Nghiên cứu ứng dụng polymer để sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc

1

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN NGHIÊN CỨU DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU











BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG POLYMER ĐỂ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHO
CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ CÂY LẠC


MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 227.10. RD/ HĐ-KHCN

CHỦ TRÌ THỰC HIỆN: Ths. TRẦN YÊN THẢO

9162



TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12/ 2011





i
BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN NGHIÊN CỨU DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG POLYMER ĐỂ SẢN XUẤT
CHẾ PHẨM VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHO
CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ CÂY LẠC


Thực hiện theo Hợp đồng đặt hàng sản xuất và cung cấp dịch vụ
sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ
Số 227.10.RD/HĐ-KHCN ngày 16/03/2009 giữa
Bộ Công Thương và Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu


Chủ trì thực hiện: ThS. Trần Yên Thảo

Tham gia thực hiện: Lê Thị Xuân Mai
Tô Thị Bích Loan
Nguyễn Văn Việt
Phạm Thị Sim
Phan Phạm Như Liên
Huỳnh Thị Trang Thuỳ

TP. Hồ Chí Minh, tháng 12/ 2011

i
LỜI NÓI ĐẦU

Canh tác cây đậu tương và lạc hiện nay ở nước ta vẫn phụ thuộc vào phân
bón hoá học N đắt tiền và có tiềm ẩn gây ô nhiễm môi trường. Các chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm có thể thay thế phân bón hoá học N cho cây, nhưng vẫn duy
trì hoặc trong nhiều trường hợp tăng năng suất của cây. Do đó, phát triển sản
xuất các chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây là đòi hỏi cấp bách c
ủa sản
xuất nông nghiệp. Sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đến nay sử
dụng than bùn là chủ yếu do than bùn có khả năng bảo vệ tế bào Rhizobium tốt
và chế phẩm có thời gian bảo quản lâu hơn các dạng chế phẩm khác. Tuy nhiên,
đầu tư cho sản xuất cao hơn, qui trình sản xuất phức tạp hơn. Hướng nghiên cứu
này nhằm phát triển chế phẩ
m dạng dịch thể và bổ sung polymer như là chất
bảo vệ tế bào để giúp tế bào vượt qua được các điều kiện môi trường không
thuận lợi, và do đó tăng cường hiệu quả cố định N khi trời cung cấp cho cây. Về
mặt ứng dụng, mục tiêu của nghiên cứu nhằm thúc đẩy sản xuất chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc theo h
ướng giảm đầu tư trang
thiết bị cho sản xuất, giảm giá thành sản phẩm.
Trong khuôn khổ đề tài này, mục tiêu nghiên cứu là xây dựng qui trình
sản xuất, xác định chất lượng và xác định hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn cố
định đạm có sử dụng polymer.


ii
MỤC LỤC

Lời nói đầu i
Mục lục ii
Danh mục các bảng iv
Danh mục các biểu đồ và đồ thị vi
Danh mục các hình vii
Tóm tắt đề tài viii
Mở đầu 1

Chương 1. Tổng quan tài liệu 3
1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 3
1.1.1. Các phương pháp bảo vệ vi khuẩn để sản xuất các dạng chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm phổ biến 3
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt
giống 5
1.1.3. Các đáp ứng sinh lý của tế bào đối với sự làm khô 7
1.1.4. Các phươ
ng pháp cải thiện sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt
giống 8
1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 10
Chương 2. Phương pháp nghiên cứu 12
2.1. Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm vi khuẩn
cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc 12
2.1.1. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn c
ố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 12
2.1.2. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến tồn tại của các chủng
vi khuẩn cố định đạm trên hạt đậu tương và hạt lạc 12
2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tồn tại của các chủng vi
khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc 13
2.3. Nghiên cứu xây dựng qui trình công ngh

ệ, sản xuất và đánh giá chất lượng
chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương và lạc 13
2.3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm của môi trường
nhân sinh khối 13
2.3.2. Xác định đường cong sinh trưởng của chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 14

iii
2.3.3. Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung polymer
cho cây đậu tương và cây lạc 14
2.4. Xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm vi khuẩn có sử dụng polymer
ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 14
2.5. Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 18
Chương 3. Kết quả và bình luận 18
3.1. Kết quả nghiên cứu năm 2011 18
3.1.1. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer18
3.1.2. Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở điều
kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 18
3.1.3 Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 18
3.2. Kết quả nghiên cứu n
ăm 2010 và 2011 20
3.2.1. Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc 20
a. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 20
b. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng các polymer đến tồn tại của các chủng vi
khuẩn c
ố định đạm trên hạt đậu tương và hạt lạc 22
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tồn tại của các chủng vi
khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc 23
3.2.3. Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất

lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu tương
và lạc 24
a. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm của môi trường nhân
sinh khối 25
b. Thời gian nhân sinh khối sản xuất chế phẩm 25
c. Qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm 26
d. Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung polymer cho
cây đậu tương và cây lạc 28
e. Chi phí sản xuất 29
3.3. Thử nghiệm ch
ế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở điều
kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc 30
3.4. Đánh giá hiệu quả kinh tế của sản phẩm 33
Kết luận và kiến nghị 36

iv
Tài liệu tham khảo 37
Phụ lục 44

v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ tạp nhiễm vi sinh vật
trong môi trường nhân sinh khối 26
Bảng 3.2. Số lượng và chất lượng của các mẻ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố
định đạm cho cây đậu tương và cây lạc- năm 2010 29
Bảng 3.3. Số lượng và chất lượng của các mẻ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố
định đạ
m cho cây đậu tương và cây lạc- năm 2011 29
Bảng 3.4. Chi phí sản xuất 30

Bảng 3.5. Hiệu quả cố định đạm đối với cây đậu tương khi áp dụng chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer - Vụ Xuân Hè 2011 - Đồng Tháp 31
Bảng 3.6. Hiệu quả cố định đạm đối với cây lạc khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn
cố định đạm có sử dụng polymer – Vụ Hè Thu 2011 – Trà Vinh 31
Bảng 3.7. Hiệu quả cố định đạm đối với đậu tương khi áp dụng chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer – Vụ Hè Thu 2011 – Đắc Nông 32
Bảng 3.8. Hiệu quả cố định đạm đối với cây lạc khi áp dụng chế phẩm vi khuẩn
cố định đạm có sử dụng polymer – Vụ Hè Thu 2011 – Đắc Nông 32
Bảng 3.9. Năng suất và phân tích hiệu quả kinh tế khi áp dụng ch
ế phẩm vi
khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer đối với cây đậu tương và cây lạc 34
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của PVP đến sự tăng trưởng của chủng VD-RS 1 theo
thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của PVA đến sự tăng trưởng của chủng VD-RS 1 theo
thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của Gum Arabic đế
n sự tăng trưởng của chủng VD-RS 1
theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tăng trưởng của chủng VD-
RS1
theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của PVP đến sự tăng trưởng của chủng VD-RG 1 theo
thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của PVA đến sự tăng trưởng của chủng VD-RG 1 theo thời
gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 42
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tăng trưởng của chủng VD-RG
1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 45
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tăng trưởng của chủng VD-
RG 1 theo thời gian nuôi cấy (số lượng tế bào/ml) 44

vi
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của PVP đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi
khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của PVA đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của chủng vi
khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của
chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 44
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tồn tại trên hạt đậu tương của
chủng vi khuẩn VD-RS 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của PVP đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn
VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của PVA đến sự tồ
n tại trên hạt lạc của chủng vi khuẩn
VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của Gum Arabic đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng vi
khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 45
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của Xanthan Gum đến sự tồn tại trên hạt lạc của chủng
vi khuẩn VD-RG 1 (số lượng tế bào/hạt) 46
Bảng 3.26. Ảnh hưởng c
ủa loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố
định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (số lượng tế
bào/ml) 46
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố
định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 5
o
C (số lượng tế bào/ml).46
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố
định đạm VD-RS 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng (số lượng tế
bào/ml) 47
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của loại polymer đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố

định đạm VD-RG 1 theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 5
o
C (số lượng tế bào/ml) 47
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định
đạm VD-RS 1 trong môi trường có polymer sau thời gian bảo quản 3 tháng 47
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tồn tại của tế bào vi khuẩn cố định
đạm VD-RG 1 trong môi trường có polymer sau thời gian bảo quản 3 tháng 48
Bảng 3.32. Sinh trưởng của chủng VD-RS 1 trong các môi trường nhân sinh
kh
ối có sử dụng polymer, bình lên men 5 lít (số tế bào/ml) 48
Bảng 3.33. Sinh trưởng của chủng VD-RG 1 trong các môi trường nhân sinh
khối có sử dụng polymer, bình lên men 5 lít (số tế bào/ml) 48

vii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Biểu đồ 1. Số lượng tế bào của chủng VD-RS 1 trong các môi trường có
polymer ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm sau 5 ngày nuôi cấy 21
Biểu đồ 2. Số lượng tế bào của chủng VD-RG 1 trong các môi trường có
polymer ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm sau 7 ngày nuôi cấy 21
Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của polymer và nồng độ đến tồn tại của VD-RS 1 trên
hạt đậu tương 23
Biểu
đồ 4. Ảnh hưởng của polymer và nồng độ đến tồn tại của VD-RG 1 trên
hạt lạc 23
Biểu đồ 5. Ảnh hưởng của loại polymer và nhiệt độ đến tồn tại của VD-RS 1 và
VD-RG 1 sau thời gian bảo quản 3 tháng 24
Đồ thị 1. Sinh trưởng của VD-RS 1 khi nhân sinh khối sản xuất chế phẩm cho
cây đậu tương 26
Đồ thị 2. Sinh trưởng của VD-RG 1 khi nhân sinh khối sản xuất chế phẩm cho

cây lạ
c 25

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Làm đất chuẩn bị thí nghiệm tại Đồng Tháp 49
Hình 2. Lấy mẫu nốt sần 49
Hình 3. Rễ đậu tương khi áp dụng phân bón N và khi sử dụng chế phẩm 49
Hình 4. Điểm thí nghiệm đậu tương tại Đồng Tháp 49
Hình 5. Năng suất quả đậu tương khi nhiễm chế phẩm và bón phân N 50
Hình 6. Cây lạc có nhiễm chế phẩm 50
Hình 7. Cây lạc không nhiễm chế phẩm 50
Hình 8. Chế phẩm vi khuẩn cố định
đạm có polymer 50
Hình 9. Bao bì hướng dẫn sử dụng sản phẩm 50
Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm 27

ix
TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng polymer thay thế than bùn để
sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và cây lạc. Các loại
polymer và liều lượng khác nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng vả sự tồn tại
của tế bào Rhizobium trong môi trường nhân sinh khối và trên hạt. Các polymer
và liều lượng được chọn lọc cho mục đích sản xuất chế phẩm vi khuẩ
n cố định
đạm sử dụng hai chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 là PVP (2%), Gum Arabic (1%)
và Xanthan Gum (0,5%). Hai qui trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm
có sử dụng polymer cho cây đậu tương và cây lạc đã được đề xuất. Sản phẩm
sản xuất từ các qui trình này có số lượng tế bào Rhizobium cao, đạt 5x10
8
–
2x10
9
tế bào/ml. Vi sinh vật tạp nhiễm xuất hiện trong vài mẻ sản xuất nhưng
có số lượng thấp (<10
3
tế bào/ml), thời gian bảo quản đạt 3 tháng. Kết quả tại 4
điểm thí nghiệm đồng ruộng ở Đồng Tháp (vụ Xuân Hè 2011), Trà Vinh (vụ Hè
Thu 2011), Đắc Nông (vụ Hè Thu 2011) cho thấy chế phẩm có chất bảo vệ là
các polymer làm tăng năng suất ở cây đậu tương và cây lạc. Thí nghiệm đồng
ruộng diện rộng phân tích hiệu quả kinh tế của chế phẩm đã thực hiện tại tỉ
nh
Đồng Tháp trên diện tích 70.8 ha cây đậu tương với 118 hộ nông dân tham gia,

10 ha lạc với 15 hộ nông dân và một số điểm trình diễn tại tỉnh Đắc Nông. Kết
quả cho thấy lợi ích mang lại từ chế phẩm cao. Đối với cây đậu tương, năng
suất tăng từ 150 kg/ha đến 400 kg/ha, giảm sử dụng phân bón N 20-50 kg/ha,
thu nhập tăng thêm từ sử dụng chế phẩm trung bình là 4.320.000đ/ha; đối với
cây lạ
c, năng suất tăng 200-500 kg/ha, phân bón N tiết kiệm là 27-50 kgN/ha,
thu nhập tăng thêm trung bình là 9.100.000đ/ha.

1
MỞ ĐẦU
1. Cở sở pháp lý/xuất xứ của đề tài
- Cơ sở pháp lý: Hợp đồng số 227.10.RD/HĐ-KHCN “Đặt hàng sản xuất và
cung cấp dịch vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ”
giữa Bộ Công thương và Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu.
2. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
N là một trong các yếu tố cần thiết nhất cho tăng trưởng và phát triển củ
a
cây trồng. Trong không khí có tới 80% N nhưng ở dạng N
2
nên cây trồng không
thể sử dụng được. Cây trồng chủ yếu sử dụng N ở dạng ion amonium (NH
4
)
hoặc dạng ion nitrat (N0
3
). Trong khi công nghiệp sản xuất phân bón bằng con
đường hoá học đòi hỏi nhiệt độ và áp suất rất cao thì trong tự nhiên một số vi
khuẩn có khả năng cố định N
2
trong không khí, cung cấp N trực tiếp cho cây.

Đó là vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ đậu được gọi là các vi khuẩn nốt sần
hay là Rhizobium. N từ cố định đạm cộng sinh thay đổi từ 2-284 kg N/ha/năm
đối với cây cỏ họ đậu (People and Baldock, 2001) và 0-271 kgN/ha/năm đối với
cây họ đậu cho hạt (Unkovich et al., 1994; Evans et al., 2001). Các chế phẩm vi
sinh vật do đó được nghiên cứu và áp dụng để giảm thiểu sự phụ thuộc vào các
ch
ất hoá học sử dụng trong nông nghiệp. Áp dụng này có lợi ích rất lớn bởi vì
giảm đầu tư và đất đai không bị ô nhiễm do sử dụng quá nhiều sản phẩm có
nguồn gốc hoá học.
Sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đến nay sử dụng than bùn
là chủ yếu do than bùn có khả năng bảo vệ tế bào Rhizobium tốt và chế phẩm có
thời gian b
ảo quản lâu hơn các dạng chế phẩm khác. Tuy nhiên, đầu tư cho sản
xuất cao hơn, qui trình sản xuất phức tạp hơn.
Đề tài nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình sản xuất, xác định chất
lượng chế phẩm và xác định hiệu quả cố định đạm ở điều kiện đồng ruộng của
chế phẩm vi khuẩn cố định đạm dạng dịch thể có s
ử dụng polymer phục vụ sản
xuất cây có dầu đậu tương và lạc.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu chọn lựa các polymer thích hợp để sản xuất chế phẩm
vi khuẩn cố định đạm phục vụ canh tác cây đậu tương và cây lạc.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (loại polymer sử dụng,
nhiệt độ) đến sự tồ
n tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương
và cây lạc.
Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá
chất lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu
tương và cây lạc.

2
Nội dung 4: Thử nghiệm chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer ở
điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
1.1.1 Các phương pháp bảo vệ vi khuẩn để sản xuất các dạng chế phẩm vi
khuẩn cố định đạm phổ biến
Bảo vệ bằng agar: đây là dạng chế phẩm thương mại đầu tiên, sản xuất bởi
công ty Nitragin Co., Milwaukee, USA, dựa vào phát minh về cố định đạm sinh
học của Hellriegel và Wilfarth vào năm 1886. Loại chế phẩm này đầu tiên
được sản xuất trên gelatin, sau
đó trên agar hoặc trên môi trường dinh dưỡng.
Sản phẩm là sinh khối trên bề mặt agar, dịch sinh khối sau đó được nhiễm trực
tiếp vào hạt và đem gieo. Phương pháp này rất thuận lợi. Tuy nhiên một trở
ngại quan trọng nhất của phương pháp này là tốc độ chết rất cao khi hạt bị khô
ngay lập tức sau khi vi khuẩn nhiễm lên hạt (Brockwell, 1982).
Bảo vệ bằng đông khô: Đông khô là phương pháp dùng phổ biế
n để bảo quản
giống vi sinh vật nhưng lần đầu tiên nó được ứng dụng thương mại sản xuất
chế phẩm đông khô bởi một công ty của Úc trong một thời gian ngắn trong năm
1958. (Brockwell, 1982). McLeod và Roughley (1961) nhận thấy chế phẩm này
tạo nốt sần tốt trong điều kiện đồng ruộng nhưng dường như chỉ giới hạn trong
các điều kiện thu
ận lợi mà thôi, bởi vì sự tồn tại trên hạt của dạng chế phẩm này
kém (Vincent, 1965). Kremer và Peterson (1982) báo cáo rằng khi sử dụng dầu
lạc và đậu tương thì sẽ cải thiện được sự tồn tại trên hạt của tế bào. Công bố
của nghiên cứu này là các tế bào rhizobium sẽ được bảo vệ, đặc biệt trong điều
kiện nhiệt độ cao, khi pha chế phẩm đông khô với dầu.

Bảo vệ bằng bao polymer: bảo vệ vi khuẩn bằng bao polymer là công nghệ tiên
tiến nhất sản xuất chế phẩm thời gian gần đây, đó là các vi khuẩn được bao
trong viên hình nhộng nhỏ, hạt tròn hay là viên. Hai loại polymer được thử
nghiệm nhiều nhất là polyacrylamide và alginate. Chế phẩm hình thành bằng
cách trộn lẫn dịch vi khuẩn với hợp chất dạng gel trong một dung dịch polymer.
Các chất như cám hay là sét được trộn lẫn và sau
đó tạo thành dạng viên. Các
viên sau đó làm khô và đóng gói (Bashan, 1986; Walter và Paau, 1993). Hạt
chứa tế bào rhizobium trong polyacrylamide (PER) (Dommergues et al., 1979)
có chất lượng tương đương với chế phẩm trên nền chất mang than bùn khi
chúng được giữ trong điều kiện có ẩm độ phù hợp. Các dạng chế phẩm tương tự
làm với alginate (AER) hay là hỗn hợp xanthan và carob gum (XER) là các chế
phẩm có chất lượng tương tự với PER trong dạng ướt sau 50 ngày bảo quản ở
nhiệ
t độ 28°C. Dạng chế phẩm khô PER, AER và XER thì có chất lượng kém
hơn và không ổn định so với chế phẩm có chất mang than bùn ngay cả khi áp
dụng trong đất hay là nhiễm lên hạt (Jung et al., 1982). Mặc dù dạng chế phẩm
này có thể thay thế dạng chế phẩm than bùn nhưng chúng chỉ có kết quả tốt
nhất trong điều kiện chúng được duy trì trong tình trạng “ướt”. Sự làm khô gây

4
ra mất nước đáng kể tương tự trong trường hợp chế phẩm than bùn bị làm khô
nhưng số lượng tế bào trong sản phẩm giảm đi nhiều hơn (Date, 2001).
Bảo vệ bằng chất mang rắn: Chế phẩm trên nền chất mang rắn là dạng chế
phẩm chính trên thị trường các chế phẩm vi sinh. Chế phẩm dạng này được tạo
ra trên nền chất mang rắn chủ yế
u là than bùn mặc dù các chất mang khác cũng
được nghiên cứu là đất, sét, than đá, than, perlit, đá phosphate, bã mía, bùn bã
mía, vermiculite và các cây cối mục. (Brockwell, 1982; Stephens và Rask,
2000, Albareda et al., 2008). Tuy nhiên than bùn được nghiên cứu nhiều nhất và

cũng được sử dụng thường xuyên hơn cả trong sản xuất chế phẩm. Nhiều
nghiên cứu cho thấy than bùn giúp bảo vệ tế bào tốt hơn trong sản phẩm và trên
hạt so với các chất mang rắn khác bởi vì chúng giàu chất hữu cơ và khoáng chất
(Somasegaran và Hoben, 1994). Chất mang than bùn cũng phù hợ
p cho sản
xuất bởi vì chế phẩm đạt thời gian bảo quản 6 tháng (Roughley và Vincent,
1967). Thành phần lý hoá học của than bùn chất lượng tốt dùng cho sản xuất
thương mại được trình bày trong bảng 1 và 2.
Bảng 1.1 Đặc trưng của than bùn dùng trong sản xuất thương mại tại Mỹ
Loại Lượng Phân tích tro (%)
N tổng (%) 1,62 K 1,12
Chất hữu cơ (%) 86,80 P 0,33
Tro (%) 13,20 Ca 5,21
K trao đổi K (ppm) 62,00 Mg 1,14
N dạng NH4 và NO3 (ppm) 94,00 Fe 2,10
P dễ tiêu (ppm) 12,00 Si 28,00
pH 4,5 -5,0 Al 6,32
Ẩm độ (%) 7 – 8 Na 0,52
Burton (1979)
Bảng 1.2 Đặc trưng than bùn dùng cho sản xuất thương mại tại Úc
Đặc trưng Khoảng Giá trị trung bình
Chất hữu cơ (%) 28,8 – 75,4 64,3
Chất hữu cơ C (%) 16,4 – 42,1 36,1
Khoáng chất (%) 10,0 – 16,0 12,1
Muối hoà tan (%) 0,09 – 1,50 0,87
Cl (%) 0,01 – 0,31 0,11
N (%) 0,89 – 2,30 1,83
K
2
O (%) 0,12 – 0,17 -

P
2
O
5
(%) 0,09 – 0,22 -
Khả năng giữ nước (%) 216 – 522 320
Tỷ lệ C/N 15,0 – 17,5 16,7
pH 5,8 – 7,8 6,8

5
Roughley (1970)
Chất lượng than bùn ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong sản phẩm và dẫn
đến sự tồn tại của chúng trong suốt quá trình bảo quản. Điểm đáng chú ý là
thành phần hoá học của than bùn không luôn luôn xác định chất lượng chế
phẩm làm từ chúng. Than bùn chấp nhận cho sản xuất chỉ có thể dựa và các thử
nghiệm sự phù hợp của nó đối với sự tăng trưởng và tồ
n tại đối với chủng
Rhizobium xác định. Hơn nữa sự phù hợp này thì phụ thuộc vào nguồn than bùn
và mỗi mẻ sản xuất than bùn (Roughley và Vincent, 1967).
- Bảo vệ ở dạng dịch thể: dạng chế phẩm dịch thể cũng được nghiên cứu gần
đây. Trong quá khứ dạng chế phẩm thương mại này không được chấp nhận
nhiều bởi vì khó khăn trong việc quản lý chất l
ượng sau khi sản phẩm xuất
xưởng (Brockwell, 1982). Hơn nữa, thời gian bảo quản ngắn và đòi hỏi bảo
quản ở nhiệt độ thấp đã hạn chế việc sử dụng chế phẩm dạng lỏng. (Stephens và
Rask, 2000). Gần đây, sản phẩm dạng này khá phong phú trên thị trường với
các công thức khác nhau, mỗi công thức là kết quả nghiên cứu và phát triển sản
phẩm của từng nhà s
ản xuất. Brockwell và Bottomley (1995) đã báo cáo sản
phẩm dạng dịch được đóng gói trong lọ, có thể áp dụng cho nhiễm lên hạt hoặc

là pha loãng và tưới trực tiếp vào luống gieo hạt. Singgleton và cộng sự (2002)
nghiên cứu bổ sung vào chế phẩm một số hợp chất hoá học để tăng số lượng tế
bào sống trên hạt sau khi nhiễm và phát triển chế phẩm vi khuẩn cố định đạm
cho cây đậu tương. Nghiên c
ứu này đề cập đến polyvinylpyrrolidone (PVP),
FeEDTA và glycerol. Tuy nhiên sự tồn tại của tế bào trên hạt từ các công thức
dịch thể được bảo quản theo thời gian thì giảm so với than bùn (Alabraeda et al.
2008).
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn cố định đạm trên hạt
giống
Chế phẩm chứa vi khuẩn cố định đạm có thể được dùng bằng cách nhiễm lên
hạt hoặc bón vào
đất. Chế phẩm có thể được sử dụng bằng cách nhiễm lên hạt
ngay trước khi gieo hoặc được phủ bao bọc hạt trong vòng 1 tuần trước khi
gieo. Hạt đậu cũng có thể được nhiễm và bảo quản trước khi bán như một sản
phẩm thương mại. Sản phẩm này gọi là hạt giống nhiễm chế phẩm (pre-
inoculated seed). Chế phẩm cũng được sử dụng theo cách nhiễ
m vi khuẩn vào
trong đất sử dụng chế phẩm than bùn pha trong nước hoặc là sử dụng chế phẩm
dạng dịch thể hay là dạng hạt. Cả hai kỹ thuật nhiễm đều có ưu điểm và khuyết
điểm. Lựa chọn phương pháp nào thì phụ thuộc vào thiết bị, kích cỡ hạt, tính
mỏng manh của mầm hạt. Nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc tối ưu hoá các
k
ỹ thuật này để cải thiện sự tồn tại của vi khuẩn và dẫn đến tăng hiệu quả cố
định đạm (Deaker, 2004).
Khi chế phẩm nhiễm lên hạt thì sự chết đi của tế bào rhizobium của tất cả
các giống xảy ra rất nhanh chóng, đặc biệt là khi các điều kiện môi trường

6
không thuận lợi. (Bowen và Kenedy, 1959; Marshall, 1964; Diatloff, 1967;

Brockwell et al. 1987). Từ đầu thế kỷ 20, các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng tế
bào Rhizobium tồn tại kém trên hạt và vấn đề này được cải thiện một phần bằng
cách bảo quản chế phẩm trong điều kiện nhiệt độ thấp và bổ sung một số hợp
chất (Fred et al. 1932).
Số lượng tế bào sống trên hạt ảnh hưởng trực tiếp
đến năng suất cây.
Roughley et al. (1993) nhận thấy tế bào Rhizobium chết đi nhanh chóng trên hạt
lupin giữa lúc nhiễm chế phẩm vào hạt và lúc gieo. Khi nhiễm số lượng tế bào
sống Bradyrhizobium trên 1 hạt là log
10
5,15 nhưng chỉ còn 4,8% (log
10
3,83) tế
bào còn lại trên hạt lúc gieo (sau 3,75 h sau khi nhiễm) và chỉ còn 0,83%
(log
10
3,07) sau 22,5 h trong đất, Khi tăng số lượng nhiễm vào hạt từ log
10
4,27
lên 6,27 và 7,28 thì số lượng tế bào trên rễ, số nốt sần hình thành sớm và khối
lượng nốt sần tăng đáng kể. Họ khuyến cáo nhiễm log
10
5,55 Rhizobium/hạt.
Các tác giả kết luận rằng cần thiết nghiên cứu giảm tốc độ chết của tế bào
Rhizobium cần thiết có tiêu chuẩn mới và cao hơn đối với sản phẩm thương
mại. Elegba và Rennie (1984) tìm ra rằng năng suất đậu tương tăng khi 10
6
tế
bào được nhiễm lên 1 hạt so với liều lượng đã được khuyến cáo khi đó là 10
5

.
Tương tự như vậy, Hume và Blair (1992) báo cáo năng suất đậu tương tăng 15-
25% khi tăng liều lượng nhiễm trên hạt từ log
10
5,0 đến 6,0. Tăng số lượng tế
bào trên hạt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành nốt sần và do đó tăng
năng suất cây. Tất cả các kết quả này chỉ ra rằng cần thiết tăng số lượng tế
bào/hạt.
Sự chết của tế bào trên hạt thông thường diễn ra ở tất cả quá trình nhiễm và
có 3 nguồn ảnh hưởng: sự làm khô (desiccation), bả
n chất độc tố của hạt và
nhiệt độ bảo quản không thuận lợi (Vincent el al. 1962; Date, 1968; Taylor and
Lloyd, 1968; Thompson et al., 1975).
Sự làm khô là yếu tố chính xác định sự tồn tại kém trên hạt của các tế bào
(Vincent et al,, 1962; Thompson, 1988). Nghiên cứu về sự tồn tại của R.
leguminosarum bv. Trifolii trên hạt thuỷ tinh ở điều kiện khô chỉ ra rằng quá
trình tế bào giảm đi trên hạt xảy ra ở 2 có hai giai đoạn (Vicent el al., 1962).
Giai đoạ
n đầu là số lượng tế bào trên hạt giảm đi một cách nhanh chóng trong
khoảng thời gian 0 và 24 h đồng thời với sự mất nước nhanh chóng thì giai
đoạn tiếp theo là sự mất nước và số lượng tế bào chết đi giảm. Tế bào tồn tại tốt
nhất trên hạt khi ẩm độ tương đối 100% và không phát hiện tế bào sống trên hạt
khi ẩm độ thấp hơn 60% sau khi nhiễm 27 giờ. Các nghiên cứ
u khác chỉ ra rằng
sự thích nghi với sự làm khô (desication) thay đổi tuỳ thuộc các chủng rhizobia
khác nhasu. Các chủng tăng trưởng chậm thì tồn tại tốt hơn trên hạt so với các
chủng tăng trưởng nhanh. Mary et al. (1994) quan sát sự tồn tại tốt hơn trên tế
bào của Sinorhizobium trong suốt quá trình bảo quản ở điều kiện ẩm độ tương
đối từ 22% đến 67% so với từ 3% đến 83,5%. Kiểu ảnh h
ưởng cũng tương tự

7
nhưng ở mức độ thấp hơn, đối với Bradyrhizobium (Boumahdi et al., 1999;
Mary et al., 1994) và Azosprillum (Paul et al., 1993). Tốc độ làm ướt cũng là
yếu tố quan trọng đối với sự tồn tại của tế bào trên hạt. Làm ướt nhanh chóng
dẫn đến tính bất ổn của tế bào và kết quả là tế bào chết đi (Bushby et al., 1977;
Salema et al., 1981). Kosanke et al. (1991) chỉ ra rằng tốc độ tái làm ướt thấp sẽ
dẫn đến múc độ tồ
n tại trên hạt cao hơn ở S. meliloti, Rhizobium
leguminosarum, Pseudominas putida.
Nhiệt độ cũng là yếu tố ảnh hưởng đến sự tồn tại trên hạt. Nhiệt độ thấp
(5°C) có lợi cho rhizobium sống trên hạt nhưng không thực tế (Date,1968).
Vincent (1958) cho thấy tốc độ chết của clover rhizobia trên hạt thuỷ tinh giảm
đi khi nhiệt độ tăng lên từ 5 đến 26 và 37°C. Bowen và Kennedy (1959) cho
thấy tính nhạy cảm của nhiều giống Rhizobium đố
i với nhiệt độ cao 40°C.
Trong thực tế sức ép lớn nhất từ nhiệt độ là khi hạt được gieo trên bề mặt đất
khô. Đây là vấn đề đặt ra đối với các vùnh đất nhiệt đới nơi đó nhiệt độ thường
vượt quá 40°C ở 5 cm bề mặt đất và 50°C ở 1 cm (Eaglesham và Ayanaba,
1984; Hafeez et al., 1991; Lal, 1993). Boonkerd et al. (2001) khám phá ra rằng
nhiệt độ thấp cũng ảnh hưởng đến sự tồn tạ
i của tế bào. Tác giả thấy rằng quần
thể rhizobia giảm do khô, nhiệt độ thấp và thiếu ẩm trong đất trong thời kỳ mùa
đông ở Thái lan. Các chủng B.japonicum cộng sinh với đậu tương tìm thấy
trong mùa hè nhưng lại biến mất trong mùa đông.
1.1.3. Các đáp ứng sinh lý của tế bào đối với sự làm khô
Dưới áp lực của sự thẩm thấu sự cân bằng nước giữa bên trong và bên
ngoài tế
bào đạt được nếu tế bào tích luỹ được các chất hoà tan tương thích
hoặc là các chất bảo vệ thẩm thấu. Các chất này bao gồm ion potassium,

glutamate, glutamine, proline, quaternary amines (glycine bataine) và các loại
đường trehalose, sucrose và glucosylglycerol. Các chất hoà tan giúp duy trì
tính ổn định protein trong suốt quá trình chịu áp lực thẩm thấu (Potts, 1994).
Trehalose: Trehalose tích luỹ trong các vi khuẩn bị áp lực thẩm thấu (Lesli et
al., 1995; Potts, 1994) và đặc biệt là đối với rhizobia (Breedveld et al., 1993;
Streeter, 2003). Trehalose bảo vệ tế bào chống lại sự làm khô bằng cách duy trì
sự nguyên vẹn củ
a màng tế bào trong quá trình làm khô và sau đó làm ướt
(Leslie et al., 1994, 1995) và sự hiện diện của trehalose có thể giải thích cho sự
tăng tính tồn tại của tế bào đối với sự làm khô trong suốt phase ổn định và khi
tế bào đối mặt với muối NaCl. Gouffi et al. (1998, 1999, 2000) tìm thấy rằng
trehalose và succrose không không tích luỹ trong môi trường nhưng nó tổng
hợp mới trong trong phase tăng trưởng sớm của vi khuẩn. Nghiên cứu của
Streeter J.G (2003) về ảnh hưởng của trehalose đối với s
ự tồn tại của
Bradyrhizobium japonicum trong suốt quá trình làm khô cho thấy trehaolose khi
được bổ sung vào môi trường tại thời điểm làm khô thì sự sống sót của tế bào
được cải thiện nhưng thấp trong lúc khi nó được bổ sung vào quá trình sinh

8
trưởng thì khả năng chống chịu với sự làm khô tăng lên rất nhiều. Nghiên cứu
của Gaber Zayed (2003) đối với Lactobacillus salivarus cho thấy trehalose
cũng làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn này khi đối mặt với quá trình
đông khô và tác giả này cho rằng khả năng chuyển hoá trehalose bởi vi khuẩn
này thì không liên quan đến khả năng kháng lại với quá trình làm khô mà có thể
liên quan đến một cơ chế khác. Có sự tương quan chặt chẽ gi
ữa lượng trehalose
của tế bào Bradyrhizobium với sự sống sót của chúng trên hạt đậu tương
(Streeter J.G, 2007). Nghiên cứu này cho thấy một số yếu tố ảnh hưởng đến sự
tồn tại của Bradyrhizobium trên hạt cần quan tâm là các chủng khác nhau, nồng

độ muối và trehalose trong môi trường, độ ẩm tương đối trong đó cho rằng
trehalose là yếu tố quan trọng. Nghiên cứu gần đây của Xiaoyan Li và Xiguang
Chen (2009) cho thấy sử dụng trehaolose nh
ư là một nguồn C và môi trường
bảo vệ tế bào vi khuẩn lactic đã có lợi ích bảo vệ tế bào trong suốt quá trình bảo
quản ở 4
0
C.
Sự tích luỹ exopolysaccharide: Rất nhiều vi khuẩn thường sinh ra và thường
sống giữa một nền exopolysaccharide (EPS) trong môi trường tự nhiên của
chúng, ví dụ trong đất (Foster, 1991) và trong phổi (Roberson và Firestone,
1992). EPS có chức năng kết các tế bào với cơ chất, bảo vệ chúng chống lại sự
thực bào, che đậy sự phát hiện kháng thể và chống lại sự phân huỷ tế bào bởi
các vi khuẩn khác (Tease và Walker, 1987). Chức năng bảo vệ chống lạ
i sức ép
bị khô (desiccation) thì chưa rõ và có một số các báo cáo trái ngược nhau.
Pseudomonas spp sản xuất một số lượng lớn EPS khi phản ứng với sự làm khô
(desiccation) (Roberson và Firestone, 1992). Tuy nhiên, Hartel và Alexander
(1986) tìm ra các chủng Bradyrhizobium không sinh màng nhày thì lại kháng
tốt hơn đối với sự làm khô trong đất cát so với chủng sinh màng nhày.
Thay đổi về hình thái tế bào: Bushby và Marshall (1977) chỉ ra rằng S.
meliloti SU47 tiết ra các thành phần của tế bào khi chúng bị làm ướt (sau giai
đoạn làm khô), chỉ ra rằng cấu trúc vách tế
bào có thể đã bị yếu đi trong suốt
quá trình desiccation. Feng et al. (2002) đã quan sát sự thay đổi cấu trúc vách tế
bào khi tế bào bị xử lý khô và bảo quản trong than bùn.
1.4. Các phương pháp cải thiện sự sống sót của vi khuẩn cố định đạm trên
hạt giống
Có nhiều loại chất đã được thử nghiệm với mục tiêu tăng cường sự tồn tại tế
bào trên hạt.

Đường, amino acid và hợp chấ
t rượu đường
Trong các nghiên cứu ban đầu về các vi khuẩn đông khô, bản chất của môi
trường huyền phù đã được xác nhận nó như là một sự trợ giúp quan trọng cho tế
bào tồn tại (Heller, 1941; Annear, 1956, 1962; Vincent, 1958). Các nghiên cứu
mở rộng hơn nữa sử dụng các chất dinh dưỡng của vi khuẩn như là tác nhân gây
huyền phù cho quá trình đông khô và bảo quản tế bào (Heller, 1941; Appleman

9
và Sears, 1944; Annear, 1956, 1962; Redway and Lapage, 1974; Dye,1982).
Heller (1941) khảo sát các ảnh hưởng bảo vệ của các hợp chất kết tinh và các
chất keo trong quá trình khô của Streptococcus pyogenes C203 and Escherichia
coli. Sucrose là một tác nhân huyền phù tốt hơn so với glucose, xylose,
tryptophane, salicin, saline và nước đối với cả hai giống. Heller kết luận rằng sự
tồn tại thì liên quan đấn tính đồng hoá và hoà tan của hợp chất này. Hơn nữa,
Vincent (1958) báo cáo rằng 24–44% tế bào tồn tại khi tạo huyền phù tế bào
trong dung dịch sucrose 10% trong khi đó chỉ có 1% t
ế bào tồn tại khi tạo
huyền phù với nước. Sucrose là tác nhân tạo huyền phù tốt hơn sorbitol,
mannitol, lysine, amino acid mixtures, sữa và, dịch cao nấm men và manitol. Sự
tồn tại kém của tế bào rhizobia trên hạt và hạt thuỷ tinh đã được cải thiện bằng
cách bổ sung sucrose. McLeod và Roughley (1961) tìm ra rằng kết hợp 10%
sucrose và dịch cao nấm men và manitol tăng tồn tại của tế bào trên hạt thuỷ
tinh so với đối chứng không có dịch này. Vincent et al. (1962) chỉ ra rằng tồn
tại của dịch thể lỏng R. leguminosarum bv. trifolii trên hạt thuỷ tinh thì cao hơn
nhiều sau khi tạo huyền phù với maltose so với các đường khác, sorbitol và
sodium chloride.
Các polymer
Các polymer tự nhiên như là gum arabic đã được sử dụng như là các chất
bám dính trong áp dụng các chế phẩm nhiễm cho cây họ đậu trong nông nghiệp.

Nhiều trong số các nghiên cứu về chất bám dính chú trọng đến khả năng của
chúng trong việc duy trì sự sống của rhizobia trên hạt cây họ
đậu (Scott, 1989).
Gum arabic tăng cường sự tồn tại của rhizobia trên hạt cây họ đậu. Vincent et
al., (1962) phát hiện ra rằng gum arabic không chỉ bảo vệ tế bào chống lại sự
làm khô mà còn làm cho tế bào tồn tại tốt hơn trên hạt so với maltose. Điều này
cho thấy có sự bảo vệ nào đấy chống lại các chất độc của hạt. Methylcellulose,
là một ether cellulose vô cực, hoà tan trong nước thì được sử dụng rộng rãi hơn
nh
ư là chất bám dính. Methylcellulose sẵn có, chất lượng của nó tương đối ổn
định do nó là một polymer bán tổng hợp và khá rẻ bởi vì được sử dụng ở liều
lượng thấp (1.5% w/v) (Scott, 1989). Tuy nhiên, các kết quả báo cáo khác nhau
về sự bảo vệ tế bào bởi methylcellulose khi so sánh với gum arabic và nó thông
thường kém hiệu quả hơn. Lloy (1983) đã được cấp bằng phát minh cho công
trình nghiên cứu về Polyvinylpyrrolidone (PVP) hoà tan trong nước như là tác
nhân bao vào hạt. PVP là một polymer tổng hợp được s
ản xuất bởi sự polymer
hoá monomer vinylpyrrolidone. PVP có thể bất hoạt các hợp chất độc hiện diện
trong các chất tiết ra từ hạt trong quá trình hạt nẩy mầm. PVP có khả năng giữ
nước cao và dường như làm chậm đi quá trình khô của chế phẩm sau khi nhiễm
vào hạt. PVP có tính chất dính ổn định và tính chất này có khả năng làm tăng sự
kết dính của tế bào và chế phẩm vào hạt. PVP dường như t
ăng sự tồn tại của
Bradyrhizobium japonicum và ảnh hưởng này thì phụ thuộc vào nồng độ PVP

10
(Singleton et al., 2002). Singleton et al., (2002) xác định tồn tại của tế bào trên
hạt đậu tương với các chủng khác nhau và chỉ rằng tốc độ tế bào sống giảm đi
trên hạt thì khác nhau giữa các chủng và các công thức. Như vậy, để sản xuất
chế phẩm có chất lượng tốt thì chất mang phù hợp hoặc các chất bổ sung đối

với các chủng Rhizobium xác định cần được chọn lọc.
1.2. Tình hình nghiên c
ứu trong nước
Nhà nước ta rất quan tâm đẩy mạnh các nghiên cứu, ứng dụng và phát triển
công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông nghiệp và nông thôn, đặc biệt chú trọng đến
phát triển công nghệ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp. Bộ Khoa học và
Công nghệ đã ban hành quyết định số 2025/QĐ-BKHCN vào ngày 13 tháng 9
năm 2006 về việc phê chuẩn về mục tiêu, nội dung và các dự kiến sản phẩm của
Chương trình Khoa họ
c và Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2006-
2010: “Nghiên cứu, ứng dụng và phát triển


c
c
ô
ô
n
n
g
g


n
n
g
g
h
h
ệ

ệ


p
p
h
h
ụ
ụ
c
c


v
v
ụ
ụ


c
c
ô
ô
n
n
g
g


n

n
g
g
h
h
i
i
ệ
ệ
p
p


h
h
ó
ó
a
a
,
,


h
h
i
i
ệ
ệ
n

n


đ
đ
ạ
ạ
i
i


h
h
ó
ó
a
a


n
n
ô
ô
n
n
g
g


n

n
g
g
h
h
i
i
ệ
ệ
p
p


v
v
à
à


n
n
ô
ô
n
n
g
g


t

t
h
h
ô
ô
n
n” (KC.07/06-10). Trong quyết định này
có đề cặp đến việc nghiên cứu và chuyển giao công nghệ các loại phân bón vi
sinh vật. Một chương trình quốc gia quan tr
ọng khác là “Nghiên cứu, phát triển
và ứng dụng công nghệ sinh học” theo quyết định số 2022/QĐ-BKHCN, ký
ngày 13 tháng 9 năm 2006, phê chuẩn các nghiên cứu và ứng dụng các chủng vi
sinh để sản xuất phân bón. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đang thực
hiện “Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học
trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020” trong đó có
kế hoạch hành động phát triển phân bón vi sinh vật cho cây trồ
ng.
Theo số liệu thống kê diện tích cây lạc và cây đậu tương hiện nay khoảng
450 ngàn ha nhưng đang trên đà phát triển, đặc biệt đối với cây đậu tương. Diện
tích trồng đậu tương tăng nhanh để đáp ứng nhu cầu vừa là cây có dầu vừa là
cây phục vụ chăn nuôi. Nhiệm vụ đã đặt ra bởi Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn là phát triển 400 ngàn ha đậu tương đến năm 2010. Bên cạnh
đó nhu
cầu phát triển cây có dầu, đặc biệt là đậu tương và lạc rất lớn do nhu cầu phát
triển công nghiệp dầu thực vật. Hiện nay nghành dầu phải nhập 96% nguyên
liệu, kim nghạch nhập khẩu rất lớn (700 triệu USD năm 2008). Điều này cho
thấy tiềm năng thị trường lớn của các chế phẩm phân bón vi sinh. Ngược lại,
phát triển phân bón vi sinh có ảnh hưởng đến tăng sản l
ượng sản xuất cây có
dầu như cây đậu tương và cây lạc do chúng giảm thiểu sử dụng phân bón hoá

học, tăng năng suất cho cây.
Tuy nhiên, tất cả diện tích gieo trồng hiện tại không áp dụng lợi ích của cố
định đạm sinh học thông qua áp dụng chế phẩm Rhizobium mà bón phân N hoá
học, với liều lượng trung bình từ 25-80 kgN/ha (Trần Yên Thảo, 2010). Thay
thế phân bón N bằng chế phẩm vi sinh sẽ tiết kiệm cho nông dân Việt nam 100-

11
200 triệu đô la hàng năm, và cùng lúc sẽ thúc đẩy mở rộng sản xuất cây họ đậu
và tác động có lợi đối với môi trường.
Các thí nghiệm về sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm cho đậu tương
thực hiện từ năm 1976 đến 2001 tại Miền Nam cho thấy đậu tương phản ứng tốt
với việc nhiễm chế phẩm thông qua tăng năng su
ất. Trung bình năng suất tăng
38% (59% tại Đồng bằng sông Cửu long, 16% tại Đông Nam bộ). Trong hầu
hết các điểm, phân bón N tiết kiệm được là 40-60kgN/ha (Trần Yên Thảo,
2004). Tương tự đối với lạc, năng suất quả tăng 13.8-17.5% ở Miền Bắc (Ngô
Thế Dân và cs, 2000). Hiệu quả kinh tế đã được tổng kết chi tiết trong báo cáo
dự án LWR2/98/27. Trong 23 thí nghiệm ở Miền nam, lợi ích kinh tế mang lại
là tăng lợi nhuận lên đến 760 đô la Úc/ha (trung bình tăng hơn 100 đô la Úc/ha)
do tăng năng suất và giảm sử dụng phân bón N hóa học. Chế phẩm vi sinh này
đã tăng năng suất hạt lạc trồng trên đất chua Đồng bằng Sông Cửu Long trung
bình là 42% so với không bón phân N và 28% so với bón phân N. Đối với 13
thí nghiệm của đậu tương năng suất tăng trung bình là 19% so với không bón
phân N, và năng suất tăng 40-50% trong một số thí nghiệm. Mức độ l
ợi ích kinh
tế thì thay đổi phụ thuộc vào loại cây, vùng đất và lịch sử trồng trọt. Không có
trường hợp nào giảm năng suất khi thay phân đạm khoáng N bằng chế phẩm vi
sinh cố định đạm.
Kết quả các mô hình trình diễn đồng ruộng sử dụng các chế
phẩm vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc từ năm 2007 đến 2010 tại

10 tỉnh trong nước cho thấy
tại tất cả các điểm trỉnh diễn, năng suất tăng khi áp
dụng chế phẩm, trung bình đối với đậu tương là 460 kg/ha (18%), đối với lạc là
290 kg/ha (11%). Lợi nhuận tăng trung bình đối với đậu tương là 5.63 triệu
đồng/ha, đối với lạc là 4.95 triệu đồng/ha. Phân bón tiết kiệm được là từ 25-80
kgN/ha đối với đậu tương và 25-70 kg/ha đối với lạc. Lợi nhuận tăng này chủ

yếu là từ viêc giảm đầu tư phân bón hoá học N và tăng năng suất. Do đó, cần
thiết sử dụng chế phẩm vi sinh cố định đạm cho cây đậu tương và lạc tại nước
ta.
Cho đến nay chế phẩm vi khuẩn cố định đạm Rhizobium chưa được
thương mại hoá ở nước ta và chất mang rắn thường được lựa chọn trong các
nghiên cứu phát triển sản ph
ẩm. Thí nghiệm đồng ruộng sử dụng chế phẩm
dạng dung dịch có ứng dụng polymer là PVP cho thấy nốt sần, sinh khối cây và
năng suất của đậu tương tăng so với đối chứng bón phân N hoá học và không có
sự khác biệt so với chế phẩm trên nền chất mang than bùn (Trần Yên Thảo et al.
2002). Ngoài ra chúng tôi chưa tìm thấy các công trình nghiên cứu khác trong
nước liên quan đến nội dung này.


12
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
Chủng vi sinh vật:
Trong nghiên cứu này, 2 chủng Rhizobium VD-RS 1 và VD-RG 1 được
sử dụng. Chủng VD-RS 1 có nguồn gốc là chủng CB1809 và chủng VD-RG 1
có nguồn gốc là chủng NC92, được nhập từ Trung tâm Nghiên cứu các Chế
phẩm Cố định đạm, Úc. Chủng VD-RS 1 chuyên biệt cho cây đậu tương, chủng
VD-RG 1 chuyên biệt cho cây lạc. Hai chủng này đã được nghiên cứu và xác
định là hai chủng có khả năng cố định đạm cao, phù hợp với nhiều vùng sinh

thái trồng
đậu tương và lạc trong nước, và được đề xuất như là các chủng quốc
gia, áp dụng cho sản xuất chế phẩm ở phạm vi cả nước (Dự án AusAID CARD,
2007-2010).
Polymer:
Các plymer sử dụng bao gồm các polymer tự nhiên (Gum Arabic,
Xanthan Gum) và các polymer tổng hợp (polyvinyl pyrrolydine-PVP,
polyvinylalcohol-PVA). Các polymer này được cung cấp bởi Trường Đại học
Sydney, Úc. Gum Arabic va Xanthan Gum là sản phẩm của Merck; PVA và
PVP của Nippon Gohsei.
Phương pháp nghiên cứu dưới đây được trình bày theo thứ tự nôi dung
của đề
tài.
2.1. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn các polymer thích hợp để sản xuất
chế phẩm vi khuẩn cố định đạm
2.1.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại và hàm lượng các
polymer đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu
tương và cây lạc
- Nghiệm thức thí nghiệm:
* Loại polymer: 4 loại polymer khác nhau polyvinyl pyrrolydine-PVP,
polyvinylalcohol-PVA, Xanthan Gum và Gum Arabic
* Nồng độ polymer:
+ PVP: 1%, 2%, 3%, 4%
+ PVA: 0,1%, 0,5%, 1% , 2%
+ Gum Arabic: 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%
+ Xanthan Gum: 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%
* Giống vi sinh vật:
+ Rhizobium cho cây
đậu tương: VD-RS 1
+ Rhizobium cho cây lạc: VD-RG 1

- Thực hiện: hai chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường YEM có bổ
sung các loại loại polymer và nồng độ như trên. Theo dõi số lượng tế bào vi

13
khuẩn (số tế bào/ml) tại các thời điểm 1, 3, 5, 7 và 9 ngày sau khi nuôi cấy. Đối
chứng là môi trường YEM dịch thể, không bổ sung polymer. Môi trường xác
định số lượng vi khuẩn Rhizobium là mội trường YEMA có Congo Red là chất
chỉ thị màu. Xác định và đếm các khuẩn lạc Rhizobium đặc trưng trên môi
trường này.
2.1.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của loại và hàm lượng các
polymer đến tồn tại của các chủng vi khuẩn cố đị
nh đạm trên hạt đậu
tương và hạt lạc
Từ kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của polymer đến sinh trưởng của 2
chủng vi khuẩn cố định đạm, các chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 được nuôi cấy
trong các môi trường có các loại polymer khác nhau và ở các nồng độ thích hợp
khác nhau. Dịch sinh khối sau đó được nhiễm trên hạt đậu tương và hạt lạc. Số
lượng tế bào tồn tại trên hạt được theo dõi sau 24 gi
ờ.
Phương pháp xác định tế bào Rhizobium tồn tại trên hạt bao gồm khử
trùng hạt, nhiễm chế phẩm lên hạt và xác định số lượng tế bào theo phương
pháp của Somasegaran, P., and Hoben, H. J. (1994).
2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của loại polymer và nhiệt độ đến
sự tồn tại của các chủng vi khuẩn cố định đạm cho cây đậu tương và lạc
Ở nội dung nghiên cứu này các chủng VD-RS 1 và VD-RG 1 được nuôi
c
ấy trong các môi trường dịch thể khác nhau về loại polymer để tạo các chế
phẩm vi khuẩn cố định đạm khác nhau. Loại polymer và hàm lượng của chúng
được xác định ở nội dung 1.
Các sản phẩm này sau đó được bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ mát

(5
o
C). Theo dõi số lượng tế bào vi khuẩn của 2 chủng này theo thời gian tại 1,
7, 14, 21, 28 ngày và 2, 3 tháng. Đối chứng là chế phẩm trên nền chất mang
than bùn. Phương pháp xác định số lượng Rhizobium là phương pháp xác định
khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường YEM có bổ sung chỉ thị màu Congo Red.
2.3. Phương pháp xây dựng qui trình công nghệ, sản xuất và đánh giá chất
lượng chế phẩm vi khuẩn cố định đạm có sử dụng polymer cho cây đậu
tươ
ng và lạc.
Dựa trên cơ sở đã có qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn cố
định đạm trên nền chất mang rắn là than bùn, trong nôi dung nghiên cứu này
các thí nghiệm được thực hiện theo qui trình đó và qui mô thực hiện nghiên cứu
là 5 lít chế phẩm/mẻ. Qui trình chung bao gồm:
- Sản xuất giống: bao gồm hoạt hoá giống, nhân giống
- Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối
- Tạo sản phẩm
- Kiểm tra chất l
ượng sản phẩm

14
2.3.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến mức độ
tạp nhiễm của môi trường nhân sinh khối
- Nghiệm thức thí nghiệm:
+ Khử trùng 1 lần:
• Thời gian khử trùng 30 phút
• Thời gian khử trùng 60 phút
• Thời gian khử trùng 90 phút
+ Khử trùng 2 lần:
• Thời gian khử trùng 30 phút

• Thời gian khử trùng 45 phút
Khử trùng lần 2 sau lần 1 là 8 giờ.
Chế độ khử
trùng: 121
o
C, 1 atm.
- Thực hiện: Thực hiện các nghiệm thức khử trùng môi trường như trên. 24 giờ
sau khi môi trường được khử trùng, tiến hành xác định số tế bào vi khuẩn tạp
nhiễm trong môi trường. Mội trường nuôi cấy xác định tạp nhiễm là YEMA bổ
sung Congo Red. Đếm các khuẩn lạc tạp nhiễm, là tất cả các khuẩn lạc xuất
hiện từ môi trường đã khử trùng. Đối chứng là nước cất khử
trùng.
2.3.2. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của chủng VD-RS 1
và VD-RG 1
Mục đích là để xác định thời gian nhân sinh khối sản xuất chế phẩm.
Nuôi cấy hai chủng Rhizobium trong môi trường nhân sinh khối có bổ sung
polymer ở nồng độ đã được chọn lọc từ các nội dung nghiên cứu trên. Sau thời
gian nuôi cấy 1, 3, 5, 7, 8, 9 ngày, xác định số lượng tế bào tích luỹ trong môi
trường. Phương pháp xác định số lượ
ng: phương pháp xác định khuẩn lạc đặc
trưng trên môi trường YEMA có bổ sung chỉ thị màu Congo Red.
2.4. Sản xuất thử và đánh giá chất lượng chế phẩm dịch thể bổ sung
polymer cho cây đậu tương và cây lạc
Tiến hành sản xuất thử nghiệm, qui mô 5 lít/mẻ. Xác định chất lượng của
từng mẻ sản xuất bao gồm xác định số tế bào Rhizobium sống và số tế bào tạ
p
nhiễm trong chế phẩm. Sử dụng môi trường YEMA với chất chỉ thị màu Congo
Red.
2.5. Phương pháp xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm có sử dụng
polymer ở điều kiện đồng ruộng đối với cây đậu tương và cây lạc

Phương pháp xác định hiệu quả cố định đạm của chế phẩm dựa vào
nguyên tắc là nhiễm chế ph
ẩm vào hạt, thực hiện trồng cây trong điều kiện
đồng ruộng. Xác định và so sánh nốt sần, sinh khối và năng suất giữa các
nghiệm thức không nhiễm và nhiễm chế phẩm. Phương pháp thực hiện trong