Tài liệu thí nghiệm vi sinh vật đại cương (trường đh bách khoa hà nội)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BỘ MÔN VI SINH - HỐ SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

TÀI LIỆU THÍ NGHIỆM
VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG
(tài liệu chỉ lưu hành nội bộ cho sinh viên
thực hiện thí nghiệm vi sinh vật)

Hà nội, 2021


MỤC LỤC
NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM ............................................................................................... 4
MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT ..................... 5

1.

Mở đầu .................................................................................................................................5
Vật liệu và phương pháp ........................................................................................................5
2.1. Vật liệu: .......................................................................................................................................... 5
2.2. Phương pháp tiến hành ................................................................................................................. 5
3. Báo cáo thí nghiệm................................................................................................................... 11
1.
2.

PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp amylase
12

2.

1. Mở đầu ............................................................................................................................... 12
2. Vật liệu và phương pháp ......................................................................................................12
2.1. Vật liệu .................................................................................................................................12
2.2. Phương pháp ................................................................................................................................12
3. Báo cáo thí nghiệm................................................................................................................... 14

3.

PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật yếm khí .................................................... 15
1. Mở đầu: .............................................................................................................................. 15
2. Vật liệu và phương pháp .......................................................................................................... 15
2.1. Vật liệu .........................................................................................................................................15
2.2. Phương pháp thực hiện ...............................................................................................................15
Chuẩn bị dụng cụ và môi trường ni cấy ..........................................................................................15
3. Báo cáo thí nghiệm................................................................................................................... 17

4. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI TRÊN ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE
TECHNIQUE) ........................................................................................................................ 18
Mở đầu ............................................................................................................................... 18
Vật liệu và phương pháp ......................................................................................................18
2.1. Vật liệu .........................................................................................................................................18
2.2 Phương pháp .................................................................................................................................18
3. Báo cáo thí nghiệm:.................................................................................................................. 20
1.
3.

5.

6.

ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP MPN ........................................................ 21

1. Mở đầu ............................................................................................................................... 21
2. Vật liệu và phương pháp .......................................................................................................... 22
2.1. Vật liệu .........................................................................................................................................22
2.2. Phương pháp ................................................................................................................................22
3. Báo cáo thí nghiệm:.................................................................................................................. 25

ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU ......... 27

1. Mở đầu ............................................................................................................................... 27
2. Vật liệu và phương pháp .......................................................................................................... 28
2.1. Vật liệu .........................................................................................................................................28
2.2 Phương pháp .................................................................................................................................28
3. Báo cáo thí nghiệm:.................................................................................................................. 30

2


7.

QUAN SÁT NẤM MEN – tiêu bản giọt ép (wet mount slide)...................................... 31

Mục đích.............................................................................................................................. 31
Vật liệu và phương pháp ......................................................................................................31
2.1. Vật liệu: ........................................................................................................................................31
2.2. Tiến hành......................................................................................................................................31
3. Báo cáo thí nghiệm .............................................................................................................. 33
1.
2.

QUAN SÁT vi khuẩn – tiêu bản vi sinh vật cố định (smear slide) ............................... 34

8.
1.
2.

Mục tiêu: ............................................................................................................................. 34
Vật liệu và phương pháp ......................................................................................................34
2.1. Vật liệu: ........................................................................................................................................34
2.2. Phương pháp tiến hành ...............................................................................................................34
3. Báo cáo thí nghiệm .............................................................................................................. 37

NHUỘM GRAM – PHÂN BIỆT VI KHUẨN GRAM + VÀ VI KHUẨN GRAM - ..... 38

9.
1.
2.

Mục tiêu: ............................................................................................................................. 38
Vật liệu và phương pháp ......................................................................................................38
2.1. Vật liệu: ........................................................................................................................................38
2.1. Phương pháp tiến hành ...............................................................................................................38
3. Báo cáo thí nghiệm .............................................................................................................. 40

10.

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ỐNG DUHAM
41

Mở đầu ............................................................................................................................... 41
2.1. Vật liệu: ........................................................................................................................................41
2.2. Phương pháp tiến hành ...............................................................................................................42
3. Báo cáo thí nghiệm................................................................................................................... 42
1.

11.

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASES ...................................... 43
Mở đầu ........................................................................................................................ 43

1.

Vật liệu và phương pháp ......................................................................................................43
2.1. Vật liệu: ........................................................................................................................................43
2.2. Phương pháp tiến hành ...............................................................................................................44
3. Báo cáo thí nghiệm .............................................................................................................. 44
2.

MỘT SỐ THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG ....................... 45
1.
4.
5.
6.
7.
8.

Nồi hấp thanh trùng ............................................................................................................. 45
Tủ vô trùng dạng thổi đứng – clean bench ............................................................................ 46
Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 – Biosafety Cabinet .................................................................48

Tủ nuôi tĩnh ......................................................................................................................... 49
Tủ ni lắc Labtech LSI-3016R............................................................................................... 50
Kính hiển vi .......................................................................................................................... 50
6.1 Cấu tạo kính hiển vi .......................................................................................................................51
b. Cách sử dụng ...................................................................................................................................52
Điều chỉnh ánh sáng ............................................................................................................................52
Quan sát tiêu bản ................................................................................................................................53
c. Cách bảo quản .................................................................................................................................53

THÀNH PHẦN MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG ............................................................ 54
3


NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM
Những quy định chung
1. Giữ gìn trật tự, vệ sinh của phịng. Bảo đảm sự vơ trùng tuyệt đối khi cấy truyền vi
sinh vật.
2. Tuyệt đối khơng ăn uống, hút thuốc trong phịng thí nghiệm.
3. Tuyệt đối khơng để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây ra quần áo, sách
vở, dụng cụ cá nhân.
4. Không tự ý sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ của phịng thí nghiệm khi chưa được
phép và chưa được hướng dẫn.
5. Kết thúc thí nghiệm và bài thực hành, các dụng cụ, thiết bị, hoá chất vừa sử dụng
xong đều phải được vệ sinh theo đúng quy trình và xếp vào nơi quy định.
6. Ghi nhật ký sử dụng thiết bị đầy đủ và theo đúng yêu cầu.
7. Khi rời phịng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khố cửa.
Những quy định về an tồn
1. Khi sử dụng hoá chất cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng hoặc tuân theo những hướng
dẫn của kỹ thuật viên, cán bộ phịng thí nghiệm.
2. Sinh viên sử dụng áo blouse khi thực hiện thí nghiệm

3. Những hố chất độc hại phải được xử lý riêng, tuân theo yêu cầu của quản lý PTN
- Chất thải sinh học (vi sinh vật) phải được xử lý nhiệt (thanh trùng 121oC trong
30 phút) trước khi thải ra ngồi mơi trường.
- Chất thải lỏng cần được phân loại (axit, bazơ, dung môi, dung dịch có kim loại
nặng) và chứa vào các thùng đựng chất thải riêng biệt.
- Chất thải rắn (hoá chất, lọ đựng hố chất) có tính chất độc hại phải để trong tủ
hút và xử lý theo lịch riêng của nhà trường.
- Các dung môi độc hại, dễ bay hơi phải được tiến hành trong tủ hút.
4. Trước khi rời phịng thí nghiệm phải rửa sạch tay.

4


1. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO
CẤY VI SINH VẬT
1. Mở đầu
Khả năng tồn tại và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc rất lớn vào các chất dinh dưỡng và các yếu
tố sinh trưởng ở trong mơi trường ni cấy. Trong phịng thí nghiệm, các nhà khoa học sử dụng
nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau được để nuôi cấy và nghiên cứu vi sinh vật. Trong
bài thí nghiệm này, sinh viên được giới thiệu và thực hành các kỹ năng sau đây:
- Chuẩn bị các loại môi trường và khử trùng môi trường để gieo cấy vi sinh vật.
- Làm quen với các kỹ thuật thường quy trong các phịng thí nghiệm vi sinh vật bao gồm việc
chuẩn bị môi trường và các phương pháp gieo cấy vi sinh vật từ nhiều loại canh trường khác nhau,
cấy chuyền vi sinh vật từ canh trường vi khuẩn và nấm men sang môi trường mới.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu:
- Canh trường chứa vi sinh vật
- Bình tam giác
- Ống nghiệm
- Đĩa Petri

- Que cấy
- Que trang
- Đèn cồn
- Hố chất pha mơi trường Czapek (xem phụ lục thành phần môi trường)
- Cân điện tử
2.2. Phương pháp tiến hành

5


Cân thành phần mơi
trường
Hồ tan trong nước
Lọc, điều chỉnh pH
nếu cần thiết
Môi trường lỏng

Môi trường đặc

Phân phối vào
dụng cụ đựng

Bổ sung chất đơng tụ

Đun nóng làm tan chất
đơng tụ
Phân phối vào dụng cụ
đựng

Thanh trùng

Để nguội

Môi trường
lỏng

Để nghiêng

Môi trường
thạch đứng

Môi trường
thạch nghiêng

Đổ hộp petri
Mơi trường hộp
Petri
Hình 1.1. Sơ đồ thí

nghiệm
a. Pha chế mơi trường dinh dưỡng
- Cân đong chính xác theo đơn (tính thành phần cho 300 ml mơi trường Czapek)
- Cho vào bình sạch đã sấy khơ 1/3 lượng nước cần thiết, hịa tan trước các chất có khối lượng nhỏ
hơn các chất có khối lượng lớn, hồ tan.
- Kiểm tra và hiệu chỉnh pH môi trường (trong trường hợp cần thiết). Dùng lượng nước cịn lại
tráng rửa cổ bình, phễu, v.v. Thể tích mơi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể tích bình.
6


Chú ý:

- Một số thành phần mơi trường có thành phần nhỏ nên pha tạo dung dịch có nồng lớn sau đó tính
lượng thể tích cần sử dụng trong mơi trường
- Một số thành phần dễ phân huỷ bởi nhiệt như vitamine, kháng sinh... không nên bổ sung từ đầu
trước quá trình thanh trùng. Các thành phần này được pha thành dịch, lọc vô trùng và phối trộn
vào môi trường sau thanh trùng
b. Lọc môi trường
- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc
- Lọc bằng lòng trắng trứng
- Dùng phễu lọc nóng
c. Bổ sung chất đơng dính
- Bổ sung chất đơng dính 2% khối lượng theo thể tích mơi trường
- Gia nhiệt cho tan chất đơng dính, chú ý tránh để trào môi trường
d. Phân phối môi trường
- Môi trường thạch nghiêng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm (~ 5 -6 ml)
- Môi trường thạch đứng 1/3 thể tích ống nghiệm (~ 10 ml)
- Mơi trường lỏng: thể tích ~ 1/4 thể tích ống nghiệm
- Chú ý: Mơi trường trong hộp petri được phân phối sau khi đã thanh trùng mơi trường, thể tích
dịch từ 15 -20 ml).

Hình 1.2. Phân phối môi trường vào dụng cụ đựng
d. Khử trùng mơi trường bằng hơi nước bão hịa áp suất.
- Xem phần hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng
e. Bảo quản và kiểm tra môi trường
- Bảo quản môi trường: Giữ môi trường ở nhiệt độ thấp 0-5oC tránh quá khơ, nóng, nhiều ánh sáng.
- Kiểm tra bằng cách để mơi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32oC trong vài ngày. Nếu thấy mơi
trường bị vẩn đục hoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ.
f. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật
- Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối bằng cách thao tác xung quanh ngọn lửa đèn cồn
hoặc trong các tủ cấy vô trùng.

7


Ngọn lửa đèn cồn tạo dịng khơng khí nóng vơ trùng đối lưu trong phạm vi khoảng 20 cm quanh
ngọn lửa đèn cồn như trong hình sau:

Hình 1.3. Phạm vi làm việc bên ngọn lửa đèn cồn
Một số phương pháp gieo cấy
Vật liệu : canh trường chứa vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng vơ trùng.
Dụng cụ: Que cấy vịng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang
Khi gieo cấy vi sinh vật từ canh trường giống sang mội trường dinh dưỡng vơ trùng, tùy vào mục
đích thí nghiệm, loại canh trường giống (lỏng hoặc đặc), loại và dụng cụ chứa môi trường dinh
dưỡng (thạch đứng, thạch nghiêng, môi trường trong hộp Petri, môi trường lỏng trong ống nghiệm,
môi trường lỏng trong bình tam giác) mà các dụng cụ cấy và kỹ thuật cấy khác nhau được sử dụng.
Các bước cấy được thực hiện như sau :
+ Vệ sinh khu vực cấy, bật ngọn lửa đèn cồn (hoặc đèn khí nếu thao tác trong tủ cấy)
+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt nóng đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua ngọn lửa
đèn cồn.
+ Chờ que cấy nguội, đưa que cấy đã vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống, chạm nhẹ
đầu que cấy vào phần không chứa canh trường của ống giống để làm nguội que cấy. Lấy canh
trường từ ống giống và chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng và thực hiện thao tác
cấy như mô tả chi tiết ở dưới đây.
+ Lấy que cấy ra, khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và đặt tất cả lên giá.
Chú ý : sau khi mở ống nghiệm và trước khi đóng lại, hơ miệng ống trên ngọn lửa đèn cồn.
Gieo cấy vào môi trường lỏng :
- Từ canh trường đặc, sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng lấy một lượng nhỏ canh trường,
chuyển sang môi trường dinh dưỡng lỏng lắc que cấy hoặc cọ vào thành ống nghiệm hoặc bình
tam giác chứa mơi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy đi vào môi trường.
- Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút một lượng canh trường lỏng rồi
bơm vào môi trường lỏng vô trùng.

Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng :

8


- Thạch nghiêng thường được sử dụng để lưu giữ vi sinh vật trong thời gian dài do thạch nghiêng
có lớp thạch dày và bề mặt bay hơi thấp, hơi nước thất thốt trong q trình bảo quản lâu dài ít
hơn so với canh trường trong hộp Petri.
- Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, que cấy vòng hoặc que cấy thẳng có thể được sử dụng,
đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từ canh trường giống xuống đáy thạch nghiêng, dịch chuyển
que cấy dần trên mặt thạch đến khi cách phần thạch ở gần miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – 1 cm.
Khi cấy, đưa que cấy theo đường zigzag dày để canh trường sau đó phủ kín mặt thạch, hoặc có thể
theo đường thẳng, hoặc những đường song song. Phương pháp cấy này được gọi là cấy theo vết
cấy cạn dần.
Dùng que cấy đâm sâu vào thạch đứng :
- Thạch đứng dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện hoặc vi sinh vật vi hiếu khí (đối với vi
sinh vật kỵ khí bắt buộc, các dụng cụ nuôi cấy và các kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt cần được sử dụng),
vi sinh vật kỵ khí có xu hướng phát triển ở đáy sâu của lớp thạch, vi sinh vật hiếu khí phát triển
trên bề mặt thạch, nơi có oxy khuếch tán nhiều hơn.
- Thạch đứng cũng được sử dụng để xác định khả năng di chuyển của vi sinh vật cần nghiên cứu.
Vi sinh vật khơng có khả năng di động có xu hướng phát triển ngay ở đường cấy thẳng đứng. Vi
sinh vật có khả năng di chuyển (nhờ có tiên mao) có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng
ra phía thành ống nghiệm.

Hình 1.4: Cấy đâm sâu vào mơi trường thạch đứng theo dõi đặc tính di chuyển của vi sinh vật
- Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường rồi đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng vơ
trùng, tại vị trí trung tâm của mặt thạch, rồi đâm sâu xuống đáy ống nghiệm bằng động tác dứt
khoát rồi rút nhanh que cấy khỏi ống nghiệm.
d. Cấy trên thạch hộp
- Hộp Petri chứa một lớp mỏng mơi trường dinh dưỡng (3 – 5 mm). Nhờ có bề mặt nuôi cấy lớn,

hộp Petri được sử dụng để phân lập vi sinh vật (kỹ thuật yêu cầu tách các vi sinh vật khỏi nhau và
phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt). Tuy nhiên do lớp môi trường mỏng và bề mặt bay
hơi lớn, hộp Petri không được sử dụng để giữ vi sinh vật trong một thời gian dài như canh trường
trong thạch nghiêng.
9


Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp Petri, có thể sử dụng các cách sau :
+ Sử dụng que cấy vòng (que cấy thẳng sẽ cào xước mặt thạch nên không được sử dụng), cấy theo
bốn đường zigzag ở bốn góc hộp, hoặc theo các đường song song, sao cho mật độ tế bào vi sinh
vật được cấy giảm dần từ góc cấy đầu tiên đến góc cấy cuối cùng. Nếu cần thiết, có thể cần đốt
nóng que cấy để diệt bớt vi sinh vật sau mỗi góc cấy, que cấy vơ trùng sau đó dùng để kéo vi sinh
vật từ góc cấy trước đó sang góc cấy tiếp theo (Streak technique).

Hình 1.5: Cách cấy trên hộp petri bằng phương pháp vết cấy cạn dần
Một số cách cấy khác trên môi trường hộp petri như (các cách này sẽ được thực hành ở các bài
sau)
+ Cấy chẩm điểm : sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống rồi cấy chấm điểm lên 3, 4 hoặc
5 điểm trên môi trường trong hộp Petri thành 3 cạnh của tam giác đều, 4 đỉnh của hình vng, hoặc
4 đỉnh của hình vng và một điểm tâm hình vng.
+ Dùng que trang : khi cấy từ canh trường lỏng sang môi trường thạch trong hộp Petri, dùng pipette
hút một lượng canh trường (50 – 100 µl) lên mặt thạch, rồi dùng que trang vô trùng dàn đều đến
khi mặt thạch se lại.
Canh trường mới được cấy cần được nuôi trong điều kiện thích hợp (về nhiệt độ, độ ẩm, nồng
độ oxy) một thời gian để vi sinh vật phát triển. Kiểm tra canh trường trước khi cất bảo quản ở nhiệt
độ thấp (4- 10oC).

10

3. Báo cáo thí nghiệm
1.
2.
a.
b.
3.
-

Mục đích của bài thí nghiệm:
Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
Dụng cụ thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu
Kết quả và thảo luận
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý
về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay khơng,
độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra mơi trường hay khơng)

Hình 1.6: Nhận xét đặc điểm hình thái khuẩn lạc.

11


2. PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật hiếu khí có
khả năng sinh tổng hợp amylase
1. Mở đầu
- Trong tự nhiên, vi sinh vật thường tồn tại trong hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau. Muốn nghiên
cứu hoặc sử dụng vào thực tế cần phải phân tách để thu được canh trường chỉ chứa lồi đó. Q
trình tách một vi sinh vật ra khỏi hỗn hợp gọi là phân lập.
- Mục đích của bài thí nghiệm là phân lập chủng vi sinh vật hiếu khí có khả năng phân hủy tinh
bột. Các chủng phân lập được sẽ được sử dụng trong bài tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh

enzym amylase cao
- Phương pháp phân lập sử dụng môi trường chọn lọc chứa tinh bột
2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu
- Mẫu phân lập: Tương bần, bánh men
- Môi trường phân lập: môi trường Czapek trên hộp petri thay đường saccharose bằng tinh bột
tan
- Dụng cụ:
+ Pipette 1000, 100, và hộp đầu cơn (02/nhóm)
+ Bình tam giác: 02/nhóm
+ Effendorf: 20/nhóm
+ Hộp pettri nhựa: 3/nhóm
+ Falcon 50: 01/nhóm
+ Que trang
+ Votex
+ Tủ ni tĩnh
2.2. Phương pháp
- Chuẩn bị dụng cụ và mơi trường
+ 02 Bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý
+ 01 Ống falcon 50 mL chứa 40 mL nước muối sinh lý
+ 120 mL Môi trường Czapek đặc thay đường saccharose bằng tinh bột tan
+ Tất cả bình tam giác, ống falcon, mơi trường, hộp đầu côn, ống effendorf, que trang cần
thanh trùng tại 110oC, 30 phút
+ Sau thanh trùng, sinh viên chuẩn bị 06 hộp petri chứa môi trường Czapek-tinh bột
- Phân lập
+ Đối với mẫu bánh men cần nghiền nhỏ trước khi thực hiện
12

+ Lấy 1 lượng bánh men hoặc tương bần cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 99 mL nước
đã vơ trùng, lắc đều
+ Pha lỗng trong ống effendorf (nồng độ pha loãng thảo luận trên lớp). Pha loãng theo hệ
số 10
+ Sử dụng pipette hút 100 L ra hộp petri chứa môi trường Czapek-tinh bột, sử dụng que
trang trang đều
+ Nuôi cấy trên trong tủ nuôi tĩnh tại 30oC, 2 ngày, quan sát khuẩn lạc, nhận xét

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật hiếu khí
- Chú ý :
+ Sau các thao tác phân lập ở trên sẽ thu được canh trường tập trung chứa các chủng vi sinh vật có
khả năng phân giải tinh bột ; để thu được canh trường thuần khiết cần tiến hành thêm bước cấy
tách riêng từng khuẩn lạc vi sinh vật quan tâm trên môi trường riêng và tiến hành kiểm tra độ thuần
khiết.
+ Trong quá trình phân lập để hướng tới thu riêng từng loại vi sinh vật như vi khuẩn, hoặc nấm có
thể bổ sung kháng sinh để ức chế các lồi khơng quan tâm : bổ sung cyclo heximide ức chế nấm ;
bổ sung tetracycline ức chế vi khuẩn....

13


3. Báo cáo thí nghiệm
1. Mục đích của bài thí nghiệm
2. Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
- Vẽ hình/chụp ảnh đĩa petri có chứa các khuẩn lạc.
- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay khơng,
độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra mơi trường hay khơng).
- Kết luận rút ra từ bài thí nghiệm.

14


3. PHÂN LẬP VI SINH VẬT- Phân lập vi sinh vật yếm khí
1. Mở đầu:
- Một trong những yếu tố quan trọng mà vi khuẩn và nhiều loại vi sinh vật khá nhạy cảm đó là sự
có mặt của oxy.
+ Những vi sinh vật chỉ phát triển khi có O2 được gọi là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
+ Vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện sẽ phát triển ngay cả khi có O2 nhưng chúng thường phát triển
tốt hơn khi khơng có khí này
+ Vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt sẽ chỉ phát triển khí khơng có O2.
- Trong bài thí nghiệm này, sinh viên sẽ làm quen với việc phân lập vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện;
sử dụng phương pháp đổ thạch hai lớp.

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu
- Nguồn phân lập: Sữa chua uống Yakult (Lactobacillus caseii)
- Môi trường phân lập: Môi trường MRS (thành phần môi trường xem phụ lục)
- Dụng cụ sử dụng
+ Pipette 1000, 100, và hộp đầu cơn (02/nhóm)
+ Effendorf: 20/nhóm
+ Hộp Petri nhựa: 6/nhóm
+ Vortex
+ Bể ổn nhiệt
2.2. Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị dụng cụ và môi trường nuôi cấy
- Chuẩn bị môi trường MRS cho 6 hộp Petri (~120 ml), thanh trùng
- Môi trường thạch Agar 1.5% (~ 60 mL), sau thanh trùng và giữ ấm tại 45-500C trong bể ổn nhiệt
- Dụng cụ bao gồm effendorf, đầu côn, que trang, nước được thanh trùng trước khi tiến hành thí

nghiệm
- 40 ml nước muối sinh lý trong ống falcon 50 ml, thanh trùng
Phân lập
- Hút vào các ống effendorf, mỗi ống 0,9 mL nước muối sinh lý đã vô trùng
- Hút 0,1 mL sữa chua vào ống effendorf đã chứa 0,9 mL nước muối sinh lý vô trùng; tiến hành
pha loãng tới nồng độ 10-1, 10-2,10-3

15


Hình 3.1: Sơ đồ phân lập vi sinh yếm khí
- Sử dụng pipette để cấy 100 l dịch đã pha loãng lên bề mặt hộp petri, sử dụng que trang trang
đều
- Đổ lên trên lớp thạch dinh dưỡng thứ nhất, lớp thứ hai thach agar, đợi thạch đông.
- Nuôi cấy 37oC trong vòng 2-4 ngày.

16


3. Báo cáo thí nghiệm
1. Mục đích của bài thí nghiệm
2. Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3. Kết quả và thảo luận
- Vẽ hình/chụp ảnh đĩa petri có chứa các khuẩn lạc.
- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay khơng,
độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra mơi trường hay khơng).
- Kết luận rút ra từ bài thí nghiệm.

17

4. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI
TRÊN ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)
1. Mở đầu

- Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là phương pháp định lượng gián tiếp vi sinh vật dựa
trên sự phát triển của các tế bào vi sinh vật thành các khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng
rắn khi mẫu nghiên cứu được trải trên bề mặt của môi trường (spread plate technique) hoặc
khi mẫu nghiên cứu được trộn với môi trường dinh dưỡng khi cịn ở dạng lỏng và đổ vào
dụng cụ ni cấy sau đó để đơng lại (pour plate technique). Phương pháp này chỉ xác định
được mật độ vi sinh vật sống trong mẫu.
- Đơn vị của phép định lượng là số khuẩn lạc (CFU colony forming unit) /ml môi trường
lỏng hoặc g môi trường rắn.
- Nếu số lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phẩm lớn (105 – 1012 tế bào/ml), trước khi tiến
hành trải đĩa hoặc đổ đĩa, mẫu nghiên cứu phải được pha loãng. Mẫu được pha loãng tới
số khuẩn lạc trong khoảng 30 – 300 trên mỗi đĩa petri 90 mm.
- Để xác định mật độ vi sinh vật có trong mẫu khơng khí, một phương pháp đơn giản thường
được sử dụng là phương pháp có nguyên tắc dựa trên ước tính của Omelianxki: trên một
diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với
lượng vi sinh vật có trong 10 lít khơng khí.
3. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu

-

Mẫu nghiên cứu cần xác định hàm lượng vi sinh vật ở trạng thái: rắn, lỏng và khí
Mơi trường ni cấy: mơi trường phổ dụng TSA
NaCl
Bình tam giác, micropipette 1 mL, 100 µL

Ống Eppendorf 1.5 mL, đầu tip 1 mL, 100 µL vơ trùng
Que trang

2.2 Phương pháp
a. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, vô trùng môi trường và dụng cụ cần thiết:

-

Pha môi trường TSA và nước muối sinh lý để pha loãng như đã làm trong bài 2
Các dụng cụ bao gồm ống Eppendorf, đầu tip, que trang đã được vô trùng trong nồi
hấp áp lực và sấy khô.
18


b. Định lượng vi sinh vật trong mẫu vật rắn và lỏng

Chuẩn bị và pha loãng mẫu:
- Hút 900 uL nước muối sinh lý đã vô trùng vào mỗi ống Eppendorf 1.5 mL. Số lượng
ống Eppendorf cần chuẩn bị phụ thuộc vào sơ đồ pha loãng được thảo luận trên lớp.
- Cân 1 gram mẫu rắn hoặc hút 1 mL mẫu lỏng vào bình tam giác chứa 99 mL nước
muối sinh lý vơ trùng, mẫu đã được pha lỗng 1:100. Lắc để trộn đều mẫu. Đối với
mẫu sinh vật kỵ khí, để hạn chế vi sinh vật kỵ khí trong mẫu tiếp xúc với oxy, bước
pha loãng đầu tiên nên được thực hiện trong ống Eppendorf. Mẫu trong bình tam
giác được lắc đều cho vi sinh vật phân bố đồng đều trong dịch pha loãng.
- Pha loãng lần lượt theo hệ số 10 vào các ống Eppendorf chứa sẵn nước muối sinh
lý bằng cách hút 100 uL của dịch pha loãng trước vào ống Eppendorf chứa muối
sinh lý mới. Trộn mẫu trên máy vortex ngay sau khi hút mẫu vào.

Hình 4.1. Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu phẩm rắn. Mức độ pha loãng tùy thuộc vào mẫu cụ thể
được sử dụng trong buổi thí nghiệm

Cấy mẫu:
- Kí hiệu tên mẫu, độ pha lỗng, tên nhóm thí nghiệm, ngày cấy mẫu vào đáy của đĩa
Petri chứa môi trường dinh dưỡng
- Hút 100 uL mẫu pha loãng vào trung tâm của đĩa Petri
- Sử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên tồn bộ bề mặt mơi trường dinh dưỡng
đến khi mặt thạch se lại

19


-

Lật ngược đĩa Petri sao cho đáy hộp Petri hướng lên phía trên, đưa vào tủ ấm để
ni trong 24 – 48h để khuẩn lạc hình thành

Kiểm tra mẫu:
- Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên đĩa thạch, lựa chọn những đĩa có số lương
khuẩn lạc trong khoảng 30 – 300 để đếm chính xác số lượng khuẩn lạc, ghi lại số
lượng khuẩn lạc trên đĩa có độ pha lỗng tương ứng vào sổ thí nghiệm và sử dụng
những giá trị này để tính tốn.
- Tính tốn mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu dựa vào số lượng khuẩn lạc và sơ
đồ pha loãng.
b) Đối với mẫu khơng khí: sử dụng phương pháp lắng của Omelianxki
- Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào phần đáy của đĩa Petri chứa môi
trường dinh dưỡng vơ trùng
- Đặt hộp Petri có mơi trường đặc đã vơ trùng ra chỗ khơng khí định nghiên cứu. Chú
ý lựa chọn những khu vực có khơng khí tĩnh, khơng có gió.
- Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút).
- Đậy nắp hộp, nuôi trong tủ ấm trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ

- Đếm số khuẩn lạc có được trên mỗi đĩa thạch
- Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD2/4) rồi suy ra lượng vi sinh
vật trong 1 lít hay 1 m3 khơng khí theo ước tính của Omelianxki.

3. Báo cáo thí nghiệm:
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
1. Mục đích
2. Vật liệu và phương pháp
3. Kết quả và thảo luận: Sinh viên nhận xét chung về các khuẩn lạc thu được trên đĩa
thạch, báo cáo số lượng khuẩn lạc thu được trên mỗi đĩa, tính tốn mật độ vi sinh
vật trong mỗi mẫu

20


5. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT – PHƯƠNG PHÁP MPN
(SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER)
Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên
1. Mở đầu

Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN) là phương pháp định lượng vi sinh vật được
sử dụng rất nhiều trong thực phẩm và phân tích chất lượng môi trường. MPN xác định mật
độ vi sinh vật trong mẫu phẩm một cách gián tiếp bằng cách nuôi cấy vi sinh vật trên môi
trường lỏng trong các tổ hợp gồm 3-5 ống nghiệm ở các độ pha loãng hơn kém nhau 10
lần. Tổng hợp kết quả ống dương tính đối với sự phát triển của vi sinh vật là cơ sở để tính
tốn giá trị mật độ vi sinh vật trong mẫu. Trong bài này, sinh viên kiểm tra sự ô nhiễm
phân của nước tự nhiên bằng phương pháp MPN.
Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài vi sinh vật khác nhau như tảo,
động vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v.v. Nước tự nhiên có thể
bị ơ nhiễm phân (faecal contamination) bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc

tiếp nhận nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử
dụng làm nước sinh hoạt hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao. Để đánh giá sự ô
nhiễm phân của nước tự nhiên, việc xác định sự có mặt của vi sinh vật chỉ thị được tiến
hành. Coliform được xem là vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân do: (1) chúng thường khơng
có mặt trong mơi trường nước tự nhiên, môi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường
ruột của động vật máu nóng, trong đó có con người, (2) Chúng có khả năng sống lâu trong
mơi trường nước tự nhiên hơn các loài vi sinh vật khác có nguồn gốc từ đường ruột, (3) đa
số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây bệnh, và (4) việc phát hiện chúng bằng
kỹ thuật nuôi cấy khá đơn giản. Coliform là nhóm các vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram
âm, hình que, khơng sinh bào tử, và có khả năng lên men lactose sinh ra acid và giải phóng
khí ở 35°C sau 48±2 h.
Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí
nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hồn thành.
+ Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định
sự có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48±2
h ở nhiệt độ 35°C.
+ Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở thí nghiệm
giả định được cấy chuyển sang mơi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví
dụ: mơi trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để xác nhận việc lên men sinh khí
khơng phải do vi khuẩn Gram dương (những lồi cũng có khả năng lên men sinh khí như
Clostridium và Bacillus).
21


+ Thí nghiệm hồn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên mơi trường ở thí
nghiệm xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn để xác định chúng có phải vi
khuẩn Gram âm, hình que, và không sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform).
Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên
men lactose sinh khí bằng phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable
Number).

Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc
cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh
dưỡng chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với
bảng tính thống kê tiêu chuẩn. MPN cũng có thể được sử dụng để định lượng các loại vi
sinh vật khác trong các mẫu mơi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với
phương pháp đếm trực tiếp hoặc phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng
không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu

- Mẫu nước
- Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL
- Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL
- Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí
sinh ra trong q trình lên men lactose
2.2. Phương pháp

Chuẩn bị mơi trường
Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo
công thức sau
Bảng 5-1 Thành phần môi trường
Thành phần
Nồng độ kép
Nồng độ đơn
Peptone
10g
5g
Lactose
10g

5g
Cao thịt bò
6g
3g
Nước
1000 mL
1000 mL
pH được điều chỉnh đến 6.8 ± 0.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham
úp ngược theo hướng dẫn trong bảng sau:
Bảng 5-2. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm
22


Tổ hợp ống
F1
F2
F3

Môi trường
Nồng độ kép
Nồng độ đơn
Nồng độ đơn

Thể tích phân phối
10 mL
10 mL
10 mL

Số lượng ống
3

3
3

Các ống chứa mơi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút.
Lấy mẫu:
Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập
theo tiêu chuẩn Việt Nam hoặc quốc tế (WHO – World Health Organization) về lấy mẫu
nước. Nước được chứa trong các bình được khử trùng trước, có nắp kín, vận chuyển về
phịng thí nghiệm và lưu giữ trong tủ lạnh cho đến khi phân tích. Tùy vào loại nước và mức
độ ơ nhiễm dự đốn của nước mà chúng được pha lỗng khác nhau trước khi được cấy vào
mơi trường nuôi cấy.
Cấy mẫu:
Trước khi cấy vào môi trường vô trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều để đảm bảo vi
sinh vật phân bố đồng đều.
Dùng pipette 10 mL cấy 10 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong
tổ hợp 3 ống F1.
Dùng micropipette cấy 1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong
tổ hợp 3 ống F2.
Dùng micropipette cấy 0.1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong
tổ hợp 3 ống F3.
Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35oC.

23


Hình 5.1. Sơ đồ pha lỗng và cấy mẫu nước vào các tổ hợp ống chứa môi trường lactose

Kiểm tra kết quả và xác định mật độ vi khuẩn coliform trong mẫu nước:
Sau 48 ± 2 giờ, kiểm tra số lượng các ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống. Các ống được
coi là dương tính nếu ít nhất 3 mm khí được quan sát trong ống Durham. Ghi lại số lượng

ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống, ta có bộ gồm 3 số. Ví dụ: nếu số ống dương tính
trong tổ hợp F1 là 3, tổ hợp ống F2 là 2 và tổ hợp ống F3 là 2, ta có bộ ba số 3-2-2.
Đối chiếu bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn sau đây, giá trị MPN trên 100 mL
nước sẽ được xác định. Nếu mẫu nước được pha loãng trước khi cấy mẫu, giá trị MPN của
mẫu nước thu thập sẽ được tính tốn dựa vào hệ số pha loãng ban đầu.
Bảng 5-3. Giá trị MPN trên 100 mL nước và giới hạn độ tin cậy 95% khi bộ ba ống được cấy
với 10 mL, 1 mL, và 0.1 mL mẫu nước

Số lượng ống cho kết quả dương tính
3 ống cấy
10 mL
0
0
1
1
1

3 ống cấy
1 mL
0
1
0
0
1

MPN/100
3 ống cấy mL
0.1 mL
1
3

0
3
0
4
1
7
0
7

Giới hạn MPN ở độ tin cậy
95%
Dưới

Trên

<1
<1
<1
1
1

9
13
20
21
23
24


1

1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

1
2
0
0
1
1
2
2
0
0

0
1
1
1
2
2
2
3
3
3

1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1

2

11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
48
75
120
93
150
210
240
460
1100

3
3
1
3
3
7
4

10
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150

36
36
36
37
44
49
47
149
120
130
379
210
230
380
380
440

470
1300
2400
4800

3. Báo cáo thí nghiệm:
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
1. Mục đích
2. Vật liệu và phương pháp
3. Kết quả và thảo luận: sinh viên báo cáo số ống dương tính ở mỗi tổ hợp, từ đó suy
ra giá trị MPN của nhóm vi khuẩn có khả năng lên men lactose sinh khí trong mẫu
nước và nhận xét về mật độ nhóm vi khuẩn này trong mẫu nước.
Tài liệu tham khảo
World Health Organization (1997). Annex 6: Multiple-tube method for thermotolerant
(faecal) coliforms, In Guidelines for drinking-water quality, 2nd Edition.
Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA & Clark DP (eds) (2011) Brock Biology of
Microorganisms, 12th edition. Benjamin Cummings
25