báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương

1

Bài 1: MÔI TRƯ
Ờ
NG DINH DƯ
Ỡ
NG
–

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO C
Ấ
Y VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP
GIEO CẤY VI SINH VẬT
A. Môi trường dinh dưỡng
I. Khái niệm chung
1. Mục đích, ý nghĩa:
- Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinh
vật. Môi trường dinh dưỡng được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên
cứu các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật.
2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:
- Môi trường dinh dưỡng là một hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật.
Trong thành phần của môi trường dinh dưỡng cần phải có các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon,
Hydro, Oxi, Nitơ), các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt, ),
một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden, ). Những nguyên

tố trên cần thiết phải ở dạng những hợp chất dễ hấp thu đối với vi sinh vật. Cacbon được các vi
sinh vật dị dưỡng hấp thu dễ hơn cả ở dạng glucoza. Ngoài glucoza, vi sinh vật dị dưỡng còn hấp
thu đường, rượu, axit hữu cơ và các hợp chất khác. Nguồn Nitơ có thể là các chất đạm, pepton,
axit amin, muối amon, nitrat. Các nguyên tố còn lại dưới dạng muối. Môi trường dinh dưỡng còn
cần phải có đủ các chất kích thích sinh trưởng như biotin, vitamin, đặc biệt là các axit amin
không thay thế.
- Môi trường dinh dưỡng cần phải cân đối về thành phần (đẳng trương về nồng độ các chất
hòa tan) và có độ ẩm, độ nhớt, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu.
- Môi trường dinh dưỡng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
3. Cách gọi tên
Môi trường dinh dưỡng thường được gọi tên theo tên tác giả - người phát hiện ra nó. Thí dụ: Môi
trường Sapek, Saburo, Song đúng hơn là gọi tên theo nguồn thức ăn N và C. Thí dụ môi trường
thạch thịt – pepton, môi trường Xenlluloza
II. Phân loại môi trường
1. Phân loại môi trường theo thành phần: Căn cứ vào thành phần môi trường, người
ta chia chúng thành các loại sau
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
2

Bài 1: MÔI TRƯ
Ờ
NG DINH DƯ
Ỡ
NG
–

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO

C
Ấ

Y VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

a. Môi trường tự nhiên được chế tạo từ các sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật như
thịt, trứng, sữa, nước chiết nấm men, nước quả, mạch nha, Thành phần hóa học của những môi
trường này phức tạp và không được xác định cụ thể. Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu
và các điều kiện tiến hành chế tạo môi trường. Người ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật,
tích lũy sinh khối, giữ các giống thuần sạch, các mục đích dự đoán, chúng không lợi cho việc
nghiên cứu sinh lý hoặc các quá trình trao đổi chất.
b. Môi trường tống hợp được chế tạo từ các hợp chất hóa học hữu cơ và vô cơ với nồng
độ định trước một cách chính xác. Tùy theo bộ các cấu tử, môi trường tông hợp có thể phức tạp
(môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trường cho các vi khuẩn tự
dưỡng). Người ta dùng chủng để nghiên cứu sự trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng
hợp một chất nào đó (VD: axit amin). Trong thực hành thường sử dụng môi trường tổng hợp
Sapek để nuôi cấy nấm mốc.
c. Môi trường bán tổng hợp là môi trường chung giữa hai loại trên
2. Phân loại theo mục đích sử dụng
a. Môi trường phổ dụng (môi trường cơ sở hay môi trường chuẩn) là những môi trường
thích hợp để nuôi cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trường thịt pepton, môi trường nước mạch
nha, )
b. Môi trường riêng biệt hay môi trường chọn lọc: đảm bảo sự phát triển ưu thế của
một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó, ít thuận lợi hoặc hoàn toàn bất lợi đối với sự phát triển
của các vi sinh vật khác. Các môi trường chọn lọc chủ yếu được dùng để phân lập vi sinh vật từ
các môi trường sinh sống tự nhiên của chúng hoặc được dùng để nuôi cấy tích lũy. VD: môi
trường tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn.
c. Môi trường chuẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị) cho phép phân biệt khá nhanh

chóng một loài vi sinh vật này với loài khác và xác định những giống thuần khiết trên cơ sở
nghiên cứu những tính chất sinh hóa của chúng. Các môi trường chỉ thị được ứng dụng trong vi
khuẩn học lâm sàng, trong nghiên cứu di truyền học và trong việc định tên vi sinh vật. Thông
thường trong các môi trường này người ta cho vào một số thành phần chỉ thị màu và nhờ sự thay
đổi của chất đó mà người ta có thể xác định được từng loài vi sinh vật.
VD: Trong quá trình sống, vi sinh vật thường tiết ra một loại enzyme nhất định. Dưới tác dụng
của các enzyme này các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong môi trường bị phân hủy thành các
dạng đơn giản hơn như axit và muối của chúng. Các chất này làm thay đổi độ pH của môi
trường, do đó dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
3

Bài 1: MÔI TRƯ
Ờ
NG DINH DƯ
Ỡ
NG
–

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO C
Ấ
Y VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

3. Phân loại theo tính chất lý học
Tùy theo độ chắc cứng của môi trường người ta phân biệt môi trường lỏng, đặc, xốp

a. Môi trường lỏng là môi trường thức ăn dưới dạng dung dịch. Nó được ứng dụng để
phát hiện các đặc điểm sinh lý – sinh hóa của vi sinh vật, để tích lũy sinh khối hoặc các sản phẩm
trao đổi chất, để giữ và bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển trên các môi trường đặc.
b. Môi trường đặc là môi trường lỏng có thêm các chất đông dính, được ứng dụng để tách
các giống thuần khiết (nhận từng khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình thái
khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống.
Để làm đông môi trường người ta dụng thạch, gelatine và silica-gel. Các chất này không làm
thay đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ trong suet của môi trường.
- Thạch là một loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ một số loại tảo biển
hộ Floridae. Hầu hết vi sinh vật không sử dụng nó làm cơ chất dinh dưỡng. Trong nước, thạch
tạo thành dạng gel, chảy ở 100OC và đông ở gần 40OC. Thạch có tính trung tính, không làm
thay đổi pH của môi trường song nó bị ảnh hưởng pH môi trường. ở những môi trường có độ axit
pH thấp thạch khó đông đặc hơn hơn bởi nó bị thủy phân từng phần. Thạch thường được bổ sung
vào môi trường với số lượng 1,5 – 2%. Trong trường hợp cần thiết có thể nâng nồng độ thạch lên
3%.
- Gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn của động vật dễ bị vi sinh vật sử
dụng nên dễ vữa hơn so với thạch. Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưởng tới pH môi trường nên ít
được sử dụng hơn thạch, Nhiệt độ nóng chảy của gelatine 25-27OC và đông đặc ở 18-20OC.
Thường để thu nhận những khuẩn lạc lớn trong phân loại nấm men.
- Bản silica-gel được dùng làm chất nền đặc cho các môi trường tổng hợp có thành phần
xác định chặt chẽ bởi vì nó có bản chất vô cơ.
- Môi trường xốp được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp. Thuộc loại này có kê
nấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng.
III. Cách làm môi trường
Quá trình tiến hành gồm các bước sau:
1. Pha chế
Cân đong chính xác theo đơn.
Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng nhỏ
hơn các chất có khối lượng lớn hơn rồi sau cùng là các chất đông dính. Thử pH môi trường.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()

4

Bài 1: MÔI TRƯ
Ờ
NG DINH DƯ
Ỡ
NG
–

CÁC
PHƯƠNG PHÁP GIEO C
Ấ
Y VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Dùng lượng nước còn lại tráng rửa cổ bình, phễu, Thể tích môi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể
tích bình.
Đóng miệng bình bằng nút bông rồi bọc giấy để tránh bị ướt lúc thanh trùng.
Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người chuẩn bị.
Thanh trùng xong kiểm tra pH và chỉnh lại nếu cân bằng NaOH 20% hoặc HCL 20%. Dùng
nước máy, ấm.
2. Lọc
Môi trường cần trong suốt nên sau khi pha chế phải tách cặn bã, bụi bẩn bằng một trong những
phương pháp sau:
- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc
- Lọc bằng lòng trắng trứng

- Dùng phễu lọc nóng
3. Phân phối môi trường
Môi trường được phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, sau thanh trùng vào ống
nghiệm hoặc hộp petri.
Thạch nghiêng khoảng 5ml
Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm
Hộp petri tráng đều dầy 3mm.
4. Khử trùng môi trường
Tất cả môi trường đều phải vô trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm mà chọn chế độ
thanh trùng.
a. Phương pháp Pasteur: chủ yếu dùng để diệt những vi sinh vật không sinh bào tử bằng
cách đun nóng phân đoạn ở nhiệt độ 60-75OC trong 15 đến 30 phút hay ở 80OC trong thời gian
10-15 phút. Phương pháp Pasteur ứng dụng cho những sản phẩm hay môi trường dưới tác động
của nhiệt độ cao bị ảnh hưởng sâu sắc, mất đi những phẩm chất và giá trị dinh dưỡng. Nó được
dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm
b. Phương pháp Tinđan
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
5

Bài 1: MÔI TRƯ
Ờ
NG DINH DƯ
Ỡ
NG
–

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO C
Ấ
Y VI SINH V
Ậ

T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ cao liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lần
cách nhau 24 giờ. Trong thời gian giữa hai lần hấp cần để môi trường ở nhiệt độ thích hợp cho
các bào tử còn sống sót có thể phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡng. Trong lần thanh trùng
tiếp theo các tế bào dinh dưỡng này sẽ bị tiêu diệt. Phương pháp này cho hiệu suất vô trùng cao
hơn phương pháp Pasteur.
c. Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một áp
suất lớn hơn áp suất của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo.
- Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực.
5. Bảo quản và kiểm tra môi trường
Giữ môi trường ở nhiệt độ thấp 0-5OC tránh quá khô, nóng, nhiều ánh sáng. Kiểm tra bằng cách
để môi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32OC trong vài ngày. Nếu thấy môi trường bị vẩn đục
hoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ.
B. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật
1. Định nghĩa: Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn
với mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết
cho nghiên cứu. Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này
sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống.
Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối
Dụng cụ: Que cấy nhọn hoặc vòng, pipet, que trang,
2. Một số phương pháp gieo cấy
a. Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác
Tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng).
b. Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng
- Theo hình chữ chi

- Theo hình vòng xoắn
- Theo những đường song song
- Theo một đường thẳng
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
6

Bài 1: MÔI TRƯ
Ờ
NG D
INH DƯ
Ỡ
NG
–

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO C
Ấ
Y VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

- Theo từng chem.
c. Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng
d. Cấy trên thạch hộp
Hình chữ chi trên toàn mặt thạch
Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp
Theo các đường song song
Chấm điểm

e. Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ
- Dung pipet lấy một lượng canh trường thả trên mặt thạch rồi dung que trang dàn đều giọt
canh trường trên mặt thạch
- Cấy bề sau
Giống – ống nghiệm – hộp thạch
Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trường.










Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
7

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
A. PHÂN LẬP VI SINH VẬT
Vi sinh vật thường tồn tại trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu dưới dạng một
hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau. Muốn nghiên cứu hoặc sử dụng vào thực tế bất kỳ loài nào ta
phải phân lập để thu được canh trường chỉ chứa loài đó. Quá trình tách một vi sinh vật ra khỏi
hỗn hợp gọi là phân lập. Tùy mức độ thuần khiết mà người ta phân biệt canh trường tập trung
hay canh trường thuần khiết.
I. Canh trường tập trung
1. Định nghĩa
Canh trường tập trung là canh trường trong đó một loài (có khi vài loài) vi sinh vật xác định
chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng.
Từ canh trường tập trung ta có thể phân lập canh trường thuần khiết hoặc có thể sử dụng nó trong
sản xuất hoặc thí nghiệm.
2. Phương pháp phân lập canh trường tập trung
Sử dụng môi trường chọn lọc hoặc là điều kiện chọn lọc, tức môi trường hoặc điều kiện chỉ thích
hợp cho một loài vi sinh vật nhất định, còn các loài khác thì không thể hoặc khó phát triển.
Để có môi trường chọn lọc, ta có thể thay đổi thành phần, nguồn các bon, nitơ, độ pH Ví dụ,
để tách nấm men, ta dùng môi trường chứa nhiều đường và pH thấp.
Về các điều kiện chọn lọc, ta thay đổi nhiệt độ môi trường, lưu lượng khí được cấp và các điều
kiện khác. Ví dụ: tách vi sinh vật ưa nóng hoặc lạnh bằng cách nuôi ở nhiệt độ 50-600C hoặc 10-
150C, để tách các vi sinh vật yếm khí khỏi các vi sinh vật hiếu khí, ta nuôi trong điều kiện yếm
khí.
Nói chung, tuỳ đặc tính sinh lý của từng loài mà ta có những môi trường và điều kiện chọn lọc
khác nhau.
II. Canh trường thuần khiết
1. Định nghĩa
Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả các vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế
bào ban đầu. Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện từ canh trường tập trung.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
8

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

2. Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết.
a. Phương pháp pha loãng môi trường lỏng
Phương pháp này do Pasteur đưa ra đầu tiên, tiến hành như sau:
- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn
- Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất
- Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai
- Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn
Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là tổ tiên cho
canh trường thuần khiết.
Phương pháp này đơn giản dễ làm nhưng không phải bao giờ cũng bảo đảm, vì vậy nó thường
được dùng như giai đoạn đầu của các phương pháp phân lập khác.
b. Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc
Nguyên tắc của phương pháp này là tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên môi trường đặc. Cách
tiến hành như sau:

- Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng dần đến mức độ nhất định trong
các ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô trùng. Tuỳ trường hợp mà
pha loãng nhiều hay ít hoặc không pha loãng. Nói chung nên pha loãng để các tế bào tách rời
nhau và khi gieo cấy các khuẩn lạc mọc tách biệt.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
9

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN


Hình 1: Sơ đồ quy trình pha loãng Pasteur

Sơ đồ phân lập trên môi trường đặc (có pha loãng trước)
Đem vật phẩm đã pha loãng cấy trên môi trường thạch hộp đã vô khuẩn theo một trong các cách
sau:
- Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần - cấy thưa và đưa nhanh
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
10

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN


Hình 2: Các phương pháp cấy theo vết cấy cạn dần
- Dùng pipet đưa một lượng canh trường nhất định vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn đều
vật gieo cấy trên mặt thạch hộp






- Trộn vật gieo cấy vào ống thạch đã vô trùng và làm nguội đến 45
0
C, sau đó đổ vào hộp petri.
Trong ba cách trên thì hai cách sau hay dùng vì nó thường cho các khuẩn lạc riêng biệt.
Gieo cấy xong, nuôi ở điều kiện thích hợp nhất cho loài vi sinh vật định phân lập. Sau 1 - 2 ngày,
đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vậty ở
khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch. Mỗi khuẩn lạc cấy lên một ống. Sau đó nuôi ở

nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết.
Chú ý nếu sau hai ngày, vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn. Phải chọn các khuẩn lạc
riêng biệt
- Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết quả tương đối đảm bảo.
- Nhược điểm và cách khắc phục: Khuẩn lạc có thể không phải phát sinh từ một tế bào ban đầu
mà nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu. Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng lẻ nhưng để để
quá thời gian chúng lại dính liền nhau. có thể khắc phục bằng cách phân lập như trên vài lần,
đồng thời làm tiêu bản để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
11

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

c. Phương pháp tách từng tế bào
Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử
nấm mốc. Có thể thực hiện theo hai cách sau:
+ Tách từng giọt chỉ chứa một tế bào có kiểm tra bằng kính hiển vi:
- Pha loãng canh trường vi sinh vật bằng các ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn. Pha
loãng đến mức là trong mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai tế bào vi sinh vật.

- Dùng que cấy nhọn hoặc ngòi bút nhỏ (đã vô khuẩn) chấm từng giọt nhỏ canh trường đã pha
loãng lên lá kính vô khuẩn. Chấm thành ba bốn hàng và các giọt cách xa nhau vừa phải để dễ
quan sát.
- Nhanh chóng xoay lá kính cho các giọt xuống dưới rồi đặt lên phiến kính lõm, bôi vazơlin
quanh mép lá kính, giữ không cho các giọt bị khô.
- Quan sát dưới kính hiển vi và đánh dấu những giọt chỉ có một tế bào
- Quan sát xong, đặt các phiến kính vào hộp petri có lót bông hoặc giấy lọc tẩm nước (tránh cho
các giọt không bị khô đi) rồi đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp.
- Sau 1 - 2 ngày, các tế bào trong giọt sẽ hình thành khuẩn lạc, ta lấy ra và quan sát những giọt đã
đánh dấu xem tế bào co sinh sản, phát triển không. Nếu có ta cấy chuyền các khuẩn lạc lên môi
trường thích hợp. Cách cấy truyền như sau: Dùng kẹp cặp một mảnh giấy lọc hình tam giác (tất
cả đã được vô trùng) thấm giọt có khuẩn lạc định tách rồi nhanh chóng đặt vào ống nghiệm chứa
môi trường thích hợp; để ống nghiệm vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày người ta được canh trường thuần
khiết.
Ưu điểm: Phương pháp này cho kết quả bảo đảm vì có kiểm tra bằng kính hiển vi.
+ Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur)
Micromanipulateur là một dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc dưới sự kiểm tra trực tiếp qua
kính hiển vi. Nó bao gồm các kim nhỏ, micropipet, giá đỡ và các bộ phận cơ học tinh vi có thể di
chuyển các kim và pipet để lấy riêng ra từng tế bào vi sinh vật trong giọt canh trường rồi đem
nuôi cấy riêng biệt ta sẽ được canh trường thuần khiết.
Ưu điểm: Phương pháp này tương đối nhanh chóng, chính xác nhưng đòi hỏi cẩn thận, khéo léo.
III. Phân lập vi sinh vật yếm khí
Nói chung có thể phân lập theo các phương pháp trên rồi nuôi ở điều kiện yếm khí. Nếu khó tạo
điều kiện yếm khí thì phân lập như sau:
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
12

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ

Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

1. Dùng pipet Pasteur
- Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ nhất định
- Lấy một giọt của canh trường pha loãng cuối cùng cho vào ống thạch (đã đun chảy trước và
làm nguội đến 45 - 50OC) lắc đều.
- Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín
đầu nhỏ của pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp
- Sau 1 - 2 ngày các khuẩn lạc của vi sinh vật sẽ mọc trong ống thạch
- Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào môi trường nuôi cấy
thích hợp.
Động tác này phải tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng, ngoài ra, để nhận biết vùng có vi
sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin. Những vùng có vi
sinh vật phát triển indigocacmin bị khử và chuyển thành màu vàng.

2. Dùng hộp petri lộn ngược
- Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên
- Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng paraphin
bôi xung quanh mép hộp. (Hộp petri đã vô trùng và đặt lộn ngược trước).
- Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào môi trường thích
hợp
B. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Định nghĩa: Định lượng vi sinh vật là xác định số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên
cứu.
Có hai nhóm phương pháp dùng để định lượng vi sinh vật
I. Định lượng trực tiếp
Định nghĩa: Định lượng trực tiếp là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có
trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
13

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trước lúc làm
tiêu bản.
Các phương pháp định lượng trực tiếp
1. Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu
+ Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như nấm men,
bào tử nấm mốc.
+ Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó là một phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoang

ngang, khoang giữa thấp hơn hai khoang bên 0,1 mm và được chia thành hai khoang nhỏ nhờ
một rãnh dọc; trên mỗi khoang nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, một số ô
vuông lớn lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16) có cạnh dài 1/20 mm. diện tích
1/400 mm2; nếu chiều cao 0,1 mm thì thể tích là 1/4000 mm3. Mỗi buồng đếm có kèm theo một
lá kính.

Hình 3: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu
+ Cách tiến hành:
- Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường, tùy canh trường mà mức độ
pha loãng nhiều hay ít (10, 100 lần)
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
14

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

- dùng bông thấm nước, tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính
lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.
- Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa
lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu).

Chú ý không để canh trường tràn ra ngoài khoang đếm, rơi xuống các rãnh và tránh tạo thành bọt
khí.
- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo
nhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn
mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô.
Chú ý:
- Cần làm lặp lại 3-4 lần
- Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ô
đang đếm Trước và sau khi dùng, buồng đếm và lá kính phải được rửa kỹ bằng nước cất rồi
dùng bông lau sạch để khô.
- Khi số tế bào trong một ô quá 16 thì nên pha loãng canh trường thêm.
Tính toán:
Nếu dùng buồng đếm có bề sâu h = 0,1 mm và diện tích 1ô S = 1/25 mm2
thì số tế bào trong 1 ml canh trường là: =
S
h
fa



1000

trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô
f là hệ số pha loãng của canh trường
h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích một ô
1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm
3
.
2. Phương pháp Brit

+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng để định lượng vi sinh vật có trong sữa hay một số vật
phẩm lỏng.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
15

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

+ Cách tiến hành:
- Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng khi quan sát.
- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu. Cho dàn đều lên
phiến kính sạch với diện tích nhất định (2 - 4 cm2).
- Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen.
- Để khô và quan sát dưới kính hiển vi. Đếm số tế bào trong 5 - 10 kính trường, lấy trung bình rồi
suy ra số tế bào trên một đơn vị diện tích vết bôi và cuối cùng là số tế bào trong một đơn vị vật
phẩm nghiên cứu.
3. Phương pháp Vinogratxki - Sungina
+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này thường dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật
phẩm đặc, rắn.
+ Cách tiến hành:

- Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh rồi
chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều trong 5 phút và để yên
trong 1 - 2 giây.
- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một diện
tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm2). để tránh vi sinh vật dồn lại đầu pipet, động tác
này phải làm nhanh, lượng hỗn dịch hút vào pipet không nên nhiều quá và lúc chưa dàn kịp thì
phải giữ pipet ở vị trí nằm ngang.
- Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớp thạch mỏng, loãng (0,1%). Lại để khô và cố định bằng cồn
tuyệt đối trong 5 phút.
- Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ. Trong quá trình nhuộm phải theo dõi để
thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi.
- Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu. Cách đếm và tính kết quả gần giống như
phương pháp Brit.
2. Định lượng gián tiếp
Định nghĩa: Định lượng gián tiếp là những phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo
cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức ăn thích hợp, nuôi trong 36 -
48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
16

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn
Nhược điểm:
- Tốn thời gian, công sức
- Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc chênh
nhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị so sánh tốt nên sử dụng một độ pha
loãng thống nhất đối với từng loại vật phẩm.
- Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng đôi,
từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc.
Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm
nghiên cớu.
- Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.
Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp petri, nuôi ở
nhiệt độ thích hợp. Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả.
Cách tiến hành:
+ Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1/10 như phương pháp pha
loãng Pasteur.
+ Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng lỏng bằng cách:
Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả vào bình tam giác dung tích 250 ml
đã chứa sẵn 99 ml nước vô trùng. Lắc đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục pha
loãng như trên.
+ Gieo cấy một lượng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm pha loãng cuối
cùng lên hộp petri đã chứa sẵn môi trường vô trùng.
+ Nuôi ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc.
+ Đọc kết quả
- Nếu số khuẩn lạc không nhiều lắm ta đếm trực tiếp tất cả các khuẩn lạc có trong hộp
- Nếu số khuẩn lạc nhiều quá ta dùng kính đếm Lafa. đó là một tấm kính hình vuông có kích

thước 15 x 15 cm. Mặt kính được chia ra thành những ô có diện tích bằng nhau (1 cm2). Đếm số
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
17

Bài 2 : PHÂN L
Ậ
P VÀ Đ
Ị
NH LƯ
Ợ
NG VI SINH V
Ậ
T


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

khuẩn lạc trên 5 - 10 ô. Lấy trung bình cho 1 ô (ký hiệu là a tế bào). Đếm xong đo đường kính
trong của đáy hộp (ký hiệu là D). Suy ra số khuẩn lạc trong toàn hộp là a x D2/4.
Định lượng vi sinh vật trong không khí
Phương pháp lắng của Omelianxki
Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì
lượng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí.
Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thường dùng.
Nhược điểm: Không thật chính xác vì dựa trên cách ước tính.
Cách tiến hành: Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu.
Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào tủ ấm. Sau 24
– 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc.
Tính toán: Đo đường kính hộp petri (d cm) để tính điện tích (D2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật
tong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki.

Ngoài ra còn có thể ước tính như sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2. Sau 1 giờ sẽ có một lượng
vi sinh vật lắng xuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí.











Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
18

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO
Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN



Bài 3 : KÍNH HIỂN VI. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT

VI SINH VẬT SỐNG. QUAN SÁT NẤM MEN
A. KÍNH HIỂN VI
Kính hiển vi là một hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh của vật cần quan sát. Kính hiển
vi có nhiều loại tùy thuộc vào ánh sáng mà người ta sử dụng như: kính hiển vi quang học, kính
hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử
I. Cấu tạo kính hiển vi quang học
Kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận chức năng: cơ học và quang học
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
19

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO
Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN


Hình 4: Cấu tạo kính hiển vi điện tử
1. Bộ phận cơ học: có cấu tạo khá đơn giản gồm giá kính, ống kính và khay kính.
- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để trên đó lắp các bộ phận khác của kính. Nó gồm đế kính và
thân kính
- Khay kính: hình tròn hoặc hình vuông là nơi đặt tiêu bản. Hai bên có ốc để chuyển dịch theo
hai chiều khác nhau có hai kẹp bằng thép để giữ tiêu bản.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
20

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N
VI. CÁC LO
Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN


Hình 5: Các loại khay kính thường dùng ở kính hiển vi
- Ống kính: là một ống tròn (kính một mắt) hay hai ống tròn (kính hai mắt) . Nhờ ốc cố định
bên cạnh ta có thể xoay ống kính theo hướng thuận với người quan sát người quan sát. Đầu trên
của ống kính lắp thị kính, đầu dưới gắn với bàn xoay có lắp nhiều vật kính khác nhau và có thể
xoay quanh trục của giá kính. Ống kính có thể di chuyển lên, xuống nhờ các ốc điều chỉnh quay
tự do theo hai chiều ngược nhau. Ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) dùng để tìm ảnh của
vật còn ốc di chuyển chậm (ou ốc điều chỉnh tinh) dùng để điều chỉnh cho ảnh của vật rõ nét.
2. Bộ phận quang học
Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ
quang và, bộ phận truyền quang.
- Vật kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại. Mỗi vật kính đèu có ghi số phóng đại bên cạnh (8x,
20x, 40x, 90x, 100x ). Những vật kính có độ phóng đại vừa và nhỏ (8x, 20x, 40x ) khi dùng
không cho dầu nên gọi là vật kính khô. Những vật kính có độ phóng đại lớn (90x, 100x ) khi
dùng cần nhỏ trước một giọt dầu lên trên tiêu bản nên gọi là vật kính dầu. Dầu phải trong suốt,
trung tính và có chiết suất (độ chiết quang) tương đương với chiết suất thủy tinh ( = 1,52). Nhờ
đó giữa thủy tinh và dầu tạo thành một môi trường tương đối đồng nhất nên ánh sáng đi qua

không bị khúc xạ mà rọi thẳng vào vật kính. Mỗi vật kính có một khoảng làm việc (khoảng cách
từ tiêu bản tới vật kính cho phép thấy rõ nhất ảnh của mẫu vật) nhất định, cụ thể là: đối với vật
kính 8x - 8,53 mm; 40x - 0,4 mm; 90x - 0,1mm.

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
21

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO
Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

(a) (b)
Hình 6: (a) Các loại vật kính, (b) Vị trí của vật kính trong kính hiển vi
- Thị kính: lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính. Mỗi loại thị kính cũng có độ phóng đại
khác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính (7x, 10x, 15x )

Hình 7: Các loại thị kính khác nhau
Khi quan sát ta được một ảnh ảo, ngược với vật và có độ phóng đại bằng tích số giữa độ phóng
đại của vật kính, thị kính được sử dụng và phóng đại của bộ phận truyền quang (ở một số loại
kính hệ thống truyền quang cũng có tác dụng phóng đại).
- Kính tụ quang: lắp dưới khay kính, gồm một hệ thống thấu kính ghép lại, có tác dụng tập
trung ánh sáng để chiếu vào tiêu bản. Kính tụ quang có thể di chuyển lên, xuống nhờ ốc điều
chỉnh bên cạnh.

Dưới kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng đi vào nhiều hay
ít.
II.Cách sử dụng
1. Điều chỉnh ánh sáng
- Điều chỉnh gương: Quay gương phản chiếu về nguồn sáng và điều chỉnh để chùm tia sáng rọi
vào kính tụ quang. (Nếu ánh sáng tự nhiên thì dùng gương phẳng. Nếu ánh sáng nhân tạo thì
dùng gương lõm).
- Điều chỉnh kính tụ quang: Muốn chiếu sáng vừa hoặc ít thì hạ kính tụ quang, mở chắn sáng vừa
phải. Muốn chiếu sáng nhiều thì nâng tụ quang lên, mở rộng chắn sáng.
2. Quan sát tiêu bản
- Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính.
- Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa. Đặt tiêu bản lên khay kính và nhìn vào thị kính, điều
chỉnh tiêu bản để chọn được vùng định quan sát.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
22

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO
Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

- Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản. Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản.
Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính
- Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng,

khi thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét.
III. Cách bảo quản
1. Bảo quản sau khi sử dụng kính
- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ
- Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu
vật kính cho thật sạch.
- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu
- Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục. Xếp khăn lại, đặt lên khay kính rồi hạ vật
kính chạm sát khăn.
- Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon. Chuyển kính vào tủcó hệ thống đèn bật
thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn.
2. Bảo quản thông thường và định kỳ
- Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo
- Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính.
- Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông.
- Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính.
- Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thân
kính, một tay đỡ đế kính.
B. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT SỐNG
Các loại tiêu bản quan sát vi sinh vật sống là loại tiêu bản tạm thời, có những đặc điểm sau:
- Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh.
- Quan sát được các trạng thái sống của tế bào như: sự chuyển động của tiên mao, sự sinh sản, sự
hình thành bào tử
- Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
23

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO

Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Cách lấy giống vi sinh vật:
Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng đều phải thực hiện các thao tác lấy
giống vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. Các thao tác này diễn ra theo trình tự sau:
- Đốt đèn cồn lên.
- Tay trái cầm ống nghiệm có canh trường vi sinh vật (ngửa lòng bàn tay lên, đặt ống nghiệm
giữa ngón trỏ và ngón cái sao cho ống canh trường hơi nghiêng). Nhất thiết không để canh
trường chạm nút bông (nếu là canh trường lỏng).
- Dùng tay phải xoay nhẹ nút bông một vòng để dễ rút ra.
- Tay phải cầm que cấy, nung nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, lướt thân que cấy qua đèn
cồn sao cho toàn bộ que cấy được thanh trùng hoàn toàn.
- Kẹp nút bông giữa ngón út và lòng bàn tay phải hay giữa ngón út và ngón đeo nhẫn của bàn tay
phải, rút nhẹ nút bông và giưỡ nguyên như vậy suốt quá trình lấy mẫu. tuyệt đối không để nút
bông lên bất kỳ một vật nào khác.
- Đốt miệng ống nghiệm trên đèn cồn.
- Khéo léo đưa đầu que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy canh trường và nhẹ nhàng đưa que
cấy ra.
+ Nếu ống giống là canh trường lỏng thì chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra.
+ Nếu ống giống là canh trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh khối vi sinh vật trên mặt
thạch. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cầy mặt thạch lên.
- Đốt miệng ống nghiệm một lần nữa rồi nút bông lại. Đặt ống nghiệm lên giá.
- Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt lên phiến kính để làm vết
bôi.

- Sát trùng lại que cấy rồi đặt lên giá.
I. Tiêu bản giọt ép
1. Phạm vi sử dụng
Tiêu bản giọt ép cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật
2. Cách làm
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
24

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO
Ạ
I TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT


Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

- Chuẩn bị một phiến kính và một lá kính sạch, trong suốt.
- Dùng que cấy hoặc pipet lấy canh trường vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính. Với canh trường
đặc, cho trước một giọt muối sinh lý (0,5 - 0,85% NaCl) lên phiến kính. Sau hòa canh trường vi
sinh vật vào.
Chú ý: Lấy giọt canh trường vừa phải, không nhiều hoặc ít quá. Nhiều quá, canh trường sẽ trào
ra ngoài. Nếu ít quá, tiêu bản mau khô và hay tạo thành bọt khí trong tiêu bản, rất khó quan sát.
- Ép lá kính lên giọt canh trường bằng cách để một cạnh lá kính tiếp xúc với phiến kính sát mép
giọt canh trường, nghiêng góc 60
O
, từ từ hạ lá kính nằm lên mặt phiến kính. Tránh đặt lá kính
nhanh, mạnh quá giọt canh trường bắn ra ngoài hoặc lớp không khí giữa lá kính và phiến kính

không kịp thoát sẽ tạo thành bọt khí.
Chú ý:
+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy lọc
thấm bớt nước đi.
+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dịch khỏi bị khô.
- Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát.
II. Tiêu bản giọt treo
1. Phạm vi sử dụng
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản
ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học.
2. Cách làm
- Dùng lá kính và phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính.
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lá kính lên phiến
kính sao cho giọt canh trường "treo" trong không gian lõm của phiến kính. Không để giọt canh
trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của phiến kính.
- Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()
25

Bài 3 : KÍNH HI
Ể
N VI. CÁC LO
Ạ
I

TIÊU B
Ả
N QUAN SÁT

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinh vật dễ
dàng hơn, tiêu bản giữ được lâu hơn và nhờ đó ta có thể quan sát phương thức chuyển động và
sinh sản của vi sinh vật.
III. Tiêu bản vết
1. Phạm vi sử dụng
Dùng để nghiên cứu sự phân bố tự nhiên của các tế bào trong khuẩn lạc vi sinh vật hoặc phổ biến
hơn là để nghiên cứu hình thái của chuỗi bào tử và cách sắp xếp cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn,
nấm mốc.
2. Cách làm
Dùng dao mổ cắt lấy một khối nhỏ môi trường thạch có cấy vi sinh vật đã mọc dày đặc hay mọc
thành các khuẩn lạc riêng rẽ, đặt lên phiến kính sao cho phía có vi sinh vật nằm ở bên trên. Sau
đó lấy một lá kính mỏng dặt lên, dùng que cấy vòng hay kẹp sắt (pince) ép nhẹ lá kính xuống rồi
rút que cấy hay kẹp sắt ra ngay và giữ đúng vị trí của lá kính. Đặt tiêu bản nhận được lên một
phiến kính đã có nhỏ sẵn một giọt nước hay một giọt dung dịch xanh metylen pha loãng 1/40,
cho phần vết nằm ở phía dưới, ta sẽ thu được tiêu bản "vết". Cũng có thể dùng ngay phiến kính
ép nhẹ lên bề mặt của khuẩn lạc hay bề mặt của đám vi sinh vật rồi lấy ra làm tiêu bản "vết"
IV. Nhuộm màu vi sinh vật sống
Đôi khi muốn thấy rõ hơn hình dạng tế bào vi sinh vật, người ta sử dụng thuốc nhuộm loãng như:
xanh metylen hay fuchsin (1/1000), đỏ công gô 3%, đỏ trung tính từ 0,001 đến 0,00001%
1. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không độc hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng
ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu.
2. Cách làm: Có hai cách nhuộm màu vi sinh vật sống
Cách 1
- Nhỏ một giọt thuốc nhuộm (không quá lớn) lên phiến kính
- Lấy một giọt canh trường vi sinh vật, hòa đều với thuốc nhuộm.

- Đậy lá kính lên và đem quan sát.
Cách 2
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer ()