Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Thay thế phân bón hoá học N bằng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ môi trường - MS6 " doc

1

Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn


Chương trình hợp tác nông nghiệp và phát triển nông thôn
(CARD)


013/06VIE
Thay thế phân bón hoá học N bằng chế
phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu
để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ
môi trường


MS6: Báo cáo Chế phẩm Nốt sần Chất lượng cao








Tháng 9 năm 2009
Mục lục

1. Thông tin về các viện 2
2. Liên lạc 2

3. Tóm tắt dự án 2
4. Tóm tắt các điểm nổi bật 3
5. Nội dung báo cáo 5
5.1. Giới thiệu hai chủng rhizobium của Úc vào Việt nam 6
5.2. Qui trình sản xuất chế phẩm, QA và sử dụng 16
5.3. Kết quả và đánh giá các trình diễn đồng ruộng 32

2
Thông tin các cơ quan tham gia dự án
Tên dự án:
Thay thế phân bón N hóa học bằng chế phẩm vi
sinh cố định đạm cho cây họ đậu tại Việt nam để
tăng thu nhập cho nông dân và cải thiện môi
trường

Cơ quan Việt nam chủ trì dự án
Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (OPI)
Chủ nhiệm dự án Việt nam
Ths. Trần Yên Thảo
Cơ quan Úc
NSW Department of Primary Industries
Đại học Sydney
Nhân sự phía Úc
Dr David Herridge
Dr Roz Deaker
Bà Elizabeth Hartley
Ông Greg Gemell
Thời gian bắt đầu
Tháng 3/2007
Thời gian hòan tất (đầu tiên)

Tháng 3/2009
Thời gian hòan tất (sửa đổi)
11/2009
Giai đoạn
12/2008 – 9/2009

Cán bộ liên lạc
Tại Úc: trưởng nhóm
Tên:
Dr David Herridge
Telephone:
02 67631143
Chức vụ:
Nhà Khoa học cao cấp
Fax:
02 67631222
Cơ quan
Sở các nghành Công nghiệp
cơ bản NSW
Email:


Tại Úc: cán bộ quản lý
Tên:
Mr Graham Denney
Telephone:
02 63913219
Chức vụ:
Quản lý Tài chính
Fax:

02 63913327
Cơ quan
Sở các nghành Công
nghiệp cơ bản NSW
Email:


Tại Việt nam
Tên:
Ths. Trần Yên Thảo
Telephone:
08 9143024 –
8297336
Chúc vụ:
Cán bộ nghiên cứu
Fax:
08 8243528
Cơ quan
Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có
dầu (OPI)
Email:






3
1. Tóm tắt dự án

3. Những điểm nổi bật
Ảnh hưởng của hai chủng rhizobium của Úc tại Việt nam đối với sản xuất cây
họ đậu và năng suất, phân tích so sánh giữa các chủng địa phương và chủng
của Úc
Phần này của dự án đánh giá các chủng quốc tế quí hiếm tại Việt nam và so sánh chúng với
các chủng địa phương. Các chủng địa phương và nhập có nguồn gốc từ các viện nghiên cứu
Việt nam, từ NifTAL (USA), ALIRU (Australia), DOA (Thailand), Hàn quốc và Achentina.
Mộ
t số các chủng này hiện đang sử dụng sản xuất thương mại chế phẩm như là chủng
CB1809 (đậu tương) và NC92 (đậu phộng) tại Úc. Chúng tôi thực hiện hai bộ thí nghiệm: thí
nghiệm trong chậu và thí nghiệm ngoài đồng ruộng.
Trong các thí nghiệm trong chậu, có 13 nghiệm thức cho đậu phộng (11 chủng, đối chứng có

bón phân N và không nhiễm, đối chứng không bón phân N và không nhiễm). và có 18
nghiệm thức cho đậu tương (17 chủng, đối chứ
ng có bón phân N và không nhiễm, đối chứng
không bón phân N và không nhiễm). Tất cả các chủng này đều làm tăng nốt sần của đậu
tương và đậu phộng và năng suất so sánh với đối chứng. Có tương quan chặt giữa số lượng
nốt sần, trọng lượng nốt sần và sinh khối của cây trong khi sự tương quan giữ nốt sần và
chiều cao cây thì rất thấp. Các chủng tốt nhất là NC92 (chủng sản xuất th
ương mại tại Úc) ,
GL1 và GL2 (chủng địa phương) đối với đậu phộng, và chủng CB1809 (chủng sản xuất
thương mại tại Úc), SL2, SL1, CJ2 và U110 (chủng thương mại trước kia của Mỹ) đối với
đậu tương.

Nông dân Việt nam hiện nay bón phân đạm cho cây họ đậu như đậu tương và lạc mà
không nhiễm chế phẩm vi sinh cố định đạm rhizobia. Thay thế phân đạm hoá học bằng
chế phẩm vi sinh sẽ tiết kiệm cho nông dân Việt nam khoảng 50-60 triệu đô la Úc/năm
dùng vào đầu tư phân N hoá học, và cùng lúc, thúc đẩy mở rộng diện tích sản xuất cây
họ đậu. Cũng có các lợi ích về môi trường khi sử dụng chế phẩm này. D
ự án này có mục
tiêu là tăng sản xuất chế phẩm vi sinh cố định đạm rhizobium thông qua tăng cường năng
lực sản xuất, thực hiện chương trình bảo đảm chất lượng sản phẩm ở mức độ quốc gia
(QA) và tăng cường nghiên cứu và phát triển R&D. Tham gia trong dự án này là Viện
Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (OPI), Viện Khoa học Nông nghiệp Miền nam (IAS) và
Viện Quốc gia Nông hoá Thổ nhưỡng (NISF; hiện nay đổi tên là Vi
ện Nông hoá Thổ
nhưỡng (SFI)). Cơ quan Úc tham gia trong dự án là Sở Các nghành Công nghiệp cơ bản
NSW và Trường Đại học Sydney. Sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm bởi nông dân
sẽ tăng lên thông qua sự phát triển và thực hiện một chương trình khuyến nông hiệu quả
và chương trình đào tạo ho cán bộ nghiên cứu, cán bộ khuyến nông của MARD và nông
dân. Lợi ích của chế phẩm và cố định đạm sinh học sẽ
được trình diễn trên đồng ruộng

và thảo luận trong các hội thảo, hội nghị đầu bờ và các ấn bản khuyến nông. Để chắc
chắn tính ổn định của sản xuất và sử dụng, dự án này có sự tham gia của các công ty tư
nhân trong việc marketing và “sản xuất thử” với mục đích là các công ty này sẽ mở rộng
sản xuất và việc cung cấp chế phẩm sẽ tăng dần lên cùng lúc khi công nghệ
và thị trường
phát triển.

4
Tổng số các thí nghiệm đồng ruộng trong 2007–09 là 36 thực hiện tại 10 tỉnh trong nước.
Các thí nghiệm này được thực hiện tại các vùng trồng cây họ đậu chính tại Việt nam, từ vùng
núi cao phía bắc, vùng Duyên hải miền Trung đến vùng đất cao Miền nam và Đồng bằng
Sông Cửu Long. Các tỉnh tham gia thí nghiệm này là Sơn La, Nghệ An, Bình Định, Bình
Thuận, Daklak, DakNong, Tây Ninh, Đồng Tháp, An Giang và Trà Vinh. Có ít nhất 5
nghiệm thức thí nghiệm:

1. Nông dân, không bón phân N
2. Nông dân, bón phân N
3. Nhiễ
m với chủng của Úc CB1809 (đậu tương) hoặc là NC92 (đậu phộng), không bón
phân N
4. Nhiễm với chủng địa phương: SL1 (đậu tương) hoặc GL1 (đậu phộng), không bón
phân N
5. Nhiễm với chủng địa phương: SL2 (đậu tương) hoặc GL2 (đậu phộng), không bón
phân N
Các chủng của Úc có hoạt tính cao nhất theo nghĩa là tăng nốt sần, năng suất sinh khối và
năng suất hạt. So sánh với nghiệm thứ
c không nhiễm, CB1809 và NC92 tăng nốt sần của đậu
tương và đậu phộng trung bình là 58%, sinh khối 30% và năng suất hạt là 29%. So sánh với
các chủng địa phương của Việt nam, các chủng, CB1809 và NC92, tăng nốt sần của đậu
tương và đậu phông trung bình là 22%. Năng suất sinh khối tăng trung bình là 10% và năng

suất hạt là 13%.

Qui trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần chất lượng cao bao gồm QA,
đóng gói, bảo quản, phân ph
ối và áp dụng trên đồng ruộng
Trong suốt 2 năm của dự án, công nghệ sản xuất chế phẩm nốt sần ở ba viện nghiên cứu, OPI
and IAS) đã được phát triển. Mục tiêu chính của sản xuất là chế phẩm vi khuẩn nốt sần chất
lượng cao, >5 x 10
8
rhizobia/g và tạp nhiễm cao nhất là 1 x 10
8
vi khuẩn tạp nhiễm/g. Một số
chi tiết của qui trình công nghệ khác nhau ở mỗi viện phụ thuộc vào cơ sở vật chất và kinh
nghiệm. Ở một mức độ nào đó thì công nghệ sản xuất chế phẩm được ứng dụng và có thay
đổi cho phù hợp từ các công nghệ của các nước mà công nghiệp sản xuất chế phẩm thành
công, đó là Mỹ và Úc.
Dự án đã quyết định r
ằng CB1809 và NC92 sẽ được sử dụng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn
nốt sần cho cây đậu tương và lạc tại Việt nam bởi vì thí nghiệm thực hiện ở các vùng canh
tác các cây này trong nước cho thấy các chủng này là các chủng tốt nhất. Chúng làm tăng
trọng lượng nốt sần, tăng năng suất sinh khối và hạt so với các chủng địa phương đã thử
nghiệm. Trong tương lai, sự đánh giá các chủ
ng sẽ có thể cần thiết để cố gắng phát triển các
chủng tốt hơn nữa. Dự án cũng đã đề xuất rằng các chủng này sẽ được cung cấp hàng năm từ
phòng Quản lý Chất lượng (QA) độc lập cho các cơ quan nhà nước và tư nhân sản xuất chế
phẩm cùng với qui trình duy trì giống và sản xuất giống. Chi tiết được chỉ ra trong phần 5.2.

Than bùn sẽ là nguồn chất mang chính cho s
ản xuất chế phẩm tại Việt nam trong tương lai
gần. Chi tiết xem trong mục 5.2 do có nguồn than bùn khác nhau, tính hiệu quả của nó và có

khả năng tăng cường tính hiệu quả này. Các chỉ dẫn chi tiết được nêu ra đối với pH và lượng
nước thích hợp đối với cơ chất dùng cho sản xuất.

Một thí nghiệm đã được hoàn tất so sánh các phương pháp khử trùng than bùn khác nhau.
Sau khi than bùn được khử trùng một số mẫu đượ
c sử dụng trực tiếp để xác định tạp nhiễm.

5
Các mẫu than bùn khác cấy vào môi trường Glucose Pepton lỏng và sau đó dịch lỏng này
được đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật sau 3 giờ, 24, 36 và 72 giờ. Các mẫu này cũng đã
được nhiễm với rhizobium và sau đó xác định số lượng trong mẫu theo thời gian. Nghiệm
thức tốt nhất theo nghĩa là có số lượng rhizobium cao nhất và có số lượng vi sinh vật tạp
nhiễm thấp nhất là nghiệm thức khử trùng bằng autoclave ở 60 phút và chiếu x
ạ gamma liều
lượng 30 kGy.

Hiện tại Việt nam chưa có tiêu chuẩn chất lượng riêng cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần mà chỉ
mới có tiêu chuẩn cho phân bón vi khuẩn cố định đạm. Tuy nhiên, rất quan trọng để có
chương trình QA cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần (rhizobia). Một số cải thiện đối với Tiêu
Chuẩn Quốc gia Việt nam cho Phân bón Vi sinh vật Cố định đạm (TCVN 6166-1996) đã
được thực hiệ
n để làm cho nó phù hợp hơn đối với chế phẩm vi khuẩn cố định đạm rhizobia,
dựa vào công nghệ sản xuất và đòi hỏi về hiệu quả. Tiêu chuẩn mới này sử dụng cấu trúc tốt
và dễ hiểu của tiêu chuẩn hiện tại. Tên cho tiêu chuẩn được đề xuất là Tiêu chuẩn Quốc Gia
Việt nam đối với Cế phẩm vi khuẩn nốt sần ở cây họ đậ
u. Tiêu chuẩn này bao gồm chi tiết về
các yêu cầu kỹ thuật của chế phẩm, bao gồm cả nhãn hiệu hàng hoá cũng như phương pháp
tiến hành và báo cáo.

Kết quả trình diễn đồng ruộng và hiệu quả của các trình diễn này đối với việc

tăng cường hiểu biết của nông dân
Tổng số 168 trình diễn đã được thực hiện cho đến nay A total of 168 tại 10 tỉnh. Trình diễn
đồng ruộ
ng bao gồm hai nghiệm thức: +nhiễm và không hay có sử dụng phân bón N nhưng ở
liều lượng thấp. Kết quả chỉ ra trong Phụ lục 3.

Một cách tổng quát, sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần làm tăng thu nhập của nông dân,
trung bình 4.500.000VNĐ/ha. Múc độ tăng thì thay đổi tuỳ theo địa diểm. Ở Bầu Đồn, Tây
Ninh nông dân trồng lạc lợi được khoảng 500.000VNĐ/ha nhưng ở Châu Thành, Trà Vinh
nông dân thu lợi cao h
ơn nhiều 14.200.000VNĐ/ha. Tương tự đối với đậu tương, lợi nhuận
tăng thêm là 11.640.000VNĐ ở Dương Minh Châu, Tây Ninh. Tại tỉnh Đồng Tháp nông dân
thu lợi từ chế phẩm trung bình là 4.900.000VNĐ/ha.

Tại Đồng Tháp, làng Phú Hữu, huyện Châu Thành, đã thực hiện trình diễn trên diện tích đất
lớn (61.5 ha) và với sự tham gia của 120 nông dân, năng suất tăng trung bình là 12.5%, tương
đương với 300 kg hạt/ha. Nông dân thu lợi khoảng 4.900.000 VNĐ/ha so với l
ối canh tác cũ
dùng phân bón N hoá học.

Các trình diễn đồng ruộng này được thực hiện song song với các hoạt động đào tạo và
khuyến nông và có kết quả rất tốt cải thiện hiểu biết của nông dân về lợi ích của chế phẩm vi
khuẩn nốt sần đối với sản xuất cây họ đậu. Nông dân đã được mời đến ruộng trình diễn ít
nhất là một lần, ở
nhiều điểm trình diễn nông dân thăm ruộng, lấy mẫu nốt sần, mẫu sinh
khối và thu hoạch hạt. Có hơn 3400 lượt người tham gia. Nông dân cũng được cung cấp tài
liệu khuyến nông. Hơn nữa, cán bộ dự án, khuyến nông viên giải thích cho nông dân hiểu
biết về cố định đạm sinh học, vi khuẩn nốt sần hoạt động như thế nào và điều kiện gì để quá
trình nhiễm đạt hi
ệu quả cao. Nông dân rất hứng thú trong việc tìm hiểu về quá trình cố định

đạm khí trời bởi rhizobia.


6
5. Báo cáo chi tiết
Báo cáo này bao gồm chi tiết về các thí nghiệm về chủng rhizobia, qui trình sản xuất chế
phẩm, QA, phân phối và ứng dụng chế phẩm, kết quả và đánh giá các trình diễn đồng ruộng ,
theo tiêu đề đòi hỏi của báo cáo, như sau:
• Giới thiệu hai chủng của Úc vào Việt nam, ảnh hưởng của nó đến sản xuất cây họ đậu
và hiệu quả, phân tích so sánh giữa các chủng địa phương và nhập nội.
• Qui trình sản xuất chế phẩm chất lượng cao, đóng gói, dự trữ, phân phối và áp dụng
trên đồng ruộng và quản lý chất lượng trong quá trình sản xuất.
• Kết quả trình diễn đồng ruộng, bao gồm đánh giá sinh học và kinh tế, chỉ ra lợi nhuận
sau này đối với hệ thống canh tác xen canh và hiệu quả của trình diễn đồng ruộng
trong việc cải thiện hiểu biết của nông dân v
ề lợi nhuận mang lại từ chế phẩm.

5.1. Giới thiệu hai chủng của Úc vào Việt nam, ảnh hưởng của nó đến sản xuất
cây họ đậu và hiệu quả, phân tích so sánh giữa các chủng địa phương và
nhập nội

Giới thiệu

Nghiên cứu về chế phẩm cố định đạm cho cây họ đậu đã được thực hiện từ những năm 1980
t
ại Trường Đại học Hà nội, Viện Nông hoá Thổ nhưỡng SFI (VASI), và ở Miền Nam là
Trường Đại học Cần Thơ (CTU), IAS và OPI (nay đổi tên là IOOP). Một cách tổng quát,
mục tiêu nghiên cứu là lựa chọn các chủng, sản xuất nhỏ và thực hiện các thí nghiệm đồng
ruộng đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Mỗi viện tập trung nghiên cứu ở các vùng nhất định
và nhóm cây trồng khác nhau, ví dụ như CTU tại Đồ

ng bằng Sông Mekong với cây đậu
tương, IAS tại vùng Đông Nambộ với lạc, OPI đối với lạc và đậu tương tại vùng Duyên hải
Nam Trung bộ và vùng Cao Nguyên. Các chủng đề xuất cho sản xuất chưa được nghiên cứu
lựa chọn cho qui mô quốc gia và các kết quả nghiên cứu về công nghệ sản xuất chưa được
chia sẽ giữa các viện nghiên cứu. Do đó, ngay cả có lịch sử nghiên cứu và sản xuất nh
ưng tại
Việt nam nhưng cho đến nay chế phẩm vi khuẩn nốt sần vẫn chưa có mặt trên thị trường và
nông dân ở múc độ rộng lớn không hiểu biết gì về tiềm năng lợi ích của chúng. Thay vào
d8ó, nông dân sử dụng phân bón N hoá học đắt tiền cho cây họ đậu của họ. Trong phần báo
cáo này đánh giá các chủng quí hiếm quốc tế tại các vùng trồng cây họ đậu trong nước và so
sánh chúng với các chủng qu
ốc gia (Việt nam) . Các chủng địa phương và nhập có nguồn gốc
từ các viện nghiên cứu Việt nam, từ NifTAL (USA), ALIRU (Australia), DOA (Thailand),
Hàn quốc và Achentina. Một số các chủng này hiện đang sử dụng sản xuất thương mại chế
phẩm như là chủng CB1809 (đậu tương) và NC92 (đậu phộng) tại Úc. Chúng tôi thực hiện
hai bộ thí nghiệm: thí nghiệm trong chậu và thí nghiệm ngoài đồng ruộng.

Phương pháp

Lựa chọn các chủ
ng rhizobia

Thiết kế thí nghiệm là RBDR với 3 block. The experimental design was a randomized
complete block design with three blocks. Trong các thí nghiệm trong chậu, có 13 nghiệm
thức cho đậu phộng (11 chủng, đối chứng có bón phân N và không nhiễm, đối chứng không

7
bón phân N và không nhiễm). và có 18 nghiệm thức cho đậu tương (17 chủng, đối chứng có
bón phân N và không nhiễm, đối chứng không bón phân N và không nhiễm). Thông tin về
các chủng được chỉ ra trong bảng 1. Mỗi chủng được nuôi cấy trong môi trường yeast

manitol lỏng (YMB) từ 5 – 7 ngày để đạt được độ đục tối đa (khoảng 1 x 10
9
tế bào/ml).
Dịch sinh khối lỏng này sau đó được trộn vào than bùn đã khử trùng và để cho ổn định trong
1 tuần. Hạt được nhiễm với chế phẩm 10
5
–10
6
tế bào/hạt ngay trước khi gieo.

Thí nghiệm đã sử dụng đất cát bạc màu tại Trảng Bàng, Tây Ninh. Đất được lấy ở độ sâu 10–
15 cm và vận chuyển về Trạm Thực nghiệm Bình Thạnh của OPI. Đất được trộn đều, sau đó
qua rây 5-mm. Đất sau đó trộn đều với bụi xơ dừa (1:1) và vôi và để yên 1 tuần. Mỗi chậu
1.7 kg hỗn hợp này. Khả năng giữ nước củ
a đất được xác định để xác định lượng nước thêm
vào. Phân bón áp dụng như sau: KH
2
PO
4
- 195 mg/pot; KCl - 168.4 mg/pot; MgSO
4
.7H
2
O -
22.21 mg/pot; ZnSO
4
.7H
2
O - 20.63 mg/pot; (NH
4

)
6
Mo
7
O
24
.7H
2
O - 0.81 mg/pot.

Trồng 5 cây/chậu và bỏ đi 2 cây sau 7 ngày. Cây thu hoạch sau 30 ngày đối với đậu tương và
45 ngày đối với lạc. Số lượng nốt sần, trọng lượng khô nốt sần, sinh khối khô được xác định
khi thu hoạch.

Bảng 1. Thông tin về các chủng rhizobium

STT Tên chủng Cây Nguồn
1 NC92 Lạc Australia
2 Tal 179 Lạc NifTAL
3 P088183 Lạc Thailand
4 P03818 Lạc Thailand
5 GL1 Lạc OPI – local strain
6 GL2 Lạc SFI – local strain
7 GL14 Lạc OPI – local strain
8 LAC1 Lạc SFI – local strain
9 P3 Lạc OPI – local strain
10 P1 Lạc OPI – local strain
11 CTP Lạc CTU – local strain
12 CB1809 Đậu tương Australia
13 U110 Đậu tương NifTAL

14 SEMIA 5019 Đậu tương NifTAL
15 S01015 Đậu tương Thailand
16 S1059 Đậu tương Thailand
17 Ach Đậu tương Argentina
18 YCK Đậu tương Korea
19 SL1 Đậu tương SFI – local strain
20 DT2 Đậu tương SFI – local strain
21 SL2 Đậu tương SFI – local strain
22 DL1 Đậu tương OPI – local strain
23 DL2 Đậu tương OPI – local strain
24 CJ1 Đậu tương OPI – local strain
25 CJ2 Đậu t
ương OPI – local strain
26 S6 Đậu tương OPI – local strain
27 S37 Đậu tương OPI – local strain


8
Thí nghiệm đồng ruộng

Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành tại 10 vùng trồng đậu chính tại Việt nam, từ vùng núi
cao phía bắc, vùng Duyên hải miền Trung đến vùng đất cao Miền nam và Đồng bằng Sông
Cửu Long. Các tỉnh tham gia thí nghiệm này là Sơn La, Nghệ An, Bình Định, Bình Thuận,
Daklak, DakNong, Tây Ninh, Đồng Tháp, An Giang và Trà Vinh.

Có ít nhất 5 nghiệm thức thí nghiệm:

1. Nông dân, không bón phân N
2. Nông dân, bón phân N
3. Nhiễm với chủng của Úc CB1809 (đậu tương) hoặ

c là NC92 (đậu phộng), không bón
phân N
4. Nhiễm với chủng địa phương: SL1 (đậu tương) hoặc GL1 (đậu phộng), không bón
phân N
5. Nhiễm với chủng địa phương: SL2 (đậu tương) hoặc GL2 (đậu phộng), không bón
phân N

Nguồn chủng giống:

SL1: chủng Việt nam (đậu tương) từ trường ĐH Cần Thơ
SL2: chủng Việt nam (đậu tương) từ SFI (VASI – chương trình các chủng vi sinh vật
quố
c gia)
GL1: chủng Việt nam (lạc) - OPI
GL2: chủng Việt nam (lạc) - SFI (VASI - chương trình các chủng vi sinh vật quốc gia)
CB1809: Chủng thương mại của Úc (đậu tương) từ ALIRU
NC92: Chủng thương mại của Úc (đậu tương) từ ALIRU

Các chỉ tiêu là: trọng lượng khô nốt sần, năng suất sinh khối và hạt. Ô thí nghiệm ít nhất là
20 m
2
với 4 lần lập lại. Bố trí thí nghiệm kiểu RCBD. Phụ thuộc vào vùng canh tác, ngày
gieo, sự chuẩn bị đất, bón phân, ngày lấy mẫu thì khác nhau. Chi tiết có thể cung cấp nếu
cần.

Chế phẩm trên nề than bùn được cung cấp bởi 3 viện nghiên cứu của Việt nam (OPI, IAS và
SFI) và trong mốt số thí nghiệm các chế phẩm thương mại của úc được sử dụng như là đối
chứng dương. Liều lượng nhi
ễm là 1–2 kg/ha đối với chế phẩm của Việt nam và 0.25 kg/ha
đối với chế phẩm thương mại của Úc. Các chế phẩm được xác định chất lượng bởi OPI trước

khi tiến hành thí nghiệm. Phương páho nhiễm vào hạt được áp dụng. Các phương pháp lấy
mẫu, tiến hành xác định nốt sần, sinh khối và năng suất hạt ssẽ được cung cấp nếu cần.

Kết quả và thảo luậ
n

Lựa chọn các chủng

Tất cả các chủng thí nghiệm đều làm tăng nốt sần và năng suất bso với đối chứng (bảng 2).
Dựa vào các số liệu của nốt sần phân ra làm 3 nhóm:
- Nốt sần cao nhất: NC92, GL1, GL2
- Nốt sần trung bình: P12, GL14, P03818
- Nốt sần thấp: P08183, CTP, P31, LAC1, Tal179

9
Có tương quan chặt giữa số lượng nốt sần, trọng lượng nốt sần và sinh khối (r
2
=0.82) trong
khi đó tương quan giữa nốt sần và chiều cao cây không đáng kể (r
2
=0.27). kết quả cho thấy at
NC92, GL1 và GL2 là các chủng tốt nhất. Chúng sản xuất nhiều nốt sần và nhiều sinh khối
hơn các chủng khác.

Bảng 2. Nốt sần và tăng trưởng của lạc nhiễm với các chủng rhizobia khác nhau

Chủng rhizobium
Số lượng nốt
sần/cây
Trọng lượng nốt

sần/cây (mg)
Chiều cao cây (cm)
Sinh khối khô
(g/cây)
1. NC92 79 b 93 b 33 abcd 2.7 b
2. P08183 29 gh 35 fg 29 cd 1.7 ghi
3. CTP 44 e 52 d 36 ab 2.2 def
4. GL1 113 a 136 a 35 abc 3.8 a
5. P31 35 fg 42 ef 31 bcd 1.7 hij
6. GL2 77 b 91 b 35 ab 2.5 bc
7. P12 54 cd 66 c 35 ab 1.9 fgh
8. GL14 60 c 72 c 32 abcd 1.9 efg
9. LAC1 39 ef 47 de 38 a 1.6 ij
10. Tal 179 27 h 33 g 35 ab 1.5 jk
11. P03818 53 d 63 c 32 abcd 2.4 cd
Đối chứng 1 11 i 12 h 27 d 1.2 k
Đối chứng 2 5 i 6 h 32 abcd 2.2 de
CV% 10.6 11.4 12.7 8.6
Đối chứng 1: không nhiễm, không bón phân N
Đối chứng 2: không nhiễm, bón phân N (100ppm)
Nguồn: OPI


Bảng 3. Nốt sần và tăng trưởng của đậu tương nhiễm với các chủng rhizobia khác nhau


Chủng rhizobium
Số lượng nốt
sần/cây
Trọng lượng nốt

sần/cây (mg)
Chiều cao cây (cm)
Sinh khối khô
(g/cây)
12. U110 47 cd 129 d 38 defg 2.8 d
13. DT2 45 de 121 e 35 defg 2.7 e
14. CB1809 52 bc 149 b 43 abcd 3.3 bc
15. CJ1 35 fg 121 e 41 bcde 2.7 e
16. DL2 30 g 72 h 34 efg 1.6 hi
17. S37 16 h 103 f 50 a 2.3 f
18. SL2 66 a 170 a 42 abcd 3.7 ab
19. CJ2 49 cd 136 cd 42 abcde 2.9 c
20. DL2 35 fg 114 e 37 defg 2.5 e
21. SL1 57 b 141 c 37 defg 3.1 cd
22. YCK 33 fg 77 gh 48 ab 1.7 gh
23. S01015 35 fg 121 e 46 abc 2.6 e
24. SEM 5019 34 fg 118 e 39 cdef 2.6 e
25. DL1 39 ef 83 g 39 cdef 1.8 g
26. S6 21 h 80 g 39 cde 1.7 gh

10
27. ACH 22 h 69 h 30 g 1.5 i
28. S1059 32 fg 97 f 31 fg 2.2 f
Control 1 9 i 35 i 43 abcd 1.3 j
Control 2 8 i 29 i 37 defg 1.4 i
CV% 13.2 5.1 14.6 4.1
Đối chứng 1: không nhiễm, không bón phân N
Đối chứng 2: không nhiễm, bón phân N (100ppm)
Nguồn: OPI

Trong một thí nghiệm khác thực hiện trong nhà lưới, CB1809 tỏ ra là chủng có hoạt tính cao
nhất theo nghĩa tạo nhiều nốt sần (Bảng 4). Chủng này tạo nhiều nốt sần hơn so với 3 chủng
kia.

Bảng 4. Nốt sần của 4 chủng rhizobium cho đậu tương ở thí nghiệm trong nhà lưới

Số lượng nốt sần/cây
STT Nghiệm thức
Tổng nốt sần Trên rễ chính Trên rễ phụ
1 Đối chứng - - -
2 Nhiễm với CB1809 50 25 25
3 Nhiễm với SL1 32 13 19
4 Nhiễm với SL2 39 13 26
5 Nhiễm với SL3 32 11 22
Nguồn : SFI

Thí nghiệm đồng ruộng
Tổnf số có 36 thí nghiệm đồng ruộng tại 10 tỉnh trồng đậu. Tóm tắt các kết quả thí nghiệm
của dự án trong thời gian từ 2007–09 và ảnh hưởng của các chủng CB1809 hay NC92 đối với
nốt sần, sinh khối và năng suất chỉ ra trong Phụ lục 1. Sự tăng nhỏ được xác định là nhỏ hơn
20%, từ 20 đến 40% và lớn là lớn hơn 40%.
Biểu
đồ 1, 2 và 3 tóm tắt sự trả lời đối với nhiễm bằng các chủng CB1809 (đậu tương) hoặc
NC92 (lạc) đối với nốt sần, sinh khối và năng suất, theo thứ tự. Sự trả lời thì biến đổi từ nhỏ
đến lớn phụ thuộc vào điểm thí nghiệm.


11
Graph 1. Range of nodulation responses to inoculation
-20

0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field site
% Respons
e


Có ảnh hưởng lớn của nhiễm rhizobium đối với nốt sần ở 72% số ruộng thí nghiệm 9Biểu đồ
1). ở những điểm này, nốt sần tăng 43–166%. Nốt sần tăng trung bình ở 11% trường hợp và
17% trường hợp tăng thấp. Trung bình nốt sần tăng 58% khi sử dụng các chủng của Úc .

12
Graph 2. Range of crop biomass responses to inoculation
0
10
20
30
40
50
60
70

0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field site
% Response


Đối với sinh khối, có tăng sinh kh61i múc cao (44–86%) khi nhiễm ở 33% điểm thí nghiệm.
tăng trung bình (17–40%) ở 45% trường hợp và tăng ít (5–19%) ở 22% trường hợp (Biểu đồ
2). Tăng năng suất hạt thì thấp hơn so với tăng sinh khối và nốt sần (Biểu đồ 3). Tăng năng
suất hạt lớn (41–70%) ở 20% điểm thí nghiệm. Tăng trung bình (20–40%) ở 62% và tăng ít
(4–18%) ở phần còn lại 18%. Trung bình thì tă
ng sinh khối và năng suất hạt khi sử dụng các
chủng của Úc là 30% và 29%, theo thứ tự.


13
Graph 3. Range of grain yield responses to inoculation
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field site
% R esponse

Có sự trả lời khác nhau đối với việc nhiễm với các chủng khác nhau về nốt sần, sinh khối và
năng suất hạt. Các chủng thương mại của úc CB1809 (đậu tương) và NC92 ( lạc) có hiệu quả
cao hơn so với các chủng địa phương Việt nam ở hầu hết các điểm thí nghiệm (Phụ lục 2).
Phân tích số liệu cho thấy khi cây được nhiễm với CB1809 hoặc NC92, trọng lượ
ng nốt sần,
sinh khối, năng suất hạt tăng so với các chủng bản địa, 91%, 94 và 97% các điểm thí nghiệm.
Tuy nhiên, mức độ tăng thì khác nhau phụ thuộc vào điểm thí nghiệm và các chủng bản địa.
Biểu đồ 4, 5 và 6 cho thấy sự tăng về nốt sần, sinh khối và năng suất hạt của đậu tương và lạc
khi nhiễm với CB1809 and NC92, theo thứ tự, so với nhiễm bằng các ch
ủng bản địa.

Hia chủng của Úc, CB1809 và NC92, Tăng nốt sần của đậu tương và lạc trung bình là 22%,.
Sinh khối tăng trung bình 10% (Biểu đồ 5) và năng suất hạt tăng 13% (Biểu đồ 6), so với cá
chủng bản địa.

Đối với mỗi chỉ tiêu, có sự khác biệt lớn tuỳ theo điểm thí nghiệm. Đối với nốt sần, sự khàc
biệt này là 0–70%. Đối với sinh khối là 0–30% và đối vớ
i năng suất là 0–51%. Năng suất
tăng hơn 20% so với các chủng bản địa ở 18% điểm thí nghiệm, từ 10–20% ở 34% điểm và
1–10% ở 48% diểm thí nghiệm.


14
Graph 4. Nodulation increases with CB1809 and NC92 compared to
local strains
0
10
20
30
40

50
60
70
80
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field sites
% increase
Local strain1
Local strain 2

Graph 5. Crop biomass increases with CB1809 and NC92 compared
to local strains
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field trials
% Increases
Local strain1
Local strain2


15

Graph 6. Yield increases with CB1809 and NC92 compared to

local strains
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field trials
% Increase
Local strain1
Local strain2


5.2. Qui trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần chất lượng cao, đóng gói,
bảo quản, phân phối và áp dụng trên đồng ruộng và quản lý chất lượng trong
quá trình sản xuất
Trong suốt 2 năm của dự án, công nghệ sản xuất chế phẩm nốt sần ở ba viện nghiên cứu, OPI
and IAS) đã được phát triển. Mục tiêu chính của sản xuất là chế phẩm vi khuẩn nốt sần chấ
t
lượng cao, >5 x 10
8
rhizobia/g và tạp nhiễm cao nhất là 1 x 10
8
vi khuẩn tạp nhiễm/g. Chúng
tôi trình bày sau đây công nghệ hiện tại cho sản xuất chế phẩm tại Việt nam. Một số chi tiết
của qui trình công nghệ khác nhau ở mỗi viện phụ thuộc vào cơ sở vật chất và kinh nghiệm.
Ở một mức độ nào đó thì công nghệ sản xuất chế phẩm được ứng dụng và có thay đổi cho
phù hợp từ các công nghệ của các nước mà công nghiệp sả

n xuất chế phẩm thành công, đó là
Mỹ và Úc.
Các chủng cho sản xuất
Dự án đã quyết định rằng CB1809 và NC92 sẽ được sử dụng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn
nốt sần cho cây đậu tương và lạc tại Việt nam bởi vì thí nghiệm thực hiện ở các vùng canh
tác các cây này trong nước cho thấy các chủng này là các chủng tốt nhất. Chúng làm tăng
trọng lượng nốt sần, tăng năng su
ất sinh khối và hạt so với các chủng bản địa Việt nam đã
thử nghiệm. Trong tương lai, sự đánh giá các chủng sẽ có thể cần thiết để cố gắng phát triển
các chủng tốt hơn nữa.

Duy trì hoạt tính các chủng và chuẩn bị giống mẹ

Để sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Việt nam đề nghị là giống mẹ sẽ
được cung cấp
hàng năm bởi phòng thí nghiệm quản lý chất lượng sản phẩm độc lập nơi này các chủng cho
sản xuất được duy trì theo nghĩa là thuần chủng, sống và có hiệu quả cố định đạm cao (nốt

16
sần và hoạt tính cố định đạm). Sau khi nhận được giống mẹ, các nhà sản xuất phải bảo quản
chúng trong năm sản xuất đó.

Bước đầu tiên sau khi nhận được giống me, các nhà sản xuất là cấy chuyền sang các ống
nghiệm có chứa môi trường YMA (yeast mannitol agar) (gọi là giống con), cùng một lúc thì
cấy ria trên các môi trường YMA và CRYMA (congo red yeast mannitol agar) để kiểm tra
tính thuần chủng. Nếu kiểm tra thấy giống mẹ bị nhi
ễm thì sẽ đề nghị phòng thí nghiệm quản
lý chất lượng cung cấp giống mẹ mới. Giống mẹ cần phải chắc chắn là thuần chủng trước khi
cung cấp cho nhà sản xuất. Tuy nhiên có thể có các rủi ro trong quá trình vận chuyển hoặc
trao tay. Các giống con sau đó được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ thấp (1–4

o
C) cho tới
khi sử dụng. Cần cấy chuyền các giống này sau mỗi 6 tháng. Số lượng các giống con này thì
phụ thuộc vào đòi hỏi của sản xuất. Nhiệt độ cho sinh trưởng của rhizobium là 30
o
C trong tủ
ấm. Phương pháp khác cũng có thể được áp dụng khi có đòi hỏi cao của sản xuất. Chuyển
sinh khối từ ống nghiệm giống mẹ vào erlen có môi trường YM lỏng, ủ ở 30
o
C trong vòng 5 -
7 ngày. Lấy 2ml của dịch sinh khối này cho vào 2 ml 50% glycerol, đã được khử trùng trước
trong lọ nhỏ. Các ống giống con này được bảo quản trong các tủ lạnh sâu cho sử dụng trước
khi kiểm tra nhiễm trên môi trường CRYMA và YMA.

Sự tăng trưởng của sinh khối

Giống khởi đầu: Cấy ria các chủng sử dụng trên CRYMA và YMA để kiểm tra nhiễm.
nuôi cấy ở 30°C trong 6–8 ngày. Nếu thấy không nhiễm thì cho vào ống nghiệm giống
đó 10
ml nước vô trùng. Đóng nắp lại và lắc nhẹ. Đổ dịch sinh khối này một cách vô trùng vào một
erlen có chứa môi trường nuôi cấy YM lỏng. Đóng erlen với nút bông và giấy. Nhẹ nhàng
trộn đều dung dịch và đặt vào trong máy lắc nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C cho tới khi xuất hiện
dịch có màu sữa (5-7 ngày), và quần thề rhizobium đạt được là 10
9
/ml trong dịch sinh khối.
Dịch sinh khối này sẵng sàng để cấy vào nồi lên men.

Môi trường nhân sinh khối:
Bảng 5. Số lượng tế bào/ml dịch sinh khối trong các môi trường cải tiến so sánh với
môi trường cơ bản YMB

Số lượng rhizobia/ml
Chủng
YMB SX1
SX2

CB1809 8,2 x 10
9
1,6 x 10
9
4,2 x 10
9

SL1 4,8 x 10
9
6,8 x 10
9
5,8 x 10
9

SL2 2,7 x 10
9
5,4 x 10
9
1,2 x 10
9

NC92 2,8 x 10
9
4,8 x 10

9
5,6 x 10
9

GL1 5,6 x 10
9
2,8 x 10
9
1,9 x 10
9

GL2 5,6 x 10
9
7,2 x 10
9
5,2 x 10
9


SX1(g/l): nước chiết đậu xanh 50 g; K
2
HPO
4
0.5 g; KH
2
PO
4
0.5 g; (NH
4
)2SO

4
1.0 g; MgSO
4
. 7H
2
O
0.5 g; CaCO
3
1,0g; Glucose 5,0g; Saccharose 5,0g; nước cất 1 litre.

SX2: Glucose 10g; KH
2
PO
4
0,5g; MgSO
4
.7H2O 0,25g; CaCO
3
0,5g; Yeast Extract 0,5g; nước cất 1
litre.

YMB: control – mannitol 10g; yeast extract 1g; 0,5g; KH
2
PO
4
0,5 g; MgSO4. 7H2O 0,5g; NaCl 0,1 g;
nước cất 1 litre
Source: SFI

17

Môi trường cho rhizobium sinh trưởng bao gồm nguồn C, nitơ và khoáng chất. Hầu hết
rhizobium sử dụng được pentoses, hexoses, disacharides, polysaccharides and sugar alcohols
mặc dù nguồn C thích hợp cho các chủng rhizobium thì thay đổi. Nói chung là cải tiến môi
trường nhân sinh khối cho rhizobium thì dựa trên căn bản môi trường YMB (yeast mannitol
broth).

Sản xuất lớn thì đòi hỏi môi trường rẻ tiền và sẵn có ví dụ như là dịch bắp và dịch thuỷ phân
vỏ đậu. Bảng 5 trình bày ảnh hưởng của môi trườ
ng nhân sinh khối đến sự tăng trưởng của 6
chủng rhizobia. Các thử nghiệm là nước chiết đậu xanh, saccharose và glucose thay vì yeast
extract và mannitol mắc tiền. Số lượng tế bào rhizobia của 6 chủng cao hơn 10
9
/ml trong 2
môi trường đề nghị là SX1 và SX2, tương tự như môi trường YMB. Môi trường SX1 là môi
trường tốt nhất theo nghĩa là hiệu quả và kinh tế.

Số liệu rất hứa hẹn nhưng cần lập lại. Nếu rhizobia tăng trưởng tốt trong môi trường SX1 và
SX2 vẫn tốt, thì chúng có thể xem xét như là môi trường sản xuất chế phẩm nốt sần tại Việt
nam.

Thời gian sinh trưởng : Kết qu
ả cho thấy số lượng của tế bào rhizobium tăng theo thời
gian và đạt cực đại ở ngày thứ 7 đối với tất cả cá chủng. (Bảng 6). Số lượng cao, 7 x 10
9
tế
bào/ml.

Bảng 6. Số lượng tế bào rhizobia trong dịch sinh khối ở các thời gian nuôi cấy khác nhau

Số tế bào/ml

Thời gian
(ngày)
CB1809 SL1 SL2 NC92 GL1 GL2
3 5,2 x 10
7
8,8 x 10
6
1,04 x 10
7
5,2 x 10
7
9,2 x 10
6
1,36 x 10
7

4 8,8 x 10
8
2,48 x 10
7
1,44 x 10
7
2,6 x 10
8
5,8 x 10
7
1,3 x 10
8

5 1,24 x 10

9
4,02 x 10
8
2,4 x 10
8
8,0 x 10
8
2,2 x 10
8
8,4 x 10
8

6 3,2 x 10
9
2,8 x 10
9
1,08 x 10
9
3,6 x 10
9
1,24 x 10
9
1,08 x 10
9

7 7,2 x 10
9
4,8 x 10
9
4,8 x 10

9
4,2 x 10
9
2,6 x 10
9
1,22 x 10
9

8 1,68 x 10
9
1,02 x 10
9
1,28 x 10
9
2,36 x 10
9
1,56 x 10
9
2,4 x 10
9

Nguồn: SFI
Ảnh hưởng của pH:
Bảng 7. Ảnh hưởng của pH đến tăng trưởng của rhizobia

Tăng trưởng của các chủng
pH
CB1809 SL1 SL2 NC92 GL1 GL2
4 - - - - - -
4.5

- - - - - -
5
- - - - - -
5.5
+ ++ ++ ++ ++ ++
6
++ ++ ++ ++ ++ ++
6.5
+++ +++ +++ +++ +++ +++
7
+++ +++ +++ +++ +++ +++
7.5
++ ++ ++ ++ ++ ++
8
- - - - - -
8.5 - - - - - -


18
-: không phát triển
+: phát triển yếu (10
4
–10
5
CFU/ml)
++: phát triển bình thường (10
6
–10
7
CFU/ml)

+++: phát triển tốt (10
8
–10
9
CFU/ml
Nguồn: SFI

Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Bảng 8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của rhizobia

Nhiệt độ (ºC) Sự tăng trưởng của các chủng
CB1809 SL1 SL2 NC92 GL1 GL2
25 ++ ++ ++ ++ ++ ++
30 +++ +++ +++ +++ +++ +++
37 + + + + + +
>45 - - - - - -
-: không tăng trưởng
+: Tăng trưởng yều (10
4
–10
5
CFU/ml)
++: Tăng trưởng bình thường (10
6
–10
7
CFU/ml)
+++: Tăng trưởng tốt (10
8

–10
9
CFU/ml
Nguồn: SFI

Kết quả từ bảng 7 và 8 cho thấy pH môi trường và nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng
của rhizobiuam. Tất cả 6 chủng thử nghiệm đều phát triển tốt ở pH 6.5–7 và 30
0
C.

Quá trình nhân sinh khối: Phụ thuộc vào đầu tư trang thiết bị, thiết bị sẵn có và kinh
nghiệm nhà sản xuất sẽ cần xem xét dung tích của nồi lên men. Các mẻ sản xuất lớn thì tiết
kiệm thời gian nhưng rất dễ bị tạp nhiễm. Nồi lên men có thể thay đổi kích thước từ 1–2 L
(bình thuỷ tinh trên các máy lắc hoặc là sục khí) tới >1600 L.

Sinh khối lỏng có thể được sản xuất m
ột cách đơn giản trong các bình thuỷ tinh, như là bộ
lên men bằng bình thuỷ tinh 4-L với đầu ra lấy mẫu gắn vào phần đáy bình. Hệ thống này
nuôi cấy tối đa 2–3 L môi trường. Để mà tránh tạp nhiễm thì không khí được lôc qua bộ phận
lọc nhồi với bông gòn cotton. Tất cả các dây cao su và đầu mối đều được khử trùng. Nút
bằng cao su giữ không khí vào và ra qua lọc được gắn chặt với cổ bình thuỷ tinh. Sử dụng
máy b
ơm nuôi cá nhỏ để cung cấp khí. Nó được gắn với ống không khí ra. Không khí sẽ di
chuyển tự do trong cả hai lọc khí và thổi vào bình lên men. Bông gòn trong bộ lọc khí cần
phải nén vừa phải. Nếu nén chắt quá sẽ hạn chế không khí đi vào.

Thiết bị bơm cần được tháo rời ra khỏi bộ lên men khi khử trùng. Khử trùng trong vòng 40
phút ở 1 atm nếu môi trường là 2 lít và tăng dần lên 10 phút cho mỗi lít môi trường thêm vào.
Sau khi môi trường lên men nguội thì bỏ kẹp ở
ống khí vào và nối nguồn cung cấp khí vào,

kiểm tra lượng khí cho phù hợp và kiểm tra xem hệ thống có bị rò rỉ hay không. Hệ thống lên
men như vậy đã sẵn sàng cho việc cấy giống mẹ vào môi trường lên men. Cấy giống vào qua
đường khí vào và dùng kim khử trùng gắn với xylanh. Khử trùng bề bặt ống dần khí vào với
cồn 70% hoặc là 3% hydrogen peroxide khoảng 2–3 cm phía trên đầu nối của nó với ống
thuỷ tinh. Kim được châm vào xuống phía dưới vào ống cao su và bắ
t đầu cấy dịch sinh khối
mẹ. Sau đó nuôi cấy ở 30
o
C. Sử dụng hệ thống lên men nhỏ sẽ phù hợp với điều kiện của
Việt nam, đặc biệt khi chúng được phối hợp cùng với kỹ thuật pha loãng dung dịch nuôi cấy
– lên men đặc. Với sự phối hợp này, dịch nuôi cấy có thể pha loãng đến 100 lần. Do đó 2 lít
dịch lên men sẽ cho ra 10.000 túi chế phẩm (20 mL/túi).

19

Các nồi lên men cỡ nhỏ dùng trong công nghiệp thông thường khử trùng trong autoclave.
Một hệ thống lên men cho rhizobia đã được thiết kế bởi NifTAL và sử dụng nhiệt trực tiếp
bởi gas và hệ thống ống làm lạnh để tiết kiệm thời gian sau khi khử trùng. Thùng lên men
này chịu áp lực và có dung tích là 141 L. Dung tích làm việc là 20–100 L. Chi tiết về hệ
thống này có thể liên lạc Prof. Nantakorn Boonkerd tại Đại học Công nghệ Suranaree
Thailand.

Lựa chọn chất mang

Chất mang đóng vai trò rất quan trọng trong sản xuất chế phẩm trên nền cứng. Hầu hết chế
phẩm vi khuẩn nốt sần được sản xuất trên nền chất mang than bùn sau khi đã được xay, trung
hoà. Các tính chất của một chất mang tốt là:

- Bảo đảm cho rhizobia sinh trưởng và tồn tại
- Khả năng hấp thu ẩm tốt

- Dễ dàng sản xuất
- D
ễ dàng khử trùng bởi autoclave hoặc là chiếu xạ gramma
- Sẵn có với số lượng đủ
- Không mắc tiền
- Bám dính tốt vào hạt
- Khả năng đệm pH tốt

Than bùn được nghiên cứu nhiều nhất và được sử dụng nhiều nhất như là chất mang cho sản
xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng rhizobia thì được b
ảo vệ và
tồn tại tốt trên than bùn. Bảng 9 và 10 chỉ ra các tính chất lý hoá học của các nguồn than bùn
đã được nghiên cứu kỹ. Đó là các than bùn được dùng cho sản xuất thương mại tại Mỹ và
Úc. Tuy nhiên, tính chất lý hoá học của than bùn không phải là chỉ tiêu duy nhất để xác định
chúng có phù hợp cho sản xuất hay không. Chỉ có thử nghiệm liên quan đến tăng trưởng của
rhizobia mới xác định được chúng có được chấp nhận hay không cho sản xuấ
t. Ngoài các
tính chất của than bùn như là độ măn, sét, lượng hữu cơ và sự tạp nhiễm bới các kim loại thì
còn có các yếu tố không xác định được ảnh hưởng đến sự phù hợp của than bùn như là một
chất mang. Than bùn từ các nguồn khác nhau cần thiết phải kiểm tra sau khi đưa về cùng
kích thước hạt và ẩm độ (nếu có thể). Không thể đánh giá than bùn thông qua màu sắc hay là
cấu trúc của nó.

Bảng 9. Đặc trưng của than bùn dùng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Mỹ

Loại Lượng Phân tích tro (%)
N tổng (%) 1.62 K 1.12
Chất hữu cơ (%) 86.80 P 0.33
Tro (%) 13.20 Ca 5.21
K trao đổi (ppm) 62.00 Mg 1.14

N - NH4 và NO3 (ppm) 94.00 Fe 2.10
P dễ tiêu (ppm) 12.00 Si 28.00
pH 4.5 -5.0 Al 6.32
Ẩm độ (%) 7 – 8 Na 0.52

Burton (1979)

20
Bảng 10. Đặc trưng than bùn Bendenoch dùng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm tại
Úc
Đặc trưng Khoảng cao thấp Trung bình
Chất hữu cơ (%) 28.8 – 75.4 64.3
Hữu cơ C (%) 16.4 – 42.1 36.1
Khoáng (%) 10.0 – 16.0 12.1
Muối hoà tan (%) 0.09 – 1.50 0.87
Cl (%) 0.01 – 0.31 0.11
N (%) 0.89 – 2.30 1.83
K
2
O (%) 0.12 – 0.17 -
P
2
O
5
(%) 0,09 – 0.22 -
Khả năng giữ nước (%) 216 – 522 320
C/N 15.0 – 17.5 16.7
pH 5.8 – 7.8 6.8
Roughley (1970)

Việt nam có rất nhiều mỏ than bùn, phân bố khắp nước nhưng chất lượng thì khác nhau rất
nhiều, từ nghèo (Cần Giờ) cho đến trung bình (Bình Phú) và tốt (U Minh) (Bảng 11).
Bảng 11. Đặc trưng của 3 nguồn than bùn Việt nam

Đặc trưng Cần Giờ Bình Phú U Minh
Tro (%) 50 - 70 40 - 60 7 – 9
OM (%) 14 - 21 25 - 40 46 – 51
Acid humic (%) 5 - 8 14 – 18 30
S (%) 1 - 8 0.3 – 1.5 0.25
Nguồn: Than bùn tại Việt nam và sử dụng trong nông ngjiệp (Nhà Xuất bản Nông nghiệp, 1997)

Bảng 12. Số lượng rhizobia trong các nguồn than bùn khác nhau ở Miền nam

Nghiệm thức Ban đầu 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần
1. Australia 59 x 10
7
30 x 10
8
16 x 10
8
20 x 10
8
17 x 10
8
2. Komix 1 40 x 10
7
22 x 10
8
29 x 10
8

32 x 10
8
25 x 10
8
3. Komix 2 18 x 10
7
63 x 10
7
33 x 10
7
42 x 10
7
34 x 10
7
4. DakNong 20 x 10
7
15 x 10
8
19 x 10
8
20 x 10
8
24 x 10
8
5. U Minh 46 x 10
7
25 x 10
8
24 x 10
8

18 x 10
8
22 x 10
8
Treament 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng
1. Australia 31 x 10
8
20 x 10
8
14 x 10
8
12 x 10
8
10 x 10
8
2. Komix 1 28 x 10
8
24 x 10
8
15 x 10
8
17 x 10
8
12 x 10
8
3. Komix 2 25 x 10
7
32 x 10
7
10 x 10

7
74 x 10
6
34 x 10
6
4. DakNong 20 x 10
8
15 x 10
8
11 x 10
8
12 x 10
8
78 x 10
7
5. U Minh 25 x 10
8
19 x 10
8
15 x 10
8
14 x 10
8
11 x 10
8
Nguồn: OPI
Chủng: CB1809

21
Kết quả trong bảng 12 cho thấy ảnh hưởng của nguồn than bùn đến chất lượng chế phẩm.

Ngoại trừ Komix 2, 3 nguồn than bùn của Việt nam trong thí nghiệm này tốt cho tăng trưởng
của rhizobia. Số lượng của rhizobia trong các than bùn này đạt ≥ 10
9
cfu/g than bùn ấm,
tương đương với than bùn Úc dùng cho sản xuất thương mại. Số lượng rhizobia trong komix
2 chỉ đạt 3.4 x 10
7
cfu/g than bùn ẩm sau 6 tháng.

Tương tự, nguồn than bùn ở Sơn La và Thái nguyên cũng giúp rhizobia tăng trưởng và tồn tại
tốt, đó là các chủng CB1809, NC92, GL2, SL2. Số lượng rhizobia đạt ≥ 10
9
cfu/g than ùn
ẩm
Bảng 13. Số lượng rhizobia trong hai nguồn than bùn ở Miền Bắc

Number of rhizobia/g moist peat inocualnts
Rhizobium
strain
Nguồn than
bùn
Ban đầu 1 tuần 2 tuần 1 tháng 2 tháng 3 tháng
Sơn La 3,2 x 10
9
1,8 x 10
9
4,2 x 10
9
7,2 x 10
9

8,0 x 10
9
4,0 x 10
9
NC92
Thái Nguyên 2,4 x 10
9
1,3 x 10
9
3,6 x 10
9
7,6 x 10
9
4,0 x 10
9
6,8 x 10
9
Sơn La 1,6 x 10
9
1,2 x 10
9
1,8 x 10
9
2,1 x 10
9
1,4 x 10
9
1,3 x 10
9
GL2

Thái Nguyên 1,2 x 10
9
2,4 x 10
9
1,2 x 10
9
1,1x 10
9
3,6 x 10
9
1,2 x 10
9
Sơn La 6,5 x 10
9
1,8 x 10
9
7,5 x 10
9
3,4x 10
9
3,2 x 10
9
3,6 x 10
9
CB1809
Thái Nguyên 5,3 x 10
9
2,8 x 10
9
5,3 x 10

9
2,2 x 10
9
2,4 x 10
9
1,4 x 10
9
Sơn La 6,6 x 10
9
1,4 x 10
9
1,6 x 10
9
1,5 x 10
9
5,2 x 10
9
1,1 x 10
9
SL2
Thái Nguyên 4,0 x 10
9
1,2 x 10
9
4,8 x 10
9
1,0 x 10
9
1,0 x 10
9

1,2 x 10
9

Nguồn: ISF

Bảng 14. Số lượng của tế bào rhizobia trong các chất mang khác nhau sau 1 tháng

STT Chủng rhizobium Chất mang
Số lượng tế bào
rhizobium (CFU/g)
1 NC 92 Peat 2.7 x 10
7

2 CB 1809 Peat 5.4 x 10
6

3 NC 92 Peat + worm casts 8.3 x 10
8

4 CB 1809 Peat + worm casts 5.4 x 10
8

5 NC 92 Peat + worm casts + coconut coir dust 2.5 x 10
9

6 CB 1809 Peat + worm casts + coconut coir dust 6.8 x 10
8

Nguồn : IAS
1 NC92 Peat

1,2 x 10
8
2 NC92 Peat + molasses + “rare soil”
1,5 x 10
9

3 NC92 Peat + worm casts + coconut coir dust
3,8 x 10
9

Nguồn : ISF


22
Có nhiều nguồn thay thế cho than bùn, ví dụ bã mía, bột giấy, vermiculite, polyacrylamide,
đất khoáng, than, tàn dư cây. Các vật liệu này cũng có thể trộn với than bùn để cải thiện chất
lượng. Bã mía, bụi xơ dừa và phân trùn cải thiện chất lượng than bùn thông qua tăng khả
năng giữ nước (Bảng 14). Số lượng rhizobia tăng lên khi than bùn được trôn với phân trùn

Sản xuất chất mang

Kích thước hạt của chất mang: Than bùn hiện tạ
i là chất mang được xem xét nhiều
hơn trong sản xuất chế phẩm tại Việt nam. Nghiên cứu của dự án đã chỉ ra một số cơ chất
trộn với than bùn. Chúng là phân trùn và bụi xơ dừa. Mật rỉ và “đất hiếm” có thể thêm vào
như là nguồn dinh dưỡng thêm vào. Than bùn được khai thác, làm khô nếu ướt, rây để loại
bỏ đất đá, rễ cây sau đó thì làm khô. Than bùn sau đó được xay bằng kỹ thuật nghiền búa. Và
được qua rây: 1mm, 355µm, 150 µm và 75 µm. hạt 75 µm hoặc là nhỏ hơn sẽ tốt hơn cho
bao hạt.

pH chất mang: pH chất mang quan trọng và tính acid của than bùn cần được trung hoà với
calcium hay là magnesium carbonate. pH thích hợp là 6.5–7.0. Vôi mịn dùng trong nông
nghiệp thì thích hợp cho việc trung hoà than bùn.

Chỉnh pH của than bùn cần phải thực hiện tật cẩn thận, chờ thời gian cân bằng. Phả ứng giữa
vôi và H
+
trong than bùn phụ thuộc kích thước của cả vôi và than bùn. Hạt càng nhỏ thì phản
ứng càng nhanh. Ẩm độ của than bùn cũng quan trọng. Số lượng vôi để trung hoà cũng phụ
thuộc vào lượng chất hữu cơ, sét và khả năng đệm của than bùn. Sau khi trộn lẫn than bùn và
vôi thì cần thiết cho phép phản ứng xảy ra trong vài tuần trước khi đo pH. Cũng cần thiết đo
pH theo thời gian. Vôi mịn dùng trong nông nghiệp (Aglime, calcium carbonate qua rây 150
µm mesh) là vôi tốt nhất sử
dụng để trung hoà than bùn. Vôi xây dựng thì quá mạnh còn các
vôi khác thì lại nhẹ.

Tính toán lượng vôi như sau:
- Cho 10 g chất mang vào trong 90 ml nước chứa trong erlen 400 ml
- Quậy đều bằng khuấy từ trong khi đo pH bằng pH meter và cho thêm từ từ vôi vào
cho đến khi đạt pH of 6.5
- Ghi nhận số lượng vôi trung hoà với 10 g cơ chất
- Cho lượng vôi đã xác định vào trong lượng xác định của cơ chất. Trộn kỹ.

Khả năng giữ n
ước: Khả năng giữ nước của chất mang xác định số lượng dịch sinh khối
cần cho vào cơ chất. Cơ chất thì rất thay đổi trong khả năng giữ nước của nó. Kích thước hạt,
lượng hữu cơ, sét của than bùn ảnh hưởng đến khả năng giữ nước. Tăng khả năng giữ nước
là điều mng muốn để có số lượng lớ
n hơn dịch sinh khối đưa vào than bùn trước khi ủ.

Ẩm độ ban đầu của than bùn cần được xác định. Điều này được thực hiện thuận lợi trên cân
ẩm độ nhưng cũng có thể sử dụng tủ sấy. Cân chính xác lượng 10 g than bùn trong giấy bạc
hoặc là cân trong đĩa thuỷ tinh và đặt nó vào trong tủ sấy 70
0
C trong 48 hrs. Kiểm tra ẩm độ
cuối cùng (không đổi).

Ẩm độ = [(W1 – W2) x 100%]/W2
W1: trọng lượng chất mang trước khi sấy khô
W2: Trọng lượng chất mang sau khi sấy khô


23
Xác định khả năng giữ nước của chất mang. Cân 100 g chất mang đã được làm khô vào erlen
500 ml. Thêm nước vào từ từ cho đến khi nó bão hoà. Thêm nước vào để có dịch sệt đều.
Chuyển lượng này vào phễu thuỷ tinh đã được cân trước. Cho phép nước thoát ra qua đêm,
sau đó cân phễu cộng với than bùn trong đó. Chỉ ra khả năng giữ nước trên trọng lượng khô
của chất mang. Nếu 100 g than bùn khô có khả năng giữ 120 ml nước, thì kh
ả năng giữ nước
của nó là 120%.

Xác định dịch sinh khối cho vào chất mang. Chuẩn bị 6 túi PE trong đó có chứa 50 g chất
mang. Đối với túi đầu ti6n cho vào đó lượng nước ít hơn khả năng giữ nước của chất mang 5
ml. Nếu khả năng giữ nước là 60 ml (hay là 120%) thêm vào 55 ml. Túi thứ hai, ít hơn 5 ml
(50 ml). Cứ như thế cho đến hết. Túi thứ 6 sẽ nhân được 30 ml. án các túi này vào và
massage cho đến khi tất cả ẩm được h
ấp thu và hỗn hợp chất mang/nước trở nân đồng đều.
Để các túi này trong 2 giờ sau đó mở túi ra và lấy ở mỗi túi vài gam và đặt lên tay. Hỗn hợp
này cần ẩm nưng không được ướt. Nó cần rời ra trong tay và không được dính. Ghi số liệu tỷ
lệ chất mang/nước đã sử dụng và sử dụng tỷ lệ này để tính toán mức ẩm độ cho mỗi chất

mang. Mức ẩm độ này thường
được chỉ trong % dựa trên trọng lượng ẩm.

Bảng 15. pH và số lượng dịch sinh khối thêm vào trong than bùn ẩm
*


Than bùn pH Lượngdịch sinh khối
Australia 7 65
IAS 6.5 24
Nghe An 5 50
U Minh 6 60
DakNong 6 38
Komix 1 5 35
Komix 2 5 25

Nguồn: OPI
Than bùn Úc và IAS đã được chỉnh pH với vôi
Than bùn ẩm
*
: 20% ẩm độ

Lượng dịch sinh khối thêm vào than bùn thay đổi phụ thuộc vào nguồn than bùn (Bảng 15).
Than bùn U Minh rất giống với than bùn thương mại của Úc với chất lượng chế phẩm cao.

Ẩm độ 40 đến 50% thì thuận lợi nhất cho sự tăng trưởng và tồn tại của nhiều chủng rhizobia.
Cải thiện ẩm độ than bùn hoặc là hỗn hợp của than bùn và các chất mang khác thì cần chú ý
(Bảng 16). Trước khi trộn than bùn với dị
ch sinh khối, than bùn cần được khử trùng ở ẩm độ
20%. Hiệu quả khử trùng cần được xác định bằng cách tiêm dịch môi trường vào than bùn và

xác định nhiễm trong 1 tháng. Hoà tan than bùn và pha loãng khi đếm rhizobia và trải lên
trên môi trường glucose peptone.mà ở đó cơ chất bị nhiễm.

Bảng 16. Nghiệm thức xác định ẩm độ tối ưu cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần

Ẩm độ (%) Nước thêm vào (mL) Thể tích dịch (mL)
Thể tích nước khử
trùng (mL)
40 29.5 29.5 0
50 52.5 29.5 23
60 87.5 29.5 58

24

Tính toán dựa trên 70 g than bùn khô sau khi đã chỉnh về ẩm độ 20%.

Cân bằng [1] được dùng cho tính toán ẩm độ của 70 g than bùn khô. Cân bằng giống như
vậy cũng sẽ được sử dụng cho bất cứ số lượng than bùn nào nhưng nếu than bùn ẩm thì khối
lượng than bùn khô cần được tính toán trước
70 100
x
y
x
=
+
[1]

Trong đó x là lượng dịch thêm vào và y là ẩm độ cuối cùng (ví dụ là 50).

Để điều chỉnh 70 g than bùn khô đến 20% cho sự khử trùng thì 17.5 ml nước cần thêm vào

Ví dụ: Bao nhiêu dịch nghĩa là sinh khối lỏng được thêm vào 150g than bùn với 20% ẩm độ
để có được ẩm độ là 35%?
a)
Khối lượng của than bùn khô

20
100
x 150 g = 30 g

150 g – 30 g = 120 g

b)
Ẩm độ thêm vào cho than bùn khô

35
120 100
x
x
=
+


0.35(120 )
x
x
=
+

42 0.35
x

x
=
+

0.35 42xx
−
=

0.65 42x
=


64.6x
=


64.6 g ẩm cần thêm vào 120 g than bùn khô để thu được 35%. Nếu than bùn đã có ẩm độ là
30 g thì 64.6 g – 30 g = 34.6 g cần thêm vào cho 150 g than bùn.

Thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả của hỗn hợp than bùn, phân trùn và bụi xơ dừa cần có thiết
kế như trình bày trong Bảng 10. Tất cả các chất mang cần phải được mang về ẩm độ 20%
trước khi khử trùng và hiệu quả của khử trùng cũng phải được xác định như trong mô tả phầ
n
2.1. Số lượng tế bào sống/g trong chất mang cần được xác định ở 1 tuần và 1 tháng. Phương
pháp cần được xác định bởi đếm khuẩn lạc và MPN bằng cách nhiễm 2 cây cho pha mỗi
nồng độ loãng 10
-5
và 10
-6
(nghĩa là 4 chất mang x 3 ẩm độ x 3 lập lại).

Đếm số lượng rhizobium và xác định rhizobium trong các chế phẩm than bùn như sau: pha
loãng chế phẩm trong nước vô trùng (10g chế phẩm trong 90 ml nước), sau đó chuẩn bị các
dịch pha loãng cho đến 10
-6
. Cấy trải trên đĩa petri có môi trường CRYMA và đếm số khuẩn