồng độ esomeprazol trong huyết tương và đạt được giới hạn
định lượng dưới (LLOQ) rất thấp 0,092 ng/mL [4]. Tuy nhiên, phương pháp HPLC-UV thường
có độ đặc hiệu thấp và phần lớn các nghiên cứu sử dụng LC-MS/MS để định lượng esomeprazol
trong nền mẫu dịch sinh học. Chunduri và cộng sự (2016) đã nghiên cứu xây dựng phương
*
*

Điện thoại: 0969748898
Điện thoại: 0988683282

10

Email:
Email:

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn

pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương bằng UPLC-MS/MS với LLOQ là 0,1 ng/mL

[5]. Elkady và cộng sự (2018) cũng đã nghiên cứu định lượng nồng độ esomeprazol trong
huyết tương bằng LC-MS/MS với LLOQ là 20 ng/mL, độ thu hồi từ 88,7 -104% [6].
QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe) là kỹ thuật xử lý mẫu để xác định
dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong mẫu thực phẩm do Anastassiades và cộng sự phát
triển [7]. Cơ chế chung của kỹ thuật QuEChERS là làm tăng tính phân cực của pha nước khi
thêm muối chiết từ đó tách pha dung môi hữu cơ khỏi pha nước, chất phân tích được chiết
vào pha hữu cơ và tiến hành phân tích ở các bước tiếp theo. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã ứng
dụng kỹ thuật QuEChERS để phân tích hoạt chất trong dịch sinh học với nhiều ưu điểm vượt
trội như độ nhạy tốt, tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích nhanh, q trình xử lý mẫu đơn giản.
Nghiên cứu này thực hiện xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng esomeprazol
trong huyết tương thỏ bằng LC-MS/MS kết hợp xử lý mẫu bằng kỹ thuật QuEChERS hạn chế
ảnh hưởng của nền mẫu so với nhiều phương pháp định lượng trước đây, nghiên cứu này cũng
đề cập đến độ ổn định của mẫu mà ít nghiên cứu đã cơng bố. Phương pháp được ứng dụng để
phân tích esomeprazol trong huyết tương, phục vụ đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm có
chứa esomeprazol.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và mẫu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là esomeprazol trong huyết tương thỏ. Mẫu nghiên cứu gồm: mẫu
trắng là mẫu huyết tương thỏ khơng có chất phân tích, mẫu chuẩn là mẫu chứa esomeprazol trong
dung mơi acetonitril, mẫu trắng thêm chuẩn là mẫu huyết tương có chứa chuẩn esomeprazol,
mẫu thực là mẫu huyết tương có chứa esomeprazol được lấy và xử lý sau khi cho thỏ uống chế
phẩm có chứa esomeprazol.
2.2. Hóa chất, chất chuẩn và động vật nghiên cứu
Chất chuẩn esomeprazol natri (SKS:0114302.01) hàm lượng 96,31% được đóng gói trong
lọ thủy tinh tối màu (200 mg/lọ), bảo quản ở điều kiện 2oC - 8oC, tránh ánh sáng; và chuẩn nội
pantoprazol (SKS: 0114306.01) có nguồn gốc từ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, muối
magnesi sulfat khan có nguồn gốc từ Đức (TCNSX), muối natri clorid có nguồn gốc từ Trung
Quốc (TCNSX), các dung môi gồm acetonitril (ACN), methanol (MeOH) và acid formic có
nguồn gốc từ Merck (Đức) đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC-MS.
Động vật nghiên cứu là thỏ trắng giống đực trưởng thành (4 - 6 tháng tuổi), khối lượng

khoảng 2 kg, được nhập về trước khi tiến hành thí nghiệm 02 tuần và ni trong Phịng thí
nghiệm dược lý Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.3. Thiết bị và dụng cụ
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần gồm thiết bị khối phổ SCIEX ExionLCTM AD
Triplequad 6500+ (Mỹ) kết nối với sắc ký lỏng LC 20AD XR của SCIEX (Mỹ). Một số thiết bị
phụ trợ khác bao gồm máy ly tâm Mikro 220 (Mỹ); máy ly tâm Hermle Z200A (Mỹ); cân phân
tích (có độ chính xác 0,1 mg) XS105 (Metter Toledo) và các thiết bị, dụng cụ khác trong phịng
thí nghiệm.

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

11


Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol...

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để phân tích esomeprazol

Để tối ưu hóa điều kiện phân tích, tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn esomeprazol 1
µg/mL và pantoprazol 1 µg/mL vào detector MS/MS với nguồn ion hóa phun điện tử ESI
dương. Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử thành các ion con, lựa chọn ion
con có cường độ tín hiệu cao nhất để định lượng và ion con có cường độ thấp hơn để định tính.
Tối ưu hóa năng lượng bắn phá (CE) tự động theo phần mềm Analyst 1.7 của thiết bị. Đối với
điều kiện LC sử dụng cột sắc ký Agilent Eclipse Plus C18 (150 mm x 2,1 mm), kích thước hạt
nhồi 3,5 µm, tốc độ dịng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL, thành phần pha động gồm ACN
và dung dịch acid formic 0,1%, tốc độ dòng là 0,5 mL/phút và tiến hành khảo sát điều kiện
chương trình gradient rửa giải chất phân tích.
2.4.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Điều kiện xử lý mẫu được tối ưu thông qua việc khảo sát một số quy trình sau:

Quy trình 1: Sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng [5]. Hút chính xác 475 µL huyết tương cho
vào ống ly tâm 2 mL. Thêm chính xác 25 µL dung dịch chuẩn nội 100 ng/mL và 500 µL dung mơi
chiết. Lắc xốy trong 1 phút. Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 250 µL lớp
dung mơi phía trên, thổi khơ bằng khí N2, hịa tan lại cắn bằng 250 µL acetonitril. Khảo sát một
số mơi trường chiết với quy trình 1: ethyl acetat (EtOAc), diethyl ether (DE), hỗn hợp methyl tert
buthyl ether (MTBE) : ethyl acetat (8 : 2), hỗn hợp methyl tert buthyl ether: ethyl acetat (5 : 5).
Quy trình 2: Sử dụng kỹ thuật chiết QuEChERS [7]. Hút chính xác 475 µL huyết tương
cho vào ống ly tâm 2 mL. Thêm chính xác 25 µL dung dịch chuẩn nội pantoprazol 100 ng/mL và
500 µL acetonitril. Lắc xốy trong vịng 1 phút. Thêm muối chiết vào mỗi ống ly tâm. Tiếp tục
lắc xốy trong 1 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vịng/phút trong 10 phút. Hút 200 µL lớp
dịch lỏng trên cùng vào lọ mẫu, tiến hành định lượng nồng độ dược chất bằng phương pháp
sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS. Khảo sát các loại muối chiết với quy trình 2: MgSO4, MgSO4
+ NaCl, MgSO4 + PSA, CH3COONH4, MgSO4 + C18 và NH4Cl.
2.4.3. Thẩm định phương pháp
Tiến hành thẩm định phương pháp đã tối ưu thông qua các thông số cơ bản gồm: độ đặc
hiệu; giới hạn định lượng dưới (LLOQ); đường chuẩn; độ đúng và độ chính xác; độ thu hồi; độ
ổn định của huyết tương trong thời gian dài, sau 3 chu kì đơng - rã đơng và sau xử lý - bảo quản
trong bộ phận tiêm mẫu tự động. Các kết quả được đánh giá so sánh với các quy định theo Dược
điển Việt Nam V, ICH, FDA và AOAC [8-11].
2.4.4. Nghiên cứu dược động học
Hai chế phẩm gồm chế phẩm đối chiếu bột pha hỗn dịch Nexium 10 mg hàm lượng 99,7%
so với nhãn (LOT RCWB/EXP 31-03-20) và chế phẩm bào chế micropellet chứa esomeprazol
dạng bào chế giải phóng tại ruột hàm lượng 12,4% được cho uống trên thỏ để xây dựng mơ
hình dược động học khơng ngăn. Thỏ được chia làm 02 nhóm, mỗi nhóm 03 con, khơng cho
ăn vào ngày trước ngày tiến hành nghiên cứu, mức liều tham khảo hướng dẫn của FDA [12].
Nhóm 1 cho uống chế phẩm đối chiếu với liều 2,5 mg/kg. Nhóm 2 cho uống micropellet với
liều 2,5 mg/kg. Sau khi cho thỏ uống thuốc, tiến hành lấy 3 mL máu ở tĩnh mạch tai thỏ cho
vào ống có chứa EDTA tại các thời điểm xác định 0 giờ; 0,25 giờ; 0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ;
12

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn

2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 24 giờ. Ly tâm mẫu máu với tốc độ 6.000 vòng/phút
trong 15 phút. Thu huyết tương, bảo quản ở -10oC trước khi phân tích.
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý các số liệu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. Nồng độ esomeprazol
trong huyết tương được tính tốn bằng phần mềm Analyst 1.7 trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ.
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tối ưu hóa phương pháp phân tích esomeprazol bằng LC-MS/MS
3.1.1 Khảo sát điều kiện về khối phổ
Thiết bị khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hóa phun điện tử, chế độ ion dương được sử
dụng để khảo sát điều kiện ion mẹ và ion con tối ưu. Kết quả được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1. Các ion phân tử và ion con trong phân tích khối phổ
Chất phân tích

Mảnh mẹ
(m/z)

Esomeprazol

346,1

Pantoprazol
(chuẩn nội)

384,0

Mảnh con
(m/z)
198,0
168,0
151,0
138,0
200,0
153,0

CE (eV)

Ghi chú

25
21
29
43
19
23

Định tính (26,6%*)
Định lượng
Định tính (44,8%*)
Định tính (82,9%*)
Định lượng
Định tính (4,7%*)

* Tỷ lệ ion định tính so với ion định lượng
Các thơng số phân tích khối phổ khác được tối ưu bao gồm: Điện thế đầu phun 5.500V;
nhiệt độ đầu phun 450oC; áp suất khí bổ trợ 30 psi; áp suất khí mang 8 psi.

3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Sau khi lựa chọn được ion phân tử, ion con và các điều kiện tối ưu, tiến hành phân tích dung
dịch chuẩn esomeprazol có nồng độ 50 ng/mL và nội chuẩn pantoprazole có nồng độ 50 ng/mL.
Gradient pha động gồm 2 kênh acetonitril và acid formic 0,1% được khảo sát để tối ưu, tốc
độ dịng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL, cột sắc ký Agilent Eclipse Plus C18 (150 mm x 2,1 mm),
kích thước hạt nhồi 3,5 µm. Kết quả điều kiện gradient tối ưu được thể hiện trong Bảng 2.
Bảng 2. Chương trình dung mơi của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Thời gian (phút)
0,00
2,50
5,00
7,00
7,50
10,00

Pha động
Acid formic 0,1 %/H2O (%)

ACN (%)

10
10
90
90
10
10

90
90
10

10
90
90

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

13


Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol...

Hình 1 thể hiện sắc ký đồ của esomeprazol và pantoprazol trong dung môi ACN sau khi
đã xác định được các điều kiện LC-MS/MS. Pic thu được cân đối, nhọn, khơng có hiện tượng
dính pic, điều kiện phân tích là phù hợp để tiến hành định lượng esomeprazol trong huyết
tương.

Hình 1. Sắc ký đồ của chất chuẩn esomeprazol 5 ng/mL (A) và chuẩn nội pantoprazole 5 ng/mL
(B) pha trong dung môi acetonitril
3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
3.2.1. Lựa chọn quy trình
Quy trình 1 sử dụng một số loại dung mơi để khảo sát được tham khảo [5]: ethyl acetat
(EtOAc) QT 1.1, diethyl ether (DE) QT 1.2, hỗn hợp methyl tert buthyl ether (MTBE): ethyl
acetat (8 : 2) QT 1.3, hỗn hợp methyl tert buthyl ether : ethyl acetat (5 : 5) QT 1.4. Quy trình 2 là
phương pháp QuEChERS, sử dụng muối chiết là MgSO4 QT 2. Với quy trình chuẩn bị mẫu như
đã trình bày ở mục 2.4.2. Các kết quả được trình bày ở Hình 2 và Bảng 3.
Pantoprazol

Hiệu suất thu hồi %

Esomeprazol

QT 1.1

QT 1.2

QT 1.3

QT 1.4

Hình 2. Kết quả khảo sát quy trình chiết
14

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

QT 2


Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn

Bảng 3. Hiệu suất thu hồi và ảnh hưởng của nền mẫu với các loại dung môi trong
phương pháp chiết lỏng - lỏng
Loại dung môi

Hiệu suất thu hồi (%)

Ảnh hưởng của nền

Nội chuẩn
96,20

mẫu (% N)

EtOAc

Chuẩn
69,91

DE

47,29

60,53

52,71

MTBE:EtOAc (8 : 2)

69,53

92,83

16,65

MTBE:EtOAc (5 : 5)

68,66

87,51

19,25

24,68

Chú thích: Ảnh hưởng của nền mẫu: N = (Sc – Sspk)/Sc x 100%
Trong đó: Sc là diện tích pic chất phân tích pha trong dung mơi.
Sspk là diện tích pic chất phân tích được thêm vào trước quy trình chiết.
Hiệu suất thu hồi với tất cả các loại dung môi ở cả chất chuẩn (47,3 - 69,9%), chất chuẩn
nội (60,5 - 96,2%) và giữa chất chuẩn so với chất chuẩn nội trong quy trình 1 đều thấp, ảnh
hưởng của nền mẫu trong quy trình 1 lên kết quả lớn (16,7 - 52,7%). Ngược lại, quy trình 2 cho
hiệu suất thu hồi ở cả chất chuẩn (90,7%) và chất chuẩn nội (83,8%) đều cao, đặc biệt là hiệu
suất thu hồi chất chuẩn tăng đáng kể so với quy trình 1. Việc khơng sử dụng bước làm sạch cho
hiệu suất cao trong thu hồi pantoprazol với dung môi ethyl acetat (96,2%) hay MTBE: EtOAc (8
: 2) (92,8%) nhưng ảnh hưởng của nền mẫu cũng cao do dịch chiết vẫn còn nhiều tạp. Kỹ thuật
QuEChERS cho hiệu suất thu hồi cao, hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu, do đó quy trình xử lý
mẫu 2 (kỹ thuật QuEChERS) được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát muối chiết
Loại muối chiết và lượng muối chiết có ảnh hưởng lớn đến độ thu hồi. Cố định nồng độ
thêm chuẩn là 50 ng/mL để thực hiện các bước khảo sát. Một số muối chiết thông thường sử
dụng cho phương pháp QuEChERS được tiến hành khảo sát: MgSO4, MgSO4 + NaCl, MgSO4 +
PSA, MgSO4 + C18, CH3COONH4, NH4Cl [7].
Sau khi hút 450 µL huyết tương trắng đã được xác định là khơng có esomeprazol, thêm
25 µL dung dịch chuẩn nội 1 µg/mL và 25 µL dung dịch chất chuẩn 1 µg/mL, thêm 500 µL
acetonitril và tiến hành chiết mẫu với 06 loại hỗn hợp muối chiết khác nhau: 0,2 g MgSO4 (QT
2.1); 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl (QT 2.2); 0,2 g MgSO4 + 0,05 g PSA (QT 2.3); 0,2 g MgSO4 +
0,05 g C18 (QT 2.4); 0,2 g CH3COONH4 (QT 2.5); 0,2 g NH4Cl (QT 2.6), tiến hành các bước như
quy trình. Kết quả thu được thể hiện trong Hình 3.

Hình 3. Hiệu suất thu hồi của esomeprazol theo các quy trình xử lý mẫu khác nhau
Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

15


Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol...

Sử dụng muối chiết NH4Cl, CH3COONH4 làm cho thể tích lớp acetonitril tách ra ít,
dẫn tới khơng chiết được hồn tồn chất phân tích ra khỏi pha nước. Với các muối chiết còn lại
MgSO4, MgSO4 + NaCl, MgSO4 + PSA, MgSO4 + C18 cho thể tích lớp acetonitril tương đương
nhau, với cách sử dụng hỗn hợp muối MgSO4 + NaCl cho hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn cao nhất.
Do đó, hỗn hợp muối MgSO4 + NaCl được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Như vậy, quy trình xử lý mẫu huyết tương được tối ưu như sau: Hút chính xác 475 µL
huyết tương cho vào ống ly tâm 2 mL. Thêm chính xác 25 µL dung dịch chuẩn nội pantoprazol
100 ng/mL và 500 µL acetonitril. Thực hiện lắc xốy trong vịng 1 phút. Thêm vào mỗi ống ly
tâm hỗn hợp muối chiết 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl. Tiếp tục lắc xốy trong 1 phút. Sau đó ly tâm
với tốc độ 13.000 vịng/phút trong 10 phút. Hút 200 µL lớp dịch lỏng trên cùng vào lọ mẫu, tiến
hành định lượng nồng độ esomeprazol bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS.
3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
3.3.1. Độ đặc hiệu
Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp qua các tiêu chí sau:
+ Tính số điểm IP (IP - Identification point): Theo cách tính điểm IP đối với mỗi ion mẹ
là 1 điểm, mỗi ion con là 1,5 điểm. Kết quả thu được trên mẫu chuẩn và trên mẫu trắng thêm
chuẩn cho thấy esomeprazol và pantoprazol đều có số điểm IP = 5,5 ≥ 4; thỏa mãn yêu cầu phân
tích khối phổ LC-MS/MS của AOAC [10].
A

B

C

Hình 4. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp phân tích xác định nồng độ

esomeprazol trong huyết tương bằng thiết bị LC-MS/MS (A: Sắc ký đồ của mẫu trắng,
B: Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm esomeprazol chuẩn,
C: Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn nội pantoprazol chuẩn)
+ Phân tích mẫu trắng (n = 6), mẫu trắng thêm chuẩn esomeprazol 5 ng/mL và pantoprazol
5 ng/mL theo phương pháp đã được xây dựng. Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (Hình
4A), tại thời điểm 4,39 phút và 4,55 phút trùng với thời gian lưu của esomeprazol và pantoprazol
(Hình 4B và 4C) khơng xuất hiện các pic có mảnh phổ khối m/z = 346,1/168 (đặc trưng của
esomeprazol), mảnh phổ khối m/z = 384/200 (đặc trưng cho pantoprazol). Do vậy, phương
pháp phân tích có độ đặc hiệu với esomeprazol và pantoprazol theo các quy định của phương
pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [9, 11].
3.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành thêm chuẩn vào huyết tương trắng ở các mức nồng độ từ 0,1 đến 20,0 ng/mL
có thêm 5 ng/mL chuẩn nội pantoprazol và phân tích trên LC-MS/MS. Xây dựng đường phụ
16

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn

thuộc giữa nồng độ esomeprazol thu được với tỷ lệ giữa diện tích pic chất chuẩn và diện tích pic
chuẩn nội. Đường chuẩn được lập theo phần mềm của thiết bị, theo phương pháp hồi quy tuyến
tính, sử dụng hệ số tỷ trọng 1/x2. Các kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự
tương quan tuyến tính nồng độ với tỷ lệ tín hiệu của esomeprazol và chuẩn nội, phương trình
hồi quy tuyến tính thu được là y = 0,0345x + 0,0016, với hệ số tương quan tuyến tính r2 > 0,99
và độ chệch < 15% ở tất cả các giá trị nồng độ đạt yêu cầu cho phép theo quy định của phương
pháp pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [9, 11].
3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng nền
Ảnh hưởng nền của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh đường chuẩn pha trên
nền mẫu và trên nền dung môi, trong khoảng nồng độ 0,1 đến 20,0 ng/mL. Kết quả thu được

dựa trên phương pháp hồi quy tuyến tính và được lập trên phần mềm của thiết bị phân tích.
Phương trình hồi quy của mẫu chuẩn là y = 0,0287x + 0,0013, r2 > 0,99; phương trình hồi quy
của mẫu trắng thêm chuẩn là y = 0,0345x + 0,0016, r2 > 0,99. Hệ số góc của 2 đường chuẩn thu
được lệch nhau 16,8% đạt yêu cầu cho phép theo quy định của phương pháp pháp phân tích
thuốc trong dịch sinh học (dưới 20%) [8].
3.3.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Phân tích mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương chứa esomeprazol với nồng độ 0,1
ng/mL. Xác định diện tích pic esomeprazol và chuẩn nội pantoprazol của mẫu LLOQ và xác
định nồng độ esomeprazol có trong các mẫu từ đường chuẩn. Kết quả thẩm định cho thấy tỷ
lệ đáp ứng của pic esomeprazol trong mẫu LLOQ (0,1 ng/mL) so với đáp ứng tại thời gian lưu
trong mẫu huyết tương trắng là 9,0 (lớn hơn 5).
3.3.5. Độ đúng và độ chính xác
Độ đúng và độ chính xác được xác định đồng thời bằng cách sử dụng tối thiểu 3 nồng độ
của mẫu chuẩn kiểm tra, 1 nồng độ gần với giá trị nhỏ nhất của đường chuẩn, 1 nồng độ gần
với giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ gần điểm giữa. Tiến hành thực hiện đánh giá
bằng cách thêm chuẩn vào mẫu huyết tương trắng ở 3 mức nồng độ khác nhau là 0,1 ng/mL;
5 ng/mL và 20 ng/mL (n = 6), nồng độ chuẩn nội pantoprazol là 5 ng/mL, phân tích theo quy
trình đã xây dựng. Các kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 4.
Bảng 4. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp LC-MS/MS
Nồng độ

0,1 ng/mL

5 ng/mL

20 ng/mL

Độ đúng (%)

61,3

99,2

91,9

Độ chính xác (%)

4,69

2,41

3,22

Các kết quả này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng u cầu theo quy định
của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (RSD% không vượt quá 15%) [9, 11]. Độ
đúng thể hiện qua độ thu hồi tại 0,1 ng/mL vượt quá giới hạn theo quy định của ICH (80 - 120%),
nhưng đáp ứng yêu cầu theo quy định của AOAC (độ thu hồi 60 - 115% ) [10]. Hàm lượng khảo
sát thấp (0,1 ng/mL) có thể gây ảnh hưởng đến kết quả xác định độ thu hồi; đây là một điểm hạn
chế của phương pháp và cần được khắc phục trong các nghiên cứu tiếp theo.
Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

17


Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol...

3.3.6. Độ ổn định
Khảo sát 02 lô mẫu tại LQC (mẫu kiểm tra nồng độ thấp 0,1 ng/mL) và HQC (mẫu kiểm
tra nồng độ cao 20 ng/mL) cho các phép thẩm định trong thời gian dài, sau 3 chu kì đơng – rã
đơng, sau xử lí - bảo quản trong lọ mẫu đặt trong bộ tiêm mẫu tự động 24 giờ. Tiến hành phân

tích theo quy trình đã xây dựng, kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương (n = 3) được thể hiện
trong Hình 5 và Hình 6.

Hình 5. Kết quả độ ổn định dài hạn và 3 chu kì đông - rã đông của mẫu (rã lần 1, lần 2 và lần 3
tương ứng với thời gian 1 tuần, 1 tháng và 3 tháng)

Hình 6. Kết quả độ ổn định của mẫu sau chiết – bảo quản trong bộ tiêm mẫu tự động
Các giá trị RSD và độ lệch so với thời điểm ban đầu đều nhỏ hơn 15% cho thấy phương
pháp đảm bảo được yêu cầu về độ ổn định của dược chất trong huyết tương động vật thí nghiệm
[9 - 11]. Tại nồng độ LQC, mức độ dao động về hàm lượng khá lớn, cho thấy sai số của phương
pháp tại mức nồng độ này có dao động lớn; tuy nhiên sai số này vẫn nằm trong giới hạn cho
phép (± 15%).
3.3.7. Ứng dụng phương pháp phân tích esomeprazol trong huyết tương thỏ
Áp dụng quy trình xử lý mẫu và phân tích bằng LC-MS/MS đã được khảo sát và thẩm định
để phân tích định lượng esomeprazol trong huyết tương đối với chế phẩm chứa esomeprazol.
Nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp trên để phân tích các mẫu huyết tương thu được
18

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn

tại các thời điểm xác định khi cho thỏ uống hai chế phẩm chứa esomeprazol. Từ đó xây dựng
mơ hình dược động học cho chế phẩm nghiên cứu bào chế và góp phần đánh giá khả năng hấp
thu của chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu trên thị trường. Hình 7 thể hiện nồng
độ esomeprazol trong huyết tương thỏ theo thời gian.

Hình 7. Nồng độ esomeprazol trong huyết tương thỏ theo thời gian của chế phẩm
nghiên cứu và chế phẩm đối chiếu

Kết quả cho thấy thời gian đạt nồng độ cực đại (Tmax) của chế phẩm đối chiếu lớn hơn so
với chế phẩm thử. Nồng độ cực đại (Cmax) của chế phẩm micropellet bào chế cao gấp 2,24 lần
so với Cmax của chế phẩm đối chiếu. Trong khi đó, diện tích dưới đường cong (AUC0-∞) của chế
phẩm thử cao gấp 1,39 lần chế phẩm đối chiếu. Thời gian bán thải của chế phẩm đối chiếu là
1,367 ± 0,888 giờ, cao hơn chế phẩm thử là 0,962 ± 0,535 giờ. Qua các thông số dược động học
cơ bản, chế phẩm thử cho tác dụng tốt hơn chế phẩm đối chiếu, công thức bào chế micropellet
đang nghiên cứu đúng hướng và cần tiếp tục phát triển.
Các kết quả phân tích mẫu huyết tương tại các thời điểm đạt yêu cầu về độ đúng, độ
chính xác và độ lệch theo quy định của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (sai
khác dưới 15% so với nồng độ lý thuyết tương ứng) [9, 11]. Như vậy, nghiên cứu đã trình bày
về phương pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương thỏ và được thẩm định đầy đủ với
quy trình xử lý mẫu theo phương pháp QuEChERS làm giảm ảnh hưởng của nền và tăng hiệu
quả phương pháp, đặc biệt tiêu chí về độ ổn định đã được thẩm định là điểm khác so với những
nghiên cứu trước đây, làm tăng độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trong việc ứng dụng
đánh giá sinh khả dụng làm cơ sở để nghiên cứu bào chế phát triển thuốc mới chứa esomeprazol.
4. KẾT LUẬN
Sử dụng LC-MS/MS pha đảo kết hợp với xử lý mẫu bằng kỹ thuật QuEChERS, chúng tôi
đã xây dựng được quy trình phân tích esomeprazol trong huyết tương thỏ có sử dụng chuẩn nội
là pantoprazol với độ đặc hiệu đạt yêu cầu ICH, U.S. FDA và AOAC, khoảng tuyến tính 0,1 - 20
ng/mL, độ đúng và độ chính xác với các mẫu nồng độ khảo sát đều đáp ứng theo yêu cầu của
ICH, độ thu hồi đạt yêu cầu AOAC, độ ổn định của esomeprazol trong huyết tương trong 03
chu kỳ đơng - rã đơng trong vịng 03 tháng và trong 24 giờ lưu giữ trong bộ tiêm mẫu đảm bảo
yêu cầu với kết quả RSD và độ lệch so với thời điểm ban đầu nhỏ hơn 15%. Phương pháp đã
được ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm micropellet chứa esomeprazol so với
chế phẩm đối chiếu.
Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

19

Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol...

LỜI CẢM ƠN
Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn tới Dược sĩ Lê Thành Lâm công ty Cổ phần dược
phẩm Mediplantex, công ty Colocon đã hỗ trợ nguyên vật liệu để thực hiện đề tài.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Astrazeneca, “Nexium ® (esomeprazole magnesium) delayed - release capsules”, 2006.
[2]. Medication guide nexium, 2018.
[3]. S. Missaghi,  C. Young,  K. Fegely,  and A. R. Rajabi-Siahboomi, “Delayed release film
coating applications on oral solid dosage forms of proton pump inhibitors: case studies,”
Drug development and industrial pharmacy, vol. 36, no. 2, pp. 180-189, 2010.
[4]. W. Talaat, “Bioanalytical method for the estimation of co-administered esomeprazole,
leflunomide and ibuprofen in human plasma and in pharmaceutical dosage forms using
micellar liquid chromatography,” Biomedical Chromatography, vol. 31, no. 5, 2017.
[5]. R. H. B. Chunduri and G. S. Dannana, “Development and validation of a high throughput
UPLC-MS/MS method for simultaneous quantification of esomeprazole, rabeprazole and
levosulpiride in human plasma,” Journal of Pharmaceutical Analysis, vol. 6, no. 3, pp. 190198, 2016.
[6]. E. F. Elkady, M. A. Fouad, and B. M. Jaadan, “LC-MS/MS bioassay of four proton pump
inhibitors,” Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and
Life Sciences, vol. 1076, pp. 61-69, 2018.
[7]. M. Anastassiades, S. J. Lehotay, D. Stajnbaher, and F. J. Schenck, “Fast and easy multiresidue
method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase
extraction” for the determination of pesticide residues in produce,” Journal of AOAC
International, vol. 86, no. 2, pp. 412-31, 2003.
[8]. United States Food and Drug Administration, Bioanalytical Method Validation Guidance
for Industry, 2018.
[9]. ICH, ICH guideline M10 on bioanalytical method validation, 2019.
[10]. AOAC International, “Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance,” AOAC
official methods of analysis, 2016.
[11]. B. Y. tế, Dược điển Việt Nam V, Phụ lục 14 Hướng dẫn đánh giá sinh khả dụng và tương

đương sinh học in vivo thuốc generic, Nhà xuất bản Y học, 2017.
[12]. United States Food and Drug Administration, Guidance for industry: estimating the
maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy
volunteers, 2015.

20

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021


Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn

Determination of esomeprazole in rabbit plasma by liquid
chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
Le Minh Anh1, Nguyen Thach Tung1*, Nguyen Nhu Nam1
Bui Quang Dong2, Pham Thanh Dat1, Nguyen Thi Hong Ngoc2, Tran Cao Son2
1
Hanoi University of Pharmacy, Hanoi, Vietnam
2
National Institute for Food Control, Hanoi, Vietnam
Abstract
A rapid extraction method was developed and validated for esomeprazole determination
in rabbit plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS).
Esomeprazole in rabbit plasma was extracted and then cleaned up using QuEChERS technique.
The analyte was separated using C18 column and quantified by MS/MS detector. Pantoprazole
was used as the internal standard. The positive ESI source was used in this study together with
the multi-reactive ion monitoring mode. The validity of the method has been confirmed in
accordance with ICH Harmonized guidelines on bioanalytical method validation. The method
showed good specificity, good stability, with the linearity varying from 0.1 ng/mL to 20 ng/mL,
the lower limit of quantification was 0.1 ng/mL, the accuracy and precision were within 85%

and 115% which achieved the ICH Harmonized guideline requirements, FDA guideline and
AOAC International requirements. The method has been applied to quantify the concentration
of esomeprazole in rabbit plasma, and then to compare the bioavailability of two preparations
containing esomeprazole.
Keywords: Esomeprazole, Pantoprazole, LC-MS/MS, rabbit plasma, QuEChERS.

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

21


Nghiên cứu khoa học

Thu nhận acid phenyllactic từ chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.
và thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản nông sản
Vũ Kim Dung*, Nguyễn Như Ngọc, Lê Sỹ Dũng, Vũ Thị Ngọc Hiền
Trường Đại học Lâm nghiệp, Hà Nội, Việt Nam
(Ngày đến tòa soạn: 03/11/2020; Ngày chấp nhận đăng: 28/01/2021)
Tóm tắt
Acid phenyllactic (PLA) là một hợp chất sinh học được sinh tổng hợp từ vi sinh vật, có
khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triển của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương,
cùng nhiều loài nấm men, nấm mốc gây hại thực phẩm. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và
tuyển chọn được chủng Lactobacillus sp. MX3.2 có khả năng sinh tổng hợp acid phenyllactic
cao (1,98 g/L) từ các sản phẩm rau củ muối chua. Chế phẩm PLA thu nhận từ quá trình lên
men chủng Lactobacillus sp. MX3.2 có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc Aspergillus
niger, Aspergillus flavus và Aspergillus oryzae ở nồng độ 40 - 50 g/L và vi khuẩn Escherichia coli,
Salmonella enterica và Shigela flexneri ở nồng độ 20 - 30 g/L. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng
PLA trong bảo quản nông sản - thực phẩm đạt hiệu quả cao. Quả xoài và ớt khi xử lý bằng PLA
2% kết hợp với CaCl2 1% trong 2 phút sau 28 ngày bảo quản vẫn giữ được độ tươi, ngon và chất
lượng cảm quan tốt, kéo dài hơn so với không xử lý 14 ngày.

Từ khóa: Acid phenyllactic, bảo quản, Lactobacillus, tuyển chọn.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nước có rất nhiều loại rau quả nhiệt đới với nhiều giống cây ăn quả đặc
sản phù hợp cho xuất khẩu sang các thị trường ở khu vực khí hậu hàn đới. Tuy nhiên, trong
những năm gần đây xuất khẩu rau quả chỉ chiếm tỷ trọng 2,5% trong tổng giá trị xuất khẩu hàng
hóa và chiếm 2% tổng GDP [1]. Một trong những nguyên nhân chính là do khâu thu hoạch, vận
chuyển và bảo quản kém dẫn đến rau quả sụt giảm về mặt chất lượng rất lớn. Do đó, các nghiên
cứu về việc sản xuất các chất bảo quản an toàn sinh học cũng như giá thành rẻ được thúc đẩy
mạnh mẽ.
Acid phenyllactic là một hợp chất sinh học mới, có tiềm năng ứng dụng như là chất bảo
quản thực phẩm, sinh tổng hợp từ nhóm vi khuẩn lactic, được các nhà khoa học trên thế giới
phát hiện và tập trung nghiên cứu. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng PLA là một hợp chất
an tồn, có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương và nấm men, nấm mốc, đặc
biệt là nhiều loài nấm sinh độc tố [2-4]. Với những lợi ích cũng như tiềm năng đã được kiểm
chứng PLA là sản phẩm rất phù hợp sử dụng cho những đối tượng nông sản, thực phẩm dễ bị
lây nhiễm bởi vi sinh vật gây hại và địi hỏi có tính an tồn cao khi sử dụng.
Trên quy mơ lớn, PLA có thể được thu hồi từ dịch lên men chứa nhiều tạp chất bằng
phương pháp hóa học [5]. PLA trong dịch lên men phản ứng với Ca(OH)2 tạo kết tủa muối
canxi phenyllactat, dùng kết tủa này phản ứng với H2SO4 sẽ tạo ra sản phẩm là PLA dạng dung
dịch và kết tủa CaSO4, sau đó lọc hoặc ly tâm để thu dung dịch PLA.
*

Điện thoại: 0988893382

22

Email:

Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

Vũ Kim Dung, Nguyễn Như Ngọc, Lê Sỹ Dũng, Vũ Thị Ngọc Hiền

Hiện nay, những cơng trình nghiên cứu và ứng dụng PLA trên thế giới và ở Việt Nam
mới dừng ở phạm vi tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh PLA cao để bổ
sung vào thức ăn chăn ni, chỉ có một vài nghiên cứu thử nghiệm sản xuất PLA thơng qua q
trình lên men ở quy mô nhỏ và thử nghiệm bảo quản rau quả chế biến tối thiểu [2, 5]. Do đó
nghiên cứu phân lập và tuyển chọn được chủng Lactobacillus sp. có khả năng sinh tổng hợp acid
phenyllactic cao ứng dụng trong bảo quản nơng sản - thực phẩm rất có ý nghĩa.
Acid phenyllactic được sinh tổng hợp từ nhiều loại vi sinh vật [10], tuy nhiên các loài vi
khuẩn Lactobacillus như: L. plantarum, L. acidophilus, L. paracasei có khả năng sinh PLA cao
hơn [11]. Do vậy, để tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng sinh PLA cao, cần tập trung
phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Rau củ muối thu thập từ chợ Xuân Mai và Hà Đông tại Hà Nội
Chủng đối chứng: Shigela flexneri S1, Samonela enterica ST, Escherichia coli T1,
Staphylococcus aureus SA, Apergillus niger LN02, Apergillus oryzae A4, Apergillus flavus do bộ
sưu tập giống của Bộ môn Cơng nghệ vi sinh - Hóa sinh, Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp
cung cấp.
Hóa chất: mơi trường ni cấy vi sinh vật từ hãng HiMedia và một số hóa chất khác từ
Trung Quốc.
Thiết bị: sử dụng các thiết bị thường quy trong nghiên cứu vi sinh vật, bao gồm: kính hiển
vi (Olympus - Nhật Bản), tủ sấy (Memmert - Đức), tủ nuôi (GYROMAX 737- Mỹ), thiết bị khử
trùng (Hirayama - Nhật Bản), tủ cấy vi sinh (CHCLab - Hàn Quốc).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.
Các chủng Lactobacillus sp. được phân lập theo phương pháp của Nguyễn Thị Minh Hằng
và cộng sự, từ mẫu rau củ muối chua được thu thập từ chợ ở Xuân Mai và Hà Đông - Hà
Nội, dựa trên đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn, tính chất gram, hoạt tính

catalase, khả năng di động, khả năng sinh acid lactic [6].
Sàng lọc chủng có khả năng sinh acid lactic cao: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường MRS
lỏng (Lactobacillus MRS Broth) trong 48 giờ ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Xác định hàm
lượng acid tạo ra bằng phương pháp chuẩn độ Therner [6], từ đó lựa chọn các chủng sinh acid
lactic cao.
Tuyển chọn chủng sinh PLA cao: quá trình tuyển chọn dựa trên nguyên lý PLA phản ứng
đặc hiệu với Ca(OH)2 tạo canxi phenyllactat kết tủa nên chủng vi sinh vật tạo ra lượng lớn PLA
sẽ tạo nhiều kết tủa canxi phenyllactat khi đưa Ca(OH)2 vào dịch ni cấy. Sau đó tiếp tục sàng
lọc các chủng này dựa trên kết quả xác định hàm lượng PLA tạo thành bằng HPLC [10] để lựa
chọn chủng có khả năng sinh PLA cao nhất.
Định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn: Sử dụng Kit API 50 CHL Medium (API system,
France) với 49 loại đường để định tên chủng theo phương pháp của Aras và cộng sự [7].
Tạp chí Kiểm nghiệm và An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021

23