Giáo trình probiotic và prebiotic

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM
PGS.TS. ĐỖ THỊ BÍCH THỦY

GIÁO TRÌNH

PROBIOTIC VÀ PREBIOTIC

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC HUẾ
Huế, 2023
1


Biên mục trên xuất bản phẩm của Thư viện Quốc gia Việt Nam
Đỗ Thị Bích Thủy
Giáo trình Probiotic và Prebiotic / Đỗ Thị Bích Thủy. - Huế : Đại học Huế, 2023.
- 139 tr. : minh họa ; 27 cm
Thư mục cuối mỗi chương

1. Chế phẩm vi sinh 2. Probiotic 3. Prebiotic 4. Giáo trình
615.329 - dc2UH0304p-CIP

Mã số sách: GT/292-2023
2


LỜI NĨI ĐẦU
Các vi sinh vật có tiềm năng probiotic có mặt trong đời sống, trong thực phẩm
hàng ngày. Chúng có thể được đưa bổ sung vào cơ thể thơng qua đường ăn uống các
sản phẩm như sữa chua, nem, tôm chua, dưa cải… Hiện nay, các chế phẩm probiotic
không chỉ có lợi cho con người mà cịn được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản,

chăn nuôi gia súc và xử lý mơi trường.
Các tính chất có tiềm năng probiotic của các lợi khuẩn gồm chống chịu được
điều kiện của dạ dày, kết dính với thành ruột, có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh
trong đường ruột, làm tăng hệ miễn dịch và hoạt độ enzyme glycosidase.
Trong công nghệ thực phẩm, các chủng probiotic được sử dụng làm giống khởi
động trong công nghệ lên men. Bên cạnh tạo ra sản phẩm lên men chức năng, các
chủng probiotic cịn đóng vai trò tạo mùi, tạo vị dễ chịu cũng như kéo dài thời gian
bảo quản.
Prebiotic là thành phần thực phẩm có tác dụng kích thích có chọn lọc sự tăng
sinh trưởng và hoạt động của hệ vi khuẩn trong đường ruột của con người. Hầu hết
các prebiotic được xác định cho đến nay là carbohydrate khơng thể tiêu hóa, lên men
được có tác dụng kích thích sự phát triển của các probiotic trong đường ruột.
Việc sử dụng prebiotic và probiotic cùng nhau sẽ có tác dụng bổ sung và hiệp
đồng với nhau. Vì vậy, thực phẩm có chứa cả probiotic và các thành phần prebiotic
được gọi là synbiotic.
Nội dung cuốn Giáo trình Probiotic và Prebiotic trang bị cho sinh viên kiến
thức chuyên sâu về khái niệm, một số tính chất về tiềm năng probiotic của vi sinh vật,
cơ chế tác dụng của probiotic và prebiotic đối với sức khỏe. Phương pháp phân lập,
định danh và sàng lọc chủng có tiềm năng probiotic, kỹ thuật sản xuất và bảo quản
chế phẩm probiotic và prebiotic cũng như thực phẩm chức năng có tiềm năng
probiotic và prebiotic (synbiotic).
Nội dung giáo trình bao gồm 5 chương:
Chương 1. Vi sinh vật có chức năng probiotic
Chương 2. Tuyển chọn và bảo quản chế phẩm probiotic
Chương 3. Vai trò của probiotic đối với sức khỏe
Chương 4. Cơ chế tác dụng của probiotic
Chương 5. Prebiotic
Mặc dù đã nỗ lực cố gắng để hoàn thiện nội dung của giáo trình, tuy nhiên chắc
chắn khơng tránh khỏi thiếu sót. Chúng tơi rất mong nhận được các góp ý của q
đồng nghiệp và bạn đọc để cuốn sách được hoàn thiện hơn trong lần tái bản sau.

Trân trọng!
Tác giả
PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy
3


MỤC LỤC
Trang
LỜI NÓI ĐẦU

3

Chương 1. VI SINH VẬT CÓ CHỨC NĂNG PROBIOTIC

11

1.1. Định nghĩa probiotic

11

1.2. Tuyển chọn, định danh và khảo sát một số tính chất của các chủng
Lactobacillus và Bifidobacterium

12

1.2.1. Các nguồn phân lập và tuyển chọn các chủng có tiềm năng probiotic

13

1.2.2. Định danh, phân loại và phân tích các chủng vi khuẩn Bifidobacterium

14

1.2.3. Định danh, phân loại các chủng Lactobacillus

21

1.2.4. Một số tính chất về tiềm năng probiotic của các chủng Bifidobacterium
và Lactobacillus

25

1.2.5. Kết luận

30

1.3. Sự kết hợp của probiotic trong thực phẩm

30

1.3.1. Lựa chọn sự kết hợp giữa thực phẩm và vi khuẩn probiotic

31

1.3.2. Trạng thái sinh lý của probiotic

32

1.3.3. Nhiệt độ

33

1.3.4. pH

34

1.3.5. Hoạt độ nước

34

1.3.6. Oxy

35

1.3.7. Các thành phần gây bất lợi cho sự tồn tại của probiotic trong thực phẩm

35

1.4. Sự an toàn của vi sinh vật có chức năng probiotic

35

Chương 2. TUYỂN CHỌN VÀ BẢO QUẢN CHẾ PHẨM PROBIOTIC

46

2.1. Phân lập vi sinh vật có chức năng probiotic

46

2.2. Tuyển chọn vi sinh vật có chức năng probiotic

48

2.2.1. Tiêu chí sản xuất (Tiêu chí chung)

48

2.2.2. Thời gian sống và vận chuyển trong đường ruột (Tiêu chí chung)

48

2.2.3. Các tính chất về sức khỏe (Tiêu chí cụ thể)

52

4


2.2.4. Tiêu chí về an tồn

52

2.2.5. Định danh

54

2.3. Bảo quản vi sinh vật có chức năng probiotic

55

Chương 3. VAI TRỊ CỦA PROBIOTIC ĐỐI VỚI SỨC KHỎE

63

3.1. Ảnh hưởng của probiotic đối với sức khỏe con người

63

3.1.1. Chứng khó tiêu do lactose

64

3.1.2. β-Galactosidase trong các sản phẩm sữa lên men

65

3.1.3. Phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng miệng và sâu răng

65

3.1.4. Phòng ngừa và điều trị tiêu chảy

66

3.1.5. Điều trị hội chứng ruột kích thích (Irritable Bowel Syndrome, IBS)

67

3.1.6. Phịng ngừa và điều trị các bệnh viêm ruột (Inflammatory Bowel

Diseases, IBD)

68

3.1.7. Điều trị nhiễm H. pylori

68

3.1.8. Phòng ngừa nhiễm trùng sau phẫu thuật

68

3.1.9. Phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng đường hơ hấp

69

3.1.10. Phịng ngừa và điều trị các bệnh dị ứng

69

3.1.11. Hiệu ứng chống khối u

70

3.1.12. Giảm cholesterol trong máu

70

3.1.13. Nâng cao các đáp ứng của vaccine

70

3.2. Ảnh hưởng của probiotic đối với sức khỏe vật nuôi

71

3.2.1. Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia cầm

72

3.2.2. Sử dụng probiotic trong chăn nuôi lợn

72

3.2.3. Sử dụng probiotic trong động vật nhai lại

73

3.2.4. Sử dụng probiotic đối với thỏ

74

3.2.5. Sử dụng probiotic đối với thú cưng

74

Chương 4. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA PROBIOTIC

80

4.1. Khả năng bám dính trên thành ruột

80

4.1.1. Sự kết dính vào các tế bào biểu mơ đường tiêu hóa

80

5


4.1.2. Bám dính vào chất nhầy đường ruột

81

4.1.3. Sự tồn tại của probiotic trong ruột người

82

4.1.4. So sánh giữa kết quả in vitro và in vivo

82

4.1.5. Thành phần có tác dụng gây khả năng bám dính

83

4.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất bám dính của probiotic

85

4.1.7. Tính chất bám dính và ức chế của probiotic khơng cịn sống

85

4.1.8. Ảnh hưởng của độ tuổi và bệnh đến sự bám dính

86

4.2. Khả năng ức chế vi sinh vật có hại trong đường ruột của probiotic

87

4.2.1. Acid hữu cơ

89

4.2.2. Hydrogen peroxide

89

4.2.3. CO2

89

4.2.4. Các hợp chất kháng khuẩn phân tử thấp

89

4.2.5. Các tác nhân kháng khuẩn khác

89

4.3. Khả năng tự kết dính của probiotic

90

4.4. Khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

90

4.5. Ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của probiotic

91

4.5.1. Hệ vi sinh vật đường ruột sơ sinh

91

4.5.2. Tầm quan trọng của hệ vi sinh vật đường ruột trong phát triển
miễn dịch

92

4.6. Sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột

92

4.7. Một số vi sinh vật có chức năng probiotic đã được dùng trên thị trường

93

4.7.1. Lactobacillus acidophilus LA-5

93

4.7.2. Lactobacillus acidophilus NCDO 1748

94

4.7.3. Lactobacillus acidophilus NCFM

94

4.7.4. Lactobacillus paracasei ssp. paracasei F19

95

4.7.5. Lactobacillus rhamnosus HN001 và Bifidobacterium lactis HN019

95

4.7.6. Bifidobacterium animalis ssp. lactis BB-12

96

4.7.7. Bifidobacterium longum BB536

97
6

4.7.8. Bifidobacterium longum strain BL46 và BL2C- Probiotic dành cho
người lớn và người cao tuổi

97

Chương 5. PREBIOTIC

108

5.1. Khái niệm về prebiotic

108

5.2. Tóm tắt lịch sử phát triển của prebiotic

109

5.3. Những ưu, nhược điểm của việc sử dụng prebiotic

109

5.4. Các hợp chất có tính chất prebiotic

110

5.5. Sản xuất prebiotic

113

5.6. Cơ chế tác dụng của prebiotic đối với probiotic

119

5.5.7. Điều chỉnh sữa công thức phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột ở
trẻ
sơ sinh

120

5.7.1. Sữa mẹ

120

5.7.2. Sữa công thức của trẻ em

120

5.8. Điều chỉnh sữa công thức phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột ở
người lớn

122

5.8.1. Những ảnh hưởng ở cấp độ chi

122

5.8.2. Những ảnh hưởng ở cấp độ loài

122

5.8.3. Thay đổi sinh lý của hệ vi sinh vật

123

5.9. Biến đổi hệ vi sinh vật đường ruột ở người cao tuổi

123

5.10. Ứng dụng và ảnh hưởng đến sức khỏe của prebiotic

123

5.10.1. Thuốc nhuận tràng

124

5.10.2. Bệnh não gan (Hepatic encephalopathy)

124

5.10.3. Phòng ngừa sơ cấp về dị ứng ở trẻ sơ sinh

125

5.10.4. Cải thiện bệnh viêm ruột (Inflammatory bowel disease, IBD)

125

5.10.5. Phịng chống nhiễm trùng

126

5.10.6. Hấp thụ khống chất

127

5.10.7. Phịng chống ung thư đại trực tràng

127

5.10.8. Giảm nồng độ lipid huyết thanh

128
7


5.10.9. Kiểm soát cân nặng và cải thiện độ nhạy cảm với insulin

128

5.10.10. Tác dụng của prebiotic đối với bệnh tiểu đường

128

5.10.11. Tác dụng của prebiotic đối với bệnh viêm ruột hoại tử

129

5.10.12. Ảnh hưởng của prebiotic đối với rối loạn chuyển hóa

129

5.10.13. Ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản của phụ nữ

130

5.1011. Thực phẩm chức năng dành cho động vật

130

5.11.12. Tính an tồn của prebiotic

130

8


9


1. CHƯƠNG 1

2. VI SINH VẬT CÓ CHỨC NĂNG PROBIOTIC
3.
1.1. Định nghĩa probiotic
Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, theo tiếng Anh là “for life” nghĩa là
“dành cho cuộc sống”, chỉ những vi sinh vật sống trong cơ thể động vật và mang lại
những tác động có lợi cho cơ thể vật chủ. Trải qua nhiều năm khi mà sự hiểu biết về

mối quan hệ của nó giữa sức khỏe đường ruột và sức khỏe nói chung càng ngày càng
tăng, định nghĩa về probiotic đã có những thay đổi nhất định. Năm 1965, Lilly và
Stillwell đã định nghĩa probiotic là “các yếu tố thúc đẩy tăng trưởng được tạo ra bởi
vi sinh vật”. Đến năm 1974, Parker đã định nghĩa probiotic có liên quan đến sự tương
tác giữa vi sinh vật với vật chủ. Theo đó, probiotic là những sinh vật có tác dụng có
lợi cho động vật bằng cách ảnh hưởng đến hệ vi sinh đường ruột. Salminen và cộng
sự (1998) định nghĩa probiotic là một loại thực phẩm bổ sung vi sinh vật có lợi ảnh
hưởng đến sức khỏe của vật chủ. Đến năm 1999, Diplock và cộng sự đã cho rằng
thực phẩm có chức năng probiotic nếu chúng đã được chứng minh một cách thỏa
đáng là ảnh hưởng có lợi đến một hoặc nhiều chức năng trong cơ thể bên cạnh tác
dụng dinh dưỡng, theo đó có liên quan đến việc cải thiện tình trạng sức khỏe tốt hơn
và hoặc giảm nguy cơ mắc bệnh. Trong khi đó, theo Naidu và cộng sự (1999),
probiotic là vi sinh vật có lợi ảnh hưởng đến sinh lý vật chủ bằng cách điều chỉnh hệ
thống miễn dịch của niêm mạc cũng như cải thiện sự cân bằng dinh dưỡng và vi sinh
vật trong đường ruột. Năm 2000, Tannock đã nghiên cứu và thấy rằng việc tiêu thụ
probiotic trong thời gian dài không liên quan đến bất kỳ sự thay đổi mạnh mẽ nào
trong thành phần hệ vi sinh vật đường ruột. Từ đó, ơng đã đề xuất định nghĩa
probiotic là các tế bào vi sinh vật trong đường tiêu hóa có lợi sức khỏe của người.
Schrezenmeir và de Vrese (2001) đã định nghĩa probiotic là chế phẩm có chứa các vi
sinh vật sống, xác định với số lượng đủ lớn, có thể làm thay đổi hệ vi sinh (bằng cách
cấy ghép hoặc khu trú) trong một khoang của vật chủ và bằng cách đó tạo ra các tác
dụng có lợi cho sức khỏe. Theo Reidetal và cộng sự (2003), probiotic là các vi sinh
vật sống khi được sử dụng với lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ.
Như vậy, những điểm chính về probiotic là: (1) Các vi sinh vật sống khi có mặt
trong cơ thể sẽ gây ra tác động có lợi cho vật chủ; (2) Cần được đưa vào với một
lượng phù hợp để mang lại tác động mong muốn.
Các vi sinh vật có tính chất probiotic có mặt trong đời sống, trong thực phẩm
hàng ngày, và có thể được đưa bổ sung vào cơ thể thông qua đường ăn uống các sản
phẩm ăn sống có chứa chúng như sữa chua, nem, tôm chua, dưa cải... Probiotic hiện
10

nay khơng chỉ có lợi cho con người mà cịn được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản,
sử dụng trong chăn nuôi gia súc, trong việc xử lý môi trường.
1.2. Tuyển chọn, định danh và khảo sát một số tính chất của các chủng Lactobacillus
và Bifidobacterium
Trong số các chi vi khuẩn và nấm men có tiềm năng probiotic, phổ biến nhất là
các loài thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium. Việc tuyển chọn chủng vi sinh
vật có tiềm năng probiotic là một quá trình phức tạp và gồm các bước sau:
(1) Xác định nguồn phân lập: Có nhiều nguồn phân lập vi sinh vật có chức năng
probiotic trong đó, phổ biến nhất là ruột động vật hoặc người.
(2) Phân lập và định danh: Đây là bước cần thiết nhất vì khi định danh vi sinh
vật phân lập và tuyển chọn được ở cấp độ lồi mới có bằng chứng cho thấy chúng có
những tính chất có tiềm năng probiotic. Các kỹ thuật kiểu hình và di truyền thường
được sử dụng kết hợp để định danh.
(3) Xác định các tính chất chức năng có tiềm năng probiotic và đánh giá sự an
tồn in vitro của các chủng đã phân lập và định danh. Ngồi ra, ngay cả khi những chi
này có lịch sử lâu dài về việc sử dụng an toàn trong các sản phẩm lên men truyền
thống và một số loài đã được Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (the American
Food and Drug Association) tuyên bố “Được Công nhận là An toàn” (“General
Recognised As Safe”, GRAS) hoặc Cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu (the
European Food Safety Authority, EFSA) xem xét là đủ điều kiện về an toàn (qualified
presumption of safety, QPS), các chủng vi khuẩn mới cần được xác định một số tính
chất để đảm bảo an tồn.
Các chức năng có tiềm năng probiotic có thể được kể đến là: (a) Chống chịu
được điều kiện của dạ dày (khả năng chịu acid và muối mật); (b) Kết dính với thành
ruột; (c) Có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trong đường ruột (khả năng tự kết
dính, đồng kết dính, bám dính với dung mơi); (d) Làm tăng hệ miễn dịch; (e) Khả
năng thủy phân muối mật; và (f) Có hoạt độ enzyme glycosidase. Bên cạnh đó, các
chủng này có các chức năng cơng nghệ như: (a) Chống chịu với điều kiện không thuận

lợi của môi trường (pH, NaCl, nhiệt độ…); (b) Chịu được oxy và (c) Khả năng sống sót
trong điều kiện chế biến và bảo quản.
Các tiêu chí cần đánh giá độ an tồn gồm: (a) Khả năng kháng kháng sinh;
(b) Đánh giá hoạt động chuyển hóa; (c) Sự tạo ra các hợp chất gây độc; và (d) Khả
năng tan máu.
(4) Thử nghiệm các tính chất in vitro, ở mức độ in vivo trên mô hình động vật
và người. Tuy nhiên, probiotic để sử dụng cho người phải được xác nhận với các
nghiên cứu trên người bao gồm cả khía cạnh an tồn (thử nghiệm giai đoạn 1) và hiệu
11


quả (thử nghiệm giai đoạn 2). Giai đoạn 2 nên thiết kế ngẫu nhiên và đối chứng với
giả dược để đo lường hiệu quả của chủng lợi khuẩn so với giả dược và cũng để xác
định các tác dụng phụ có thể xảy ra.
Nội dung của chương này giới thiệu các kỹ thuật hiện tại để định danh các
chủng Lactobacillus và Bifidobacterium và xem xét đặc tính probiotic in vitro của chúng.
1.2.1. Các nguồn phân lập và tuyển chọn các chủng có tiềm năng probiotic
Về cơ bản, tất cả các loài động vật đều chứa các chủng của cả hai chi Lactobacillus
và Bifidobacterium. Tuy nhiên, một loại probiotic hữu hiệu cho người phải có nguồn
gốc từ con người do ruột của con người có khác biệt với ruột của động vật. Vì vậy,
mơi trường dùng để phân lập khơng nhất thiết phải phù hợp với ruột của con người.
Đường tiêu hóa (gastrointestinal tract, GIT) của con người là một hệ sinh thái rất
phức tạp. Hệ vi khuẩn trong GIT có thể đạt được mật độ tế bào cao nhất so với bất kỳ
hệ sinh thái nào. Do đó, sự đa dạng của chúng là thấp nhất. Trong ruột người, các
chủng vi khuẩn lactobacilli và bifidobacteria chiếm ít hơn 5% tổng số hệ vi sinh vật.
Trong vài năm gần đây, nhiều công bố về sự đa dạng của hệ sinh thái GIT đã sử dụng
một số phương pháp sinh học phân tử và khơng phụ thuộc vào mơi trường ni cấy.
Vì vậy, để phân lập các chủng mới, các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống phải được sử
dụng. Môi trường chọn lọc, các điều kiện nuôi cấy cụ thể đã được sử dụng để phân
lập các chủng từ mẫu phân người và được định danh ban đầu bằng đặc điểm hình thái

học dưới kính hiển vi. Các cơng cụ sinh học phân tử, chủ yếu dựa trên trình tự
nucleotide của gene 16S rRNA, cho phép xác định ở cấp độ loài. Với các phương
pháp cơ bản này, một số bộ sưu tập các chủng đã được phân lập từ các mẫu phân
người (và động vật khác). Thông thường, mẫu phân được hiến tặng bởi những người
tình nguyện là người lớn hoặc trẻ sơ sinh khỏe mạnh. Một phần GIT khác được thu
nhận từ người khỏe mạnh và bệnh nhân được gửi đến sinh thiết như đoạn cuối hồi
tràng hoặc niêm mạc đại tràng có thể được sử dụng để phân lập và tuyển chọn
(Mattila-Sandholm và cộng sự, 2002). Hệ vi sinh vật trong phân trẻ sơ sinh phản ánh
thành phần vi khuẩn trong sữa mẹ đã được công bố (Nicklas và cộng sự, 1999). Do
đó, hệ vi sinh vật tự nhiên của sữa mẹ có thể được đề xuất như một nguồn để phân lập
các vi khuẩn probiotic mới.
Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được xác định một số tính chất có tiềm
năng probiotic như sau:
(1) Sự thích nghi với các điều kiện môi trường của đường tiêu hóa: Sau khi
uống, vi khuẩn probiotic phải tồn tại khi đi qua GIT và đến ruột kết để phát huy tác
dụng có lợi của chúng. Độ pH thấp trong dạ dày và nồng độ cao của muối mật trong
ruột non, hoạt động như chất tẩy rửa sinh học phá vỡ màng tế bào, là những điều kiện
bất lợi chính mà probiotic phải vượt qua (Begley và cộng sự, 2005). Margolles và
12


cộng sự (2003) đã cơng bố các chủng Bifidobacterium có khả năng kháng
natrisodium-cholate bằng cách nuôi chúng trong môi trường có nồng độ tăng dần của
hợp chất này. Khả năng kháng thuốc của chúng ổn định và thúc đẩy một số thay đổi
sinh lý giúp cải thiện sự tồn tại của vi khuẩn thích nghi trong mơi trường ruột kết.
Tương tự, Collado và Sanz (2006) đã phát triển một phương pháp để tuyển chọn các
chủng Bifidobacterium kháng acid bằng cách nuôi chúng trong thời gian dài với phân
người. Các chủng có khả năng chống chịu với điều kiện acid dạ dày (pH 2,0) cũng
cho thấy khả năng chống chịu tốt với nồng độ cao của muối mật và NaCl.
(2) Sự chống chịu các điều kiện bất lợi trong đường tiêu hóa kết hợp với tính

chất chức năng cơng nghệ là tiêu chuẩn để tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactobacilli
và bifidobacteria.
Với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử người ta có thể tạo ra các
chủng tái tổ hợp có chức năng probiotic. Tuy nhiên, việc sử dụng các chủng tái tổ hợp
vẫn còn lâu mới được áp dụng trong thực phẩm chức năng, ít nhất là trong khung
pháp lý của châu Âu. Một số chủng Bifidobacterium đã được biến đổi gene để điều trị
chống lại các khối u sau khi uống và chống lại các vi sinh vật gây bệnh đường ruột.
Các chủng Lactobacillus tái tổ hợp hiện đang được nghiên cứu để tăng cường hệ
thống miễn dịch (Hazebrouck và cộng sự, 2007), điều trị chống lại Helicobacter
pylori (Corthesy và cộng sự, 2005) và cải thiện tình trạng viêm ruột kết (Han và cộng
sự, 2006). Mặc dù lồi Lactococcus lactis nói chung khơng được coi là một probiotic,
nhưng các chủng tái tổ hợp đã được tạo ra để điều trị hoặc giảm bớt các bệnh dị ứng
(Adel-Patient và cộng sự, 2005) và viêm đại tràng (Steidler và cộng sự, 2000).
1.2.2. Định danh, phân loại và phân tích các chủng vi khuẩn Bifidobacterium
1.2.2.1. Phân loại vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium
Các chủng thuộc chi Bifidobacterium là các trực khuẩn khơng di động, khơng
hình thành bào tử, có thể có nhiều hình dạng khác nhau, có thể uốn cong nhẹ hoặc có
nhiều nhánh rẽ. Chúng có thể được tìm thấy một cách đơn lẻ, dạng chuỗi, kết đám, ở
dạng chữ “V” khi được ni cấy trong điều kiện phịng thí nghiệm. Đây là những
chủng kỵ khí nghiêm ngặt, mặc dù một số lồi có thể chịu được nồng độ oxy thấp và
chúng có q trình chuyển hóa lên men.
Các lồi thuộc chi Bifidobacterium tạo thành một nhóm phát sinh lồi và trình
tự rRNA 16S của chúng có sự tương đồng trên 93% (Satokari và cộng sự, 2003). Chi
này thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương có G+C cao, thuộc ngành Actinobacteria, lớp
Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bậc b ifidobacteria và họ Bifidobacteriaceae.
Theo cơ sở dữ liệu Danh mục vi khuẩn DSMZ (German Collection of Microorganisms
and Cell Cultures) ( ture), các
13

loài trong chi Bifidobacterium là: B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis,
B. asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum,
B. coryneforme, B. cuniculi, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum,
B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum,
B. pseudolongum, B. psychraerophilum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare,
B. scardovii, B. subtile, B. thermacidophilum và B. thermophilum. Sự phân loại dưới
lồi có các lồi B. animalis (subsp. animalis và lactis), B. pseudolongum (subsp.
globosum và pseudolongum), B. thermacidophilum (subsp. thermoacidophilum và
porcinum) và loài B. longum được chia thành ba loại biotype khác nhau (longum,
infantis và suis).
Hiện nay, các chủng Bifidobacterium đã phân lập được là từ GIT của người và
động vật, thực phẩm và nước thải. Các chủng phổ biến nhất được tìm thấy trong ruột
và phân người là catenulatum, pseudocatenolatum, teecentis, longum, breve,
angulatum, bifidum và dentium, và loài điển hình được phân lập từ các thực phẩm
chức năng là B. animalis subsp. lactis (Masco và cộng sự, 2005); do đó, các chủng
thuộc các lồi này là mục tiêu đầu tiên cho các nghiên cứu nâng cao sức khỏe.

Hình 1.1. Cây phát sinh loài của các chủng Bifidobacterium
dựa trên trình tự 16S rDNA
14


Trong những năm gần đây, nghiên cứu thiết lập cây phát sinh loài đã được thực
hiện (Matsuki và cộng sự, 2003; Sakata và cộng sự, 2006; Ventura và cộng sự, 2004).
Sự xây dựng cây phát sinh loài dựa vào toàn bộ hoặc một phần trình tự của các gene
16S rRNA và một số gene khác. Theo đó, các lồi vi khuẩn bifidobacteria được phân
thành 6 nhóm: B. boum, B. asteroides, B. adolescentis, B. pullarum, B. longum và
B. pseudologum (Hình 1.1).
1.2.2.2. Định danh
Việc định danh chính xác một chủng vi sinh vật là điều kiện tiên quyết để có thể

cơng bố tính an tồn của nó. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng có những sai sót về chất
lượng vi sinh vật và nhãn mác của các sản phẩm probiotic trên thị trường sử dụng cho
người và động vật. Việc kết hợp các vi khuẩn probiotic định danh khơng chính xác
trong các sản phẩm thực phẩm chức năng rõ ràng có tác động đến sức khỏe cộng
đồng, bằng cách làm suy yếu hiệu quả của probiotic và ảnh hưởng đến niềm tin của
công chúng đối với thực phẩm chức năng (Huys và cộng sự, 2006). Do đó, việc sử
dụng các phương pháp thích hợp để định danh vi sinh vật để thực hành sản xuất tốt và
hợp pháp, cũng như để kiểm sốt các chế phẩm sinh học trong q trình sản xuất thực
phẩm và trong quá trình vận chuyển đường ruột của chúng là rất cần thiết.
Theo truyền thống, vi khuẩn bifidobacteria được xác định trên cơ sở điều tra
kiểu hình. Vật chủ mà từ đó vi khuẩn bifidobacteria được phân lập (ví dụ: động vật,
ấu trùng, pullorum, dentium...) thường đại diện cho tiêu chí nhận dạng đầu tiên đối
với nhiều loại vi khuẩn này. Hình thái tế bào, xác định chất chuyển hóa, hoạt động
của enzyme và khả năng sử dụng đường là những đặc điểm kiểu hình được phân tích
phổ biến nhất cho chi này, và cho đến những năm 1960 là tiêu chí nhận dạng duy nhất
được sử dụng. Cụ thể, sự liên kết của hình dạng phân nhánh với sự hiện diện của hoạt
động fructose-6-phosphate phosphoketolase (F6PPK) trong một chủng cho thấy rằng
nó thuộc chi Bifidobacterium (Ventura và cộng sự, 2004). Tuy nhiên, việc xác định
được thực hiện ở cấp độ lồi và kiểu hình cổ điển, chẳng hạn như cấu hình lên men
đường, phân loại huyết thanh transaldolase, thành phần thành tế bào và nghiên cứu
các đồng dạng F6PPK là không đủ để phân biệt loài, loài phụ và nhận dạng mức độ
sinh vật. Hơn nữa, các phương pháp xác định kiểu hình này phụ thuộc điều kiện ni
cấy, tình trạng trao đổi chất của tế bào, và đơi khi thiếu tính ổn định của các yếu tố
quyết định di truyền chịu trách nhiệm cho các kiểu hình đó.
Trong thời gian gần đây, các phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng để
định danh vi sinh vật bằng cách giải trình tự nucleic acid hoặc phân tích các đại phân
tử khác thơng qua phản ứng khuếch đại (polymerase chain reaction, PCR) và lai ghép
với DNA và RNA (Ben-Amor và cộng sự, 2007). Bảng 1.1 trình bày tóm tắt về các
kỹ thuật phân tử được sử dụng để định danh và phân loại vi khuẩn có tiềm năng probiotic.
15

Cho đến nay, phương pháp phân tích trình tự gene rRNA ribosome (rDNA) để
định danh vi khuẩn bifidobacteria là phương pháp phổ biến nhất. Ribosome của vi
khuẩn được cấu tạo bởi protein và ba ribonucleic acid: 5S RNA, 16S RNA và 23S
RNA. Các gene rRNA được sắp xếp trong các rrn operon, trong đó các chủng
bifidobacteria tùy vào lồi mà có 2 đến 6 gene (Schell và cộng sự, 2002; Ventura và
cộng sự, 2004). 16S rDNA có 9 vùng biến đổi (variable region) (V1 đến V9), và ba
gene được phân tách bởi các vùng đệm (spacer rigion). Phân tích chi tiết trình tự 16S
rDNA cũng như các vùng đệm (intergenic transcribed sequence, ITS) giữa các vùng
16S-23S thể hiện các chỉ dấu nucleotide (nucleotide fingerprint) giúp phân biệt ở các
cấp độ phân loại khác nhau. Trình tự 16S đang được sử dụng để phân biệt tất cả các
loài vi khuẩn bifidobacteria, trong khi trình tự 16S-23S rRNA ITS thay đổi nhiều hơn
so với gen cấu trúc 16S rRNA cả về kích thước và trình tự, ngay cả trong các nhóm
phân loại có quan hệ gần gũi, điều này làm cho nó trở thành mục tiêu thích hợp cho
cả việc định danh và phân loại bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu lồi; nó có khả
năng phân biệt cao hơn và cho phép phân biệt các chủng Bifidobacterium khác nhau
trong cùng một lồi.
Gần đây, các phương pháp phân loại có hiệu quả hơn đã được áp dụng để định
danh Bifidobacterium. Phương pháp MLST (multilocus sequence typing) lần đầu tiên
được sử dụng để phân loại vi khuẩn năm 1998, sử dụng các bước giải trình tự DNA
tự động để xác định đặc điểm của các alen có mặt ở “gene giữ nhà” (housekeeping
gene). Vì dựa trên trình tự nucleotide nên nó có tính phân biệt cao và cung cấp các
kết quả rõ ràng. Nhiều gene (tuf, recA, xfp, atpD, groEL, groES, dnaK, hsp60, clpC,
dnaB, dnaG, dnaJ1, purF, rpoC) đã được phân tích trình tự nucleotide để định danh
và phân loại vi khuẩn (Masco và cộng sự, 2004; Ventura và cộng sự, 2004; Yin và
cộng sự, 2005). Một số trình tự của các gene khác (pyk, tal) cũng đã được nghiên cứu
để định danh loài và dưới loài.
Các phương pháp dựa trên PCR được sử dụng rộng rãi và cho phép phân biệt
giữa các chủng của cùng một loài và ở một mức độ nào đó và giữa các lồi. Việc

phân tích các mẫu “dấu vân tay” (fingerprint pattern) có được bằng cách khuếch đại
các đoạn DNA mang lại tiềm năng đáng kể cho việc phân loại chủng vi khuẩn
probiotic. Các kỹ thuật phân tích này bao gồm:
- Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình (random amplification of
polymorphic DNA, RAPD) sử dụng các đoạn mồi trình tự ngẫu nhiên ngắn có khả
năng liên kết với mức độ nghiêm ngặt thấp đối với các trình tự bổ sung một phần
hoặc hồn tồn ở vị trí khơng xác định dọc theo bộ gene. Các “mẫu vân tay” được tạo
ra bằng công nghệ này rất hữu ích để phân biệt các chủng thuộc chi Bifidobacterium
từ nguồn gốc thực phẩm và con người (Ventura và cộng sự, 2006).
16


- Phân tích giới hạn DNA ribosome khuếch đại (amplified ribosomal DNA
restriction analysis, ARDRA) bao gồm việc khuếch đại các gene rDNA (tồn bộ hoặc
một phần) và q trình phân cắt tiếp theo bởi các enzyme cắt giới hạn, do đó việc lựa
chọn enzyme là rất quan trọng để phân loại. Việc định danh đặc hiệu loài thường đạt
được bằng kỹ thuật này (Venema và cộng sự, 2003), mặc dù B. animalis subsp. lactis
và B. animalis subsp. animalis cũng có thể được phân biệt.
- ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence) -PCR, và
REP (enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence) -PCR phân tích các
phần đặc hiệu của các đoạn DNA lặp lại. Các trình tự ERIC là những lần lặp lại đảo
ngược 126-bp và các trình tự REP là những đoạn DNA ngắn (từ 21 đến 65 base) được
phát hiện trong không gian ngoại lai; cả hai đều phân tán khắp bộ gene vi khuẩn
(Tobes và Ramos, 2005). Việc áp dụng ERIC-PCR để định danh bifidobacteria ở cấp
độ loài và dưới loài đã được cơng bố và REP-PCR có thể được coi là một công cụ
kiểu gene đầy hứa hẹn để định danh vi khuẩn bifidobacteria tiềm năng có khả năng
lên đến cấp độ dòng.
Mặc dù các kỹ thuật PCR là phương pháp phổ biến nhất để xác định và loại các
chủng thuộc chi Bifidobacterium, các phương pháp PCR khác bao gồm TGGE/DGGE
(điện di theo gradient nhiệt độ - temperature gradient gel electrophoresis/điện di biến

tính theo gradient - denaturing gradient gel electrophoresis), AFLP (đa hình độ dài
các đoạn khuếch đại - amplified fragment length polymorphism), ELISA (PCR
coupled to enzyme-linked immunosorbent assay), (TAP (triplicate arbitrarily primer))
–PCR, RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn - restriction fragment length
polymorphism) -PCR và PCR đa mồi (multiplex PCR) (Dunne và cộng sự, 2001;
Mullie và cộng sự, 2003) đã được sử dụng để phân loại vi khuẩn bifidobacteria ở cấp
độ loài và dưới loài (Bảng 1.1).
Một số phương pháp định danh và phân loại bifidobacteria bằng cách sử dụng
DNA tổng số (hoặc một phần), bao gồm phân tích plasmid và RFLP của DNA tổng
số đã được sử dụng (Alvarez-Martin và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, phương pháp
PFGE có liên quan đến sự phân giải genomic DNA bằng các enzyme cắt giới hạn
hiếm (rare-cutting restriction enzyme) và sự phân tách của các đoạn lớn thông qua
một điện trường định hướng liên tục, thường được các nhà vi sinh vật học coi là kỹ
thuật tốt nhất để phân loại đặc hiệu chủng. Phương pháp PFGE được thiết kế cho các
loài thuộc chi Bifidobacterium khác nhau (Simpson và cộng sự, 2003; Yeung và cộng
sự, 2004) và có khả năng phân biệt tốt, ví dụ B. animalis subsp. lactis, thường có thể
phân biệt bằng các phương pháp định danh khác xác định sự gần gũi giữa các chủng
(Garrigues và cộng sự, 2005).
Ribotyping là phương pháp lai phổ biến và rộng rãi nhất để phân loại vi khuẩn.
Nó kết hợp lai Southern (Southern hybridization) của các mẫu giới hạn DNA bộ gen
17


với các đầu dị rDNA. Hơn nữa, sự sẵn có của các hệ thống thương mại cho phép
phân tích nhiều loại vi khuẩn một cách tự động. Mặc dù việc phân loại ribotyping có
độ phân biệt thấp hơn so với phân tích PFGE, nhưng nó vẫn được sử dụng rộng rãi để
phân loại bifidobacteria (Matto và cộng sự, 2004; Sakata và cộng sự, 2006).
Trong số các kỹ thuật này, Southern blot và microplate blot cũng đã được sử
dụng để phân loại các chủng thuộc chi Bifidobacterium và việc lai microarray đã phát
triển trong những năm gần đây như một sự thay thế hợp lệ để phân biệt giữa các loài

Bifidobacterium, mặc dù thiết bị đặc biệt và nhân lực có kỹ năng cao là hạn chế.
Phương pháp phân tích sắc ký các acid hữu cơ cũng là một phương pháp để
định danh nhanh Bifidobacterium spp. ở cấp độ chi (Lee và cộng sự, 2001). Người ta
cũng có thể sử dụng phương pháp huỳnh quang để phân tích các amino acid thơm trong
nghiên cứu khảo sát probiotic ở quy mô lớn (Ammor và cộng sự, 2007). Đây là phương
pháp không đắt tiền và phù hợp để định danh nhanh các bifidobacteria đường ruột.
Bảng 1.1. Các phương pháp chính trong định danh
và phân loại các loài Bifidobacterium và Lactobacillus
Phương pháp

Trên cơ sở

Tác dụng

Ưu điểm

Nhược điểm

Phân loại theo
phương pháp
truyền thống
(Phenotyping)

Sự chuyển
hóa của tế bào

Định danh và
phân loại sinh
học

Không cần thiết
bị đặc biệt, hiện
đại

Không chính xác do
sự thay đổi của kiểu
hình và phụ thuộc vào
mơi trường ni cấy
và điều kiện quan sát.

Phổ tồn bộ
protein (Protein
profiles) của tế
bào

Protein của cả
tế bào

Định danh

Dễ thực hiện và
có độ lặp lại cao

Cần có các chủng để
đối sánh (reference
strains) (thư viện phổ
protein của các chủng
đã biết)

Phổ FAME

(FAME profiles)

Các acid béo

Định danh

Giá thành rẻ

Cần có thiết bị đặc
biệt, hiện đại, có kỹ
năng về kỹ thuật và xử
lý kết quả bằng tốn
học.

PCR đặc hiệu lồi
(Species-specific
PCR)/PCR đa mồi
(multiplex PCR)

Gene rRNA,
vùng đệm và
các gene khác

Định danh
một loài hoặc
đa loài, phát
hiện loài vi
sinh vật

Đơn giản,

nhanh và nhạy,
mồi có thể sử
dụng cho nhiều
lồi.

Chỉ có một vài loài
được phát hiện trong
cùng một thời gian.
Các loài chưa biết sẽ
khơng định danh được.
Cần dữ liệu trình tự để
thiết kế mồi đặc hiệu.

18


ARDRA

rRNA
operons

Định danh,
phân loại

Đơn giản, có
Sự thay đổi của trình
thể phân giải với tự gene rRNA
nhiều enzyme cắt
giới hạn.

Giải trình tự gene
rRNA 16S

Gene rRNA

Định danh và
quan hệ kiểu
hình

Đơn giản, giải
trình tự các
đoạn PCR và so
sánh trình tự, có
tính khả dụng
“phổ qt” và
đặc hiệu nhóm

Khuếch đại PCR
và giải trình tự
housekeeping
genes

recA, groESL,
dnaK, hsp60,
tuf, etc.

Định danh và
phân loại

Có độ phân giải Khả thi cho các trình

cao hơn khi so
tự.
sánh vi khuẩn
có quan hệ gần
gũi so với trình
tự 16S rRNA

Ribotyping

Các gene
rRNA

Phân loại và
định danh

Tự động
(Riboprinter,
Qualicon,
DuPont)

Thiết bị đắt tiền

DGGE, TGGE

Gene 16S
rRNA và các
gene khác

Định danh vi
khuẩn, phân

loại quần thể
vi sinh vật

Có thể phân tích
một lượng mẫu
lớn đồng thời;
thơng tin phân
loại vượt trội
liên quan đến
các band chưa
biết

Có sự sai lệch PCR;
các bản sao không
đồng nhất của rDNA
operon; hiệu suất ly
giải và trích ly

PFGE

Tồn bộ
genome

Phân loại

Độ phân giải và
độ lặp lại cao,
sử dụng nhiều
enzyme cắt giới
hạn

Tốn thời gian và chỉ
phân tích được số
lượng mẫu nhỏ

AFLP

Tồn bộ
genome

Phân loại

Độ lặp lại cao

Tốn thời gian, đòi hỏi
kỹ năng kỹ thuật và
tiêu chuẩn cao, đắt tiền

AP-PCR, RAPD

Toàn bộ
genome

Phân loại và
định danh

Đơn giản, dễ
thực hiện, có
thể sử dụng
nhiều primer, rẻ

tiền

Độ lặp lại thấp, chỉ có
một số lượng band nhỏ

19

Thiếu định nghĩa lồi
rõ ràng


ERIC-PCR

Tồn bộ
genome

Phân loại

Nhạy, đặc hiệu
và đơn giản, có
thể so sánh nhiều
mẫu đồng thời

REP-PCR

Tồn bộ
genome

Phân loại

Đơn giản, dựa
Có sự sai lệch PCR
trên kỹ thuật PCR

TAP-PCR

Tồn bộ
genome

Phân loại

Độ lặp lại cao

Có sự sai lệch PCR

RISA, ARISA

rRNA vùng
đệm

Phân loại vi
khuẩn, phân
nhóm vi sinh
vật

Độ lặp lại cao,
tự động

Có sự sai lệch PCR;
Cần một lượng lớn

DNA

Có sự sai lệch PCR,
cần cẩn thận và chuẩn
hóa kỹ thuật

FAME: fatty acids methyl esther; ARDRA: amplified ribosomal DNA restriction
analysis; DGGE, TGGE: denaturing gradient gel electrophoresis, termal gradient gel
electrophoresis; PFGE: pulsed field gel electrophoresis; AFLP: amplified fragment
length polymorphism; AP-PCR, RAPD: arbitrarily primed PCR, also know as
random amplification of polymorphic DNA; ERIC: enterobacterial repetitive
intergenic consencus sequence; REP-PCR: repetitive extragenic palindromic
elements-PCR; TAP-PCR: triple abitrary primed-PCR; RISA, ARISA: ribosomal
intergenic spacer analysis, automatic ribosomal intergenic spacer analysis.
1.2.3. Định danh, phân loại các chủng Lactobacillus
1.2.3.1. Phân loại
Chi Lactobacillus là nhóm lớn nhất trong số các vi khuẩn lactic (LAB). Hiện
nay, chi này có hơn 120 loài và 20 dưới loài (Felis và Dellaglio, 2007). Lactobacilli là
một nhóm lớn, Gram dương, hình que khơng sinh bào tử hoặc coccobacilli với hàm
lượng G+C thường dưới 50 mol%. Lactobacilli thuộc nhóm Firmicutes, lớp Bacilli,
bộ Lactobacillales và họ Lactobacillaceae. Chúng có thể lên men đồng hình hoặc dị
hình, hiếu khí hoặc kỵ khí, nhu cầu dinh dưỡng phức tạp (gồm carbohydrate, amino
acid, peptide, ester của các acid béo, muối, dẫn xuất của nucleic acid, vitamin).
Chúng có phân bố tự nhiên với nhiều loại mơi trường có nguồn gốc động thực vật
giàu dinh dưỡng. Nhiều loài được sử dụng trong sản xuất và bảo quản thực phẩm lên
men cũng như thức ăn từ nông sản như sữa, thịt, rau và ngũ cốc. Hơn nữa, một số loài
được sử dụng làm giống khởi động trong lên men thực phẩm như sữa chua, pho mát,
rau quả lên men (ô liu, dưa chua và dưa bắp cải), thịt lên men (xúc xích), bột chua và
các mặt hàng thực phẩm làm từ ngũ cốc khác. Mặc dù ít hơn vi khuẩn bifidobacteria,
20

nhưng lactobacilli là có nhiều trong đường tiêu hóa và bộ phận sinh dục của người và
động vật. Tại đó, chúng đóng vai trị quan trọng trong việc duy trì và phục hồi sức
khỏe. Một lượng lớn các chủng đã được sử dụng làm chế phẩm probiotic trong hơn
70 năm. Tác dụng có lợi của lactobacilli bao gồm bám dính và bảo vệ niêm mạc ruột
và sinh dục, ức chế vi khuẩn gây bệnh, điều hòa miễn dịch và đồng hóa cholesterol.
1.2.3.2. Định danh
Việc định danh chính xác là mục tiêu chính của các nghiên cứu phân loại vi
khuẩn đồng thời đóng vai trị quan trọng khi ứng dụng trong cơng nghiệp. Nghiên cứu
về hình thái tế bào, nhuộm Gram, và các phản ứng sinh hóa (lên men carbohydrate,
sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, nồng độ muối...) là các phương pháp truyền
thống để phân loại ban đầu các loài Lactobacillus. Các phương pháp này vẫn đang
được sử dụng. Dựa trên các đặc điểm về kiểu hình và các phản ứng sinh hóa, lactobacilli
được chia thành ba nhóm dựa vào khả năng lên men các loại đường khác nhau. Nhóm
thứ nhất là các lồi lactobacilli lên men đồng hình bắt buộc đường hexose thơng qua
q trình đường phân và tạo ra sản phẩm chủ yếu là lactic acid. Nhóm thứ hai là các
lồi lên men dị hình bắt buộc theo con đường 6-phospho-gluconate/phospho-ketolase
(6PG/PK) và ngoài sản phẩm là lactic acid cịn có các sản phẩm khác như CO 2,
ethanol. Nhóm thứ ba bao gồm các lactobacilli lên men dị hình tùy tiện; theo đó,
chúng có thể lên men các đường hexose qua con đường đường phân và pentosophosphate
(6PG/PK). Việc phân tích kiểu hình tốn nhiều thời gian và địi hỏi kỹ năng kỹ thuật
cao, thí nghiệm và điều kiện quan sát chuẩn xác để tránh kết luận chủ quan. Hơn nữa,
các loài Lactobacillus thể hiện mức độ biến đổi kiểu hình cao. Do đó, sự khơng đồng
nhất về kiểu hình làm cho các phương pháp này trở nên không đáng tin cậy. Trên
thực tế, nhiều nghiên cứu nhấn mạnh rằng phân loại kiểu hình của lactobacilli là
khơng đạt yêu cầu (Ahrne và cộng sự, 1998).
Phân loại của các loài Lactobacillus đã thay đổi đáng kể với kiến thức ngày
càng tăng về cấu trúc bộ gen và các mối quan hệ phát sinh loài của chúng được thu
thập bằng các phương pháp phân tử.

- Kỹ thuật lai DNA-DNA vẫn mang tính chất tham khảo, mặc dù kỹ thuật này
tốn nhiều cơng sức và thời gian.
- Phân tích ester của methyl acid béo (Fatty acid methyl ester, FAME) cũng đã
được áp dụng để xác định lactobacilli từ các nguồn sữa và chế phẩm sinh học (Yeung
và cộng sự, 2002). Đây là một quy trình rẻ tiền cũng giúp nghiên cứu sự đa dạng,
thành phần và sự biến đổi của các quần thể vi sinh vật. Tuy nhiên, thành phần các
FAME khó giải thích và cần phải xử lý tốn học.
- Việc định danh và phân loại các loài Lactobacillus cũng đã được thực hiện
bằng cách phân tích tồn bộ các phân tử protein trong tế bào (Doan và cộng sự, 2012).
21


Nhờ các điều kiện SDS-PAGE được tiêu chuẩn hóa cao nên việc định danh nhanh
chóng và chính xác một số lượng lớn các chủng. Phổ protein của các chủng chưa biết
được so sánh với cơ sở dữ liệu của các loài đã biết.
Hiện nay, phần lớn các phương pháp định danh Lactobacillus dựa vào việc phân
tích gene rRNA sau khi khuếch đại một phần hoặc toàn bộ của chúng bằng kỹ thuật
PCR (Bảng 1.1). Các gene rRNA là cơ sở tiềm năng để định danh và phân tích phát
sinh lồi của vi khuẩn. Do đó, việc khuếch đại PCR và giải trình tự các đoạn mồi của
16S rDNA hoặc 23S rDNA đã được sử dụng thành công để phát hiện và định danh
các loài Lactobacillus (Ventura và cộng sự, 2000). Một số kỹ thuật khuếch đại
thường được phân cắt bởi các enzyme cắt giới hạn đặc biệt là giải trình tự chuỗi kép.
Khi định danh bằng giải trình tự 16S rDNA có độ tương đồng phải trên 97%. So sánh
trình tự gene rRNA (chủ yếu là rRNA 16S) cho phép định danh chính xác và đồng
thời có thể xác định được mối quan hệ giữa các lồi. Việc phân tích trình tự 16S
rDNA đã chỉ ra rằng các lồi lactobacilli thành ba nhóm là khơng phù hợp với mối
quan hệ tự nhiên của chúng. Trên thực tế, các loài Lactobacillus phân nhánh thành
nhiều nhóm (Hình 1.3). Hiện tại, các mồi đặc hiệu có thể sử dụng để định danh hầu
hết các loài Lactobacillus (Song và cộng sự, 2000).
Bên cạnh các gene rRNA, việc phân tích ITS cũng được sử dụng để định danh

vi sinh vật. Dựa trên gene hoặc vùng ITS, kỹ thuật PCR đa mồi của các cặp mồi đặc
hiệu loài đã được phát triển để phát hiện lên đến 11 loài LAB khác nhau (Settanni và
cộng sự, 2005). Tương tự như mồi oligonucleotide, đầu dị oligonucleotide cũng có
thể được sử dụng để phát hiện, định danh các loài Lactobacillus (Park và Itoh, 2005).
Sự khác biệt nucleotide trong các gene 16S rRNA cũng có thể được khai thác để phân
tách bằng điện di các sản phẩm PCR bằng kỹ thuật DGGE hoặc TTGE. Các kỹ thuật
này có thể được sử dụng để định danh các chủng riêng lẻ hoặc để phân tích sự
đa dạng và tiến hóa của tồn bộ quần thể hỗn hợp vi khuẩn phức tạp (Ogier và cộng
sự, 2004).
Các gene mã hóa của các protein như RecA, GroESL và yếu tố kéo dài (EF) Tu
đều đã được sử dụng để định danh các loài lactobacilli và xác định mối quan hệ phát
sinh lồi của chúng. Trình tự gene này cung cấp độ phân giải phát sinh loài tương
đương với gene 16S rRNA ở tất cả các cấp độ phân loại và khả năng phân giải tốt hơn
giữa các sinh vật có quan hệ gần gũi, vì tốc độ tiến hóa trong gene mã hóa protein cao
hơn một bậc so với gene 16S rRNA. Việc so sánh các trình tự của gene fructose-1,6bifosphatase (fbp) đã được sử dụng để định danh và phân loại các chủng vi khuẩn
Lactobacillus rhamnosus trong thực phẩm (Roy và Ward, 2004).

22


Hình 1.3. Cây phát sinh lồi thể hiện mối quan hệ của trình tự 16S rDNA
của các chủng loại của các lồi Lactobacillus
Các phương pháp phân loại rất hữu ích trong việc phân biệt các chủng đã được
bảo hộ bằng sáng chế, cũng như phân biệt các giống khởi động và chế phẩm probiotic
với các chủng phân lập tự nhiên. Đối với các khía cạnh an tồn, điều chủ yếu là có thể
so sánh các chủng gây bệnh với các chủng probiotic đang được sử dụng. Bên cạnh
các phương pháp kiểu hình, nhiều phương pháp phân loại có sử dụng kỹ thuật PCR
đã được sử dụng để phân loại lactobacilli, chẳng hạn như ribotyping, RAPD, PFGE,
TAP-PCR, AFLP, REP-PCR, ERIC-PCR...
23

Kỹ thuật MLST gần đây đã được áp dụng để định danh và nghiên cứu phát sinh
loài của các chủng Lactobacillus. Một phương pháp MSLT dựa trên phân tích sáu
loci gene (pgm, ddl, gyrB, purK1, gdh và mutS) đã được phát triển để định danh các
chủng L. plantarum (De las Rivas và cộng sự, 2006).
Việc giải trình tự genome và comparative genomic cung cấp những hiểu biết
sâu sắc về sự tiến hóa của vi khuẩn sẽ ảnh hưởng đến phân loại vi khuẩn trong tương
lai gần. Trên thực tế, thông tin trình tự gene và genome gần đây đã được xem như
một cơng cụ để xác định khái niệm lồi phát sinh, loài sinh vật nhân sơ. Comparative
genomic đã củng cố thêm ý tưởng rằng các lactobacilli không tạo thành một nhóm
phát sinh lồi nhất qn, hỗ trợ việc nhận biết các nhóm phụ mới. Trên thực tế, một
số lồi (L. salivarius, L. plantarum) có quan hệ họ hàng gần với Enterococcus
faecalis hơn là với các loài lactobacilli khác. Và các lồi khơng phải lactobacilli khác
như Pediococcus pentosaceus có thể là một nhóm hoặc chi riêng. Các kỹ thuật
genome như lai comparative genomic (CGH) có thể nhanh chóng được sử dụng để
xác định genome của chủng vi khuẩn chưa được biết đến (Molenaar và cộng sự, 2005).
1.2.4. Một số tính chất về tiềm năng probiotic của các chủng Bifidobacterium và
Lactobacillus
Để tuyển chọn các chủng probiotic người ta dựa vào các chỉ tiêu được sử dụng
như khả năng sống sót trong môi trường GIT (chịu được pH thấp và nồng độ muối
mật cao), khả năng kết dính và hoạt tính kháng khuẩn thông qua việc sản xuất các
phân tử kháng khuẩn hoặc khả năng ức chế/thay thế sự bám dính của mầm bệnh. Một
số xét nghiệm in vitro và in vivo được sử dụng để sàng lọc các đặc điểm này, mặc dù
thiếu phương pháp chuẩn hóa hoặc thống nhất để đánh giá chức năng của probiotic.
Bảng 1.2 tóm tắt một số cơng trình cơng bố về tuyển chọn các đặc điểm lợi khuẩn
phổ biến nhất trong các bộ sưu tập Lactobacillus, Bifidobacterium và các chủng
LAB khác.
Bảng 1.2. Sàng lọc các đặc điểm của probiotic Lactobacillus và Bifidobacterium
được phân lập từ các nguồn khác nhau

Chủng
(số chủng)
Bifidobacterium

Nguồn
phân lập
Phân trẻ
em

Tính chất probiotic
được nghiên cứu
Khả năng sống sót
trong các điều kiện GIT
Sự bám dính/Sự tồn
tại trong GIT
Hoạt tính kháng khuẩn

24

Kết quả

Nguồn

Khơng có tất cả các đặc
tính mong muốn; hầu
hết khả năng bám dính
và khả năng ức chế vi
khuẩn gây bệnh kém

Zavaglia và

cộng sự,
1998


Bifidobacterium

Người, sữa

Khả năng sống sót
trong các điều kiện
GIT

Một chủng (B. lactic)
sống sót

Crittenden
và cộng sự,
2001

Bifidobacterium

Phân
người

Hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng ức chế phụ
thuộc vào loài vi khuẩn
gây bệnh

Bevilacqua
và cộng sự,
2003

Bifidobacterium

Người,
động vật

Sự ức chế/sự tồn tại
trong GIT

Sự bám dính và hoạt
động kháng khuẩn tùy
thuộc vào chủng và
nguồn gốc

Collado và
cộng sự,
2005

Hoạt độ kháng khuẩn

Bifidobacterium

Người, bộ
sưu tập
ni cấy

Sự bám dính/sự tồn

tại trong GIT

Hoạt tính chịu muối
mật hỗ trợ khả năng
bám dính của các chủng

Gueimonde
và cộng sự,
2006

Bifidobacterium

Người, bộ
sưu tập
ni cấy

Sự bám dính/sự tồn
tại trong GIT

Sự bám dính phụ thuộc
vào chủng, pH và sự có
mặt của vi khuẩn gây
bệnh

Riedel và
cộng sự,
2006

Lactobacillus

Bộ sưu tập
ni cấy

Sự bám dính/sự tồn
tại trong GIT

Sự bám dính phụ thuộc
vào chủng

Tuomola và
cộng sự,
1998

Lactobacillus

Người,
thực phẩm
lên men

Khả năng sống sót
trong các điều kiện GIT

Sự sống sót của 3 chủng
có liên quan đến khả
năng bám dính và khả
năng chịu pH 2,5

Jacobsen và
cộng sự,
1999

Sự bám dính/Sự tồn
tại trong GIT
Hoạt tính kháng khuẩn

Nhóm L. acidophilus

Người,
động vật,
sữa

Sự bám dính/sự tồn
tại trong GIT

Khả năng bám dính vào
chất nhầy của ruột chuột
phụ thuộc vào chủng

Matsumura
và cộng sự,
1999

Lactobacillus

Bộ sưu tập
ni cấy

Sự bám dính/Sự tồn
tại trong GIT

Môi trường phát triển
và thành phần thực
phẩm ảnh hưởng đến
tính chất bám dính

Ouwehand
và cộng sự,
2001

Khả năng kháng vi
khuẩn Gram âm và hoạt
động ức chế phụ thuộc
vào chủng

Annuk và
cộng sự,
2003

Hoạt tính kháng khuẩn
Lactobacillus

Phân trẻ
em

Hoạt tính kháng khuẩn

25