Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro lan trầm rồng đỏ (dendrobium nestor o’brien)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN QUỐC KHÁNH

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN TRẦM RỒNG ĐỎ
(DENDROBIUM NESTOR O’BRIEN)
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. BÙI VĂN THẮNG
2. TS. NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM

Gia Lai, 2023


i
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi:

- Hiệu trưởng Trường Đại học Lâm nghiệp;

- Trưởng phòng Đào tạo sau đại học.

Tơi tên là: Nguyễn Quốc Khánh, Giới tính: Nam
Sinh ngày: 09/3/1971
Ngành: Công nghệ sinh học
Lớp: 28B2-CNSH
Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sĩ “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống
in vitro lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien)” là công trình
nghiên cứu khoa học độc lập của tơi. Các số liệu nghiên cứu khoa học và kết
quả nghiên cứu của luận văn là trung thực và tài liệu tham khảo đã được ghi
rõ nguồn trích dẫn.
Nếu phát hiện bất kỳ sự sao chép nào từ kết quả nghiên cứu khác hoặc sai
sót về số liệu nghiên cứu, tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trước Nhà trường
và Hội đồng.
Gia Lai, ngày tháng năm 2023
Học viên

Nguyễn Quốc Khánh


ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi tham gia thực
hiện đề tài luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro lan
Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien)” tại Viện.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Bùi Văn Thắng, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học và TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm - Bộ môn
Công nghệ tế bào - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã trực tiếp hướng
dẫn và luôn quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi đối với bản thân tơi trong suốt

q trình thực hiện đề tài và hồn thiện luận văn tốt nghiệp này.
Tơi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô giáo thuộc Bộ môn Công
nghệ tế bào cùng các Thầy Cô trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp
đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong q trình tơi học tập
và thực hiện đề tài tại Viện.
Tuy đã cố gắng để hoàn thiện đề tài luận văn này, song kiến thức cũng
như kinh nghiệm của bản thân tơi cịn nhiều hạn chế, vì vậy bản luận văn tốt
nghiệp này khơng tránh khỏi những sai sót, kính mong quý Thầy Cô đóng góp
ý kiến để bản Luận văn của tơi được hồn thiện hơn.
Trân trọng!
Gia Lai, ngày tháng

năm 2023

Học viên

Nguyễn Quốc Khánh


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ v
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................. vii
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chương 1.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU..................................... 4
Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 15

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................ 15
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................ 15
2.3. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ............................................................ 15
2.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 16
2.4.1. Phương pháp luận ......................................................................... 16
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể .......................................... 16
2.5. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu ................................................. 23
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 25
3.1. Kết quả nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro từ chồi
nhánh ............................................................................................................... 25
3.2. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến
khả năng tạo thể chồi....................................................................................... 28
3.3. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến
khả năng nhân nhanh thể chồi (protocorm). ................................................... 29
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến
khả năng nhân nhanh thể chồi ........................................................................ 29
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân
nhanh thể chồi ................................................................................................. 31


iv
3.4. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến
khả năng nhân nhanh chồi ............................................................................... 33
3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến
khả năng nhân nhanh chồi .............................................................................. 33
3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân
nhanh chồi ....................................................................................................... 36
3.5. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến
khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh .................................................................. 39
3.5.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng đến

khả năng ra rễ, tạo cây hồn chỉnh ................................................................ 39
3.5.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ,
tạo cây hoàn chỉnh .......................................................................................... 41
3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây
con ở giai đoạn vườn ươm .............................................................................. 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 46
1. Kết luận .................................................................................................. 46
2. Kiến nghị ................................................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47
PHỤ LỤC ...........................................................................................................


v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Viết đầy đủ

BAP

Benzyl amino purine-6

Cs

Cộng sự

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

ĐHST

Điều hịa sinh trưởng

IAA

Indol acetic acid

IBA

Indole-3- butyric acid

Ki

Furfury amino purine-6

MS

Murashige &Skoog, 1962

NAA

Naphthyl acetic acid

Sig

Mức ý nghĩa (Significant)

TB

Trung bình


vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến khả năng tạo
mẫu sạch .......................................................................................................... 18
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân
nhanh thể chồi ................................................................................................. 19
Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân
nhanh chồi ....................................................................................................... 20
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro21
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con23
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch
và tỷ lệ tái sinh của mẫu .................................................................................. 26
Bảng 3.2. Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo
thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ......................................................................... 28
Bảng 3.3. Kết quả ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh thể chồi sau 6 tuần nuôi cấy ........................................................ 30
Bảng 3.4. Kết quả ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi .... 32
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng kích thích
tăng trưởng và nhân nhanh chồi lan Trầm rồng đỏ ......................................... 34
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân nhanh chồi .............. 38
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ lan
Trầm rồng đỏ sau 6 tuần nuôi cấy ................................................................... 40
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ của Lan Trầm rồng đỏ...... 42
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giá thể đến khả năng sống của cây
mô giai đoạn vườn ươm sau 3 tuần ra ngôi..................................................... 43
Bảng 3. 10. Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giá thể đến khả năng sống của cây

mô giai đoạn vườn ươm sau 8 tuần ra ngôi..................................................... 45


vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Cây và hoa lan Trầm rồng đỏ .......................................................... 16
Hình 3.1. Mẫu sạch tái sinh chồi ở cơng thức KT2 ........................................ 28
Hình 3.2. Thể chồi trong các công thức môi trường nhân nhanh sau 6 tuần
nuôi cấy ........................................................................................................... 31
Hình 3.3. Thể chồi lan dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau ..................... 33
Hình 3.4. Chồi lan Trầm rồng đỏ trong các môi trường nhân nhanh sau 3 t̀n
ni cấy ........................................................................................................... 35
Hình 3.5. Bình chồi lan Trầm rồng đỏ trong các môi trường nhân nhanh sau 6
tuần ni cấy ................................................................................................... 36
Hình 3.6. Chồi lan Trầm rồng đỏ nuôi cấy trong điều kiện tổ hợp ánh sáng
AS3 (1 xanh : 5 đỏ : 1 trắng) sau 3 tuần ni cấy........................................... 38
Hình 3.7. Bình chồi lan Trầm rồng đỏ trong các điều kiện ánh sáng sau 6 tuần
nuôi cấy ........................................................................................................... 39
Hình 3.8. Rễ cây lan Trầm rồng đỏ trong các loại mơi trường khác nhau. .... 41
Hình 3.9. Cây lan Trầm rồng đỏ trong môi trường ra rễ R2 ........................... 41
Hình 3.10. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng ra rễ lan Trầm rồng đỏ ... 43
Hình 3.11. Cây mô lan Trầm rồng đỏ trên các giá thể ra cây khác nhau sau 3
t̀n ra ngơi ...................................................................................................... 44
Hình 3.12. Cây mô lan Trầm rồng đỏ trên các giá thể ra cây khác nhau sau 8
tuần ra ngôi ...................................................................................................... 45


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghề trồng hoa ở Việt Nam có lịch sử từ rất lâu. Trong "Ngũ bách

viên" do Vua Trần Nhân Tơng lập nên, có 500 lồi hoa quý được sưu tập từ
khắp các địa phương trong cả nước, chủ yếu là kiếm lan (lồi lan bản địa có
nhiều hương) thuộc chi Cymbidium. Ngày đó, các chậu lan còn được coi là
vật báu quốc gia. Các lồi lan đó cịn tồn tại đến ngày nay, được các nhà nho,
quan lại, các gia đình khá giả thích chơi các lồi lan này và phát triển trong
dân gian. Hiện nay, một số loài lan quý hiếm vẫn tồn tại như Thanh Ngọc,
Mạc đen, Đại mạc biên, Đại mạc, Hoàng vũ, Thanh trường, Hoàng điểm...,
giá trị mỗi chậu lan nhỏ lên tới vài triệu đồng thậm chí cả chục triệu đồng khi
Tết đến xuân về [12].
Việc nghiên cứu về lan ở Việt Nam thời gian đầu không thấy rõ rệt lắm,
theo một số tài liệu, có lẽ người đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là
Gioalas Noureiro - nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, Ơng đã mơ tả cây lan ở Việt
Nam lần đầu tiên vào năm 1789. Trong cuốn “Flora cochin chinensis” gọi tên
các cây lan trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là aerides, Phaius
và Sarcopodium... đã được Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera
plante rum” (1862- 1883). Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam thì mới có
những cơng trình nghiên cứu được công bố đáng kể là F. gagnepain và A.
gnillaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ
"Thực vật Đông Dương chí" (Flora Genera Indochine) do H. Lecomte chủ
biên, xuất bản từ những năm 1932 - 1934. Ở nước ta đã biết được 897 loài
thuộc 152 chi của họ hoa lan. Nguồn gen hoa phong lan của Việt Nam rất
phong phú, trong đó lan Hoàng Thảo chiếm khoảng 30 - 40% trong tổng số
các loài lan của Việt Nam [12].
Từ lâu, các loài Hoa lan đã được sử dụng làm loài cây cảnh quý giá,
khơng những đẹp về màu sắc mà cả về hình dáng, từ đường nét tao nhã của


2
cánh hoa đến hình dạng thân, lá cành duyên dáng, hiếm có lồi hoa nào sánh
nổi, một số lồi cịn có hương thơm quyến rũ, thanh tao... Vì vậy, từ lâu ông

cha ta luôn coi hoa lan như một biểu tượng của sự thuần khiết, sự cao quí và
vương giả [12].
Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguyên của nhiều loài lan
quý, là nơi có nguồn quỹ gen cây trồng đa dạng và vô cùng phong phú. Thời
tiết khí hậu ở Việt Nam rất thuận lợi, mùa đông ở nước ta không quá lạnh, đất
nước tràn đầy hoa. Trong khi đó Châu Âu, Bắc Á, Bắc Mỹ mùa đơng tuyết
phủ, cịn các nước phía Nam lại rất khơ, nóng và khan hiếm hoa [12]. Việt
Nam có điều kiện tự nhiên rất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của
nhiều loài hoa lan, trong đó có lan Trầm rồng đỏ.
Lan Trầm rồng đỏ có tên khoa học là: Dendrobium nestor O’Brien
(Gard.Chron.1892 (1): 718.1892). Loài lan này được lai tạo từ lan Giả hạc và
lan Song hồng, bắt nguồn từ rừng Myanma. Lồi hoa này cịn có tên gọi là lan
trầm Đài Loan và được phân vào nhóm lan cao cấp. Thân của cây lan Trầm
rồng đỏ rất dài so với các giống lan trầm rừng Việt Nam, loài lan này có màu
hoa sắc tím, đỏ đậm, đặc biệt nó có tên Trầm bởi vì hoa rất thơm. Lan Trầm
rồng đỏ có thể sống được ở nhiều vùng khí hậu, thường ra hoa và nở vào mùa
xuân với khí hậu ấm áp do đó được giới chơi lan rất ưa chuộng [20].
Lan Trầm rồng đỏ là một loài hoa có giá trị kinh tế cao, mỗi chậu hoa
có giá từ vài trăm ngàn đồng đến vài triệu đồng. Là loài lan lai nên lan
Trầm rồng đỏ có đầy đủ đặc tính ưu tú của cả bố, mẹ từ mùi hương thơm
đến sắc hoa đều đặc biệt, dáng hoa rất đẹp. Loài này được nhập nội vào
nước ta trong thời gian gần đây [20].
Trong tự nhiên, việc nhân giống hoa lan chủ yếu bằng con đường sinh
sản sinh dưỡng từ vật liệu thân, cành. Tuy nhiên, việc nhân giống bằng hình
thức sinh sản này thường cho hệ số nhân giống thấp và ảnh hưởng lớn đến


3
sinh trưởng và tuổi thọ cây mẹ. Ngoài ra, việc nhân giống vơ tính tạo cây con
bằng hình thức giâm cành cũng gặp phải với một số vấn đề như bị thối rữa do

vi khuẩn xâm nhập; hệ rễ phát triển yếu, không đầy đủ từ đó làm giảm khả
năng sinh trưởng của cây con; giá thể quá ẩm ướt dễ dẫn tới sự gia tăng mầm
bệnh, hay vào mùa đông có thể xảy ra sự ngủ đông của chồi. Bên cạnh đó,
quá trình sinh trưởng và phát triển của lan cũng chịu rất nhiều ảnh hưởng của
vấn đề dinh dưỡng, các điều kiện về môi trường sinh thái, trong đó yếu tố ánh
sáng và độ ẩm là quan trọng nhất. Mặt khác, do hạt lan không chứa nội nhũ
nên rất khó nảy mầm nên nếu áp dụng hình thức nhân giống hữu tính để tạo
cây con cũng không khả thi [10].
Do vậy, để giải quyết vấn đề trên, việc nhân giống các lồi hoa lan bằng
phương pháp ni cấy mô tế bào là phương pháp hiệu quả nhất, bởi nhân
giống bằng phương pháp này cho hệ số nhân giống cao, có thể sản xuất được
cây giống với số lượng lớn, chất lượng cây giống đồng đều, đồng thời vẫn giữ
nguyên được các đặc điểm ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào điều
kiện môi trường, mùa vụ, thời tiết… đồng thời cịn góp phần giúp cho cơng
tác phát triển nguồn gen phong lan tốt hơn. Từ các lý do trên, chúng tôi đã
tiến hành đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro lan Trầm rồng đỏ
(Dendrobium nestor O’Brien).


4
Chương 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Thiên nhiên và con người là sự gắn kết hài hoà, một phần sự gắn kết đó
không thể bỏ qua vẻ đẹp tự nhiên của các loài hoa. Hoa là sự chắt lọc kỳ diệu
nhất những tinh tuý mà thế giới cây cỏ ban tặng cho con người. Mỗi loài hoa
đều ẩn chứa trong mình một vẻ đẹp, sức quyến rũ riêng, mà qua đó con người
có thể gửi gắm tâm hồn mình cho hoa lá, cỏ cây [12].
Hoa phong lan mang một vẻ đẹp nhẹ nhàng, tinh khiết tạo nên những
khoảng lặng của tâm hồn của những người yêu hoa. Có thể nói, thưởng
ngoạn hoa lan như một thú chơi tao nhã, đã được con người biết đến từ rất

xa xưa. Hoa lan mang đến cho tâm hồn con người những giây phút thư
giãn êm đềm và bình yên trong cuộc sống. Hoa lan được biết đến không
chỉ ở vẻ đẹp, hương thơm, màu sắc đa dạng, mà cịn có giá trị kinh tế cao.
Hiện nay, có 750 chi và 35.000 lồi lan tự nhiên, 75.000 giống lan do chọn
lọc và lai tạo đã được biết đến.
Hoa phong lan vốn sống ở vùng rừng cao, núi thẳm, có thể sống lơ lửng
trên các thân cây, dưới mặt đất và cả vùng trũng thấp. Chúng có mặt tại nhiều
vùng sinh thái khác nhau trên thế giới và ở Việt Nam, kể cả xứ nóng hay
lạnh. Thiên nhiên đã ban tặng cho loại hoa này vẻ đẹp kiêu sa, cấu trúc hoa
cầu kỳ, phức tạp, mn hình vạn trạng và nhiều loại có hương thơm quyến
rũ khiến những người chơi hoa phong lan khi thưởng thức vẻ đẹp hay mùi
hương của hoa không thể nào quên.
Trước đây, giá hoa phong lan thường rất đắt, vì để khai thác và trồng
được một giị lan đẹp thì không phải ai cũng có thể làm được. Ngày nay, khoa
học phát triển, việc áp dụng nhiều tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công tác
giống như các phương pháp lai giống nhân tạo kết hợp với kỹ thuật nuôi cấy
mô đã tạo ra được rất nhiều loại lan mới đa dạng về chủng loại, màu sắc hoa


5
và có thể sản xuất với số lượng lớn nên việc chơi hoa lan ngày càng được phổ
biến rộng rãi, thỏa mãn nhu cầu người chơi và cũng đã đem lại nguồn lợi kinh
tế cho người sản xuất.
Giống như đa số lồi thực vật khác, khi chăm sóc lan cũng cần duy trì
đầy đủ các yếu tố như độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ để lan sinh trưởng và phát
triển tốt. Nếu chúng ta không hiểu đặc tính từng loại lan để tạo ra vùng tiểu
khí hậu phù hợp với chúng thì khó có thể thu được thành quả như ý. Trong
nuôi cấy mô cũng vậy, mỗi giai đoạn khác nhau đều chịu sự ảnh hưởng của
các yếu tố hóa học (là các chất điều hòa sinh trưởng với chủng loại và hàm
lượng khác nhau) cũng như các yếu tố vật lý (đặc biệt là điều kiện ánh sáng),

chúng quyết định đến khả năng tái sinh và sinh trưởng của mẫu cấy. Vì vậy
việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố này trong quy trình nhân giống
thực vật bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là vô cùng cần thiết.
Các giống lan nhập nội lại có các ưu điểm về mặt sinh trưởng, phát
triển khỏe mạnh, sản lượng - chất lượng hoa cao cho người trồng và kinh
doanh lan. Việt Nam có điều kiện xã hội - tự nhiên rất thuận lợi cho sự sinh
trưởng và phát triển của hoa lan. Như vậy, bên cạnh việc khai thác các nguồn
gen q hiếm sẵn có trong tự nhiên thì đồng thời chúng ta cũng phải nhập nội
và nghiên cứu chọn lọc, lai tạo để tuyển chọn được những giống lan mới phù
hợp đáp ứng được nhu cầu thị hiếu của người chơi.
Trên thế giới, chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 lồi,
chủ yếu phân bố ở Đơng Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia,
Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài
và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven
biển. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị
tuyệt chủng hoặc bị đe dọa. Tình trạng khai thác đến cạn kiệt hầu hết các loài
phong lan rừng ở nước ta đang diễn ra mạnh, điển hình như vùng Tây Nguyên


6
và các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Yên Bái, Thái Nguyên... gây nguy cơ
tuyệt chủng cao một số loài phong lan quý hiếm.
Hoa Phong Lan khơng chỉ có tác dụng làm đẹp cho khơng gian sống
mà cịn là bài thuốc có tác dụng chữa bệnh thần kỳ. Trong đó có thể kể đến
là loài lan Kim tuyến được dùng trong điều trị các bệnh như trị đau bụng,
sốt cao, rắn cắn, bệnh tiểu đường, bệnh viêm thận, huyết áp cao, yếu sinh
lý, phòng ngừa u bướu và chữa các bệnh tim mạch; Lan Phi Điệp, Hoàng
thảo đùi gà trị các chứng suy nhược cơ thể, thần kinh suy nhược, đau họng
và yếu sinh lý ở nam giới. Lan Thạch hộc được dùng chữa ho lao, sốt
nóng, khơ cổ, ho, đau họng, khát nước thuộc chứng âm hư, nóng trong,

đau lưng, chân tay nhức mỏi, ra mồ hôi trộm, thiểu năng sinh dục ở nam
giới, di tinh, đau dạ dày, viêm ruột…
Hiện nay, lan rừng đang bị khai thác cạn kiện do nhu cầu chơi hoa
cũng như nhu cầu thu hái làm dược liệu. Các thương lái Trung Quốc đã
tràn sang các tỉnh phía bắc Việt Nam và săn lùng, thu mua số lượng lớn
các loại lan có tác dụng làm thuốc. Vì vậy việc bảo tồn nguồn dược liệu tự
nhiên là rất cần thiết.
Thông qua phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với hệ số nhân
giống cao có thể tạo ra hàng loạt cây con in vitro đồng đều mang các đặc
điểm ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết… góp
phần thực hiện công tác bảo tồn nguồn gen phong lan tốt hơn. Thêm vào đó,
phương pháp nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thực vật có thể tạo ra các cây con
sạch virus từ cây mẹ đã bị nhiễm bệnh (công tác phục tráng giống cây trồng).
Hơn nữa, nuôi cấy mô, tế bào còn cung cấp nguyên liệu cho việc tạo ra các
giống mới bằng cơng nghệ gen, lai soma, chọn dịng tế bào… mang các đặc
điểm tốt như có hoạt tính sinh học cao, có khả năng kháng bệnh virus, chịu
hạn, chịu được các yếu tố ngoại cảng bất lợi từ môi trường.


7
Trong điều kiện hội nhập quốc tế hiện nay, đầu tư phát triển công
nghiệp, đô thị và du lịch với tốc độ cao, nhu cầu về hoa phục vụ nhu cầu tiêu
dùng trong nước và xuất khẩu gia tăng mạnh. Cùng với sự phát triển của công
nghiệp, đời sống con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu thưởng thức
cái đẹp ngày càng nâng lên. Nghề trồng hoa cây cảnh nói chung và đặc biệt
chọn tạo giống hoa lan xuất khẩu nói riêng, đã và đang trở thành một ngành
kinh tế đem lại nhiều lợi nhuận.
Hoa, cây cảnh mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho người trồng hoa,
đồng thời thúc đẩy du lịch, hội nhập và đời sống văn hóa tinh thần của quốc
gia. Đã có những công ty hàng năm sản xuất và tiêu thụ hoa lan doanh thu lên

hàng tỷ đồng như Sài gịn Orchi dex, cơng ty hoa Hồng Lan..., song các cơng
ty này chủ yếu buôn bán các giống lan nhập nội [12].
Lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien) thuộc chi Hoàng thảo
(Dendrobium). Đây là giống lan có giá trị cao vì hoa đẹp, cánh hoa căng,
thẳng tự nhiên, được lai tạo giữa cây Dendrobium anosmum (Giả hạc) và cây
Dendrobium parishii (Song hồng). Vì thừa hưởng đặc tính di truyền của cả
cây bố và mẹ nên lan Trầm rồng đỏ có mùi thơm nhẹ nhàng dễ chịu như
hương trầm chứ không quá hắc. Hiện nay, lan Trầm rồng đỏ được giới chơi
lan khá ưa chuộng vì tương đối dễ trồng và cho mùi hương rất dễ chịu [19].
Lan Trầm rồng đỏ thuộc loại thân thòng và rễ chùm. Giả hành dài 2050 cm chia đốt ngắn, có màu xanh cốm, các sọc trắng nổi rõ trên lớp vỏ lụa
bao phủ thân. Trên lá cũng có sọc trắng mờ dọc theo bề mặt lá và kích thước
lá từ 7-10 cm. Sắc hoa thay đổi tùy theo vùng miền, từ tím nhạt đến tím đỏ
sẫm và mỏi mắt thân cho 1-4 hoa. Cánh hoa bóng sáp, mắt tím và lưỡi có
nhiều lơng tơi mịn. Hoa nở tỏa mùi thơm dịu nhẹ như trầm chứ không quá
gắt, tạo cảm giác thư thái và xả stress rất hiệu quả. Lan Trầm rồng đỏ ra hoa
vào tháng 2 đến tháng 4 và hoa nở khoảng 10 ngày thì tàn, nếu điều kiện nhiệt
độ thích hợp thì hoa bền được hơn 15 ngày [20].


8
Trong điều kiện tự nhiên, lan Trầm rồng đỏ ưa khí hậu nóng ẩm với
nhiệt độ từ 15-27oC, độ ẩm thích hợp trong khoảng 75-80%. Cũng như những
loại thân thịng khác, lan Trầm rồng đỏ phát triển tốt khi có nhiều ánh sáng
mặt trời, tuy nhiên cây dễ bị cháy lá dưới nắng gắt giờ trưa [19].
Để sinh trưởng, phát triển tốt, các loài sinh vật đều yêu cầu về điều kiện
ngoại cảnh nhất định. Các loài hoa lan nói chung, lan Trầm rồng đỏ nói riêng
cũng yêu cầu một số điều kiện ngoại cảnh như: giá thể trồng, ẩm độ, ánh
sáng, nhiệt độ và dinh dưỡng. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu và kết
luận: một trong những yếu tố quan trọng nhất của cây lan là việc lựa chọn giá
thể hay môi trường để trồng thích hợp. Cây lan sinh trưởng trong chất nền

thoáng khí, có khả năng duy trì và thốt nước tốt. Một loại giá thể (chất nền)
tốt cho cây lan phải có khả năng cung cấp có hiệu quả độ ẩm, dinh dưỡng và
không khí cho cây. Giá thể sử dụng cho cây lan có thể là các chất trơ vật lý
hay còn gọi là giá thể vô cơ (đá dăm, hạt nhựa, đá vụn dung nham và các
dạng khác nhau của bọt núi lửa) hoặc vật liệu hữu cơ (sơ dừa, rêu biển, than
bùn, than củi, bã mía, trấu hun, vỏ cây...) [21]. Giá thể vơ cơ có ưu điểm là có
thể ổn định một vài năm, đối với giá thể này, việc quan trọng nhất là sử dụng
phân bón hợp lý. Giá thể hữu cơ chúng phân hủy theo thời gian gây ra sự thối
rễ ở đáy bầu do sự đóng kết và tích lũy nước. Do vậy, cần thường xuyên bổ
sung thêm giá thể mới để kích thích, trẻ hố bộ rễ cây.
Ở nước ta có rất nhiều cơng trình nghiên cứu, nhân giống thành cơng
nhiều lồi hoa lan bằng phương pháp ni cấy in vitro, trong đó có nhiều lồi
thuộc chi Dendrobium. Đây là phương pháp mang lại hiệu quả cao với quy
mơ cơng nghiệp, đồng thời cũng góp phần bảo tồn các loài lan cũng như các
loài cây quý hiếm khác.
Năm 2002, tác giả Phạm Thị Liên [6] đã thành công trong việc nghiên
cứu nhân giống in vitro đối với một số loài địa lan ở khu vực phía Bắc Việt
Nam và đưa ra quy trình nhân giống cho loài lan Địa lan Hạc đính nâu như sau:


9
Khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút. Đưa mẫu đã khử
trùng vào môi trường F + 3% đường sucrose + 0,8% agar + 1,0 mg/l BAP +
0,7mg/l kinetin + 0,5mg/l IBA. Mơi trường thích hợp để tạo cây hồn chỉnh: Mơi
trường F + 3% đường sucrose + 0,8% agar + 10% nước dừa + 0,5mg/l NAA.
Năm 2005, tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự [14] của Viện Di
truyền Nông nghiệp Hà Nội, khi tiến hành nghiên cứu nhân nhanh phong lan
Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ, đã cho thấy: Mơi trường phát sinh chồi từ
chồi ngủ của phát hoa là MS+ 10% nước dừa + 3% đường+ 1g/l than hoạt
tính + 1mg/l BAP + 0,1mg/l NAA, mơi trường tạo cây hồn chỉnh từ chồi ngủ

của phát hoa là: MS + 10% nước dừa + 3% đường + 1g/l than hoạt tính +
0,1mg/l BAP + 1mg/l NAA.
Năm 2006, Dương Tấn Nhựt và các cộng sự [9] đã nghiên cứu ảnh
hưởng của hệ thống nuôi cấy đến sự hình thành thể chồi và rút ngắn thời gian
sinh trường của hai giống địa lan (cymbidium spp.) Vàng Mỳ và Tím Hột. Kết
quả nghiên cứu cho thấy: Nuôi cấy chồi in vitro trong môi trường lỏng lắc có
tác dụng tốt hơn rõ rệt đối với sự hình thành PLB so với nuôi cấy trên môi
trường đặc. Việc bổ sung các chất điều tiết sinh trường BAP 0,5 mg/1 và
NAA 0,2 mg/1, kết hợp với nước dừa, dịch chiết chuối, khoai tây làm tăng
khả năng sinh trường và kích thích hình thành rễ, có tác dụng rút ngắn thời
gian nuôi cấy.
Năm 2007, tác giả Nguyễn Thị Hồng Gấm và cộng sự [2] tại Trường
Đại học Lâm nghiệp đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan Ngọc
Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro,
cho thấy môi trường nhân nhanh thể chồi: Knudson + 30g/l đường + 100g/l
khoai tây + 100ml/l nước dừa + 7g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA+
0,3mg/l NAA, hệ số nhân nhanh thể chồi là 4,25. Môi trường kéo dài chồi:
Knudson + 30g/l đường+ 100g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa + 7g/l agar +


10
0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA + 0,2mg/l GA3. Môi trường
ra rễ: Knudson + 30g/l đường + 100g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa + 7g/l
agar + 0,1mg/l NAA.
Năm 2008, Phan Thị Kim Hạnh và cộng sự [3] đã nghiên cứu nhân
nhanh in vitro loài lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea) trong bioreactor và
cho kết quả về tỉ lệ nảy mầm cũng như tốc độ sinh trường của cây con in vitro
tốt hơn so với môi trường đặc. Môi trường nuôi cấy là vừa bổ sung vitamin,
axit amin MS, bằng phương thức lỏng - bioreactor với các thông số kỹ thuật:
nhiệt độ 25°c, lưu lượng khơng khí 0,5 lít/phút, thời gian 45 ngày, chu kỳ 4

ngày ngập: 1 ngày khô là tốt nhất để tăng tỉ lệ tạo cây con (91,1%), giảm thời
gian phát triển mầm (5 tuần) đồng thời kích thích sinh trưởng cây con in vitro.
Cây con được cấy chuyển sang môi trường đặc sau 3 tháng đạt được 5,8 lá;
5,2 rễ; lá dài 6,1 cm; lá rộng 1,35 cm; rễ mập 0,41 cm. Giá thể nuôi cây ngoài
vườn ươm bọt núi + than củi + tảo Đài Loan.
Năm 2009, tác giả Nguyễn Thị Mỹ Duyên [1] đã tiến hành nhân giống
lan Dendrobium anosmum, Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô
và nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp và cho
hiệu quả cao. Sau 4 tháng nuôi cấy đã cho ra được cây lan con Dendrobium
mini hồn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng.
Năm 2009, Lê Minh Nguyệt và cộng sự [5] đã nghiên cứu ảnh hưởng
của môi trường và chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng tái sinh và nhân
nhanh giống Hoàng lan thuộc chi lan Kiếm (Cymbidium). Các tác giả đã
khẳng định: môi trường nhân nhanh bổ sung các chất điều hồ sinh trưởng
thuộc nhóm auxin và cytokinin có tác dụng tốt tăng hệ số nhân và chất lượng
chồi đối với hai giống lan CD5 và CD9. Môi trường cho hệ số nhân và chất
lượng chồi cao nhất với giống CD5 là môi trường cơ bản MS bổ sung 1 mg/lít
BAP và 0,3 mg/lít NAA. Mơi trường tốt nhất đối với giống CD9 là môi
trường cơ bản MS bổ sung 1 mg/lít BAP và 0,5 mg/lít NAA.


11
Các chất điều hoà sinh trưởng EBA, kinetin bổ sung riêng rẽ hay tổ hợp
với các môi trường MS + BAP + NAA. Các chất có trong các sản phẩm tự
nhiên ở nước ta như chuối xanh, nước dừa có thể bổ sung để tăng hiệu quả
môi trường và tiết kiệm chi phí khi nhân giống hoa lan.
Mơi trường tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất cho CD5 và CD9 là mơi trường
MS bổ sung 1,0 gam than hoạt tính và 0,5 mg/lít NAA, tạo ra số rễ nhiều nhất
và chất lượng rễ tốt nhất.
Giá thể tốt nhất để ra cây con sau giai đoạn in vitro là dớn đối với cả

hai giống CD5 và CD9. Tuy nhiên, có thể dùng hỗn hợp rong biển và xơ dừa
với tỉ lệ 1:1 vì tỉ lệ sống của giá thể hỗn hợp này cũng khá cao, nhằm giảm chi
phí giá thể trong nhân giống.
Năm 2010, Vũ Ngọc Lan và cs, [4] đã nghiên cứu ảnh hưởng của giá
thể trồng đến quá trinh sinh trưởng của lan Hoàng thảo trúc đen trên 3 loại giá
thể: gỗ nhãn, than củi, xơ dừa. Kết quả cho thấy, giá thể gỗ nhãn có hiệu quả
nhất đến giai đoạn sinh trưởng của cây lan này.
Năm 2010, tác giả Nguyễn Thị Loan [5] (Trường Đại học Lâm nghiệp)
đã nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus
setaceus) qua phôi hạt bằng phương pháp nhân giống in vitro thu được mơi
trường thích hợp để nhân nhanh chồi: Knudson + 20g/l sucrose + 100ml/l
dịch chiết khoai tây + 100ml/l nước dừa + 7g/l agar + 0,3 mg/l NAA + 0,2
mg/l IAA + 0,3 mg/l Kinetin. Môi trường ra rễ: Knudson + 30g/l sucrose +
100 ml/l dịch chiết khoai tây + 100 ml/l nước dừa + 7g/l agar + 0,3mg/l NAA.
Năm 2017, tác giả Lê Thị Thúy và cộng sự [13] đã nghiên cứu về ảnh
hưởng của ánh sáng đèn led Dendrobium lituiflorum và Dendrobium shavin,
kết quả với ánh sáng LED đỏ, cây lan Hoàng thảo kèn in vitro cho số rễ và
chiều dài rễ cao nhất (10 rễ/cây, rễ dài 1,29 cm) so với nghiệm thức đèn
LED xanh (3,33 rễ/cây, rễ dài 0,79 cm) và đèn LED trắng (7,67 rễ/cây, rễ
dài 1,03 cm).


12
Năm 2017, tác giả Nguyễn Văn Việt [15] đã nghiên cứu nhân giống
in vitro lan Hoàng thảo kèn cho thấy sát khuẩn bề mặt quả lan bằng
ethanol 70% trong 1 phút, khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1%
trong 12 phút và nuôi cấy trên môi trường Knops, cho tỷ lệ mẫu sạch
là 86,7%, tỷ lệ mẫu phát sinh thể chồi (protocorm) là 76,7% với thời
gian phát sinh chồi là 5 tuần.
Năm 2018, tác giả Vũ Thị Phan và cộng sự [10] tại Trường Đại học

Lâm nghiệp đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây lan Trầm tím
(Dendrobium nestor) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và đã nghiên cứu thành
công. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khử trùng quả lan bằng phương pháp đốt
3 lần bằng cồn 960 cho tỷ lệ nảy mầm 90,8% sau 8 tuần nuôi cấy. Nhân nhanh
thể chồi trên môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA; 0,2 mg/l
Kinetin; 30g/l sucrose; 5,5 g/l agar, hệ số nhân đạt 6,33 lần sau 6 tuần nuôi
cấy. Kích thích tăng trưởng chồi bằng môi trường nhân nhanh thể chồi bổ
sung 100 mg/l khoai tây cho hệ số nhân chồi là 4,12 lần, chiều cao chồi đạt
4,23 cm, thân mập lá dài và xanh. Ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l
IBA; 0,1 mg/l NAA; 20 g/l sucrose 6,5 g/l agar với tỷ lệ ra rễ 100%; số rễ
trung bình đạt 5,45 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình là 3,85cm. Cây con hoàn
chỉnh được huấn luyện 2 tuần trước khi ra ngôi, sau đó trồng cây trên giá thể
dớn trắng cho tỉ lệ sống 93,33%, cây khỏe, thân cứng, rễ bám tốt vào giá thể
và xuất hiện lá mới sau 8 t̀n. Quy trình nhân giống có thể áp dụng để sản
xuất hàng loạt cây giống lan Trầm rồng đỏ chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu
nguồn cây giống hiện nay [10].
Năm 2022, tác giả Ngọc Minh và cộng sự [7] nghiên cứu các biện
pháp thử nghiệm nhân giống và trồng lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium
nestor O’Brien) tại thành phố Đà Nẵng, sau quá trình thử nghiệm, đánh giá
hiệu quả kỹ thuật các cơng thức thí nghiệm trên cây lan Trầm rồng đỏ, đã
xây dựng được quy trình nhân giống và trồng, chăm sóc phù hợp. Theo đó


13

biện pháp kích thích phát sinh chồi tốt nhất là phun chất kích thích sinh
trưởng lên đoạn thân chứa mắt ngủ, cho số chồi mới là 4,0 chồi. Giá thể
phù hợp để nhân giống là Vỏ thông: Dớn với tỷ lệ 1:1, độ ẩm giá thể phù
hợp là 90%. Đối với nội dung trồng và chăm sóc, kết quả cho thấy chiều
cao cây tốt nhất đạt 30,54cm khi dùng phân NPK (20-20-15-TE), cây cần

liều lượng phân cao 1,0g/L và số lần tưới phù hợp là 5 ngày/lần. Lan Trầm
rồng đỏ phải đảm bảo độ ẩm là 70% và che sáng 30% [8].
Theo trang web www.trongraulamvuon.com [22]. Kỹ thuật nuôi
trồng hoa lan thì lan hài có thể được trồng với nhiều loại giá thể khác nhau
miễn sao có thể giữ ẩm tốt như than vụn, vỏ thông, dớn cọng, dớn tổ quạ,
xi than....thường trồng với một lớp xốp bên dưới, dùng than vụn trộn với
dớn cọng chặt nhỏ khoảng l cm, đặt cây lan hài vào giữa chậu bỏ hồn hợp
than vụn và dớn cọng vào, bên trên phủ một lớp mỏng dớn tổ quạ hoặc
dớn mềm.
Theo một số tài liệu nước ngồi thì hầu hết các nguồn chiếu sáng sử
dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật đều sử dụng đèn huỳnh
quang (thiết bị phục vụ chiếu sáng cho con người). Tuy nhiên, vùng quang
phổ phát ra từ chúng rất rộng, khơng phải là ngưỡng thích hợp ở một số
loài thực vật. Gần đây, đèn đơn sắc (LED) phát triển như nguồn chiếu sáng
cho cây trồng bởi chúng có bước sóng xác định, thể tích và khối lượng
nhỏ, cấu trúc đặc, tuổi thọ cao và ít tỏa nhiệt [18].
Hahn et al. (2000) đã cho biết tốc độ quang hợp của cây Rehmannia
glutinose nuôi cấy in vitro rất cao dưới hệ thống LED hỗn hợp (50% LED
đỏ và 50% LED xanh), còn ở dưới hệ thống chỉ có đèn LED xanh hay
LED đỏ đơn sắc thì tốc độ quang hợp lại rất thấp [16].
Gần đây với sự ra đời của ánh sáng LED trắng, một số cơng trình
nghiên cứu đã cho biết sự phối hợp giữa ánh sáng LED đỏ, LED xanh và ánh
sáng LED trắng cũng ảnh hưởng rất nhiều đến tốc độ sinh trưởng và chất


14
lượng của cây trồng. Nghiên cứu của Kuan et al., (2013) trên cây xà lách
(Lactuca sativa) cho biết trọng lượng tươi của thân lá, rễ, hàm lượng
chlorophyll a, chlorophyll b cũng như các chỉ số về độ ngọt, độ giòn và màu
sắc lá của các cây nuôi cấy dưới đèn huỳnh quang và đèn LED RBW đều tốt

hơn đèn LED RB [17].
Ở nước ta việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân
giống cây lan trong chi Dendrobium là khá phổ biến. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về lan Trầm rồng đỏ còn rất hạn chế. Để góp phần phát triển nguồn
gen cây lan Trầm rồng đỏ thì việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống
invitro loài lan này là việc làm cần thiết và rất có ý nghĩa.
Nhân giống lan Trầm rồng đỏ bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro
đem lại nhiều ý nghĩa: Tạo ra cây đồng đều nhau, hệ số nhân giống cao, giữ
được đặc tính của cây ban đầu, tạo ra cây con sạch bệnh do nuôi cấy trong
điều kiện vô trùng, hoàn toàn chủ động điều chỉnh tác nhân ảnh hưởng khả
năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất
điều hòa sinh trưởng.… Hơn nữa, tạo ra số lượng cây lớn trong một thời gian
ngắn, cung cấp giống cây cho người trồng, để phục vụ cho nhu cầu chơi hoa
của người tiêu dùng [11]. Vậy nên, chính những lí do trên mà chúng tôi thực
hiện đề tài nhân giống lan Trầm rồng đỏ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.


15
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu chung: Xây dựng được kỹ thuật nhân giống in vitro lan
Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor O’Brien).
- Mục tiêu cụ thể:
+ Xác định được công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro.
+ Xác định được sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh
sáng đến khả năng nhân nhanh thể chồi; nhân nhanh chồi và khả năng ra rễ,
tạo cây hoàn chỉnh.
+ Xác định được ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con

ở giai đoạn vườn ươm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng
đến khả năng nhân nhanh thể chồi.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng
đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và ánh sáng
đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh in vitro.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây con
ở giai đoạn vườn ươm.
2.3. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Trầm rồng đỏ (Dendrobium nestor
O’Brien) do công ty TNHH hoa Đan Phượng cung cấp.


16

Hình 2.1. Cây và hoa lan Trầm rồng đỏ
- Vật liệu nghiên cứu: Chồi nhánh lan chọn từ cây khỏe mạnh, mập mạp,
không bị sâu bệnh.
Môi trường nuôi cấy: Môi trường cơ bản MS, được bổ sung đường
sucrose làm nguồn cacbon, agar là tác nhân làm cứng, khoai tây và bổ sung
thêm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau thuộc nhóm chất kích
thích Auxin và Cytokin. pH của môi trường được điều chỉnh đến 5,8 trước khi
bổ sung thêm agar và khử trùng ở nhiệt độ 1180C trong thời gian 20 phút.
- Thời gian: Từ tháng 01/2022 đến tháng 5/2023.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp luận
- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu: chia thành các cơng thức khác nhau,

phải có cơng thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: đảm bảo tính đồng nhất
giữa các cơng thức trong thí nghiệm.
- Số mẫu thí nghiệm đủ lớn (≥ 30)
- Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3 lần.
2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể
Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành.


17
Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp.
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo với các chế độ:
- Thời gian chiếu sáng: 10 - 12 h/ngày.
- Nhiệt độ phịng ni: 25 ± 2oC.
2.4.2.1. Nghiên cứu cơng thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro từ chồi nhánh.
- Mục đích: Xác định được công thức khử trùng tạo mẫu sạch in vitro
- Vật liệu: Chồi nhánh lan chọn từ cây khỏe mạnh, mập mạp, không bị
sâu bệnh.
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được
bố trí 3 lần lặp, 30 bình/1 lần lặp.
- Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sạch, số mẫu sạch nảy mầm. Thời gian thu
thập số liệu: Sau 4 - 8 tuần nuôi cấy và theo dõi.
Chồi nhánh lan Trầm rồng đỏ được khử trùng thơ ở ngồi bằng xà
phịng, đã được pha lỗng, lắc mẫu trong 5 phút sau đó xả lại dưới vòi
nước sạch để loại bỏ sạch xà phòng, thực hiện 3 lần lặp lại thu được mẫu
khử trùng thơ.
Tiến hành q trình khử trùng trong tủ hút vô trùng bằng việc sử dụng
các loại hóa chất khử trùng mẫu khác nhau, với thời gian khử trùng bằng hóa
chất khác nhau. Trong nghiên cứu này, sử dụng cồn 70ᵒ trong 1 phút, sau đó
dùng dung dịch HgCl2 0,1% hai lần kế tiếp nhau (lần thứ nhất với thời gian

khử trùng lần lượt là 5 phút – 7 phút – 9 phút; lần thứ hai với thời gian là 2
phút). Tiếp theo, khử trùng mẫu bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime 400
mg/l trong vòng 10 phút. Sau mỗi lần khử trùng mẫu bằng hóa chất, lắc rửa
mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần.